Isolamento, Síntese e Caracterização de Nanopartículas Poli(ácido lático-coglicólico) revestidas com membrana de Macrófagos CD47 e Integrina α4/β1

Summary

Esse protocolo permite a preparação e caracterização de nanopartículas de poli(ácido lático-coglicólico) revestidas de membrana CD47 e integrina α4/β1 para aplicações direcionadas de entrega de fármacos.

Abstract

A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica e um dos principais fatores que contribuem para a morbidade e mortalidade cardiovascular. A entrega direcionada de agentes anti-inflamatórios aos locais ateroscleróticos continua sendo um desafio significativo. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a preparação e caracterização de nanopartículas de membrana revestidas com colchicina (MMM/COL) com CD47 e integrina α4/β1 co-modificadas por membrana de macrófagos (MMM/COL NPs). O protocolo inclui modificação de macrófagos por transfecção de plasmídeos e estimulação com endotelina-1, isolamento de membrana, fabricação de NP e revestimento de membrana. Os NPs MMM/COL resultantes são avaliados usando caracterização fisicoquímica, análise de expressão proteica e ensaios in vitro e in vivo . A validação funcional inclui avaliação da associação celular com células endoteliais ativadas, captação de macrófagos, efeitos anti-inflamatórios em células de espuma e biodistribuição em um modelo murino de aterosclerose. Além disso, parâmetros experimentais chave e etapas de controle de qualidade são destacados para garantir reprodutibilidade e consistência entre os laboratórios. Esse protocolo oferece uma abordagem robusta e escalável para gerar NPs biomiméticos para aplicações direcionadas de entrega de medicamentos em pesquisas de aterosclerose.

Introduction

Aterosclerose é uma doença inflamatória crônica que leva a eventos cardiovasculares fatais e AVC por meio de estenose do lúmen arterial e ruptura instável de placas, responsável por uma carga significativa de saúde^{global 1,2,3}. A regulação negativa das respostas inflamatórias no local aterosclerótico é um alvo terapêutico principal ^4,5. A colchicina, um potente anti-inflamatório, tem mostrado potencial na redução de eventos cardiovasculares^{adversos 6,7}. No entanto, sua utilidade clínica é limitada por uma janela terapêutica estreita e efeitos colaterais sistêmicos, exigindo sistemas de administração direcionados para aumentar o acúmulo no local da placa, minimizando a^{toxicidade 8}.

Nanopartículas revestidas de membrana celular (NPs) emergiram como uma poderosa plataforma para entrega direcionada de medicamentos, aproveitando as funções biológicas naturais das células^{fonte 9,10,11}. Entre os tipos celulares envolvidos na aterosclerose, os macrófagos desempenham um papel fundamental 12,13,14. A integrina α4/β1, expressa nos macrófagos, meda o recrutamento para placas ateroscleróticas ao se ligar à molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1) expressa nas células endoteliais (CEs) ativadas. CD47, um sinal de "não me coma", permite a evasão da fagocitose pelo sistema mononuclear^{de fagocitos 15,16}. Ao engenheirar as membranas dos macrófagos para superexpressar essas proteínas em comparação com as membranas nativas dos macrófagos, pode-se criar NPs com direcionamento aprimorado via interação integrina α4/β1–VCAM-1 e redução da fagocitose por sinalização^{mediada por CD47 6}. A estratégia de modificação dupla aprimora os NPs nativos revestidos por membrana e os sistemas de direcionamento baseados em ligando, ao simultaneamente aprimorar o direcionamento para ECs ativados e reduzir a depuração fagocítica. Ao contrário das membranas nativas de macrófagos, que expressam apenas níveis basais dessas proteínas, nossa membrana engenheirada oferece funcionalidade aprimorada sem introduzir ligantes sintéticos direcionados que possam desencadear imunogenicidade.

Este protocolo detalha a preparação e caracterização de NPs poli(ácido lático-coglicólico) carregados de colchicina (NPs COL) revestidos com membranas de macrófagos co-modificadas CD47- e integrina α4/β1, gerando NPs revestidas por membrana de macrófagos modificadas (NPs MMM/COL). Descrevemos métodos para a modificação genética e farmacológica dos macrófagos RAW 264.7, isolamento de membranas modificadas, preparação e revestimento de NPs PLGA, e ensaios funcionais abrangentes in vitro e in vivo . Esse método fornece uma estrutura reprodutível para preparar e avaliar NPs biomiméticos para aplicações direcionadas de entrega de fármacos em pesquisas de aterosclerose.

Protocol

Todos os procedimentos com animais descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais do Hospital Torre Drum de Nanjing e seguiram as diretrizes para o cuidado e uso de animais de laboratório estabelecidas pelos Institutos Nacionais de Saúde.

1. Modificação dos macrófagos RAW 264.7

1. Preparar as células RAW 264,7, completar o Meio Eagle Modificado de Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina–estreptomicina, plasmídeo de superexpressão CD47, reagente de transfecção Lipofectamina 3000, endotelina-1 (ET-1), soro salino tamponado com fosfato (PBS) e suprimentos de cultura de tecido estéril.
2. Cultive 264,7 células RAW em uma incubadora umidificada a 37°C com 5% de CO₂ e mantenha as células até que atinjam aproximadamente 4–5 ×^10,5 células por poço em uma placa de 6 poços.
3. Realizar modificação do CD47
   1. Prepare a solução de DNA plasmídico misturando 2,5 μg de DNA plasmídico com 5 μL de reagente P3000 em meio livre de soro Opti-MEM de 125 μL.
   2. Prepare a solução do reagente de transfecção diluindo 3,75 μL de reagente de transfecção em 125 μL de meio livre de soro.
   3. Use esses volumes para um formato de placa de 6 poços. Escale todos os componentes proporcionalmente para outros formatos, mantendo uma razão DNA:P3000 de 1:2 (μg:μL) e uma razão DNA:reagente de transfecção de 1:1,5 (μg:μL).
      NOTA: Por exemplo, use 10 μg de DNA, 20 μL de P3000 e 15 μL de reagente de transfecção para pratos de 10 cm.
   4. Combine a solução de DNA com a solução do reagente de transfecção e incube por 15 minutos a 25°C.
   5. Adicione os complexos de transfecção às células em DMEM livre de antibióticos suplementado com 10% de FBS em aproximadamente 2–2,5 × 10⁶ células por prato de 10 cm.
   6. Substitua o meio por meio fresco e completo contendo antibióticos 6 h após a transfecção.
4. Realizar modificação de integrina α4/β1
   1. Estimule células transfectadas ou não transfectadas com 100 nM ET-1 em meio sem soro por 24 horas para aumentar a expressão da integrina α4/β1.
      NOTA: Verifique a eficiência da modificação por reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR) e análise por Western blot para CD47, integrina α4 e integrina β1.

2. Isolamento da membrana de macrófagos modificados (MMM)

1. Colhe as células modificadas do RAW 264.7 usando um raspador de células.
2. Centrifuge as células a 900 × g por 5 minutos a 4°C.
3. Lave o pellet de células três vezes com PBS frio de 1×.
4. Ressuspenda a célula em 2 mL de tampão de lise hipotônica pré-resfriada (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM de KCl, 1,5 mM de_MgCl2 e 1 mM de fenilmetilsulfonil fluoreto) e incube a suspensão no gelo por 15 minutos.
5. Congele a suspensão em nitrogênio líquido por 2 minutos e depois descongele em banho-maria a 37°C por 5 minutos. Repita o ciclo de congelamento-descongelamento cinco vezes para lisar completamente as células.
   ATENÇÃO: Nitrogênio líquido pode causar queimaduras criogênicas graves. Manuseie com luvas isoladas apropriadas e proteção facial.
6. Centrifuge o lisado a 850 × g por 10 minutos a 4°C para remover núcleos e células não quebradas.
7. Centrifuge o sobrenadante coletado a 15.000 × g por 30 minutos a 4°C. Para obter maior pureza de membrana, transfere-se o sobrenadante obtido após 15.000 × g de centrifugação para tubos ultracentrífugas e centrifuge a 100.000 × g por 1 h a 4°C usando uma ultracentrífuga.
   ATENÇÃO: Certifique-se de que os tubos ultracentrífugas estejam devidamente balanceados e classificados para centrifugação em alta velocidade, a fim de evitar desequilíbrio ou falha do rotor.
   NOTA: A ultracentrifugação gera membranas plasmáticas purificadas com redução da contaminação intracelular por organelos.
8. Colete o pellet contendo fragmentos de MMM e ressuspenda-o em 300 μL de 1× PBS ou tampão de lise para obter uma concentração de proteína de aproximadamente 1–2 mg/mL.
9. Determine a concentração de proteínas de membrana usando um kit de quantificação de proteínas BCA.
   NOTA: Membranas isoladas podem ser armazenadas a −80°C para uso posterior.

3. Preparação de NPs PLGA carregados com colchicina (COL NPs)

1. Dissolva 10 mg de PLGA (50:50, MW 90.000) e 1 mg de colchicina em 1 mL de dimetil sulfóxido (DMSO).
   ATENÇÃO: O DMSO pode penetrar na pele e melhorar a absorção de outras substâncias. Use equipamentos de proteção individual apropriados (luvas de nitrilo, jaleco e óculos de segurança) ao manusear. Colete soluções contendo DMSO como resíduos de solventes orgânicos e descarte por meio de serviços licenciados de descarte de resíduos perigosos. A colchicina é tóxica e potencialmente teratogênica. Colete todos os materiais contaminados com colchicina (soluções, luvas e tubos) como resíduos farmacêuticos perigosos e descarte por meio de serviços licenciados de descarte de resíduos perigosos, conforme as regulamentações institucionais e locais.
2. Mexa a solução a 500 rpm usando um agitador magnético com uma barra de agitação revestida de Teflon de 10 mm a 25°C.
3. Adicione 4 mL de água ultrapura em gota a gota a aproximadamente 1 mL/min usando uma bomba de seringa equipada com uma seringa de 5 mL e uma agulha de 26G a 25°C.
4. Continue mexendo a mistura por 3 horas para permitir a formação do NP.
5. Transfira a suspensão NP para uma bolsa de diálise (MWCO 3.500 Da).
6. Dialise contra 2 L de água destilada a 4°C sob uma leve agitação a 200 rpm.
7. Continue a diálise por 24 horas e substitua completamente o buffer de diálise às 6, 12 e 24 horas para remover a colchicina livre e o DMSO.
   ATENÇÃO: Colete todos os solventes e reagentes orgânicos, incluindo os da diálise, como resíduos químicos orgânicos. Não jogue tudo no ralo. Siga os protocolos institucionais de descarte de resíduos perigosos.
8. Recolha a suspensão COL NP dialisada e armazene a 4°C.
   NOTA: Os NPs de COL podem ser armazenados a 4°C para uso de curto prazo (até 3 dias). Para marcação fluorescente, incorpore 0,1% (p/w) de 1,1′-dioctadecil-3,3′,3′,3′-perclorato de tetrametilindocarbocianiano (DiI) na solução de PLGA durante o Passo 3.1.
9. Verifique a remoção do DMSO e da colchicina livre
   1. Colete o dialisado final (o tampão após a última alteração às 24 horas) e analise-o usando espectrofotometria ultravioleta–visível (UV–vis).
   2. Escaneie o diálisado de 200 a 400 nm e compare com uma amostra controle (tampão de diálise fresca).
   3. Confirme que não há pico de absorção presente em aproximadamente 210 nm (característico da DMSO) ou em 345 nm (característico da colchicina), indicando remoção bem-sucedida do solvente residual e do medicamento livre.
   4. Alternativamente, determine a concentração residual de DMSO usando um kit de ensaio DMSO conforme as instruções do fabricante. Certifique-se de que o DMSO residual esteja abaixo de 0,1% (v/v) para evitar citotoxicidade nos ensaios posteriores.

4. Fabricação de NPs revestidos por membrana (NPs MMM/COL)

1. Sonice a suspensão isolada do MMM (do passo 2.7) por 20 minutos usando um sonicador de banho-maria a 40 kHz e 110 W. Mantenha o volume da amostra em 1 mL em um tubo de 1,5 mL e temperatura abaixo de 25°C usando banho de gelo conforme necessário.
2. Extruda a suspensão de membrana sonicada através de um filtro de membrana de policarbonato com tamanho de poros de 400 nm usando um mini extrusor para formar vesículas de membrana.
3. Misture as NPs do COL (do passo 3.5) com as vesículas MMM em uma proporção de massa de proteína membrana para PLGA de 1:1.
   1. Use uma suspensão de membrana contendo 10 mg de proteína para 10 mg de PLGA, conforme determinado por ensaio de quantificação de proteínas.
   2. Pipeteie suavemente as NPs do COL com as vesículas MMM para cima e para baixo 15 vezes usando uma pipeta de 1 mL.
4. Coextruda a mistura através de um filtro de membrana de policarbonato com tamanho de poro de 200 nm e repita a extrusão por 15 passagens.
5. Recolha a suspensão resultante contendo NPs MMM/COL e armazene-a a 4°C para uso imediato.

5. Caracterização dos NPs

1. Meça o diâmetro hidrodinâmico, o índice de polidispersidade (PDI) e o potencial zeta usando espalhamento dinâmico da luz (DLS) sob as seguintes condições: temperatura, 25°C; ângulo de retroespalhamento, 173°; tempo de equilíbrio, 2 min; e três medições replicadas por amostra.
2. Dilua as amostras 20 vezes em água desionizada (concentração final, aproximadamente 0,1 mg/mL).
   NOTA: A diluição minimiza múltiplos efeitos de espalhamento.
3. Visualize a estrutura núcleo–camada dos NPs MMM/COL usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM).
   1. Coloque 5 μL de suspensão NP (aproximadamente 0,1 mg/mL) sobre uma grade de cobre revestida a carbono com descarga luminosa (malha 300).
   2. Deixe a amostra adsorver por 2 minutos a 25°C.
   3. Remova o excesso de líquido tocando suavemente a borda da grade com papel de filtro.
   4. Aplique 5 μL de solução de acetato de uranila a 1% na grade e incube por 1 minuto a 25°C.
   5. Remova o excesso de mancha com papel filtro.
   6. Deixe a grade secar completamente ao ar por pelo menos 10 minutos antes da imagem.
      ATENÇÃO: Acetato de uranila é tóxico e radioativo. Manuseie com equipamentos de proteção individual apropriados (luvas, jaleco e proteção ocular) e descarte resíduos de acordo com as diretrizes institucionais de materiais perigosos.
4. Marque a membrana com o corante 3,3′-dioctadeciloxacarbociacinato (DiO) durante a etapa 2 ou marcando células intactas antes do isolamento da membrana, e marque o núcleo do PLGA com DiI.
5. Analise a colocalização dos sinais DiO (verde) e DiI (vermelho) usando microscopia de varredura a laser confocal (CLSM).
   1. Defina os parâmetros de excitação/emissão da seguinte forma: DiO (verde), excitação 488 nm, emissão 550 nm; DiI (vermelho), excitação 561 nm, emissão 620 nm.
   2. Use uma lente objetiva de imersão em óleo de 60× (abertura numérica, 1,4).
   3. Ajuste o orifício para 1 unidade Airy.
   4. Ajuste o ganho do detector para evitar a saturação dos pixels.
   5. Adquira imagens com resolução de 1024 × 1024 pixels com média de linha de 2×.
   6. Mantenha a potência do laser abaixo de 5% para minimizar o fotobranqueamento.
6. Analise a presença de CD47, integrina α4 e integrina β1 na superfície np do MMM/COL usando análise por Western blot.
7. Determinar o carregamento e liberação do medicamento
   1. Lisar um volume de 100 μL de NPs em DMSO e medir a absorção da colchicina a 345 nm para determinar a carga do fármaco e a eficiência do encapsulamento.
   2. Coloque 1 mL de suspensão de MMM/COL NP (contendo aproximadamente 100 μg de colchicina) em um saco de diálise (MWCO, 3.500 Da).
   3. Feche o saco e mergulhe-o em 50 mL de PBS (pH 7,4) contendo 20% de FBS em um béquer de vidro de 100 mL.
   4. Mantenha o meio de liberação a 37°C sob agitação constante a 100 rpm usando um agitador magnético com barra de agitação revestida com Teflon de 20 mm.
   5. Mantenha as condições de pia durante todo o experimento.
      NOTA: A solubilidade da colchicina no PBS com 20% de FBS é >1 mg/mL; A concentração máxima de colchicina no meio liberador é <10% da saturação.
   6. Em pontos de tempo predeterminados (0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48 e 62 h), retire 500 μL do meio de liberação.
   7. Substitua o volume retirado por um volume igual de PBS pré-aquecido fresco (37°C) contendo 20% de FBS.
   8. Meça a concentração de colchicina nas amostras retiradas usando espectrofotometria UV–Vis a 345 nm.
   9. Realize todas as medições em triplicado.

6. Ensaios funcionais in vitro

1. Seme as células endoteliais da veia umbilical, humanas, (HUVECs). Estimule as células com 10 ng/mL fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) por 24 horas para aumentar o VCAM-1.
2. Associação celular de NPs MMM/DiI com HUVECs
   1. Incubar as células com NPs MMM/COL marcados com DiI (MMM/DiI NPs) em uma concentração de 50 μg/mL (com base na massa central do PLGA) por 4 horas a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO₂.
   2. Lave as células três vezes com PBS pré-resfriado. Centrifuge as células a 300 × g por 5 minutos a 4 °C após cada lavagem.
   3. Ressuspenda as células lavadas em PBS contendo 0,5% de albumina sérica bovina (BSA). Ajuste a concentração final da célula para 1 × 10⁶ células/mL.
   4. Defina os parâmetros do instrumento para citometria de fluxo ou CLSM. Detectar fluorescência DiI usando excitação a 549 nm e emissão a 565 nm (canal PE).
   5. Obtenha dados das amostras. Adquirir pelo menos 10.000 eventos por amostra para citometria de fluxo ou capturar campos representativos para CLSM.
   6. Selecione cinco campos representativos por amostra de regiões distintas, excluindo as bordas, usando uma lente de imersão em óleo de 60×. Certifique-se de que as células estejam intactas e sem sobreposição.
   7. Cegue as amostras antes da aquisição da imagem. Selecione campos movendo aleatoriamente o palco em vez de escolher manualmente áreas específicas.
   8. Aplicar parâmetros de limiar e análise idênticos a todas as amostras sob condições de cegueira.
   9. Exclua detritos celulares usando o rastreamento FSC-A/SSC-A. Selecione células singlete usando o rastreamento FSC-A/FSC-H.
   10. Selecione células vivas usando coloração com corante viável. Adicione 7-aminoactinomicina D (7-AAD) a 1 μg/mL, incube por 5 minutos a 4°C no escuro e use para o gating de células vivas.
   11. Analise a intensidade da fluorescência para quantificar a associação celular. Use a intensidade média de fluorescência como métrica de quantificação. Realize análise de dados usando o software de análise de citometria de fluxo FlowJo (v10.8.1).
3. Captação celular de NPs MMM/DiI por macrófagos RAW 264.7
   1. Incubar NPs MMM/COL marcados com DiI (MMM/DiI NPs) com macrófagos RAW 264,7 não modificados a uma concentração de 50 μg/mL (baseada na massa central do PLGA) por 4 horas a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO₂.
   2. Prepare as células para análise conforme descrito nos Passos 6.2.2–6.2.3.
   3. Defina parâmetros do instrumento para detecção de DiI usando excitação a 549 nm e emissão a 565 nm (canal PE).
   4. Obtenha dados das amostras. Adquira pelo menos 10.000 eventos por amostra.
   5. Exclua detritos celulares usando o rastreamento FSC-A/SSC-A. Selecione células singlete usando o rastreamento FSC-A/FSC-H.
   6. Selecione células vivas usando coloração com corante viável. Adicione 7-AAD a 1 μg/mL, incube por 5 minutos a 4 °C no escuro e use para o gating de células vivas.
   7. Analise a intensidade da fluorescência para quantificar a captação celular. Use a intensidade média de fluorescência como métrica de quantificação. Realize análise de dados usando software de análise de citometria de fluxo.
4. Ensaio com célula de espuma
   1. Diferencie as células RAW 264,7 em células de espuma incubando com lipoproteína oxidada de baixa densidade (oxLDL) a 50 μg/mL por 48 horas. Confirme a formação das células de espuma por coloração de óleo vermelho O, indicada pelo acúmulo intracelular de lipídios.
   2. Trate as células de espuma com colchicina livre, NPs COL ou NPs MMM/COL em concentração equivalente de colchicina de 1 μM. Incube as células por 24 horas a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂.
      NOTA: Selecione essa concentração com base em experimentos preliminares de dose-resposta que avaliaram a viabilidade celular e a eficácia anti-inflamatória.
   3. Meça os níveis de citocinas inflamatórias usando um ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA).
      1. Colete supernadantes em cultura celular imediatamente após o tratamento (24 horas após o tratamento).
      2. Centrifuge as placas a 300 × g por 5 minutos a 4°C para remover os detritos da célula.
      3. Transfira os supernadantes clarificados para tubos limpos e armazene a −80°C até a análise.
      4. Meça os níveis de TNF-α e interleucina-6 usando kits ELISA conforme as instruções do fabricante.
      5. Realize todas as medições em poços triplicados e repita o experimento três vezes independentemente.
      6. Relate as concentrações de citocinas como valores absolutos (pg/mL) sem normalização adicional, pois a densidade de semeadura celular e as condições de tratamento são consistentes em todos os grupos.

7. Aplicação terapêutica in vivo em um modelo de aterosclerose

NOTA: Todos os procedimentos com animais devem ser aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso dos Animais relevante.

1. Estabelecer modelo animal
   1. Estabeleça um modelo vulnerável de placa aterosclerótica em camundongos machos de 8 semanas com apolipoproteína E knockout (ApoE⁻/⁻) (C57BL/6 fundo).
   2. Alimente os camundongos com uma dieta rica em gordura, contendo 15% de gordura e 0,25% de colesterol ad libitum, por 1 semana antes da cirurgia e continue por 4 semanas após a cirurgia.
   3. Anestesiar camundongos com isoflurano (2%–3% para indução e 1,5%–2% para manutenção) e administrar buprenorfina (0,1 mg/kg, subcutânea) para analgesia durante cirurgia de constrição da artéria carótida.
   4. Constrição da artéria carótida comum esquerda usando uma agulha de 0,3 mm de diâmetro colocada ao lado da artéria. Amarre uma ligadura de seda 6-0 ao redor da artéria e da agulha, e depois remova a agulha para criar uma constrição parcial.
   5. Confirme a formação de placa vulnerável às 4 semanas após a cirurgia por meio de avaliação histológica.
   6. Realize Hematoxilina e Eosina (H&E), Oil Red O e a coloração tricroma de Masson para avaliar a morfologia da placa, deposição lipídica e teor de colágeno.
   7. Defina placas vulneráveis pela área da placa > 40% da área da seção transversal do vaso, espessura da tampa fibrosa < 120 μm, área do núcleo lipídico > 40% da área total da placa e infiltração substancial de macrófagos CD68-positivos.
2. Injetar 100 μL de NPs MMM/COL marcados com DiI por via intravenosa pela veia caudal em uma dose de 2 mg/kg (baseada na massa central do PLGA).
   1. Fotografe camundongos 1 dia após a injeção usando um sistema de imagem in vivo para avaliar a biodistribuição do corpo inteiro.
      1. Anestesiem camundongos com isoflurano (3% para indução e 1,5%–2% para manutenção, com fluxos de oxigênio de 1 e 0,5 L/min, respectivamente). Monitore a profundidade da anestesia pela frequência respiratória e pelo reflexo de beliscão do dedo.
      2. Posicione os camundongos em deitos em um palco aquecido a 37°C para manter a temperatura corporal durante a imagem.
      3. Adquira imagens de fluorescência usando configurações DiI (excitação 549 nm e emissão 565 nm) com um conjunto de filtros CY3 ou TRITC. Use o modo de autoexposição (tipicamente 50–200 ms) e a aquisição por epifluorescência.
      4. Capture imagens correspondentes de campo claro simultaneamente para referência anatômica, com resolução de 1024 × 1024 pixels.
   2. Colhe órgãos principais e artérias carótidas para imagens de fluorescência ex vivo.
      1. Anestesiar camundongos com isoflurano (3% para indução e 2,5%–3% para manutenção).
      2. Perfunda camundongos com 20 mL de PBS gelado (pH 7,4) por perfuração ventricular esquerda a uma vazão de 5 mL/min para remover sangue residual e NPs não ligados.
      3. Colhe órgãos (coração, aorta, fígado, baço, rim e pulmão) imediatamente após a perfusão, 24 horas após a injeção.
      4. Enxágue órgãos colhidos em PBS gelado para remover sangue superficial.
      5. Abra a aorta longitudinalmente e prenda-a plana (lado endotelial para cima) em uma placa preta de silicone usando pinos de aço inoxidável.
      6. Mantenha os tecidos em PBS gelado e realize imagens de fluorescência ex vivo dentro de 30 minutos após a colheita. Remova o excesso de PBS da superfície do tecido imediatamente antes da imagem.
3. Realizar dosagem e tratamento
   1. Determinar a dose de colchicina a partir do estudo preliminar dose-resposta (0,01–0,45 mg/kg, n = 7/grupo). Selecione 0,05 mg/kg de colchicina como dose terapêutica.
   2. Administrar 100 μL por injeção na veia caudal, correspondente a uma dose NP de 2 mg/kg (massa central de PLGA) e dose de colchicina de 0,05 mg/kg. Injete uma vez ao dia por 14 dias consecutivos.
   3. Randomize os camundongos em grupos de tratamento (PBS, colchicina livre e NPs MMM/COL) usando um gerador de números aleatórios. Realize todas as quantificações por dois observadores cegos para os grupos de tratamento.
   4. Aplique critérios humanos, incluindo >20% de perda de peso corporal, mobilidade reduzida ou sinais de sofrimento.
4. Realizar análise de endpoints
   1. Eutanasiar camundongos 24 horas após a injeção final. Colhe artérias carótidas e aortas. Avalie a carga de placas pela mancha de óleo vermelho O na face da aorta.
   2. Quantifique a área da placa
      1. Quantifique a área da placa como a porcentagem da área Oil Red O-positiva da área total do lúmen aórtico em seções transversais (cinco seções por camundongo) usando software de análise de imagem.
      2. Abra a imagem no software de análise de imagens ImageJ.
      3. Clique em Imagem → Digitar → 8 bits para converter a imagem em tons de cinza.
      4. Clique na imagem → ajustar → limiar. Selecione o método Otsu e aplique o limiar para identificar regiões Oil Red O-positivas.
      5. Aplique os mesmos parâmetros de limiar a todas as imagens de amostra e registre as configurações de limiar para verificação.
      6. Clique em Analisar → Definir Medidas e selecione Área.
      7. Clique em Analisar → Medir para quantificar as regiões selecionadas.
      8. Exporte os dados quantificados.
   3. Avalie a estabilidade da placa
      1. Avalie a estabilidade da placa por meio da coloração histológica das seções transversais carótidas usando H&E, Oil Red O e coloração tricromática de Masson. Quantifique o colágeno como a porcentagem da área azul tricromo-positiva de Masson na área da placa.
      2. Prepare seções embutidas em parafina com espessura de 5 μm e seções congeladas embutidas com temperatura de corte ideal com espessura de 8 μm.
      3. Realize a coloração H&E desparafinizando e reidratando seções, seguida de coloração por hematoxilina por 5 minutos e coloração com eosina por 2 minutos em temperatura ambiente (RT; 23°C ± 2°C).
      4. Realize a coloração com óleo vermelho O em seções congeladas incubando com solução de trabalho de óleo vermelho por 15 minutos em RT. Diferencie as seções em isopropanol a 60% por 2 s e enxágue com água destilada.
      5. Realize a coloração tricroma de Masson conforme as instruções do kit, incubando seções com hematoxilina de ferro de Weigert por 10 minutos, fucisina do ácido Ponceau por 5 minutos, ácido fosfomolíbdico por 5 minutos e azul de anilina por 5 minutos em RT.
      6. Imagens histológicas abertas em softwares de análise de imagens.
      7. Aplique limiar de cor para identificar regiões positivas para colágeno. Realize o thresholding automático e aplique os mesmos parâmetros a todas as imagens da amostra.
      8. Ajuste as configurações de limiar de registro para verificação.
      9. Defina a área total da placa como a soma de todas as áreas da placa dentro da íntima vascular.
      10. Meça a área da placa traçando manualmente os limites das placas ou usando segmentação automática de limiar para identificar todas as regiões da placa.
      11. Meça a área positiva para colágeno.
      12. Calcule o teor de colágeno como área positiva para colágeno dividida pela área total de placa × 100%.
   4. Avaliar o conteúdo de macrófagos
      1. Realize coloração por imunofluorescência CD68 para avaliar o conteúdo de macrófagos. Quantifique o conteúdo de macrófagos como a porcentagem da área da placa CD68 positiva.
      2. Prepare as seções de tecido (5 μm de espessura para seções embutidas em parafina). Realize a coleta de antígenos usando tampão de citrato (pH 6,0) sob alta pressão por 2 minutos.
      3. Bloco seções com 5% de BSA por 30 minutos em RT.
      4. Incubar seções com anticorpo primário monoclonal anti-camundongo CD68 (clone D4B9C, diluição 1:200 em 1% de BSA) durante a noite a 4°C.
      5. Incubar seções com anticorpo secundário anti-coelho IgG conjugado com Alexa Fluor 488 (diluição 1:500) por 1 hora em RT.
      6. Contra-colorir núcleos com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 5 minutos.
      7. Imagens de fluorescência abertas em softwares de análise de imagem.
      8. Identifique regiões CD68-positivas usando limiar. Realize o thresholding automático e aplique os mesmos parâmetros a todas as imagens da amostra.
      9. Ajuste as configurações de limiar de registro para verificação.
      10. Meça a área CD68-positiva.
      11. Calcule o conteúdo de macrófagos como área CD68-positiva dividida pela área total da placa × 100%.

Results

As medições DLS foram realizadas usando um sistema Zetasizer Nano ZS a 25°C com um ângulo de retroespalhamento de 173°. As amostras foram diluídas 20 vezes em água desionizada (concentração final de aproximadamente 0,1 mg/mL) e equilibradas por 2 minutos antes da medição. Cada amostra foi medida em triplicado, e os resultados são apresentados como média ± SD. DLS e TEM revelam um aumento no tamanho do NP após o revestimento da membrana e confirmam a formação de uma estrutura núcleo–casca...

Discussion

Este protocolo fornece um método abrangente para construir e aplicar NPs revestidos por membrana co-modificados CD47 e integrina α4/β1 para a terapia direcionada da aterosclerose. As principais vantagens desse sistema incluem o direcionamento ativo via interação integrina α4/β1–VCAM-1 e a redução da captação de macrófagos associada à sinalização mediada pelo CD47, conforme apoiado por ensaios de captação in vitro (Figura 3) e resultados de biodistribuição

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-Aminoactinomicina D (7-AAD)	Thermo Fisher Scientific (EUA)	A1310	Corante de viabilidade para discriminação viva/morta em citometria de fluxo
Alexa Fluor 488-conjugado para cabras anti-coelho IgG	Thermo Fisher Scientific (EUA)	A-11008	Anticorpo secundário para coloração por imunofluorescência CD68
Anticorpo anti-camundongo CD47	Abcam (EUA)	ab214453	Usado para análise de Western blot para verificar a expressão do CD47
Integrina anti-mouse e alfa; 4 anticorpos (B-2)	Santa Cruz Biotechnology (EUA)	SC-376334	Usado para análise de Western blot para verificar integrina e alfa; 4 Expressão
Integrina anti-mouse e beta; 1 anticorpo (A-4)	Santa Cruz Biotechnology (EUA)	SC-374429	Usado para análise de Western blot para verificar integrina e beta; 1 Expressão
ApoE-/- ratos	O Laboratório Jackson (EUA)	N/A	Usado para modelo de aterosclerose in vivo
Kit de ensaio BCA	Thermo Fisher Scientific (EUA)	23225	Usado para determinar a concentração de proteínas
Placa de silicone preta	N/A	N/A	Usado para montar aorta em imagem ex vivo
Plasmídeo CD47 (pcDNA3.1(+))	Generay Biotech (China)	G0177361-1	Contém o gene Cd47 do camundongo para superexpressão
Colchicina	Sigma-Aldrich (EUA)	C9754	Carga terapêutica em nanopartículas
Microscópio de varredura a laser confocal	Leica Microsystems	TCS SP8	Usado para imagens de fluorescência e análise de colocalização
Tampão de citrato (pH 6,0)	Thermo Fisher Scientific (EUA)	N/A	Usado para coleta de antígenos em coloração por imunofluorescência
Tubo de diálise (MWCO 3.500 Da)	Sigma-Aldrich (EUA)	PURD35030	Usado para purificação de nanopartículas
Dimetil sulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich (EUA)	D2447	Solvente para preparação de nanopartículas
DiI (1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-perclorato tetrametilindocarbocianina)	Beyotime (China)	C1036	Marcagem fluorescente do núcleo de nanopartículas
DiO (3,3′-octadeciloxacarbociacinato perclorato)	Beyotime (China)	C1038	Marcagem fluorescente da membrana dos macrófagos
DiR	Beyotime (China)	Y239280	Usado para imagens fluorescentes in vivo
DAPI	Thermo Fisher Scientific (EUA)	D3571	Contracoloração nuclear para imagem por fluorescência
Dulbecco' s Eagle Medium Modificado (DMEM)	Thermo Fisher Scientific (EUA)	11965092	Meio de cultura celular
Analisador de espalhamento dinâmico de luz (Zetasizer Nano ZS)	Malvern Panalytical (Reino Unido)	N/A	Usado para medições de espalhamento dinâmico da luz (DLS) do tamanho de nanopartículas, PDI e potencial zeta
Kit ELISA	R& D Systems (EUA)	Depende da citocina alvo	Usado para quantificar citocinas inflamatórias
Endotelina-1 (ET-1)	Sigma-Aldrich (EUA)	E7764	Usado para estimular integrina e alfa; 4/β 1 Expressão
Soro fetal bovino (FBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific, EUA)	10091148	Suplemento para meio de cultura celular
Citômetro de fluxo	BD em Biociências (EUA)	FACSCalibur	Usado para aquisição de sinais de fluorescência
Software de análise de citometria de fluxo (FlowJo v10.8.1)	BD em Biociências (EUA)	N/A	Utilizado para análise de dados de citometria de fluxo
Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs)	FuHeng Biotechnologies (China)	FH1122	Usado em ensaios de direcionamento in vitro
Software de análise de imagem (ImageJ)	Institutos Nacionais de Saúde (EUA)	N/A	Usado para análise quantitativa de imagens
Sistema de imagem in vivo	PerkinElmer (EUA)	IVIS Lumina III	Usado para imagem de fluorescência corporal inteira
Isopropanol (60%)	Sigma-Aldrich (EUA)	34863	Usado para diferenciação durante a coloração com Oil Red O
Lipofectamina 3000	Thermo Fisher Scientific (EUA)	L3000001	Reagente de transfecção
Agitador magnético e barra de agitação	N/A	N/A	Usado para preparação de nanopartículas
Masson' s Kit de tingimento tricromo	Abcam (EUA)	ab150686	Usado para coloração de colágeno
Mini extrusor	Lípidos polares Avanti (EUA)	610000	Usado para extrusão de membrana
Linha celular Murine RAW 264.7	FuHeng Biotechnologies (China)	FH0328	Origem dos macrófagos
Linha celular lisa do músculo murino	FuHeng Biotechnologies (China)	FH-Y063	Usado para avaliação de segurança
Oil Red O	Sigma-Aldrich (EUA)	O0625	Usado para coração de lipídios
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific (EUA)	31985062	Meio sérico reduzido para transfecção
Lipoproteína oxidada de baixa densidade (Ox-LDL)	Yiyuan Biotechnologies (China)	YB-002	Usado para induzir a formação de células de espuma
Penicilina– Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific (EUA)	15140122	Suplemento antibiótico para cultura celular
Fenilmetilsulfonil fluoreto (PMSF)	Sigma-Aldrich (EUA)	78830	Inibidor de protease
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific (EUA)	10010023	Lavagem e amortecedor de diluição
Poli(ácido lático-coglicólico) (PLGA, 50:50; MW 90.000)	Dalian Meilun Biotecnologia (China)	MB5649-1	Polímero para fabricação de nanopartículas
Filtros de membrana de policarbonato (200 nm, 400 nm)	Whatman (Reino Unido)	800282	Usado para extrusão
Cloreto de potássio (KCl)	Sigma-Aldrich (EUA)	P9333	Componente do buffer de lise
Reagente P3000	Thermo Fisher Scientific (EUA)	L3000001	Realçador de transfecção
Microtomo rotativo	Leica Biosystems (Alemanha)	RM2235	Usado para seccionamento com parafina
Bomba de seringa	Aparato de Harvard (EUA)	70-3007	Usado para formação controlada de nanopartículas
Microscópio eletrônico de transmissão (TEM)	Thermo Fisher Scientific (EUA)	Talos F200S	Usado para imagem de nanopartículas
Tris-HCl	Sigma-Aldrich (EUA)	T2663	Componente buffer
Fator de necrose tumoral alfa (TNF-&alfa;)	R& D Systems (EUA)	410-MT	Usado para ativar células endoteliais
Água ultrapura	Milli-Q (Merck, EUA)	ZMQSV0T01	Usado para preparação de nanopartículas e diálise