Isolamento, Síntese e Caracterização de Nanopartículas Poli(ácido lático-coglicólico) revestidas com membrana de Macrófagos CD47 e Integrina α4/β1

Summary

Esse protocolo permite a preparação e caracterização de nanopartículas de poli(ácido lático-coglicólico) revestidas de membrana CD47 e integrina α4/β1 para aplicações direcionadas de entrega de fármacos.

Abstract

A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica e um dos principais fatores que contribuem para a morbidade e mortalidade cardiovascular. A entrega direcionada de agentes anti-inflamatórios aos locais ateroscleróticos continua sendo um desafio significativo. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a preparação e caracterização de nanopartículas de membrana revestidas com colchicina (MMM/COL) com CD47 e integrina α4/β1 co-modificadas por membrana de macrófagos (MMM/COL NPs). O protocolo inclui modificação de macrófagos por transfecção de plasmídeos e estimulação com endotelina-1, isolamento de membrana, fabricação de NP e revestimento de membrana. Os NPs MMM/COL resultantes são avaliados usando caracterização fisicoquímica, análise de expressão proteica e ensaios in vitro e in vivo . A validação funcional inclui avaliação da associação celular com células endoteliais ativadas, captação de macrófagos, efeitos anti-inflamatórios em células de espuma e biodistribuição em um modelo murino de aterosclerose. Além disso, parâmetros experimentais chave e etapas de controle de qualidade são destacados para garantir reprodutibilidade e consistência entre os laboratórios. Esse protocolo oferece uma abordagem robusta e escalável para gerar NPs biomiméticos para aplicações direcionadas de entrega de medicamentos em pesquisas de aterosclerose.

Introduction

Aterosclerose é uma doença inflamatória crônica que leva a eventos cardiovasculares fatais e AVC por meio de estenose do lúmen arterial e ruptura instável de placas, responsável por uma carga significativa de saúde^{global 1,2,3}. A regulação negativa das respostas inflamatórias no local aterosclerótico é um alvo terapêutico principal ^4,5. A colchicina, um potente anti-inflamatório, tem mostrado potencial na redução de eventos cardiovasculares^{adversos 6,7}

Protocol

Todos os procedimentos com animais descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais do Hospital Torre Drum de Nanjing e seguiram as diretrizes para o cuidado e uso de animais de laboratório estabelecidas pelos Institutos Nacionais de Saúde.

1. Modificação dos macrófagos RAW 264.7

1. Preparar as células RAW 264,7, completar o Meio Eagle Modificado de Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina–estreptomicina, plasmídeo de superexpressão CD47, reagente de transfecção Lipofectamina 3000, endotelina-1 (ET-1)....

Results

As medições DLS foram realizadas usando um sistema Zetasizer Nano ZS a 25°C com um ângulo de retroespalhamento de 173°. As amostras foram diluídas 20 vezes em água desionizada (concentração final de aproximadamente 0,1 mg/mL) e equilibradas por 2 minutos antes da medição. Cada amostra foi medida em triplicado, e os resultados são apresentados como média ± SD. DLS e TEM revelam um aumento no tamanho do NP após o revestimento da membrana e confirmam a formação de uma estrutura núcleo–casca.......

Discussion

Este protocolo fornece um método abrangente para construir e aplicar NPs revestidos por membrana co-modificados CD47 e integrina α4/β1 para a terapia direcionada da aterosclerose. As principais vantagens desse sistema incluem o direcionamento ativo via interação integrina α4/β1–VCAM-1 e a redução da captação de macrófagos associada à sinalização mediada pelo CD47, conforme apoiado por ensaios de captação in vitro (Figura 3) e resultados de biodistribuição

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-Aminoactinomicina D (7-AAD)	Thermo Fisher Scientific (EUA)	A1310	Corante de viabilidade para discriminação viva/morta em citometria de fluxo
Alexa Fluor 488-conjugado para cabras anti-coelho IgG	Thermo Fisher Scientific (EUA)	A-11008	Anticorpo secundário para coloração por imunofluorescência CD68
Anticorpo anti-camundongo CD47	Abcam (EUA)	ab214453	Usado para análise de Western blot para verificar a expressão do CD47
Integrina anti-mouse e alfa; 4 anticorpos (B-2)	Santa Cruz Biotechnology (EUA)	SC-376334	Usado para análise de Western blot para verificar integrina e alfa; 4 Expressão
Integrina anti-mouse e beta; 1 anticorpo (A-4)	Santa Cruz Biotechnology (EUA)	SC-374429	Usado para análise de Western blot para verificar integrina e beta; 1 Expressão
ApoE-/- ratos	O Laboratório Jackson (EUA)	N/A	Usado para modelo de aterosclerose in vivo
Kit de ensaio BCA	Thermo Fisher Scientific (EUA)	23225	Usado para determinar a concentração de proteínas
Placa de silicone preta	N/A	N/A	Usado para montar aorta em imagem ex vivo
Plasmídeo CD47 (pcDNA3.1(+))	Generay Biotech (China)	G0177361-1	Contém o gene Cd47 do camundongo para superexpressão
Colchicina	Sigma-Aldrich (EUA)	C9754	Carga terapêutica em nanopartículas
Microscópio de varredura a laser confocal	Leica Microsystems	TCS SP8	Usado para imagens de fluorescência e análise de colocalização
Tampão de citrato (pH 6,0)	Thermo Fisher Scientific (EUA)	N/A	Usado para coleta de antígenos em coloração por imunofluorescência
Tubo de diálise (MWCO 3.500 Da)	Sigma-Aldrich (EUA)	PURD35030	Usado para purificação de nanopartículas
Dimetil sulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich (EUA)	D2447	Solvente para preparação de nanopartículas
DiI (1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-perclorato tetrametilindocarbocianina)	Beyotime (China)	C1036	Marcagem fluorescente do núcleo de nanopartículas
DiO (3,3′-octadeciloxacarbociacinato perclorato)	Beyotime (China)	C1038	Marcagem fluorescente da membrana dos macrófagos
DiR	Beyotime (China)	Y239280	Usado para imagens fluorescentes in vivo
DAPI	Thermo Fisher Scientific (EUA)	D3571	Contracoloração nuclear para imagem por fluorescência
Dulbecco' s Eagle Medium Modificado (DMEM)	Thermo Fisher Scientific (EUA)	11965092	Meio de cultura celular
Analisador de espalhamento dinâmico de luz (Zetasizer Nano ZS)	Malvern Panalytical (Reino Unido)	N/A	Usado para medições de espalhamento dinâmico da luz (DLS) do tamanho de nanopartículas, PDI e potencial zeta
Kit ELISA	R& D Systems (EUA)	Depende da citocina alvo	Usado para quantificar citocinas inflamatórias
Endotelina-1 (ET-1)	Sigma-Aldrich (EUA)	E7764	Usado para estimular integrina e alfa; 4/β 1 Expressão
Soro fetal bovino (FBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific, EUA)	10091148	Suplemento para meio de cultura celular
Citômetro de fluxo	BD em Biociências (EUA)	FACSCalibur	Usado para aquisição de sinais de fluorescência
Software de análise de citometria de fluxo (FlowJo v10.8.1)	BD em Biociências (EUA)	N/A	Utilizado para análise de dados de citometria de fluxo
Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs)	FuHeng Biotechnologies (China)	FH1122	Usado em ensaios de direcionamento in vitro
Software de análise de imagem (ImageJ)	Institutos Nacionais de Saúde (EUA)	N/A	Usado para análise quantitativa de imagens
Sistema de imagem in vivo	PerkinElmer (EUA)	IVIS Lumina III	Usado para imagem de fluorescência corporal inteira
Isopropanol (60%)	Sigma-Aldrich (EUA)	34863	Usado para diferenciação durante a coloração com Oil Red O
Lipofectamina 3000	Thermo Fisher Scientific (EUA)	L3000001	Reagente de transfecção
Agitador magnético e barra de agitação	N/A	N/A	Usado para preparação de nanopartículas
Masson' s Kit de tingimento tricromo	Abcam (EUA)	ab150686	Usado para coloração de colágeno
Mini extrusor	Lípidos polares Avanti (EUA)	610000	Usado para extrusão de membrana
Linha celular Murine RAW 264.7	FuHeng Biotechnologies (China)	FH0328	Origem dos macrófagos
Linha celular lisa do músculo murino	FuHeng Biotechnologies (China)	FH-Y063	Usado para avaliação de segurança
Oil Red O	Sigma-Aldrich (EUA)	O0625	Usado para coração de lipídios
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific (EUA)	31985062	Meio sérico reduzido para transfecção
Lipoproteína oxidada de baixa densidade (Ox-LDL)	Yiyuan Biotechnologies (China)	YB-002	Usado para induzir a formação de células de espuma
Penicilina– Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific (EUA)	15140122	Suplemento antibiótico para cultura celular
Fenilmetilsulfonil fluoreto (PMSF)	Sigma-Aldrich (EUA)	78830	Inibidor de protease
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific (EUA)	10010023	Lavagem e amortecedor de diluição
Poli(ácido lático-coglicólico) (PLGA, 50:50; MW 90.000)	Dalian Meilun Biotecnologia (China)	MB5649-1	Polímero para fabricação de nanopartículas
Filtros de membrana de policarbonato (200 nm, 400 nm)	Whatman (Reino Unido)	800282	Usado para extrusão
Cloreto de potássio (KCl)	Sigma-Aldrich (EUA)	P9333	Componente do buffer de lise
Reagente P3000	Thermo Fisher Scientific (EUA)	L3000001	Realçador de transfecção
Microtomo rotativo	Leica Biosystems (Alemanha)	RM2235	Usado para seccionamento com parafina
Bomba de seringa	Aparato de Harvard (EUA)	70-3007	Usado para formação controlada de nanopartículas
Microscópio eletrônico de transmissão (TEM)	Thermo Fisher Scientific (EUA)	Talos F200S	Usado para imagem de nanopartículas
Tris-HCl	Sigma-Aldrich (EUA)	T2663	Componente buffer
Fator de necrose tumoral alfa (TNF-&alfa;)	R& D Systems (EUA)	410-MT	Usado para ativar células endoteliais
Água ultrapura	Milli-Q (Merck, EUA)	ZMQSV0T01	Usado para preparação de nanopartículas e diálise