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Artigo de investigação

P. gingivalis/F. nucleatum em periodontite apical crônica estão associados ao encurtamento gestacional via TLR4/MyD88/NF-κB

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DOI:

10.3791/70793

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15 de maio de 2026

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1Department of Cariology and Endodontics, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, The Affiliated Stomatology Hospital of Xinjiang Medical University, 2Development and Related Diseases of Women and Children Key Laboratory of Sichuan Province, 3Stomatology Disease Institute of Xinjiang Uyghur Autonomous Region, Xinjiang Medical University, 4Department of Endodontics, Urumqi Stomatological Hospital, 5Department of Obstetrics and Gynecology, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University

Neste artigo

Resumo

Patógenos orais associados à periodontite apical crônica (P. gingivalis, F. nucleatum) são avaliados usando modelos murinos de PAC e ensaios de infecção por trofoblastos humanos. O encurtamento gestacional é observado junto com a ativação inflamatória placentária consistente com a sinalização TLR4/MyD88/NF-κB. O DNA bacteriano é detectável em tecidos placentários/vasculares, apoiando um elo hematógeno e potenciais alvos de intervenção.

Resumo

O parto prematuro espontâneo (sPTB; parto antes das 37 semanas) continua sendo uma das principais causas de mortalidade neonatal, e a infecção intrauterina está implicada em uma proporção substancial dos casos. Evidências emergentes relacionam patógenos orais como Porphyromonas gingivalis e Fusobacterium nucleatum a desfechos gestacionais adversos; no entanto, as vias mecanicistas que conectam a periodontite apical crônica (CAP) ao risco gestacional permanecem incompletamente. Em camundongos C57BL/6J grávidos, a PAC foi estabelecida por inoculação de canal e complementada por um modelo de desafio cauda-veia usando suspensões bacterianas (1 × 108 CFU/mL). O comprimento gestacional, histopatologia placentária, marcadores inflamatórios e sinais de DNA bacteriano foram avaliados por qPCR. Paralelamente, trofoblastos humanos foram expostos a P. gingivalis ou F. nucleatum (MOI = 50, 24 h) para examinar a sinalização inflamatória consistente com a ativação do eixo TLR4/MyD88/NF-κB. Em relação aos controles, os grupos associados à PAC apresentaram encurtamento gestacional (mediana 19,5 vs 20,5 dias), acompanhada por aumento das leituras inflamatórias placentárias (incluindo elevados IL-1β e TNF-α) e características histopatológicas consistentes com lesão inflamatória. A qPCR indicou ainda a presença de sinais de DNA bacteriano nos tecidos placentários e vasculares. Em ensaios de trofoblastos, F. nucleatum provocou respostas pró-inflamatórias mais fortes do que P. gingivalis, em associação com aumento da fosforilação de NF-κB. Coletivamente, esses achados sugerem que patógenos orais associados à PAC podem contribuir para o encurtamento gestacional ao impulsionar a inflamação placentária por meio da sinalização TLR4/MyD88/NF-κB, apoiando um eixo microbiano oral-placentário como um alvo potencial para mitigar o risco gestacional relacionado à infecção.

Introdução

O parto prematuro espontâneo (SBPT) é definido como o parto ocorrendo entre 20 e 37 semanas de gestação, sem intervençãomédica 1. Como uma preocupação crítica de saúde pública global, a incidência de sPTB varia de aproximadamente 5%–9% em países desenvolvidos até 12%–18% em regiões com recursoslimitados 2,3. O parto prematuro e suas complicações continuam sendo uma das principais causas de mortalidade em crianças menores de 5 anos, representando aproximadamente um milhão de mortes neonataisanualmente. Sobreviventes frequentemente apresentam complicações imediatas, como síndrome do desconforto respiratório, e sequelas de longo prazo, incluindo paralisia cerebral e atrasosno desenvolvimento 5,6, impondo assim cargas econômicas substanciais às famílias e àsociedade 7,8.

A etiologia da SBT é multifatorial, refletindo interações entre fatores maternos, fetais e ambientais, incluindo disfunção contrátil uterina, insuficiência cervical, distúrbios endócrinos, distúrbios placentários e infecçãointrauterina 9. A infecção intrauterina é reconhecida como um dos principais fatores e estima-se que represente aproximadamente 30%–40% dos casos de partoprematuro 10,11. Patógenos podem acessar a cavidade amniótica por vias ascendentes (por exemplo, cervicovaginais) ou hematógenas, ativando respostas imunes do hospedeiro e promovendo a liberação de citocinas pro-inflamatórias (por exemplo, IL-6, TNF-α) e prostaglandinas que podem precipitar oparto 12. Trofoblastos, como componentes celulares-chave da interface materno-fetal, contribuem para a tolerância imunológica, bem como para a defesaantimicrobiana 13.

Migrorganismos orais, incluindo Porphyromonas gingivalis e Fusobacterium nucleatum, têm sido implicados em processos inflamatórios relacionados à sPTB, potencialmente por meio de bacteriemia e/ou disseminação de mediadoresinflamatórios 14. Essas espécies são patógenos periodontonais estabelecidos, e associações entre periodontite e sPTB foram relatadas em estudos epidemiológicos eclínicos 15,16,17. Notavelmente, P. gingivalis e F. nucleatum também são frequentemente detectados na periodontite apical crônica (CAP)18,19, mas a relação entre a PAC e os desfechos gestacionais adversos permanece relativamente pouco estudada, e as vias biológicas relevantes não são totalmentedefinidas 20. Harjunmaa et al. relataram pela primeira vez uma associação entre periodontite apical e redução do comprimento gestacional e baixo peso ao nascer em 201521. Um estudo de acompanhamento com a mesma coorte não apoiou transferência bacteriana direta para a placenta, sugerindo que a inflamação sistêmica pode representar uma ligação plausível entre periodontite apical e desfechos dagravidez 22. De acordo com essa interpretação, a periodontite apical radiograficamente confirmada tem sido associada a um risco elevado de partos prematuros com baixo pesoao nascer 23. Como uma infecção oculta persistente, a PAC pode contribuir para o risco gestacional por meio de inflamação sistêmica crônica de baixo grau e/ou exposição hematógena a componentesmicrobianos 24,25. Portanto, é necessário um esclarecimento adicional da relação CAP–gestação para refinar a compreensão das vias inflamatórias orais-placentárias e para informar estratégias de prevenção para o risco gestacional relacionado à infecção.

Estudos recentes destacaram a relevância do eixo de sinalização TLR4/MyD88/NF-κB no parto prematuro associado à inflamação. Robertson et al. identificaram o TLR4 como um potencial alvo terapêutico no trabalho de parto prematuro induzido por inflamação e relataram efeitos preventivos em modelosanimais 26. Peng et al. também mostraram que miR-199a-3p atenua a inflamação epitelial cervical por meio da supressão da via HMGB1/TLR4/NF-κB 27. Além disso, Shen et al. descreveram efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios da seringinha em ratos grávidas diabéticos, com a modulação da via TLR4/MyD88/NF-κB implicada nas melhoriasobservadas 28. Juntos, esses achados apoiam uma estrutura mecanicista na qual a sinalização inflamatória ligada a TLR4/MyD88/NF-κB contribui para vias associadas à infecção que influenciam o parto, ao mesmo tempo em que reconhecem que múltiplos receptores imunes inatos podem atuar em paralelo dependendo do contexto do patógeno.

O presente estudo avalia os efeitos gestacionais associados à PAC utilizando ensaios complementares in vitro de trofoblastos e modelos murinos in vivo . O modelo trofoblasto permite a interrogação controlada da sinalização inflamatória induzida pelo patógeno, enquanto o modelo CAP murino grávido conecta respostas celulares a fenótipos de gravidez em nível de organismo sob condições gestacionais fisiológicas. Um modelo de desafio da veia caudal está incluído para fornecer uma rota complementar de exposição hematógena e para avaliar se padrões de ativação inflamatória observados no ambiente de infecção oral são recapitulados quando componentes bacterianos acessam a circulação materna. Especificamente, a exposição a trofoblastos a P. gingivalis e F. nucleatum é usada para perfilar respostas de citocinas e ativação do eixo TLR4/MyD88/NF-κB, enquanto experimentos em animais avaliam o comprimento gestacional, inflamação placentária e a detecção baseada em qPCR de sinais de DNA bacteriano na bifurcação carótida e tecidos placentários. Como a qPCR indica a presença de DNA bacteriano em vez de viabilidade ou localização celular, as interpretações sobre a presença microbiana na interface materno-fetal permanecem cautelosas. Além disso, diferenças entre espécies e exposição experimental controlada podem limitar a tradução clínica direta, ressaltando a necessidade de validação subsequente em contextos relevantes para humanos.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes éticas estabelecidas pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Xinjiang (Aprovação nº: IACUC-20231121-13) e de acordo com o guia dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) para o cuidado e uso de animais de laboratório (edição de 2011). Além disso, este estudo foi realizado de acordo com as diretrizes do ARRIVE. Todos os suprimentos (reagentes, consumíveis, equipamentos e software) e suas informações de fabricante e números de catálogo correspondentes são fornecidos na Tabela de Materiais para facilitar a reprodutibilidade.

1. Cultura bacteriana

Cepas de referência de Porphyromonas gingivalis e Fusobacterium nucleatum (identificadores de cepas fornecidos na Tabela de Materiais) foram manuseadas sob condições anaeróbicas. Culturas primárias foram estabelecidas em placas de ágar sanguíneo pré-reduzidas de Columbia e incubadas anaeróbicamente (85% N₂, 10% H₂ e 5% CO₂) a 37 °C por 48 horas. Para preparações experimentais, uma única colônia bem isolada foi inoculada em caldo de infusão cardíaca cerebral de 40 mL e incubada sob condições anaeróbicas idênticas até o crescimento da fase logarítima (OD660 = 0,6–0,8). Para minimizar a exposição ao oxigênio, etapas de inoculação e transferência foram realizadas dentro de uma estação de trabalho anaeróbia usando meios e ferramentas pré-reduzidas. As concentrações bacterianas foram padronizadas para 1 ×10 8 CFU/mL para exposição animal usando quantificação baseada em OD660 com uma curva padrão OD–CFU específica para cepa gerada sob as mesmas condições de cultura; A curva de calibração foi estabelecida por diluição serial e contagem de colônias em placas de ágar anaeróbicas com pelo menos três calibrações independentes. Para os estudos de infecção por trofoblastos, suspensões bacterianas foram quantificadas usando um método de enumeração validado e diluídas em meio de cultura completa sem antibióticos para alcançar a multiplicidade de infecção (MOI) especificada imediatamente antes da cocultura.

2. Habitação e agrupamento de animais

Camundongos C57BL/6J livres de patógenos específicos (n = 90; 60 fêmeas, 30 machos) com idades entre 6 e 7 semanas foram alojados sob condições controladas (22 °C ± 2 °C, 60% ± 10% de umidade, ciclo de luz de 12 horas) com acesso ad libitum a comida e água. Após 1 semana de aclimatação, os camundongos foram alocados aleatoriamente em seis grupos experimentais (n = 15/grupo): controle normal (NC), CAP com P. gingivalis (AP), CAP com F. nucleatum (FA), injeção normal de soro fisiológico na veia caudal (VN), injeção da veia caudal de P. gingivalis (VP) e injeção da veia caudal de F. nucleatum (VF). A randomização e a alocação da gaiola foram registradas para minimizar o viés de alocação e os potenciais efeitos da gaiola.

3. Estabelecimento do modelo PAC

Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados em condições assépticas. A anestesia foi induzida pela administração intraperitoneal de pentobarbital sódico (1,62 mg/30 g de peso corporal) combinada com sulfato de atropina (12,5 μg/30 g de peso corporal), e a profundidade anestésica adequada foi confirmada pela ausência do reflexo de retirada do pedal. Os camundongos foram posicionados em deitos sobre uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal, e a boca foi suavemente aberta para permitir uma visualização estável dos primeiros molares bilaterais da maxilar. Sob ampliação, as câmaras pulpares dos primeiros molares bilaterais da maxilar foram abertas usando uma fresa redonda estéril, seguidas pela remoção do tecido polpar coronal com microinstrumentos estéreis. Os orifícios de canal foram identificados usando uma pequena lima endodôntica (tamanho 06–10), e os canais foram negociados suavemente para alcançar a permeabilidade, evitando força excessiva e minimizando o risco de perfuração. A câmara era enxaguada com soro salino estéril (ou PBS estéril) e seca com pontas de papel estériles antes da inoculação.

A inoculação bacteriana foi realizada usando uma suspensão padronizada a 1 × 108 UFC/mL. Para tornar a dosagem reprodutível, o volume administrado foi fixado operacionalmente em 2 μL por dente (aproximadamente 2 × 105 CFU por dente), administrado usando uma ponta calibrada de micropipeta posicionada na entrada da câmara. Uma ponta de papel absorvente estéril pré-embebida com a mesma suspensão era então colocada na câmara de polpa para manter a exposição localizada. O parto bem-sucedido foi confirmado pela humidade visível da ponta do papel e pela ausência de vazamento na cavidade oral. Após a inoculação, a câmara era seca ao ar até que não restasse líquido visível, depois selada com um adesivo dental curado à luz (20 s), seguida por restauração usando um compósito de resina fluida curado à luz (20 s). A integridade do selo foi confirmada por inspeção visual e sondagem suave; Restaurações que apresentavam lacunas ou perdas iniciais eram imediatamente revedadas. Analgesia pós-procedimental e monitoramento foram fornecidos de acordo com as orientações institucionais de cuidado animal.

Duas semanas depois, foram obtidas radiografias periapicais para confirmar o estabelecimento da CAP. O estabelecimento bem-sucedido foi definido por uma radiolucência periapical clara, com alterações ósseas ao redor consistentes com inflamação periapical crônica e destruição óssea. O acasalamento foi iniciado duas semanas após a infecção/estabelecimento do modelo.

4. Estabelecimento do modelo de injeção de veias caudais

As suspensões bacterianas foram preparadas a uma concentração de 1 × 108 CFU/mL em soro fisiológico estéril. Os camundongos eram contidos, e a cauda era aquecida por 1–2 minutos para dilatar as veias laterais da cauda. As injeções eram realizadas usando uma agulha de calibre fino (tipicamente 29–30 G) inserida com um bisel na veia lateral da cauda em um ângulo raso (aproximadamente 10–15°). A colocação correta da intravenosa foi confirmada por um lampejo de sangue no centro e infusão suave com baixa resistência; A colocação não bem-sucedida foi indicada por aumento da resistência e/ou formação de uma bolha subcutânea, caso em que a infusão foi interrompida e repetida em um local mais próximo após breve reaquecimento. Os camundongos receberam injeções diárias por três dias consecutivos (100 μL por camundongo a cada vez). Após três dias, as mulheres foram alojadas com os homens, e os plugs vaginais foram verificados na manhã seguinte. Após a confirmação dos plugs vaginais (DG 0,5), as injeções foram aplicadas a cada três dias (100 μL por camundongo cada vez) até o dia 15 da gestação.

5. Estabelecimento do modelo de camundongo grávido

Fêmea e macho foram co-hospedados em proporção de 2:1 (fêmea:macho) durante a noite, começando às 20:00 de cada dia. A presença de um tampão vaginal ou de um esfregaço vaginal espermatopositivo às 08:00 da manhã seguinte foi designada como dia gestacional (DG) 0,5. Para cada camundongo, foram registrados o peso corporal inicial, o peso do prepartum, o peso pós-parto, o comprimento gestacional, o peso ao nascer neonatal, o tamanho da ninhada e o número de natimortos. Com base em estudosanteriores 29,30, o parto ocorrido antes do dia de 18,5 foi definido operacionalmente como parto prematuro em camundongos. Como o encurtamento gestacional pode ocorrer dentro da faixa do termo, os desfechos da gravidez foram interpretados com atenção à distinção entre fenótipos de parto pré-termo verdadeiro e fenótipo de encurtamento gestacional.

6. Coleta e processamento de amostras

No 15º dia gestacional, três camundongos grávidos por grupo foram selecionados aleatoriamente para amostragem placentária e vascular (NC/AP/AF e VN/VP/VF). Após anestesia induzida por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (1,62 mg por 30 g de peso corporal) e sulfato de atropina (12,5 μg por 30 g de peso corporal), amostras de sangue foram obtidas por sangramento retroorbital. Os camundongos eram eutanasiados em uma câmara de dióxido de carbono até que a morte fosse confirmada por ausência de respiração, batimentos cardíacos e reflexo corneano; A entrega de dióxido de carbono seguiu uma abordagem gradual de preenchimento consistente com as orientações institucionais de bem-estar animal. A bifurcação da artéria carótida e os tecidos placentários foram coletados rapidamente com instrumentos estéreis para reduzir a contaminação por amostras cruzadas. O tecido placentário foi dividido em duas porções: uma porção foi armazenada a −80 °C, e a outra porção foi fixada em formalina tampão neutro a 10% por 24 horas, seguida por desidratação graduada com etanol e incorporação de parafina. Os camundongos restantes foram monitorados quanto ao peso corporal diário, duração gestacional, tamanho da ninhada e peso ao nascer neonatal.

7. Cultura celular e tratamento

A linhagem celular de trofoblastos humanos HTR-8/SVneo foi cultivada em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino inativado por calor a 37 °C e 5% de CO₂. Para experimentos de infecção, células HTR-8/SVneo (1 × 106 células) em fase de crescimento logarítmico foram semeadas em placas de 6 poços e deixadas aderir durante a noite. Antes do desafio bacteriano, o meio foi substituído por meio completo sem antibióticos para evitar efeitos antibacterianos durante a co-cultura. Suspensões bacterianas de P. gingivalis ou F. nucleatum foram adicionadas a MOI = 50, e cada poço foi ajustado para um volume final de 2,5 mL usando meio de cultivo completo. As placas foram incubadas por 24 horas. Os supernadantes foram coletados às 24 horas e clarificados por centrifugação breve para remover detritos antes da medição das citocinas. As células aderentes foram lavadas duas vezes com PBS estéril para remover bactérias não aderentes e processadas imediatamente para extração de RNA ou proteína, de acordo com os fluxos de trabalho descritos abaixo.

8. Análise histológica da placenta do camundongo

Os tecidos placentários foram fixados em formalina tampão neutro a 10% por 24 horas, embutidos em parafina, e seccionados com espessura de 4,5 μm. Coloração rotineira de hematoxilina e eosina (H&E) foi realizada para examinar a morfologia placentária. Para a coloração imuno-histoquímica, a localização do antígeno foi visualizada usando um substrato peroxidase cromogênico produzindo depósitos marrons em sítios positivos, seguida de contracoloração com hematoxilina. Controles negativos foram realizados substituindo anticorpos primários por soro não imune.

Para aumentar a reprodutibilidade e a transparência, a avaliação imunohistoquímica utilizou uma abordagem pré-especificada de pontuação semi-quantitativa. A intensidade da coloração foi classificada como 0 (nenhuma), 1 (fraca), 2 (moderada) ou 3 (forte), e a porcentagem de células positivas foi pontuada como 0 (<5%), 1 (5–25%), 2 (26–50%), 3 (51–75%) ou 4 (>75%). Uma pontuação de imunorreatividade foi calculada multiplicando a intensidade e as porcentagens para cada área. Para cada placenta, pelo menos cinco campos de alta potência não sobrepostos de regiões anatômicas comparáveis foram pontuados. A pontuação foi realizada de forma independente por dois observadores cegados à alocação de grupos, e os desentendimentos foram resolvidos por revisão conjunta.

9. Detecção quantitativa em tempo real por PCR de sinais de DNA bacteriano na bifurcação da carótida e placenta do camundongo

O DNA do tecido foi extraído usando um fluxo de trabalho de extração de DNA de tecido baseado em coluna de sílica. Lisados de tecido foram clarificados por centrifugação a 12.000 × g por 5 minutos a 20–25 °C, e os supernadantes foram aplicados em colunas de sílica para ligação ao DNA por centrifugação a 12.000 × g por 1 minuto a 20–25 °C. As etapas de lavagem foram realizadas de acordo com o fluxo de trabalho, com cada lavagem seguida pela centrifugação a 12.000 × g por 1 minuto a 20–25 °C. Uma centrifugação seca final foi realizada a 12.000 × g por 2 minutos a 20–25 °C para remover o etanol residual. O DNA foi eludido em tampão de elução de 50 μL após uma incubação de 2 minutos a 20–25 °C e coletado por centrifugação a 12.000 × g por 1 minuto a 20–25 °C. O DNA genômico bacteriano foi extraído usando um fluxo de trabalho de extração de DNA bacteriano baseado em coluna de sílica, usando os mesmos parâmetros de centrifugação de ligação/lavagem/centrifugação seca/elução, a menos que o fluxo de trabalho exija o contrário.

A concentração e pureza do DNA foram medidas usando um quantificador de ácido nucleico em microvolume, e a integridade foi avaliada por eletroforese em gel de agarose. Amostras de DNA qualificadas foram armazenadas a –20 °C para análise subsequente. Os genes bacterianos alvo foram amplificados e clonados usando primers listados na Tabela Suplementar 1, com condições de PCR detalhadas nas Tabelas Suplementares 2 e Tabela Suplementar 3. As faixas-alvo amplificadas foram purificadas, clonadas de acordo com as especificações da Tabela Suplementar 4 e transformadas em células competentes de Escherichia coli DH5α. Cepas contendo plasmídeo recombinante foram verificadas para garantir sequências de inserção corretas, e DNA plasmídico foi extraído para preparação padrão. Curvas padrão foram geradas pela realização de qPCR em padrões de plasmídeos serialmente diluídos contendo fragmentos gênicos bacterianos alvo. Os sinais de DNA bacteriano P. gingivalis 16S e F. nucleatum 16S em amostras de bifurcação carotídea e placentária foram detectados quantitativamente por PCR em tempo real, com números de cópias de DNA calculados a partir dos valores de Ct usando a curva padrão. Sistemas e programas de reação são detalhados na Tabela Suplementar 5 e na Tabela Suplementar 6, respectivamente. Como a qPCR indica sinais de DNA bacteriano em vez de viabilidade ou localização celular, as interpretações sobre a presença microbiana na interface materno-fetal permanecem cautelosas.

10. Detecção de fatores inflamatórios por ELISA em amostras de soro de camundongos e supernadantes em cultura celular

Todos os reagentes e amostras foram equilibrados à temperatura ambiente antes do teste. Os níveis séricos de TNF-α e IL-1β foram medidos usando fluxos de trabalho ELISA em camundongos, e os níveis de TNF-α e IL-1β em supernadadores em culturas celulares foram determinados usando fluxos de trabalho ELISA humanos, seguindo os procedimentos do kit. Padronizações e amostras foram medidas em poços duplicados, e curvas padrão foram geradas para cada placa. Duplicados técnicos foram calculados em média para obter um valor por replicação biológica.

11. Outras análises de biologia molecular

Para qRT-PCR, o RNA total foi extraído de células cultivadas usando um fluxo de trabalho de extração de RNA baseado em fenol-clorofórmio. Após a separação de fases, a fase aquosa foi clarificada por centrifugação a 12.000 × g por 10 minutos a 4 °C, e o RNA foi precipitado, lavado e ressuspenso conforme o fluxo de trabalho. A concentração de RNA foi medida usando um analisador de ácidos nucleicos, e a integridade do RNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose. A transcrição reversa foi realizada para gerar cDNA, e PCR quantitativa em tempo real foi usada para quantificar os níveis de TNF-α e IL-1β de mRNA. As sequências de estúpidos estão listadas na Tabela Suplementar 7, as misturas de reação na Tabela Suplementar 8 e os programas de reação na Tabela Suplementar 9.

Para Western bloting, lisados proteicos de tecidos placentários de camundongos ou células trofoblastas foram clarificados por centrifugação a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C, quantificados e submetidos a SDS-PAGE, seguido por transferência de membrana e detecção baseada em anticorpos usando um fluxo de trabalho de imagem por fluorescência. A carga igual de proteína foi definida em 30 μg por pista. Imagens originais de membrana não recortadas, incluindo marcadores de peso molecular, foram mantidas para todas as manchas apresentadas nas figuras e estão disponíveis DOI: 10.57760/sciencedb.28254. Salvo especificação em contrário, "n" refere-se a réplicas biológicas (animais individuais ou culturas celulares independentes), enquanto repetições técnicas são usadas para controle de qualidade e não substituem a replicação biológica.

12. Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas usando software de análise estatística, e os números foram gerados usando software de gráficos (listados na Tabela de Materiais). Dados contínuos normalmente distribuídos foram apresentados como média ± desvio padrão e analisados por ANOVA unidirecional com testes post hoc apropriados, enquanto dados não distribuídos normalmente foram expressos como mediana (intervalo interquartil) e analisados usando o teste de Kruskal–Wallis com comparações apropriadas por pares. Os limiares de significância estatística foram estabelecidos em P < 0,05, P < 0,01 e P < 0,001. A menos que especificado de outra forma, "n" denota réplicas biológicas, e réplicas técnicas (por exemplo, poços ELISA duplicados) foram médias para gerar um único valor por réplica biológica.

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Resultados

A infecção por P. gingivalis ou F. nucleatum está associada ao encurtamento gestacional e ao aumento das citocinas pró-inflamatórias séricas em camundongos
As estatísticas básicas para mudanças de peso materno, desfechos neonatais e duração gestacional estão resumidas na Tabela 1 e na Figura 1. As trajetórias do peso materno e as condições neonatais não diferiram significativamente entre os grupos (ANOVA...

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Discussão

Nos últimos anos, evidências acumuladas sugerem ligações estreitas entre saúde bucal e desfechos na gravidez, levando a uma atenção crescente às possíveis associações entre periodontite apical crônica (PAC) e desfechos adversos na gravidez, incluindo fenótipos relacionados ao partoprematuro 31 . Uma revisão sistemática indica que a base atual de evidências clínicas permanece limitada e heterogênea, mas, no geral, apoia uma associação positiva entre a periodontite ...

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Divulgações

Os autores não têm interesses concorrentes a declarar.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pela Fundação de Desenvolvimento e Doenças Relacionadas de Mulheres e Crianças do Laboratório Chave da Província de Sichuan (Grant No. FYYFEJB2025002).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Chromogenic Peroxidase SubstrateAgilent DakoK3468Substrato peroxidasa cromogênico para IHC
Defibrinated sheep blood, sterileThermo Fisher (Remel)R54012Aditivo para ágar sangue (5%)
Dental X-ray unit / radiography systemPlanmecaIntra (model)Radiografias periapicais para confirmação de CAP
DNeasy Blood & Tissue KitQIAGEN69504Extração de DNA de coluna de sílica de tecidos/bactérias
E. coli DH5α Competent CellsTaKaRa9057Transformação para construção de padrão de plasmídeo
Eosin Y solution, alcoholicSigma-Aldrich (Merck)HT110132Corante H&E
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, AustraliaGibco (Thermo Fisher Scientific)10099-141Suplemento para meio completo 
Flowable resin composite3MFiltek Supreme Flowable 6010Restauração após selamento; cura por luz
Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum reference strainATCC25586Cultura anaeróbica; exposição CAP e veia caudal
GraphPad PrismGraphPad SoftwarePrism 9 (version)Análise estatística e geração de figuras
Hematoxylin solutionSigma-Aldrich (Merck)HHS32Contracorante H&E
HTR-8/SVneo human trophoblast cell lineATCCCRL-3271Ensaios de infecção in vitro 
Human IL-1β/IL-1F2 Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)DLB50Medição de IL-1β no sobrenadante celular
Human TNF-α Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)DTA00DMedição de TNF-α no sobrenadante celular
Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45 µmMillipore (Merck)IPFL00010Transferência de Western blot fluorescente
IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L)LI-COR925-68071Anticorpo secundário fluorescente
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H+L)LI-COR926-32211Anticorpo secundário fluorescente
IκBα (44D4) Rabbit mAbCell Signaling Technology4812Anticorpo primário (WB)
K-File (endodontic file)Dentsply Sirona (Maillefer)A012D015Instrumentação do canal (tamanho de exemplo 15)
LED dental curing light3MElipar DeepCure-S (model)Curing de 20 s (por protocolo)
Mouse IL-1β/IL-1F2 Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)MLB00CMedição de IL-1β no soro
Mouse TNF-α Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)MTA00BMedição de TNF-α no soro
MyD88 (D80F5) Rabbit mAbCell Signaling Technology4283Anticorpo primário (WB)
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-WQuantificação de DNA/RNA
Near-infrared imaging systemLI-COROdyssey CLx (model)Imageamento de Western blot fluorescente
NF-κB p65 (D14E12) Rabbit mAbCell Signaling Technology8242Anticorpo primário (WB)
PBS, pH 7.4, without Ca2+/Mg2+Gibco (Thermo Fisher Scientific)10010-023Lavagem celular e preparação de reagentes
Penicillin-Streptomycin Gibco (Thermo Fisher Scientific)15140-122Antibióticos 
Pentobarbital sodium saltSigma-Aldrich (Merck)P3761Indução da anestesia (dose por protocolo)
Peroxidase blocking solutionAgilent DakoS2023Bloqueio da peroxidase endógena para IHC
Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAbCell Signaling Technology3033Anticorpo primário (WB)
Porphyromonas gingivalis reference strainATCC33277Cultura anaeróbica; exposição CAP e veia caudal
PrimeScript RT Reagent Kit (Perfect Real Time)TaKaRaRR037ASíntese de cDNA
Real-time PCR systemApplied BiosystemsQuantStudio 5 (model)Quantificação qPCR de alvos 16S
Round bur (sterile)Dentsply SironaH1-010Abertura de acesso para câmara pulpar do primeiro molar superior
RPMI 1640 MediumGibco (Thermo Fisher Scientific)11875-093Meio de cultura base HTR-8/SVneo
SYBR-safe DNA gel stainInvitrogenS33102Visualização de DNA
TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0TaKaRa9760Miniprep de plasmídeo para padrões
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TaKaRaRR820AMaster mix qPCR (baseado em corante)
TLR4 (D8L5W) Rabbit mAbCell Signaling Technology14358Anticorpo primário (WB)
TRIzol ReagentInvitrogen15596-026Extração de RNA fenol–cloroformo
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco (Thermo Fisher Scientific)25200-056Destaque celular
T-Vector pMD19 (Simple)TaKaRa3271Clonagem de produto de PCR para curvas padrão
Universal dental adhesive3MScotchbond Universal Adhesive 26200Selamento da câmara pulpar após inoculação

Referências

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