Construindo Modelos Eficientes de Blastocisto de Camundongos Derivados de Células-Tronco para Estudos Ambientais

Summary

Este protocolo descreve a geração e análise de blastoides iGATA4, um modelo escalável baseado em células-tronco que recapitula características-chave do blastocisto do camundongo, incluindo organização de linhagem e cavitação, e possibilita avaliação reprodutível e de alta capacidade de perturbações ambientais e moleculares que afetam o desenvolvimento embrionário precoce.

Abstract

Modelos embrionários baseados em células-tronco oferecem uma plataforma poderosa para investigar o desenvolvimento inicial de mamíferos e sua sensibilidade a perturbações ambientais. Aqui, é apresentado um protocolo robusto e acessível para gerar blastoides de camundongos de alta fidelidade usando células-tronco embrionárias (ESCs), células-tronco trofoblastas (TSCs) e células-tronco embrionárias projetadas para expressão induzível de GATA4 (iGATA4-ESCs). Esse sistema produz blastoides iGATA4 que recapitulam com precisão a morfologia natural dos blastocistos E4.5, proporções de linhagem e assinaturas transcricionais, fornecendo um modelo in vitro confiável dos compartimentos endoderma (PE), epiblasto (EPI) e trofectoderma (TE). Este protocolo primeiro demonstra como manter e preparar as três populações de células-tronco necessárias para a formação do blastoide. A montagem passo a passo dos blastoides iGATA4 sob condições de cultura pré-implantação é então descrita, destacando parâmetros experimentais críticos. Para permitir uma caracterização rigorosa, é fornecido um fluxo de trabalho testado para fixação, coloração e imagem de blastoides. Por fim, é apresentado um exemplo demonstrando como blastoides iGATA4 podem ser usados em ensaios de alta produtividade. Ao expor grandes coortes de blastoides a fatores ambientais definidos, mudanças na morfologia, alocação de linhagem e progressão do desenvolvimento podem ser quantificadas de forma rápida e reprodutível. Juntos, esse protocolo estabelece uma plataforma escalável para modelar o desenvolvimento pré-implantacional, dissecar decisões iniciais de linhagem e realizar triagens multiparamétricas para avaliar influências ambientais ou moleculares na formação de blastocistos.

Introduction

Compreender como embriões de mamíferos precoces se auto-montam e como fatores ambientais comuns podem afetar negativamente sua formação requer sistemas modelo que sejam reproduzíveis, acessíveis experimentalmente e escaláveis. Modelos integrados semelhantes a embriões gerados pela combinação de células-tronco embrionárias e extraembrionárias fornecem essa plataforma ^1,2. Este protocolo descreve como células-tronco embrionárias (ESCs), células-tronco trofoblastas (TSCs) e ESCs projetadas para expressão induzível de GATA4 (iGATA4-ESCs) podem ser montadas sob condições pré-implantação para produzir blastoides com linhagens robustas e devidamente proporcionadas de endoderma primitivo (PE), epiblasto (EPI) e trofetectoderma (TE). Trabalhos recentes demonstraram que essas estruturas, chamadas iGATA4-blastoides³, se assemelham ao blastocisto E4.5 em proporções de linhagem, assinaturas transcricionais e expressão de marcadores funcionais. Quando cultivadas in vitro, 12,5% dessas estruturas fazem a transição para a morfologia pós-implantação. Importante, eles são passíveis de triagens toxicológicas e ambientais.

O desenvolvimento dessa técnica foi motivado por limitações em sistemas blastoides^{pré-existentes 2,4,5}. Embora muitos protocolos 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 geram estruturas cavitadas semelhantes a blastocistos iniciais, a maioria faz isso com eficiência relativamente baixa ou produz estruturas com formação incompleta de PE, identidades celulares indefinidas ou proporções incorretas de linhagem. Essas inconsistências reduzem sua adequação para estudos mecanicistas e telas de perturbação de alto rendimento. Como a especificação de PE in vivo segue a ativação de GATA6, SOX17, GATA4 e SOX7²², e defeitos tanto no PE quanto em seu derivado, o endoderma visceral (VE), prejudicam o desenvolvimento peri-implantacional 23,24,25,26,27, reforçando esse programa transcricional in vitro Melhora a fidelidade do blastoide. ESCs que carregam um transgene GATA4 condicional transdiferenciam-se robustamente em VE e, quando combinados com ESCs e TSCs sob condições pós-implantação, geram modelos embrionários integrados que gastrulam e iniciam a organogênese 28,29,30,31. Aqui, esse princípio é adaptado a condições pré-implantacionais, demonstrando que iGATA4-ESCs geram PE de forma confiável e produzem blastoides que se assemelham muito aos blastocistos^{naturais 3}.

Esse método supera limitações anteriores na modelagem de blastocistos usando células-tronco e oferece alta eficiência de formação de blastoides (80% das estruturas formadas são blastoides, 75% das quais demonstram organização e proporções adequadas de linhagem) e alta semelhança embrionária. Além disso, a montagem modular dos blastoides iGATA4, na qual cada linhagem de blastocistos é derivada de uma população de células-tronco cultivada independentemente, proporciona acesso experimental direto a cada compartimento embrionário. Essas propriedades tornam o sistema particularmente adequado para aplicações de triagem multiparamétrica. Por produzir grandes coortes de estruturas morfologicamente consistentes com linhagens TE, EPI e PE proporcionadas com precisão, permite perturbações paralelas e quantificação de respostas específicas de linhagem com poder estatístico inatingível usando embriões naturais.

Como prova de princípio, foram medidos os efeitos de fatores ambientais comuns apresentados em intervalos fisiológicos 32,33,34,35,36,37,38 sobre o desenvolvimento do blastoide. O impacto das modificações de cafeína, nicotina, etanol e aminoácidos na taxa de cavitação, morfologia, aptidão física e proporções de linhagem foi avaliado em uma variedade de concentrações e janelas temporais de tratamento. A maioria das condições (cafeína, etanol, nicotina e aquelas que imitam dietas com baixo teor de proteína) resultou em formação aberrante de blastoides e deterioração da qualidade estrutural. Em contraste, aumentar a concentração de aminoácidos de cadeia ramificada (semelhante às dietas ricas em proteínas) melhorou a eficiência e a qualidade da formação de blastoides. Esses resultados refletiram efeitos observados em blastocistos naturais de camundongos cultivados in ^{vitro-cultivo 3}, demonstrando que esse sistema captura fenótipos sutis e dependentes da dose e suporta pipelines de triagem multidimensional e escaláveis que não são viáveis com embriões naturais.

No contexto mais amplo da modelagem embrionária, essa técnica demonstra que as mesmas células usadas para modelar o desenvolvimento pós-implantação integrado também podem ser implantadas como modelos pré-implantação. Esse método é particularmente adequado para aplicações que exigem modelagem escalável de estruturas semelhantes a blastocistos com formação precisa de PE e integração robusta de linhagem. No entanto, assim como outros modelos baseados em células-tronco do blastocisto de camundongo, os blastoides iGATA4 não se implantam e se desenvolvem mais após a transferência para um camundongo hospedeiro, tornando-se adequados para estudos de interações embrião-mãe. No geral, esse protocolo oferece uma abordagem confiável e acessível para gerar blastóides de alta fidelidade que modelam decisões precoces de tipo celular no embrião de mamífero.

Protocol

Todos os procedimentos descritos neste protocolo envolvem linhagens celulares estabelecidas e foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança do Instituto de Tecnologia da Califórnia. Nenhum trabalho com animais vivos ou humanos foi realizado.

Múltiplas linhas ESC e TSC foram testadas e comprovadas como suportando a formação de blastoides iGATA4. ESCs, iGATA4-ESCs e TSCs de estudos^{anteriores 28} foram usados com sucesso para completar todas as etapas descritas neste protocolo. Os mesmos autores descrevem a geração de iGATA4-ESCs a partir de uma linha de ESC de mouse CD1 (ICR) já estabelecida.

Os TSCs são cultivados sobre fibroblastos embrionários (MEFs) de camundongos comercialmente disponíveis. Todos os produtos químicos, reagentes, kits, equipamentos e softwares usados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cultura de células-tronco de camundongos para formação de blastoides

1. Preparação das placas alimentadoras MEF
   1. Recubra uma placa de cultura celular de 6 poços com 1,5 mL de 0,2% (p/v) de gelatina em água deionizada (DI) por poço. Incube a 37 °C na normóxia por pelo menos 45 minutos.
   2. Durante a incubação, prepare um tubo centrífugo de 15 mL com 4 mL de meio FC (Tabela 1) pré-aquecido a 37 °C.
   3. Descongele o frasco de MEF em banho-maria usando um movimento em forma de oito até que reste apenas uma pequena bola de gelo. Transfira o conteúdo para o tubo preparado, depois pipete para cima e para baixo para misturar bem. Centrifuge a 500 × g por 4 minutos.
   4. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio FC. Ajuste para um volume suficiente para placar ~160.000 células por poço em 1,5 mL por poço.
   5. Aspire a gelatina e coloque 1,5 mL de MEFs por poço. Incubar em normóxia durante a noite sem perturbação.
   6. Substitua o meio por meio fresco de 1,5 mL por poço no dia seguinte. Mude o meio a cada 48 horas. Use MEFs de 2 a 7 dias após o placar. Os MEFs podem permanecer saudáveis por mais tempo, mas sua capacidade de suportar o crescimento do TSC pode estar comprometida.

ATENÇÃO: Realize toda a cultura de células de camundongos em gabinetes de fluxo laminar nível de biossegurança (BSL) 1 utilizando a técnica BSL-2.

2. Descongelamento e passagem de células-tronco embrionárias de camundongos (WT ESCs e iGATA4-ESCs)
   1. Descongelar ESCs WT ou iGATA4-ESCs seguindo as etapas 1.1.1–1.1.3. Após a centrifugação, ressuspenda as células em 1 mL de meio N2B27/2i/LIF (Tabela 1) e semeie ~50.000 células por poço em uma placa de 6 poços revestida a gelatina com ~1,5 mL por poço. Incubar a 37 °C em normóxia e trocar o meio a cada 48 horas.
   2. Certifique-se de que as colônias estejam bem compactas e arredondadas, com protuberâncias mínimas antes de passar. Passagem a cada 2–3 dias.
      NOTA: As ESCs WT e as iGATA4-ESCs são morfologicamente indistinguíveis até a indução com doxiciclina (DOX).
   3. Revestir uma placa de 6 poços com 1,5 mL de gelatina 0,2% em água DI por poço. Incube a 37 °C por pelo menos 45 minutos.
   4. Adicione 500 μL de reagente de dissociação celular por poço e incube por 3 minutos. Adicione 2 mL de medium FC enquanto pipeteia suavemente ao redor das bordas. Confirme > descolamento de 90% sob o microscópio. Se as células permanecerem presas, pipetee suavemente para ajudar na ressuspensão.
   5. Transfira a suspensão da célula para um tubo centrífugo de 15 mL e centrifuge a 500 × g por 4 minutos.
   6. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio N2B27/2i/LIF. Determine a concentração celular usando 10 μL em um hemocitômetro. Ajuste o volume para semente ~50.000 células por poço.
   7. Aspire a gelatina e seme as células. Incubar em normóxias. Mude de médio no dia seguinte e a cada 48 horas depois disso.
3. Descongelamento e passagem de células-tronco trofoblastas (TSCs) de camundongos
   1. Descongelar os TSCs seguindo as etapas 1.1.1–1.1.3. Após a centrifugação, ressuspenda as células em 1 mL de meio TSF4H (Tabela 1) e semeie ~20.000 células por poço em uma placa de 6 poços revestida com MEF. Incube a 37 °C, 5% CO₂, 5% O₂ (hipóxia) e troque o meio a cada 24 horas.
   2. Certifique-se de que as colônias sejam grandes (>75 μm de diâmetro) e achatadas antes da passagem. Adicione 500 μL de reagente de dissociação celular por poço e incube por 5 minutos. Adicione 2 mL de medium FC enquanto pipeteio suavemente. Confirme >90% de desapego.
   3. Transfira as células para um tubo centrífugo e gire a 500 × g por 4 minutos.
   4. Resuspenda em 1 mL TSF4H médio. Determine a concentração e ajuste para ~20.000 células por poço.
   5. Placar sobre MEFs e incubar em hipóxia. Mude o meio a cada 24 horas e passe a cada 2–3 dias antes da fusão da colônia.

2. Formação dos blastoides iGATA4

1. Preparação da placa de agregação de micropoços para agregação celular
   1. Adicione 500 μL de solução antiaderente de enxágue a cada poço de uma placa de agregação de micropoços. Centrifuge a 2.000 × g por 5 minutos com equilíbrio adequado para remover o ar preso dos micropoços. Incube a 37 °C em normóxia por pelo menos 1 hora ou durante a noite.
2. Preparação do blastoide, dia 0 — Preparação e placagem dos WT e iGATA4-ESCs
   1. Pré-aquecimento de meios N2B27/2i/LIF, FC e FCYL (FC + 10 ng/mL de LIF recombinante de camundongo (mLIF) + inibidor de ROCK de 2 μM Y27632) a 37 °C. Prepare gelatina a 0,2% em água DI e tenha o reagente de dissociação celular pronto.
   2. Aspire solução antiaderente sem tocar no fundo do poço. Lave duas vezes com 1 mL de PBS e uma vez com 1 mL de médio FCYL. Pipete ao longo da parede para evitar danificar os micropoços.
   3. Prepare uma placa de 6 poços revestida com gelatina (incubação ≥45 min) para as células de passagem.
   4. Colhe WT e iGATA4-ESCs aspirando o meio e adicionando 500 μL de reagente de dissociação celular por poço. Incube por 3 minutos a 37 °C. Adicione 2 mL de FC médio e pipete suavemente. Confirme o destacamento completo sob um microscópio. Transfira para um tubo de 15 mL e centrifuge a 500 × g por 4 minutos.
   5. Resuspenda em 1 mL de meio FCYL. Determine a concentração celular usando 10 μL em um hemocitômetro. Ajuste para 500.000–700.000 células/mL. Calcule o volume necessário para 5 ESCs WT e 5 iGATA4-ESCs por micropoço (6.000 células por poço).
      NOTA: Otimize para outras linhas ESC se necessário. Uma faixa inicial é de 4 a 7 ESCs por micropoço, com uma proporção de 1:1 entre ESCs e iGATA4-ESCs.
   6. Prepare 500 μL de suspensão de célula por poço. Adicione gota a gota à placa de agregação Microwell usando uma pipeta de 1000 μL. Centrifuge a 100 × g por 3 minutos e verifique a distribuição uniforme. Incube por 6 horas até que os agregados se formem.
   7. Passagem dos ECCs restantes conforme descrito na Seção 1.2.
3. Preparação do blastoide, dia 0 — Preparação do médio TX
   1. Prepare um meio basal TX de ~20 mL usando DMEM/F12 (Tabela 2). Prepare-se fresco para cada experimento.
      1. Adicione 200 μL e 200 mM de suplemento de L-alanil-L-glutamina (2 mM finais). Armazene o estoque a 4 °C.
      2. Adicione 200 μL 10.000 U/mL de penicilina/estreptomicina (final 100 U/mL cada). Armazene a −20 °C.
      3. Adicione 40 μL de 32 mg/mL de ácido L-ascórbico (final 64 μg/mL). Prepare em água DI, filtre esterilize e armazene a −20 °C.
      4. Adicione 20 μL de selenito de sódio (final 14 ng/mL). Prepare e armazene a −20 °C.
      5. Adicione 240 μL de NaHCO₃ (final 543 μg/mL). Misture bem depois de descongelar.
      6. Adicione 20 μL de holo-transferrina (final 10,7 μg/mL). Misture após descongelar.
      7. Adicione ~37,5 μL de insulina (final 19,4 μg/mL; dependente do lote). Armazene a 4 °C.
   2. Imediatamente antes do uso, adicione Y27632 a uma concentração final de 20 μM, CHIR99021 a 3 μM, IL-11 a 30 ng/mL, FGF4 a 25 ng/mL, heparina a 1 μg/mL, mLIF a 10 ng/mL, TGFβ a 15 ng/mL e 8Br-cAMP a 25 μM.
4. Preparação do blastoide, dia 0 — Preparação e blindagem dos TSCs
   1. Pré-aquecimento TSF4H, FC (Tabela 1) e mídia TX (Seção 2.3). Prepare placas revestidas com gelatina (≥45 min) para a redução do MEF.
   2. Colhe TSCs adicionando 500 μL de reagente de dissociação celular por poço e incubando por 5 minutos na hipóxia. Adicione 2 mL de FC médio e pipete suavemente. Confirme o distanciamento. Transfira para um tubo e centrifuge a 500 × g por 4 minutos.
      NOTA: CSTs cultivados >4 dias podem requerer até 10 minutos de tratamento com reagente de dissociação celular.
   3. Resuspenda em 1 mL de meio TSF4H e ajuste para o volume apropriado para o banhamento em uma divisão 1:2.
   4. Placar em poços revestidos com gelatina para esgotamento do MEF. Incubar ~45 minutos em hipóxia. Garantir que os MEFs se fixem enquanto os TSCs permanecem em sua maioria desacoplados.
   5. Substitua o meio de 900 μL dos poços de placas de agregação de micropoços por meio TX de 500 μL. Volte para a hipóxia.
   6. Transfira sobrenadante contendo TSC para um tubo sem perturbar os MEFs acoplados. Determine a concentração (alvo 500.000–700.000 células/mL).
   7. Calcule o volume para 12 TSCs por micropoço (14.400 células por poço). Centrífuga se for necessária concentração adicional.
      NOTA: Otimize para outras linhas de TSC (10–15 células por micropoço recomendado).
   8. Adicione 500 μL de suspensão de célula por poço dropwise. Centrifuge a 100 × g por 3 minutos. Confirme a distribuição e incube em hipóxia por 24 horas.
   9. Aprovar os TSCs restantes conforme necessário (Seção 1.3).
5. Preparação para blastoide, dia 1 — Indução
   1. Por volta de 24 horas após a adição do TSC, adicione 20 μL de 5 mM 8Br-cAMP e 1 μL de 1 μg/mL DOX por poço. Incubar por 48–72 horas em hipóxia.
6. Preparação para blastoide, dia 3 — Fixação
   1. Resuspenda agregados usando uma ponta de pipeta cortada de 1000 μL. Transfira para tubos de 2 mL e deixe sedimentar por 5 min.
   2. Remova o sobrenadante e adicione 250 μL de paraformaldeído (PFA) a 4%. Resuspenda suavemente.
      ATENÇÃO: Manuseie o PFA em uma exaustão com EPI apropriado.
   3. Incube por 15 minutos, fazendo um movimento a cada 5 minutos.
   4. Remova o PFA e adicione 300 μL de PBST (PBS + 0,1% Tween-20). Misture suavemente. Armazene a 4 °C por <1 semana antes de tingir.
7. Imunofluorescência de blastóides
   1. Transfira 150 μL por amostra para uma placa de fundo em U com 96 poços.
   2. Adicione um tampão de permeabilização de 100 μL e incube por 20 minutos. Substitua por solução primária de anticorpos e incube durante a noite a 4 °C.
   3. Lave 3× com PBST (5 min cada). Adicione anticorpos secundários.
   4. Incube 2 horas em temperatura ambiente, no escuro.
   5. Lave 3× e transfira para o prato de imagem.
   6. Imagem usando microscopia confocal (≥25× objetivo, NA ≥0,8).

3. Telas de alta taxa usando o modelo iGATA4-blastoide

1. Preparação e teste de fatores ambientais iGATA4-blastoides
   1. Prepare a placa de agregação de micropoços conforme descrito na Seção 2.1 e gere blastoides iGATA4 seguindo as Seções 2.2–2.4. Prepare poços suficientes, incluindo controles apropriados. Inclua um controle em branco (blastoides preparados usando o protocolo padrão), um controle de portadora e uma ou mais condições experimentais.
   2. Incube blastoides durante a noite na hipóxia. Aproximadamente 24 horas após a semeadura do TSC, prepare o meio TX suplementado com 8Br-cAMP, doxiciclina (DOX) e o composto de interesse (ou controle de transportadores). As seguintes condições foram testadas:
      1. Cafeína: 3,5 mg/L, diluída a partir de estoques de água ultrapura.
      2. Nicotina: 330 ng/L, diluído a partir de estoques 100% de etanol (EtOH).
      3. Etanol: 17 mM, diluído a partir de EtOH absoluto.
      4. Aminoácidos de cadeia ramificada elevada (BCAA): +5%, +25%, +50% em relação às concentrações basais (0,45 mM de L-leucina, 0,45 mM de L-valina, 0,42 mM de L-isoleucina), preparados a partir de estoques concentrados em água ultrapura.
      5. Metionina e leucina baixas: −5%, −25%, −50%, −100% em relação às concentrações iniciais (0,12 mM L-metionina, 0,45 mM L-leucina), preparados usando DMEM/F12 livre de Met/Leu. O DMEM Met-/Leu livre (LM-DMEM) é complementado com 1x Mistura Nutritiva F-12 do Ham's antes do uso.
         ATENÇÃO: Prepare e manuseie estoques concentrados de cafeína e nicotina em uma exaustão usando equipamentos de proteção individual apropriados (EPI; luvas, jaleco, proteção ocular). O etanol é inflamável e deve ser mantido longe de fontes de calor.
   3. Aspire o meio de cada poço e adicione 1 mL de meio TX contendo composto. Processe um poço de cada vez para evitar que ressece. Devolva a placa ao incubador de hipóxia e faça a cultura até o terceiro dia.
   4. Capture imagens representativas de campo claro no terceiro dia usando um microscópio de luz transmitida. Fixe as estruturas e realize a imunofluorescência conforme descrito nas Seções 2.6 e 2.7.
      NOTA: Ajuste as janelas de tratamento conforme o objetivo experimental. Os tratamentos podem ser aplicados durante a agregação inicial (dia 1) ou em estágios posteriores (por exemplo, expansão da cavidade). Janelas de exemplo incluem dias 1–3, dias 1–2 (seguidos pela substituição de mídia) e dias 2–3.
2. Análise multiparamétrica iGATA4-blastoide
   1. Use imagens de campo claro para quantificar a porcentagem de poços contendo estruturas cavitadas (ou seja, estruturas com cavidade central claramente definida) e medir o diâmetro do blastoide.
      1. Imagens abertas no software de análise de imagens.
      2. Use a ferramenta de linha reta para desenhar uma linha em cada estrutura.
      3. Meça o diâmetro usando Analisar > Medir.
   2. Selecione amostras representativas imunocoloridas (20–40 estruturas por réplica biológica, com pelo menos três réplicas biológicas por condição) e a imagem conforme descrito na Seção 2.7.
   3. Quantifique o número total de células e a composição da linhagem usando marcadores de imunofluorescência: TE (CDX2-positivo), EPI (SOX2-positivo e SOX17-negativo) e PE (SOX17-positivo).
   4. Avalie a organização estrutural e a morfologia determinando se as células PE estão espacialmente segregadas das células EPI dentro da massa interna da célula (ICM) (classificação binária: sim/não).
   5. Classifique a morfologia como boa (estrutura clara semelhante a um blastocisto, cavidade definida e compartimentos TE, EPI e PE devidamente organizados), medíocre (pequenas anomalias como formato irregular ou cavidade parcialmente formada) ou ruim (anormalidades maiores como ausência de cavidade ou linhagens desorganizadas/não organizadas).
   6. Quantifique parâmetros adicionais, incluindo tamanho ou volume da cavidade, quando aplicável. Use ferramentas bioinformáticas ou outras ferramentas para plotagem e análise estatística, e softwares de análise de imagens 3D para contagem de células e/ou preparação de imagens para exibição.

Results

Manter ESCs e iGATA4-ESCs (normóxia) e TSCs (hipóxia) sob condições apropriadas de cultura é essencial para a geração bem-sucedida de blastoides. Quando cultivados conforme descrito, ESCs e iGATA4-ESCs devem ser em grande parte indistinguíveis, formando colônias de tamanho médio, arredondadas e bem definidas após 3 dias. A aparência de colônias achatadas ou bordas protuberantes indica diferenciação incipiente, e tais culturas não devem ser usadas para a formação de blastoides. Os CTT devem formar colônias epiteliais planas com bordas ligeiramente elevadas e centros mais planos. Colônias de TSC crescidas ou em fusão (tipicamente após >3 dias em cultura) frequentemente resultam em resultados blastoides ruins (Figura 1).

Durante a montagem do blastoide iGATA4, vários marcos iniciais indicam sucesso do protocolo (Figuras 2A, B). Aproximadamente 6 horas após a agregação de ESC e iGATA4-ESC, agregados de células compactas devem ser visíveis no fundo dos micropoços. Agregados soltos sugerem exposição excessiva a reagentes de dissociação celular, o que reduz a adesão célula-célula. Progressão para o próximo passo (adição de TSC; Seção 2.4) só deve ocorrer quando agregados apertados forem observados (Figura 2B, ponto de tempo D0.5). A imunocoloração neste estágio deve mostrar agregados homogêneos SOX2⁺ e GATA4⁻ (Figura 2B, ponto temporal D0.5).

Após a adição de TSC e a incubação durante a noite, um único agregado coeso cercado por células CDX2⁺ deve ser evidente (Figura 2B). A presença de células grandes e não agregadas na superfície dos agregados frequentemente indica MEFs residuais. A contaminação por MEF pode reduzir a eficiência da formação de blastoides; portanto, a depleção adequada do MEF é fundamental para obter uma população predominantemente TSC antes da agregação. Um filtro de célula de 40 μm pode ser usado para remover MEFs residuais, embora isso possa reduzir o rendimento do TSC. Cobertura incompleta ou excessiva de CDX2⁺ pode ser corrigida ajustando o número de TSCs adicionados por micropoço (faixa recomendada: 10–15).

Após a adição de DOX e 8Br-cAMP, as cáries geralmente são observadas até o segundo dia e podem persistir até o terceiro dia. Sob microscopia de campo claro, as cavidades aparecem como espaços claros e vazios dentro dos blastoides (Figura 2B, C; linha branca tracejada). Células GATA4⁺ aparecem logo após a indução do DOX e são progressivamente classificadas para a superfície do compartimento semelhante ao ICM (Figura 2B). A formação bem-sucedida de blastoides é caracterizada por alta eficiência de cavitação (tipicamente ~80% das estruturas por placa de agregação de micropoços; Figura 2D), um epitélio externo de camada única semelhante ao tipo TE do CDX2⁺, uma cavidade semelhante a um blastocoel e um compartimento arredondado semelhante ao ICM contendo células semelhantes ao SOX2⁺ do tipo EPI sobrepostas por células semelhantes ao GATA4⁺ do tipo PE (Figuras 2C–E).

Desfechos subótimos comuns incluem estruturas não cavitadas, blastoides de formato irregular com múltiplas cavidades ou compartimentos semelhantes a ICM, e poços contendo poucas estruturas ou detritos celulares. Embora se espere aproximadamente 20% de estruturas anormais (Figura 2C), taxas mais altas podem indicar problemas como preparação incorreta do meio TX, baixa qualidade da célula inicial, falha em adicionar DOX ou 8Br-cAMP no primeiro dia, ou deslocamento de estruturas durante trocas de meio.

Para aplicações de triagem de alta produtividade, poços não tratados e de controle veicular devem produzir blastoides comparáveis às condições de controle positivo (Figuras 3A,B). Tratamentos experimentais podem afetar múltiplos indicadores de qualidade, incluindo tamanho do blastoide (Figura 3C), eficiência de cavitação, número total e específico de células por linhagem (Figura 3D), classificação PE e morfologia geral (Figura 3E). Por exemplo, o tratamento com cafeína, nicotina ou etanol durante a formação do blastoide resultou em estruturas menores com eficiência de cavitação reduzida, menor número total ou de células ICM, classificação de PE comprometida e morfologia mais deteriorada. Em contraste, o aumento das concentrações de aminoácidos de cadeia ramificada produziu blastoides maiores e mais cavitados, com maior número celular e morfologia melhorada (Figura 3C–E). A variabilidade biológica entre os experimentos é esperada, destacando a importância de incluir tanto controles em branco quanto de portadores em cada experimento.

Figura 1: Exemplos de ESCs WT de boa e baixa qualidade, iGATA4-ESC e TSCs. Micrografias de campo claro de ESCs WT, iGATA4-ESCs e TSCs mostrando morfologias esperadas de colônia após 2–3 dias de cultivo em N2B27/2i/LIF (ESCs) ou meio TSF4H (TSCs). O painel intitulado "ESCs WT – má qualidade" mostra células com morfologia subótima, incluindo colônias achatadas com bordas salientes (pontas de flecha vermelhas). O painel "TSC superdimensionado" mostra colônias de TSC fundidas e ampliadas após 4 dias de cultivo. Barra de escala: 100 μm para todos os painéis. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Morfologia esquemática e esperada dos blastoides iGATA4. Reimpresso de Developmental Cell, Vol. 61, Jorgensen V, Bao M, Junyent S et al., Modelos eficientes de embriões de camundongos derivados de células-tronco para estudos ambientais, pp. 193–207.e6, Copyright (2025)³, com permissão da Elsevier. (A) Representação esquemática do desenvolvimento natural de blastocistos de camundongos (top) e modelagem baseada em células-tronco usando ESCs WT, iGATA4-ESCs e TSCs.
(B) Micrografias mostrando a morfologia esperada e a expressão dos marcadores em diferentes estágios do protocolo. Projeção de intensidade máxima (MIP); linhas tracejadas delimitam a cavidade. Barra de escala: 20 μm. (C) Imagem de campo claro dos blastoides iGATA4 no dia 3. Barra de escala: 100 μm.
(D) Taxas de cavitação de iGATA4-blastoides geradas usando TSCs pré-cultivados em normóxias ou hipóxias; Agregados foram cultivados sob condições hipóxicas. n ≥ 4; As barras de erro representam o erro padrão da média. (E) Imunocoloração de blastocistos E4.5 e blastoides iGATA4 do dia 3 para marcadores de linhagem (CDX2, ciano; 4 de OUTUBRO, vermelho; GATA4, verde). Projeção de intensidade máxima (MIP); plano Z único mostrado onde indicado. Barra de escala: 25 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Efeitos dos fatores ambientais na formação e qualidade dos blastoides. (A) Imagens representativas de imunofluorescência 3D (acima) e reconstruções de superfície IMARIS (inferior) de blastoides iGATA4 tratados com fatores ambientais (cafeína, nicotina, etanol e condições que imitam dietas ricas e pobres em proteínas). Barras de escala: 25 μm para todas as imagens. (B) Esquema do fluxo de trabalho experimental. (C) Diâmetro do blastoide sob diferentes condições de tratamento. A faixa representa os percentis 10 a 90; caixas indicam a faixa interquartil; a linha indica o separador central. A análise estatística foi realizada usando ANOVA unidirecional com múltiplas comparações. (D) Quantificação dos números celulares totais (cinza), trofetoderma (ciano), epiblastos (vermelho) e endoderma primitivo (verde) em blastoides controle e tratados. Barras representam a média; As barras de erro representam o desvio padrão. A análise estatística foi realizada usando ANOVA unidirecional com múltiplas comparações. (E) Quantificação da proporção de blastoides classificados como "boas" (ordenação correta da linhagem com anormalidades morfológicas mínimas), "medíocres" (morfologia em grande parte correta com pequenas anomalias, incluindo a classificação incompleta do EPI–PE) ou "ruins" (morfologia severamente anormal com organização da linhagem perturbada) sob condições de controle e tratamento. A análise estatística foi realizada usando ANOVA bidirecional em relação às condições de controle. Para todos os painéis, n ≥ 3. A significância estatística é indicada como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Mídia	Reagente	Concentração final
FC
	DMEM	N.A.
	FBS inativado por calor (iFBS)	15%
	GlutaMax	2 mM
	2-Mercaptoetanol (2-ME)	0,1 mM
	Aminoácidos não essenciais (NEAA)	1x
	Na Pyruvate	1x
	Penicilina–Estreptomicina	1x
N2B27/2i/LIF
	DMEM/F12	50%
	NeurobasalA	50%
	Suplemento B27	1x
	Suplemento N2	0,5x
	2-ME	100 μM
	Penicilina–Estreptomicina	1%
	GlutaMax	2 mM
	PD0325901	1 μM
	CHIR99021	3 μM
	LIF recombinante de camundongos	10 ng/mL
TSF4H
	Megacélula RPMI-1640 Médio	N.A.
	iFBS	20%
	GlutaMax	2 mM
	Na Pyruvate	1x
	Penicilina–Estreptomicina	1x
	FGF4	25 ng/mL
	Heparina	1 μg/mL

Tabela 1: Receitas de mídia para FC, N2B27/2i/LIF e TSF4H. Receitas para preparar mídia FC, mídia N2B27/2i/LIF e mídia TSF4H, com concentrações finais.

Componente	Concentração final	Concentração de estoque	Solvente e armazenamento	Volume para ~20 mL
8Br-cAMP	25 μM	5 mM	PBS, armazenar a -20 °C	100 μL
CHIR99021	3 μM	10 mM	DMSO, armazene a -20 °C	6 μL
DMEM/F12	N/A	N/A	Armazene a 4 °C	20 mL
FGF4	25 ng/mL	100 μg/mL	0,1% de BSA no PBS, armazenar a -20 °C	5 μL
Suplemento L-alanil-L-glutamina	2 mM	200 mM	Armazene a 4 °C	200 μL
Heparina	1 μg/mL	1 mg/mL	PBS, armazenar a -20 °C	20 μL
Holo-transferrina	10,7 μg/mL	10,7 mg/mL	Água DI, armazene a -20 °C	20 μL
TGF-β1 humano	15 ng/mL	20 μg/mL	4 mM HCl + 0,1% BSA, armazenar a -20 °C	15 μL
IL-11	30 ng/mL	25 μg/mL	0,1% de BSA no PBS, armazenar a -20 °C	24 μL
Insulina	19,4 μg/mL	9,5 - 11,5 mg/mL	A concentração depende do lote, armazene a 4 °C	33,7–40,8 μL, ajuste o volume de acordo com a concentração do estoque.
L-ácido ascórbico-2-fosfato magnésio	64 μg/mL	32 mg/mL	Água DI, armazene a -20 °C	40 μL
LIF recombinante de camundongos	10 ng/mL	10 μg/mL	PBS + 0,1% BSA, armazenar a -20 °C	20 μL
NaHCO3	543 μg/mL	45,25 mg/mL	Água DI, armazene a -20 °C	240 μL
Penicilina/Estreptomicina	1x	100x	Armazene a -20 °C	200 μL
Selenito de sódio	14 ng/mL	14 μg/mL	Água DI, armazene a -20 °C	20 μL
Y27632	20 μM	20 mM	DMSO, armazene a -20 °C	20 μL

Tabela 2: Receita de mídia para TX. Receita para preparar mídia TX, com detalhes sobre como preparar e armazenar pequenas moléculas e outros reagentes, e concentrações finais.

Discussion

Os blastoides iGATA4 fornecem um modelo altamente eficiente, semelhante a embriões, baseado em células-tronco do blastocisto de camundongo, autoorganizando três tipos celulares cultivados in vitro: ESCs, GATA4-ESC induzíveis (iGATA4-ESCs) e TSCs cultivados por hipóxia. Essas estruturas recapitulam características-chave do blastocisto E4.5, incluindo proporções apropriadas de linhagem e identidade transcricional, e podem ser usadas para triagem ambiental multiparamétrica, refletindo de forma confiável defeitos de desenvolvimento no estágio de^blastocisto. Um estudo recente demonstra ainda que a agregação de ESCs, iGATA4-ESCs e TSCs em meios blastoides basais também resulta na formação de blastoides de alta eficiência, destacando a robustez e adaptabilidade dessa abordagem em laboratórios e condições^{de cultura 39}. Já foi demonstrado que iGATA4-ESCs recapitulam as funções das células VE em modelos embrionários baseados em células-tronco^{pós-implantação} 28,29,30,31. Juntos, esses resultados ilustram como os iGATA4-ESCs podem servir como substitutos flexíveis e confiáveis para células PE/VE na modelagem embrionária baseada em células-tronco ao longo dos estágios do desenvolvimento.

Várias etapas do protocolo são críticas para alcançar blastoides de alta qualidade. Estes incluem a qualidade das populações celulares iniciais, especialmente os TSCs cultivados por hipóxia (Figura 1); a preparação do meio TX, que deve ser preparado fresco no dia 0 (Tabela 2; Seção 2.3); e manuseio cuidadoso das placas após a agregação. Leituras principais do sucesso do protocolo incluem eficiência de cavitação (tipicamente ~80%), morfologia apropriada (estruturas de ~100 μm de diâmetro com cavidade semelhante a blastocoel, camada externa semelhante a TE-CDX2⁺ e uma massa interna de células SOX2⁺ e GATA4⁺ ordenadas com uma razão aproximada de 3 TE:1 EPI:1 PE), e a presença de uma camada semelhante a GATA4⁺ PE devidamente ordenada. Essas são métricas comumente usadas na^área 1,2,4,5. Entre os blastoides cavitados, aproximadamente 75% das estruturas apresentam todas essas características. Essas métricas podem ser usadas como indicadores iniciais para a resolução de problemas. Qualidade celular subótima geralmente se reflete na morfologia anormal das colônias, resultando em estruturas mal agregadas ou não cavitadas. A preparação inadequada do meio pode levar a agregação incompleta ou defeitos de linhagem, enquanto o manuseio brusco pode resultar em múltiplos agregados por micropoço ou poços vazios.

Otimizações adicionais podem incluir o ajuste do número de células semeadas (faixas iniciais recomendadas: 4–7 ESCs e iGATA4-ESCs, e 10–15 TSCs por micropoço), refinamento dos métodos de depleção de MEF (por exemplo, filtragem por um filtro de célula de 40 μm) e modificação da composição do meio TX. Por exemplo, a remoção de FGF4 e heparina ainda pode apoiar a formação eficiente de blastoides enquanto promove uma identidade mais mural, semelhante à TE. Blastoides iGATA4 podem ser mantidos em cultura por até 6 dias; no entanto, estruturas dos dias 4 a 6 frequentemente aumentam de tamanho, mantendo proporções semelhantes a blastocistas da linhagem. O protocolo gera resultados consistentes entre réplicas biológicas, mas controles apropriados devem ser incluídos em cada experimento.

Comparado com outros sistemas blastoides de camundongos, que variam nas populações celulares iniciais e nas condições^{de cultivo} 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 , os blastoides iGATA4 alcançam tanto alta eficiência de formação quanto representação precisa da linhagem. Embora muitos protocolos existentes gerem estruturas cavitadas e sejam valiosos para aplicações biológicas específicas, eles frequentemente apresentam formação incompleta de PE, identidades celulares heterogêneas ou indefinidas, ou proporções incorretas de linhagem. Ao combinar três populações de células-tronco direcionadas por linhagem de forma gradual, os blastoides iGATA4 superam essas limitações e fornecem um sistema reproduzível, modular e experimentalmente acessível.

Apesar dessas vantagens, várias limitações permanecem. A cultivação in vitro prolongada em meio TX por mais de 4 a 6 dias resulta em crescimento excessivo, mesmo que as proporções da linhagem permaneçam semelhantes a blastocistos. Aproximadamente 12,5% dos blastoides iGATA4 fazem a transição para morfologias semelhantes à peri-implantação in vitro, caracterizadas por um epiblasto pseudoestratificado em forma de copo ao redor de uma cavidade pró-amniótica, um compartimento extraembrionário expandido semelhante a um ectoderma adjacente ao epiblasto proximal e uma camada externa visceral semelhante a endoderme. No entanto, os blastoides iGATA4 não se implantam e se desenvolvem ainda mais após a transferência para um camundongo hospedeiro. Portanto, os blastoides iGATA4, e os blastoides de forma mais ampla, não são adequados para estudar implantação ou interações embrião–mãe.

A base molecular da falha dos blastoides em implantar permanece incerta, embora evidências atuais sugiram que a modelagem incompleta do trofectodermo pode ser um fator contribuinte. Células semelhantes a TE em blastoides iGATA4 apresentam uma identidade molecular excessivamente polar. Esforços futuros para desenvolver TSCs que se assemelhem mais a células TE murais, ou para introduzir linhas celulares alternativas que recapitulem melhor TE competente para implantação, representam direções promissoras para superar essas limitações. A natureza modular dos blastoides iGATA4, nos quais modificações específicas para TE podem ser implementadas independentemente da formação de EPI e PE, torna este sistema particularmente adequado para tais desenvolvimentos.

Em conjunto, o protocolo iGATA4-blastoide oferece uma plataforma robusta e escalável para estudar a especificação de linhagem e os processos iniciais de desenvolvimento no embrião de mamíferos. Sua reprodutibilidade e adaptabilidade o tornam bem adequado para aplicações ambientais, farmacológicas e genéticas de alta produção. Assim, os blastoides iGATA4 representam um sistema poderoso para investigar mecanismos iniciais de desenvolvimento e avaliar como diversas perturbações influenciam o desenvolvimento pré-implantacional.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	Usado para preparação geral de meio
8-Bromo-cAMP	STEMCELL Technologies	73602	Usado para preparação de meio TX e cavitação blastóide
AggreWell400	STEMCELL Technologies	34415	Placa de agregação em micropoços; Usado para preparação de blastóides
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies	7010	Usado para preparação de blastóides
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	2079GPK	Pipetas de orifício largo para movimentação de blastóides durante a imunocoloração.
B27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Usado para preparação de meio
Caffeine	Sigma	58-08-2	Usado como fator ambiental para teste em blastóides iGATA4
CDX2 antibody, mouse	Biogenex	MU392A5UC	Para imunofluorescência, usado em 1:200
CellXpert (normoxia incubator)	Eppendorf	6731010015	Outras marcas/modelos também podem funcionar.
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72054	Usado para preparação de meio
Countess Cell Counting Chamber slides	Invitrogen	C10228	Usado para fins gerais de cultura de tecidos
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	Usado para imunofluorescência, usado em 1:500-1:1.000
DMEM	Gibco	11995040	Usado para preparação de meio FC
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	Usado para preparação de meio N2B27 e TX
DMEM-LM	Thermo Fisher Scientific	30030	Complementar DMEM-LM com pó de mistura de nutrientes Ham's F-12 para uma concentração final de 1x para obter DMEM/F12 Met- e Leu-livre
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055	Usado para imunofluorescência, usado em 1:500-1:1.000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 647	Invitrogen	A-31571	Usado para imunofluorescência, usado em 1:500-1:1.000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 568	Invitrogen	A10042	Usado para imunofluorescência, usado em 1:500-1:1.000
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A78947	Usado para imunofluorescência, usado em 1:500-1:1.000
Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Usado para imunofluorescência. Descongelar a 4°C; e armazenar aliquotado a -20°C;.
Doxycycline	Sigma	D9891-5G	Para indução de iGATA4 durante a preparação de blastóides
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf	5702	usado em nosso laboratório, outros funcionarão. Requer adaptadores para tubos e placas.
Falcon 96-well Clear Round Bottom Not Treated Microplate, with Lid, Individually Wrapped	Corning	351177	Usado para imunofluorescência
FGF4	R&D Systems	5846-F4	Usado para preparação de meio
Fiji	Schindelin et al., 2012	https://imagej.net/Fiji	Usado para análise de imagem
GATA4 antibody, rabbit	Cell Signalling	36966S	Usado para imunofluorescência, usado em 1:500
Gelatin solution, 2%	Sigma	G1393	Usado para fins gerais de cultura de tecidos
Glass Bottom Dish 35 mm	Ibidi	81218-200	Para imunofluorescência e imagem
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061	suplemento de L-alanil-L-glutamina; Usado para preparação de meio
Ham's F-12 Nutrient Mix powder	Thermo Fisher Scientific	21700075	Usado como suplemento para DMEM-LM, para condições de dieta com baixo teor de proteína.
Heparin	Sigma	H3149	Usado para preparação de meio
Heracell VIOS 160i (hypoxia incubator)	Thermo Fisher Scientific	51030400	Outras marcas/modelos também podem funcionar.
Holo-transferrin	Sigma	T4132	Usado para preparação de meio TX.
Human recombinant TGF-ß1	PeproTech	100-21	Usado para preparação de meio TX.
IL-11	PeproTech	200-11	Usado para preparação de meio TX.
Imaris	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/	Usado para análise de imagem e preparação de imagem.
Inactivated Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	Usado para preparação de meio
Inducible GATA4 ESCs (tetO-GATA4-ESCs)	Amadei et al., 2021	NA	Linha celular disponível do laboratório Zernicka-Goetz mediante solicitação
Insulin	Sigma	I9278	Usado para preparação de meio TX.
Irradiated C57bl/6 Mouse Embryonic Fibroblasts	Thermo Fisher Scientific	A34960	Usado como camada alimentadora para cultura de TSC. Descongelar conforme indicado no protocolo e usar dentro de uma semana.
L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium	Sigma	A8960	Usado para preparação de meio TX.
L-isoleucine	Thermo Fisher Scientific	73-32-5	Usado para complementar o meio TX.
L-leucine	Thermo Fisher Scientific	61-90-5	Usado para complementar o meio TX.
L-valine	Thermo Fisher Scientific	72-18-4	Usado para complementar o meio TX.
Megacell RPMI-1640 Medium	Sigma	M3817	Usado para preparação de meio
Miscellaneous pipette tips	Multiple providers	NA	Para manuseio geral de líquidos
Mouse recombinant LIF	STEMCELL Technologies	78056	Usado para preparação de meio
N2 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17502