Farmacologia Integrada em Redes, Metabolômica e Validação in vivo da Decocção Liangxue Dihuang em Camundongos de Colite Ulcerativa Induzida por DSS

Resumo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho reproduzível que integra farmacologia em rede, metabolômica não direcionada e validação in vivo para elucidar os mecanismos multicomponentes da Decocção de Liangxue Dihuang em um modelo camundongo induzido por sulfato de sódio dextrano de colite ulcerativa.

Resumo

A colite ulcerativa () é uma doença inflamatória crônica do intestino caracterizada por inflamação intestinal persistente e desregulação metabólica. As fórmulas da medicina tradicional chinesa (MTC) são amplamente utilizadas na prática clínica para distúrbios inflamatórios; no entanto, abordagens experimentais sistemáticas para elucidar seus mecanismos multicomponentes e multi-alvo permanecem limitadas. Este artigo apresenta um protocolo experimental reprodutível que integra farmacologia em rede, metabolômica não direcionada e validação in vivo para investigar os efeitos anti-inflamatórios da Decocção Liangxue Dihuang (LXDHD) em um modelo camundono de UC induzido por dextrano sulfato de sódio (DSS). O fluxo de trabalho inclui preparação da decocção herbal, modelagem da colite induzida pelo DSS, avaliação da atividade da doença, avaliação histopatológica e hematológica, medição de citocinas séricas, perfil metabolômico baseado em LC–EM e análise computacional de rede. Usando essa abordagem integrada, a colite induzida pelo DSS foi estabelecida com sucesso, e o tratamento com LXDHD resultou em melhorias mensuráveis no índice de atividade da doença, comprimento do cólon, danos histopatológicos, níveis de citocinas inflamatórias e perfis metabólicos. Análises de farmacologia em redes e metabolômica demonstraram ainda que esse protocolo permite a identificação de alvos-chave, vias e metabólitos associados à intervenção terapêutica. Esse fluxo de trabalho visualizado e padronizado fornece uma estrutura metodológica prática para estudar os mecanismos farmacológicos das fórmulas de MTC multicomponente em doenças inflamatórias intestinais e pode ser adaptado a outras prescrições herbais e modelos de doença.

Introdução

A colite ulcerativa () é uma doença inflamatória crônica do intestino caracterizada por inflamação mucosa contínua do^cólon-1, levando a sintomas como dor abdominal, diarreia, sangramento retal e perda^{de peso 2}. A incidência da tem aumentado mundialmente, impondo um fardo substancial aos sistemas de saúde e prejudicando significativamente a qualidade de vida dos^{pacientes 3}. Embora a etiologia da permaneça incompleta, evidências acumuladas indicam que respostas imunes desreguladas, produção excessiva de citocinas inflamatórias, estresse oxidativo e distúrbios metabólicos desempenham papéis centrais na patogênese^{da doença 4,5}.

As estratégias terapêuticas atuais para a incluem principalmente aminosalicitos, corticosteroides, agentes imunossupressores e biológicos que visam citocinas^{inflamatórias 6}. Embora esses tratamentos possam aliviar sintomas e induzir remissão, seu uso a longo prazo frequentemente está associado a efeitos adversos, altos custos e respostas terapêuticas^{variáveis 7,8,9}. Além disso, uma proporção considerável de pacientes não alcança a remissão sustentada, destacando a necessidade de abordagens terapêuticas alternativas ou complementares com maior segurança e eficácia multi-alvo.

A medicina tradicional chinesa (MTC) tem sido amplamente utilizada no tratamento de distúrbios gastrointestinais há séculos e é cada vez mais reconhecida por seus potenciais benefícios em doenças inflamatórias complexas, como a UC¹⁰. Ao contrário das terapias de alvo único, as fórmulas da MTC normalmente exercem efeitos terapêuticos por meio de múltiplos componentes atuando em múltiplos alvos e vias, o que pode abordar melhor a natureza multifatorial da UC¹¹. Estudos clínicos e experimentais sugerem que certas prescrições de MTC podem modular respostas imunes, suprimir inflamação, proteger a integridade da barreira intestinal e regular a homeostase^metabólica 12,13,14,15.

A Decocção Liangxue Dihuang (LXDHD) é uma fórmula clássica da MTC tradicionalmente usada para "resfriar o sangue e limpar o calor" e tem sido clinicamente aplicada para distúrbios inflamatórios e hemorrágicos¹⁶. A receita consiste em várias ervas, incluindo Scutellaria baicalensis, Phellodendron chinense, Rehmannia glutinosa, Paeonia suffruticosa, Paeonia lactiflora, Sanguisorba officinalis, Platycladus orientalis, Saposhnikovia divaricata, Citrus aurantium, Angelica sinensis e Glycyrrhiza uralensis. Estudos farmacológicos modernos mostraram que várias ervas constituintes e seus compostos ativos possuem propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes e^{imunomoduladoras} 17,18,19. No entanto, os efeitos terapêuticos gerais e os mecanismos subjacentes da LXDHD na ainda não foram sistematicamente esclarecidos.

A farmacologia de redes surgiu como uma abordagem eficaz para explorar as complexas interações entre fórmulas herbais multicomponentes e alvos moleculares relacionados a^{doenças 20}. Ao integrar informações de múltiplos bancos de dados, a farmacologia em redes pode prever potenciais compostos ativos, alvos terapêuticos e vias de sinalização, fornecendo uma compreensão em nível de sistema dos mecanismos da^{MTC 21}. No entanto, a farmacologia em redes baseia-se principalmente em previsões de banco de dados e não reflete diretamente mudanças metabólicas in vivo .

A metabolômica, como ferramenta poderosa para perfilar alterações metabólicas globais, oferece insights complementares sobre a fisiopatologia da doença e respostas terapêuticas²². Na, análises metabolômicas revelaram distúrbios significativos no metabolismo lipídico e aminoácido, bem como vias relacionadas ao estresse^oxidativo 23,24,25. Integrar a metabolômica com farmacologia em rede pode ajudar a reduzir a lacuna entre alvos moleculares previstos e fenótipos metabólicos reais, melhorando assim a confiabilidade das interpretações mecanicistas.

No presente estudo, uma estratégia integrada que combina farmacologia de rede, metabolômica não direcionada e validação experimental foi empregada para investigar os efeitos anti-inflamatórios e os potenciais mecanismos da LXDHD em um modelo de camundongo de UC induzido por dextrano sulfato de sódio (DSS) (Figura 1A). Esse desenho metodológico geral, integrando previsões in silico com validação metabolômica e fenotípica in vivo , está de acordo com os rigorosos quadros de pesquisa^{estabelecidos 26}. A análise farmacológica em redes foi usada para identificar compostos ativos, potenciais alvos terapêuticos e vias de sinalização enriquecidas pelo tratamento com LXDHD. Metabolômicas não direcionadas foram realizadas para caracterizar alterações metabólicas induzidas pela e sua modulação pelo LXDHD. Além disso, os principais achados foram validados por meio de experimentos in vivo , incluindo avaliações da atividade da doença, alterações histopatológicas, parâmetros hematológicos e níveis de citocinas inflamatórias.

Ao integrar previsões computacionais, perfil metabólico e validação biológica, este estudo visa fornecer uma compreensão abrangente dos mecanismos multicomponente, multi-alvo e multi-via subjacentes aos efeitos terapêuticos do LXDHD na. Esse trabalho não apenas oferece evidências experimentais que apoiam o uso do LXDHD como uma possível terapia complementar para a, mas também fornece uma estrutura metodológica para investigar os mecanismos de outras fórmulas complexas da MTC.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais com animais foram realizados de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing (Aprovação nº #2025DW-034-01; Data de aprovação: 24 de março de 2025). A preparação da Decocção Liangxue Dihuang foi realizada de acordo com os procedimentos descritos na Farmacopeia^{Chinesa 27}. Os reagentes, produtos químicos e softwares usados no protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação da Decocção Liangxue Dihuang (LXDHD)

1. Prepare os materiais herbais secos de acordo com a formulação padrão do LXDHD. A composição exata das ervas, os nomes botânicos e as doses exatas prescritas das onze ervas constituintes são especificadas na Tabela 1.
   NOTA: Autentique todos os materiais herbais por um farmacêutico qualificado antes do uso para garantir a identidade botânica e a consistência da qualidade. Manter registros de autenticação para reprodutibilidade.
2. Preparação em pó
   1. Seque ao ar livre todos os materiais herbais em temperatura ambiente, em um ambiente limpo e bem ventilado.
   2. Pulverize cada erva individualmente usando um moedor mecânico até obter um pó fino.
   3. Combine os pós de acordo com as proporções prescritas.
   4. Passe o pó misturado por uma peneira de 80 malhas (diâmetro interno 180 μm ± 7,6 μm) para garantir um tamanho uniforme das partículas.
   5. Homogeneize completamente o pó peneirado.
      NOTA: Tamanho uniforme das partículas é essencial para uma eficiência consistente na extração. Moagem incompleta ou mistura desigual pode resultar em variabilidade na composição química.
3. Preparação do extrato aquoso LXDHD
   1. Pese com precisão o pó de ervas misturado e adicione água destilada na proporção de 1:10 (p/v).
   2. Aqueça a mistura até ferver e descocte por 20 minutos.
   3. Filtre o extrato e colete o filtrado.
   4. Adicione água destilada fresca ao resíduo e repita a decocção por mais 20 minutos.
   5. Combine os dois filtrados para obter o extrato aquoso final LXDHD.
      NOTA: A dupla decocção é essencial para garantir a extração eficiente tanto dos componentes solúveis em água quanto dos moderadamente solúveis.
4. Concentração e armazenamento
   1. Concentre a decocção combinada sob pressão reduzida ou aquecimento suave até que a concentração desejada seja alcançada.
   2. Deixe o extrato esfriar até a temperatura ambiente.
   3. Armazene o extrato de LXDHD preparado a 4 °C e use em até 48 horas.
      NOTA: Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento, pois eles podem degradar compostos bioativos e reduzir a reprodutibilidade experimental.
5. Administração
   1. Leve o extrato à temperatura ambiente antes da administração.
   2. Administrar a decocção aquosa concentrada de LXDHD a camundongos por gavage oral nas doses designadas de acordo com o agrupamento experimental.

2. Design de experimentos com animais

1. Animais e condições de moradia
   1. Obtenha machos C57BL/6 camundongos (com idades de 6 a 8 semanas, 20–25 g) de um fornecedor certificado de animais de laboratório.
   2. Camundongos domésticos em condições padrão de laboratório com ciclo de 12 horas de luz/escuridão, temperatura controlada (22–25 °C) e umidade relativa (50%–60%).
   3. Ofereça aos camundongos acesso livre à comida e água padrão durante todo o experimento.
   4. Permita que os camundongos se aclimatem por pelo menos 7 dias antes da experimentação.
      NOTA: Inclua apenas camundongos saudáveis com atividade e peso corporal normais em experimentos subsequentes.
2. Agrupamento e cálculo da dose
   1. Calcule a dosagem de camundongos de LXDHD de acordo com o princípio de conversão de dose humano–animal descrito em Metodologia de Experimentos Farmacológicos, com base em um peso corporal adulto padrão de 70 kg e uma dose clínica diária de 8,4 g²⁸.
   2. Divida aleatoriamente os camundongos nos seguintes grupos (n = 6 por grupo): grupo controle normal, grupo modelo UC induzido por DSS, grupo LXDHD em baixa dose (1,09 g/kg), grupo LXDHD em dose alta (2,18 g/kg) e grupo controle positivo 5ASA (100 mg/kg⁾²⁹.
      NOTA: Realize randomização usando uma tabela de números aleatórios para minimizar o viés de seleção.
   3. Indução da e administração de medicamentos
      1. Prepare solução DSS 2,5% (p/v) na água potável.
      2. Administrar a solução DSS ad libitum a camundongos nos grupos modelo, tratado com LXDHD e 5ASA por 7 dias^{consecutivos e 30}.
      3. Forneça água purificada para camundongos do grupo controle normal.
      4. Administrar LXDHD e 5ASA aos grupos de tratamento uma vez ao dia por gávage oral nas doses correspondentes durante todo o período experimental.
      5. Administrar um volume igual de solução veicular aos grupos de modelos normais de controle e DSS.
         NOTA: Prepare a solução DSS de novo e substitua a cada 2 dias. Os lotes de DSS podem variar em potência indutora de colite; Realize testes piloto ao usar um novo lote. O estabelecimento bem-sucedido do modelo de induzido pelo DSS é caracterizado por perda progressiva de peso corporal, diarreia com sangue, escores elevados de DAI e encurtamento marcante do cólon. Esses critérios e o desenho metodológico dos experimentos com camundongos são consistentes com os padrões de referência^{estabelecidos 31}.
3. Preparação de soro em branco e contendo medicamentos para metabolômicas exógenas
   1. Use uma coorte separada de machos saudáveis C57BL/6.
   2. Divida aleatoriamente os camundongos em dois grupos: o grupo em branco e o grupo LXDHD.
   3. Administrar LXDHD ao grupo LXDHD por gavage oral a 2,18 g/kg uma vez ao dia por 7 dias consecutivos.
   4. Administre um volume igual de água destilada ao grupo em branco.
   5. Colete amostras de sangue 1 hora após a administração final.
   6. Processe amostras de sangue para obter soro conforme descrito anteriormente na Seção 3.5.

3. Avaliação da atividade da doença

1. Monitore diariamente o peso corporal, a consistência das fezes e o sangramento fecal durante o experimento.
2. Calcule o Índice de Atividade da Doença (DAI) com base na perda de peso corporal, consistência das fezes e sangramento fecal. O marco específico de pontuação está detalhado na Tabela 3. Calcule o
   pontuação final do DAI como a média (ou soma) desses três^{parâmetros 32}.
3. Ao final do oitavo dia, anestesiem camundongos de cada grupo com 1% de pentobarbital de sódio (30 mg/kg). Colete aproximadamente 400 μL de sangue do plexo venoso retroorbital de cada camundongo. Subsequentemente, eutanasia dos animais por luxação cervical para garantir a morte, em estrita conformidade com as Diretrizes da Associação Americana de Medicina Veterinária (AVMA) para a Eutanásia de Animais (Figura 1B).
   NOTA: Confirme anestesia adequada beliscando suavemente os dedos e a superfície plantar das patas traseiras; A ausência de resposta de retirada indica profundidade suficiente de anestesia.
4. Colete tecidos do cólon e meça o comprimento do cólon como indicador da gravidade da doença.
   NOTA: O encurtamento do comprimento do cólon é considerado uma característica marcante da colite induzida pelo DSS com^{gravidade 33}.
5. Obtenção do soro sanguíneo
   1. Deixe uma parte das amostras coletadas coagular em temperatura ambiente por 1 hora.
   2. Centrifuge amostra a 1.000 × g por 15 minutos a 4 °C para obter soro.
   3. Quantifique os níveis séricos de interleucina (IL)-1β, IL-6, IL-17, fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) e IL-10.
   4. Colete amostras de tecido do cólon para análise histopatológica.
   5. Use amostras de sangue restantes para análise periférica.
   6. Reserve amostras adicionais de soro para análise metabolômica.

4. Coloração por Hematoxilina–Eosina (H&E)

1. Fixe os tecidos do cólon com paraformaldeído a 4% por pelo menos 24 horas.
2. Desidratar tecidos por meio de uma série de etanol graduado.
3. Limpe os tecidos com xileno e embutido na parafina.
4. Corte as seções do tecido (3–5 μm de espessura) usando um microtomo.
5. Desparafinizar seções com xileno.
6. Reidrate as seções com etanol graduado.
7. Seções de coloração com hematoxilina para visualização nuclear.
8. Contracolorar seções com eosina para coloração citoplasmática.
9. Observe mudanças histopatológicas sob um microscópio óptico e capture imagens representativas usando o software de imagem associado.
10. Avalie os escores histológicos (SCH) com base na gravidade da inflamação, profundidade da lesão e dano da cripta.
11. Consulte a Tabela 4 para critérios detalhados de pontuação histológica.
    NOTA: Capture imagens representativas de incrustação, seção e coloração de tecidos para aprimorar a visualização do protocolo.

5. Análise do sangue periférico

1. Colete amostras periféricas de sangue em tubos anticoagulantes EDTA-K2 (1,5 mg de EDTA por mL de sangue).
2. Inverta suavemente os tubos 8–10 vezes para garantir a mistura adequada.
3. Analise a contagem de células sanguíneas usando um analisador hematológico veterinário de três partes (Mindray BC-2600vet) com calibração específica por espécie.
4. Transporte amostras a 4 °C.
5. Analise as amostras em até 4 horas após a coleta.
   NOTA: Exclua amostras que mostrem hemólise ou coagulação da análise.

6. Ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA)

NOTA: IL-6, IL-17, IL-1β e TNF-α são citocinas pró-inflamatórias chave, enquanto IL-10 é uma citocina anti-inflamatória fundamental. Essas citocinas refletem a presença e a gravidade das respostas^{inflamatórias 34}.
A medição dessas citocinas é crucial para entender os processos inflamatórios e avaliar a eficácia dos tratamentos anti-inflamatórios.

1. Colete amostras de sangue do plexo venoso retroorbital.
2. Deixe as amostras coagularem em temperatura ambiente por 1 hora.
3. Centrifuge amostra a 1.000 × g por 15 minutos a 4 °C para obter soro.
4. Meça os níveis séricos de IL-1β, IL-6, IL-17, TNF-α e IL-10 usando kits ELISA comerciais.
5. Meça a absorção usando um leitor de microplacas equipado com software padrão de aquisição de dados.
6. Calcule as concentrações de citocinas com base em curvas padrão.
   NOTA: Analise todas as amostras e padrões em duplicado para reduzir a variabilidade técnica.

7. Análise LC–MS da Decocção Liangxue Dihuang

1. Preparação de amostras
   1. Pesar com precisão 10 g do pó de ervas cru misto LXDHD.
   2. Dissolva o pó em 30 mL de água quente.
   3. Realize extração ultrassônica por 30 minutos.
   4. Misture 100 μL do extrato com 400 μL de metanol.
   5. Vórtice por 10 minutos.
   6. Centrifuge a 14.000 × g por 10 minutos.
   7. Colete o sobrenadante como solução de teste.
2. Condições LC–MS
   1. Realize separação cromatográfica usando um sistema LC acoplado a um espectrômetro de massa Q.
   2. Use uma coluna C18 (150 × 2,1 mm, 1,8 μm).
   3. Defina a fase móvel da seguinte forma: solvente A, 0,1% de ácido fórmico em água; solvente B, metanol.
   4. Ajuste a vazão para 0,30 mL/min.
   5. Ajuste a temperatura da coluna para 35 °C.
   6. Ajuste o volume de injeção para 5 μL.
   7. Aplique o seguinte programa de elução de gradiente:
      0–2 min, 5% B;
      2–15 min, 5–95% B;
      15–18 min, 95% B;
      18–18,1 min, 95–5% B;
      18,1–22 min, 5% B.
   8. Defina os parâmetros da espectrometria de massa da seguinte forma: vazão de gás da bainha, 35 arb; Vazão de gás auxiliar, 10 arb; tensão de pulverização, 3,5 kV (positivo) e 2,8 kV (negativo); temperatura capilar, 320 °C; temperatura do aquecedor a gás auxiliar, 350 °C.
   9. Adquira dados MS tanto em modos de íons positivos quanto negativos com uma faixa completa de varredura MS de m/z 100–1500 (resolução: 70.000).
   10. Realize varreduras MS2 (dd-MS2) dependentes de dados com resolução de 17.500.
   11. Processe dados brutos e identifique compostos usando o banco de dados mzCloud.

8. Análise metabolômica não direcionada do soro

1. Preparação da amostra de soro e controle de qualidade (QC)
   1. Amostras de soro de descongelamento em gelo.
   2. Transfira 50 μL de soro para um tubo centrífugo de 1,5 mL.
   3. Adicione 200 μL de metanol/acetonitrilo frio (1:1, v/v).
   4. Faça vórtice por 1 minuto para precipitar proteínas.
   5. Incube no gelo por 15 minutos.
   6. Centrifuge a 14.000 × g por 15 minutos a 4 °C.
   7. Transfira o sobrenadante para um novo tubo.
   8. Seque o extrato usando um concentrador a vácuo.
   9. Reconstituir em 100 μL de acetonitrila/água (1:1, v/v).
   10. Vortex completamente.
   11. Centrifuge novamente a 14.000 × g por 15 minutos a 4 °C.
   12. Colete o sobrenadante para análise LC-MS.
   13. Prepare amostras de controle de qualidade agrupando 10 μL de alíquotas de cada amostra.
   14. Injete uma amostra de controle de qualidade para cada 8–10 amostras experimentais para monitorar a estabilidade e repetibilidade do instrumento.
2. Configurações de aquisição do LC-MS
   1. Realize a separação cromatográfica usando o sistema LC com uma coluna C18 (150 × 2,1 mm, 1,8 μm).
   2. Ajuste a temperatura da coluna para 35 °C.
   3. Ajuste a vazão para 0,30 mL/min.
   4. Ajuste o volume de injeção para 2 μL (modo positivo) ou 5 μL (modo negativo).
   5. Use o solvente A (0,1% de ácido fórmico em água) e o solvente B (acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico).
   6. Aplique um programa de elução linear em gradiente.
   7. Operar o espectrômetro de massa em modos HESI positivo e negativo.
   8. Ajuste a faixa de varredura de massa para m/z 100–1500.
   9. Ajuste a tensão de pulverização para 3,5 kV (positivo) e 2,8 kV (negativo).
   10. Ajuste a temperatura capilar para 320 °C.
3. Processamento de dados e identificação diferencial de metabólitos
   1. Importe dados brutos do LC-MS (arquivos .raw) para o software.
   2. Realize alinhamento de picos, captação de picos e correção de linha de base.
   3. Normalize as características da área de pico extraídas para a intensidade total dos íons.
   4. Identifique metabólitos comparando padrões precisos de fragmentação de massa (tolerância à massa < 5 ppm) e MS/MS com bases de dados mzCloud e ChemSpider.
   5. Realize análise estatística multivariada (PCA e OPLS-DA/PLS-DA).
   6. Defina metabólitos diferenciais com base nos seguintes limiares: VIP > 1,0 e p < 0,05 (teste t do Estudante).

9. Análise de farmacologia de redes

NOTA: A farmacologia de redes foi empregada para prever componentes ativos e alvos-chave do LXDHD no UC^35,36. A metodologia inclui mineração de banco de dados, processamento de informações químicas, aquisição de dados de bioatividade, recuperação de alvos proteicos, perfilamento de expressão gênica, construção de redes de interação e análise de enriquecimento de^{vias 37,38}.

1. Cribragem ativa de compostos
   1. Recupere compostos ativos do banco de dados e análise de sistemas de medicina tradicional chinesa (TCMSP) (acessado em 10 de dezembro de 2025) usando OB ≥ 30% e DL ≥ 0,18.
   2. Suplementar compostos por meio de buscas bibliográficas no PubMed e Web of Science (10–15 de dezembro de 2025).
   3. Padronize alvos usando o banco de dados UniProt (acessado em 15 de dezembro de 2025).
2. Identificação de alvos de doenças
   1. Colete alvos relacionados à UC dos bancos de dados GeneCards, OMIM, TTD e DrugBank (acessado em 15 de dezembro de 2025).
3. Construção e análise da rede
   1. Identifique alvos que se cruzam usando o pacote VennDiagram no software R.
   2. Construa a rede usando o software Cytoscape.
   3. Analise a topologia usando o plugin NetworkAnalyzer e o plugin CytoNCA.
4. Rede PPI e identificação de alvos centrais
   1. Importar alvos que se intersectam para o banco de dados STRING.
   2. Restringa espécies a Homo sapiens.
   3. Remova nós isolados.
   4. Aplique um limiar de pontuação PPI > 0,9.
   5. Exporte dados e analise no software.
   6. Calcule DC, BC, EC, CC, NC e LAC.
   7. Realize filtragem baseada em mediana para gerar subredes e identificar alvos^{centrais 39}.
5. Análise de Enriquecimento GO e KEGG
   1. Realize o enriquecimento GO e KEGG usando pacotes R e Biocondutores.
   2. Use pacotes R, incluindo org. Hs.eg.db, clusterProfiler, DOSE, enrichplot, stringi e ggplot2.
   3. Defina limiares de significância em p = 0,05 e q = 0,05.
   4. Realize análises GO para as categorias MF, BP e CC.
   5. Realize o enriquecimento e classificação da via^{KEGG 40}.
6. Acoplamento molecular
   1. Baixe estruturas compostas do TCMSP no formato SDF.
   2. Baixe estruturas proteicas do AlphaFold no formato PDB.
   3. Realizar acoplamento usando o servidor web CB-DOCK2 (CADD Lab, Universidade de Sichuan, Chengdu, China).
   4. Defina os arquivos receptores e ligantes de acordo.
   5. Registre a pose e a energia de ligação ótimas.
      NOTA: O acoplamento foi realizado usando um algoritmo^{genético 41}. Os resultados foram classificados por energia de ligação.

10. Análise estatística

1. Realize análise estatística usando o software GraphPad Prism.
2. Expresse dados quantitativos como média ± desvio padrão (DE).
3. Teste a normalidade usando o teste de Shapiro–Wilk.
4. Teste a homogeneidade da variância usando o teste de Brown–Forsythe.
5. Realize ANOVA unidirecional com o teste post hoc de Tukey para dados normalmente distribuídos.
6. Realize o teste de Kruskal–Wallis com o teste de Dunn para dados não paramétricos.
7. Considere p < 0,05 como estatisticamente significativo.
   NOTA: Um valor-p menor indica uma diferença estatística maior entre os grupos.

Resultados

Análise de farmacologia de redes de LXDHD na UC

A farmacologia em redes foi aplicada para prever os potenciais alvos terapêuticos e os mecanismos moleculares da LXDHD na. Um total de 211 compostos com propriedades farmacocinéticas favoráveis foram analisados no banco de dados TCMSP, incluindo 36 de Scutellaria baicalensis, 37 de Phellodendron chinense, 10 de Rehmannia glutinosa, 11 de Paeonia suffruticosa, 2...

Discussão

Esse método apresenta um fluxo de trabalho experimental visualizado e reproduzível, integrando farmacologia de rede, metabolômica não direcionada e validação in vivo para investigar os efeitos anti-inflamatórios das fórmulas da MTC em um modelo camundongo de induzido por DSS. Ao contrário dos estudos farmacológicos convencionais, que focam principalmente em conclusões mecanicistas isoladas, este protocolo enfatiza a robustez do próprio arcabouço metodológico, ao mesmo tempo em q...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido 5-Aminosalicílico (5-ASA)	Sigma-Aldrich	A3537	Medicamento controle positivo para colite ulcerativa; administrada a 100 mg/kg por gávage oral.
Acetonitrila (grau LC-MS)	Merck	100030	Usado para preparação de amostras de metabolômica e fase móvel de LC-MS.
Banco de Dados de Estrutura de Proteínas AlphaFold	EMBL– Instituto Europeu de Bioinformática	https://alphafold.ebi.ac.uk/	Banco de dados usado para obter estruturas tridimensionais previstas de proteínas-alvo.
Angelica sinensis (Dang Gui)	Hospital de Medicina Chinesa da Província de Jiangsu	Lote: 2409001	Erva constituinte do LXDHD (Dose: 1,6 g).
CB-Dock2	Laboratório CADD	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/	Plataforma baseada na web usada para acoplamento molecular e previsão de ligando e ndash; modos de ligação de proteínas.
Citrus aurantium (Zhi Ke)	Hospital de Medicina Chinesa da Província de Jiangsu	Lote: 2409001	Erva constitutiva do LXDHD (Dose: 0,5 g).
Software Descoberta de Compostos	Thermo Fisher Scientific	Versão 3.3	Usado para processamento de dados de LC– MS e identificação de compostos.
CTAn Software	Bruker	Versão 1.17	Usado para reconstrução de imagens 3D Micro-CT e análise de erosão óssea.
Citoscape	Consórcio Cytoscape	Versão 3.8.0	Software usado para construção e visualização de redes.
Dextrano Sulfato de Sódio (DSS)	MP Biomédicos	160110	Peso molecular 36.000– 50.000 Da; Usado para induzir colite ulcerativa em camundongos.
Tubos anticoagulantes EDTA-K2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	N/A	Usado para coleta de sangue periférico.
Solução de Coloração por Eosina	Biosharp	N/A	Usado para contracoloração citoplasmática em H& Coloração com E.
Etanol	Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD	64-17-5	Usado para desidratação de tecidos.
Ácido fórmico (grau LC-MS)	Merck	5.33002	Usado para preparação da fase móvel LC-MS.
Glycyrrhiza uralensis (Gan Cao)	Hospital de Medicina Chinesa da Província de Jiangsu	Lote: 2409001	Erva constitutiva do LXDHD (Dose: 0,5 g).
GraphPad Prisma	GraphPad Software	Versão 9.0	Usado para análise estatística e apresentação gráfica.
Analisador de Hematologia	Mindray	BC-2600vet	Analisador hematológico veterinário em três partes para análise de rotina de sangue.
Solução de Coloração de Hematoxilina	Biosharp	BL700B	Usado para H& Coloração por E em seções do tecido do cólon.
Centrífuga de alta velocidade	Hitachi	CT15E/CT15RE	Usado para soro e preparação de amostras.
Kit IL-10 ELISA (Mouse)	MEIMIANA	MM-0176M2	Usado para avaliar os níveis séricos de IL-10.
Kit IL-17 ELISA (Mouse)	Abclonal	RK00039	Usado para medir os níveis séricos de IL-17.
IL-1 e beta; Kit ELISA (Mouse)	Abclonal	RK00006	Usado para detecção de IL-1 e beta séricos; níveis.
Kit IL-6 ELISA (Mouse)	Abclonal	RK00008	Usado para quantificar os níveis séricos de IL-6.
ImageJ (Fiji) Software	Institutos Nacionais de Saúde (NIH)	Versão 1.53c	Software de código aberto usado para processamento e quantificação de imagens.
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	Versão 3.7	Software de imagem usado para capturar lâminas histopatológicas.
Metanol (grau LC-MS)	Merck	106035	Usado para preparação de amostras de metabolômica e fase móvel de LC-MS.
Camundongos (macho C57BL/6)	Anokang Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Animais experimentais (idade 6 e ndash; 8 semanas, 20 e NDASH; 25 g) usado para o modelo UC induzido por DSS.
MzCloud Database	Thermo Fisher Scientific	https://www.mzcloud.org/	Banco de dados usado para correspondência espectral MS/MS.
Microscópio Óptico	Leica	DM500	Usado para observação histopatológica.
Paeônia lactiflora (Chi Shao)	Hospital de Medicina Chinesa da Província de Jiangsu	Lote: 2409001	Erva constituinte do LXDHD (Dose: 0,6 g).
Córtex sufragista da Paeônia (Mu Dan Pi)	Hospital de Medicina Chinesa da Província de Jiangsu	Lote: 2409001	Erva constitutiva do LXDHD (Dose: 0,5 g).
Paraformaldeído (4%)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	N/A	Usado para fixação de tecidos do cólon.
Microtomo Patológico	Leica	RM2016	Usado para preparação de seções de tecido de parafina.
Chinense de feledendro (Huang Bo)	Hospital de Medicina Chinesa da Província de Jiangsu	Lote: 2409001	Erva constitutiva do LXDHD (Dose: 0,5 g).
Platycladus orientalis (Ce Bai Ye Tan)	Hospital de Medicina Chinesa da Província de Jiangsu	Lote: 2409001	Erva constituinte do LXDHD (Dose: 0,7 g).
Espectrômetro de Massa de Alta Resolução Exativo Q	Thermo Fisher Scientific	Q Exativo	Espectrômetro de massa baseado em Orbitrap para análise LC–MS.
R Software	Fundação R para Computação Estatística	Versão 4.2.1 (https://www.r-project.org/)	Software usado para análises de enriquecimento GO e KEGG.
Rehmannia glutinosa (Sheng Di Huang)	Hospital de Medicina Chinesa da Província de Jiangsu	Lote: 2409001	Erva constituinte do LXDHD (Dose: 2,1 g).
Sanguisorba officinalis (Di Yu Tan)	Hospital de Medicina Chinesa da Província de Jiangsu	Lote: 2409001	Erva constituinte do LXDHD (Dose: 0,6 g).
Saposhnikovia divaricata (Fang Feng)	Hospital de Medicina Chinesa da Província de Jiangsu	Lote: 2409001	Erva constituinte do LXDHD (Dose: 0,3 g).
Scutellaria baicalensis (Huang Qin)	Hospital de Medicina Chinesa da Província de Jiangsu	Lote: 2409001	Erva constitutiva do LXDHD (Dose: 0,5 g).
Pentobarbital sódico (1%)	Sigma-Aldrich	P3761	Usado para anestesia animal antes da coleta da amostra.
SoftMax Pro Software	Dispositivos Moleculares	Versão 7.1	Software de aquisição e análise de dados usado com o leitor de microplacas para ELISA.
Banco de Dados STRING	Consórcio STRING	https://string-db.org/	Banco de dados usado para proteína & ndash; Análise de interação proteica.
Banco de Dados TCMSP	Plataforma TCMSP	https://tcmsp-e.com/	Banco de dados usado para triar compostos ativos e prever alvos de medicamentos.
TNF-&alfa; Kit ELISA (Mouse)	Abclonal	RK00027	Usado para determinar TNF-e alfa no soro; concentrações.
Sistema Ultimate 3000 RS LC	Thermo Fisher Scientific	Ultimate 3000 RS	Sistema UHPLC acoplado a espectrometria de massas.
Purificador Ultrassônico	Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd	KQ3200E	Usado para extração ultrassônica de LXDHD.
Banco de Dados UniProt	Consórcio UniProt	https://www.uniprot.org/	Banco de dados usado para padronização de nomes de genes e proteínas.
Misturador de vórtices	Beijing PowerStar Technology Co., Ltd	LC-Vórtice-P1	Usado para mixagem de samples.
Coluna Welch AQ-C18 (150 e vezes 2,1 mm, 1,8 e mu; m)	Materiais Welch	AQ-18-15021	Coluna usada para separação de metabólitos e componentes herbais.
Xylene	Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD	1330-20-7	Usado para limpeza de tecidos durante o processamento histológico.