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Artigo de método

Medindo a Dinâmica Traducional de mRNA em Células Vivas com Marcação Luminescente Dividida em Células HEK293

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DOI:

10.3791/70840

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14 de agosto de 2026

 ,  ,  , 
1Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Pharmacology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um método flexível e compatível com alto rendimento para medir dinâmicas de tradução de mRNA vivo em células HEK293, utilizando marcação luminiscente dividida. Este ensaio versátil distingue efeitos estruturais, auxilia na otimização da transcrição in vitro e agiliza o desenvolvimento de terapias com mRNA.

Resumo

O desenvolvimento acelerado da vacina para combater a COVID-19 ilustrou o potencial dos terapêuticos baseados em RNA mensageiro (mRNA) de transformar o desenvolvimento de medicamentos. Assim como o mRNA maduro, o mRNA transcrito in vitro possui os mesmos elementos, incluindo uma capa 5’, regiões não traduzidas (UTRs), sequência codificante e uma cauda poli(A). Estudos anteriores que investigaram os efeitos desses componentes na tradução do mRNA utilizaram principalmente proteínas repórter altamente modificadas, que apresentam tradução eficiente e estabilidade proteica. Como os elementos estruturais de cada mRNA afetam diferencialmente sua tradução, é fundamental identificar o desenho ideal relevante à proteína terapêutica de interesse (POI). Para permitir a caracterização da tradução da POI, foi empregado um sistema de complementação de luciferase dividida. Uma etiqueta peptídica curta (HiBiT), que pode ser fundida a qualquer uma das extremidades da POI, associa-se ao seu heterodímero complementar (LgBiT), reconstituindo a atividade enzimática na presença de um substrato permeável às células. Até o momento, a marcação com luminescência dividida tem sido utilizada principalmente em estudos de alto rendimento sobre a degradação proteica. Anteriormente, demonstramos como a marcação com luminescência dividida pode ser empregada para quantificação de alto rendimento da tradução do mRNA ao longo do tempo in cellulo em células HEK293 que expressam constitutivamente o heterodímero complementar. Aqui, demonstramos ainda mais a versatilidade desse ensaio e detalhamos como ele pode ser utilizado para otimizar a transcrição in vitro, reduzindo custos. O sistema de ensaio pode distinguir unicamente alterações em componentes estruturais, destacando ao mesmo tempo os efeitos da otimização da sequência codificante com genes não modificados. Além disso, demonstramos que uma redução de 4 vezes na concentração da capa 5’ para transcrição in vitro resulta em tradução equivalente in cellulo. Esses achados ilustram como a marcação com luminescência dividida pode ser facilmente integrada ao fluxo de trabalho de terapêuticos de mRNA, permitindo o monitoramento em tempo real da dinâmica de expressão proteica mediada por mRNA in cellulo, oferecendo assim um método versátil para o avanço de terapêuticos baseados em mRNA.

Introdução

Os terapêuticos e aplicações de pesquisa baseados em RNA mensageiro (mRNA) expandiram-se rapidamente nos últimos anos, impulsionados pelo sucesso das vacinas de mRNA1,2 e pelo crescente reconhecimento da versatilidade do RNA como uma biomolécula programável. Um desafio central nesse campo é a capacidade de avaliar quantitativa e dinamicamente a eficiência da tradução de mRNA em diversos contextos. O método descrito aqui – que utiliza um sistema de marcação luminiscente dividido – fornece uma plataforma flexível e escalonável para estudar a tradução de mRNA em tempo real in cellulo3. O objetivo geral deste método é permitir que pesquisadores meçam como características de sequência, modificações químicas e elementos estruturais influenciam a cinética da tradução e a degradação subsequente da proteína, oferecendo assim uma ferramenta poderosa para otimizar construtos de mRNA para aplicações terapêuticas e científicas básicas.

O mRNA transcrito in vitro espelha a arquitetura essencial de transcritos maduros, incorporando uma capa 5′, regiões não traduzidas (UTRs), uma sequência codificante e uma cauda poli(A), além de frequentemente incluir nucleotídeos modificados para reduzir a imunogenicidade4,5. Trabalhos extensivos demonstraram que cada um desses elementos – isoladamente ou em combinação – pode ser engenharizado para influenciar fortemente a eficiência da tradução e o rendimento proteico6,7. No entanto, a maioria dos estudos anteriores baseou-se em proteínas repórter altamente otimizadas, como a Proteína Verde Fluorescente (GFP)7, NanoLuc8 ou a proteína spike do SARS-CoV-28,9, que são projetadas para se traduzirem com alta eficiência e produzirem proteínas muito estáveis, e, portanto, não refletem os desafios enfrentados em contextos terapêuticos. Como os mRNAs terapêuticos codificam diversas proteínas de interesse (POIs), cada uma sujeita a restrições estruturais únicas e regulação específica de tipo celular, os princípios de design que maximizam a tradução para um determinado construto podem não ser generalizáveis a outro, conforme relatado anteriormente3. Assim, identificar a configuração ideal para uma determinada POI terapêutica é essencial e exige métodos capazes de avaliar de forma sensível e sistemática como características individuais do transcrito contribuem para a produção proteica.

Métodos focados em ribossomos, como o perfilamento de polissomos, distinguem frações de tradução por meio de centrifugação em gradiente10, enquanto o perfilamento de ribossomos (Ribo-seq) fornece resolução em nível de nucleotídeo da ocupação ribossomal, sítios de iniciação e pausas11. Assim como o Ribo-seq, outras abordagens baseadas em sequenciamento, como o Sequenciamento de Alto Rendimento de RNA Isolado por Imunoprecipitação com Reticulação Cruzada (HITS-CLIP) e a Purificação por Afinidade de Ribossomos em Tradução (TRAP), caracterizam ainda mais a tradução de RNAs associados a proteínas ligadoras de RNA ou a ribossomos12. Embora poderosos, esses métodos exigem preparação complexa, equipamentos especializados e conhecimento computacional, tornando-os inadequados para o desenvolvimento de mRNA terapêutico de alto rendimento. A imunoprecipitação de cadeias nascentes13 mede a eficiência de tradução utilizando proteínas marcadas com FLAG imunoprecipitadas de ribossomos e quantificadas por Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa Quantitativa (qRT-PCR). Embora adaptável a mRNAs terapêuticos, o ensaio é trabalhoso, carece de resolução temporal e não é adequado para aplicações de alto rendimento. O sistema SunTag14 oferece medidas em tempo real da produção de síntese proteica e da regulação traducional a partir de moléculas individuais de mRNA, funcionando por meio da interação de um fragmento variável monocatenário (scFv) fundido à GFP com repetições em tandem do epítopo peptídico. Esse sistema permite medidas dinâmicas da tradução e da localização com resolução de única molécula de mRNA, tendo sido, portanto, explorado para desenvolver inúmeros sistemas de rastreamento de cadeias nascentes15,16. No entanto, essa abordagem apresenta baixo rendimento e exige o uso de microscópios de alta potência.

Embora a marcação da proteína nascente seja inevitável, identificou-se o uso potencial de uma etiqueta peptídica pequena, derivada da luciferase NanoLuc, para relatar a tradução de mRNA em células vivas. A NanoLuciferase foi projetada para ser dividida em uma subunidade pequena, de 11 aminoácidos (HiBiT), e uma subunidade maior, de 158 aminoácidos (LgBiT), que podem rapidamente dimerizar e, na presença de substrato, reconstituir uma luciferase funcional17,18. Existem várias vantagens-chave do sistema de marcação luminiscente dividido para estudos da dinâmica de mRNA. Primeiramente, o tamanho mínimo da subunidade pequena fundida à POI permite que o construto codificado permaneça o mais próximo possível da proteína de interesse nativa. Como o comprimento da sequência codificante pode afetar diretamente as taxas de tradução19, minimizar o comprimento da etiqueta melhora nossa previsão da dinâmica de tradução de mRNA sintéticos. Crucialmente, essa estratégia de marcação mínima permite a detecção de diferenças na tradução impulsionadas por variações na sequência codificante sinônima, permitindo que a eficiência traducional seja investigada independentemente da sequência ou estabilidade da proteína3. Por esse motivo, o uso de etiquetas maiores, como proteínas fluorescentes ou luciferases completas, é subótimo. Em segundo lugar, o sistema de marcação luminiscente dividido empregado aqui permite a geração imediata do sinal. Sua reação de complementação rápida e eficiente in cellulo apresenta alta afinidade relatada (KD = 700 pM) e já foi utilizada para medir modulações na degradação proteica com leituras tão frequentes quanto a cada 30 s18. Embora o sistema original de marcação luminiscente dividido tenha sido principalmente comparado a outros sistemas de luciferase dividida17,18, a vantagem principal neste contexto é que a geração do sinal não é limitada pela maturação proteica. Em contraste, as proteínas fluorescentes requerem maturação do cromóforo, que pode ocorrer em escala de minutos a horas20, limitando assim a resolução temporal. Finalmente, o sistema de marcação luminiscente dividido aqui empregado supera limitações dos sistemas de proteínas fluorescentes divididas, que normalmente exigem a formação do cromóforo após a complementação21, introduzindo um atraso adicional e limitando sua adequação para capturar processos rápidos e dinâmicos. Estudos anteriores demonstraram a utilidade da marcação luminiscente dividida em ensaios de turnover proteico e estudos de degradação22,23,24. Estender essa tecnologia consolidada à cinética de tradução representa um avanço metodológico significativo. Por exemplo, embora o perfilamento de ribossomos possa revelar a densidade de ribossomos ao longo dos transcritos, ele não consegue facilmente capturar mudanças dinâmicas nas taxas de iniciação ou alongamento da tradução sob diferentes condições. Como ilustrado anteriormente3, este sistema de marcação luminiscente dividido pode detectar diferenças ao alterar a estrutura do cap, a composição da região não traduzida 5′ (UTR), a otimização de códons, modificações de nucleotídeos e o comprimento da cauda poli(A), todos os quais são determinantes críticos da eficiência traducional. Essa ampla aplicabilidade torna o método singularmente poderoso para dissecar as contribuições de características individuais do mRNA na produção proteica total. Vale ressaltar que, dependendo do instrumento utilizado, tanto dados de célula única quanto de poço inteiro podem ser obtidos com esta tecnologia. Plataformas de imagem capazes de adquirir imagens baseadas em luminescência podem potencializar o uso desta tecnologia para estudar a dinâmica de tradução em nível de célula única. Aqui, focamos em uma aplicação baseada em leitor de placas, devido à sua natureza de média a alta produtividade e exigência mínima de análise de dados.

Pesquisadores que considerem este método devem avaliar sua adequação à luz de seus objetivos experimentais específicos. O ensaio é particularmente valioso em contextos onde é necessária a triagem em alto rendimento de construtos de mRNA sintético, como nos fluxos de trabalho de design de terapias baseadas em mRNA. É bem adequado para análises comparativas de características de sequência de mRNA sintético – incluindo regiões não traduzidas, uso de códons ou modificações de nucleotídeos – nas quais pequenas diferenças na eficiência de tradução podem ser detectadas3. Como o sistema é compatível com plataformas de tradução livre de células, ensaios em células vivas e um ensaio lítico específico por ponto temporal, oferece flexibilidade aos pesquisadores que desejam adaptar seu delineamento experimental a estudos mecanicistas ou a pesquisas aplicadas. Ao mesmo tempo, é importante reconhecer os limites da técnica. Criticamente, o ensaio de marcação com luminescência dividida não fornece resolução da ocupação ribossômica, uma capacidade que permanece exclusiva das abordagens de footprinting de ribossomos, nem mede diretamente a estabilidade ou degradação do RNA, o que pode precisar ser avaliado utilizando métodos complementares. No entanto, devido às limitações das técnicas existentes centradas em ribossomos, os pesquisadores dependem de ensaios baseados em marcadores, como o sistema de luminescência dividida, para investigar a expressão proteica mediada por mRNA com resolução temporal como um indicador da dinâmica traducional. Assim, embora este sistema seja uma ferramenta poderosa para monitorar a expressão proteica induzida por mRNA sintético, sua adequação depende de a questão de pesquisa estar focada na produção proteica dinâmica, e não no posicionamento fino dos ribossomos ou na degradação do RNA.

Em resumo, o sistema de marcação luminiscente dividido representa um método poderoso e versátil para o estudo da tradução de mRNA. Seu objetivo geral é fornecer aos pesquisadores um sistema flexível, escalonável, de alto rendimento e capaz de detectar diferenças na produção proteica decorrentes de mRNA sintético com elementos estruturais e de sequência variáveis3. A justificativa para seu desenvolvimento reside na superação das limitações das técnicas existentes, oferecendo vantagens em sensibilidade, escalabilidade e resolução temporal. Inserido na literatura mais ampla sobre biologia e terapêutica do RNA, este método constitui um acréscimo valioso ao repertório experimental, permitindo tanto avanços fundamentais quanto aplicações translacionais. Ao considerar cuidadosamente os pontos fortes e as limitações do ensaio, os pesquisadores podem determinar sua adequação para aplicações específicas, maximizando assim seu impacto no campo em rápida evolução da ciência do RNA.

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Protocolo

Uma representação gráfica de todo o protocolo é mostrada na Figura 1.

1. Preparação do molde para transcrição in vitro (IVT)

OBSERVAÇÃO: Para preparar o molde de DNA para a transcrição in vitro (IVT), certifique-se de que o DNA plasmidial contenha um promotor para RNA polimerase (geralmente T7 ou SP6), regiões UTR 5’ e 3’ e o quadro de leitura aberto do POI (Figura 1).

  1. Linearize o DNA plasmidial utilizando uma enzima de restrição com um sítio de corte único localizado após a UTR 3’ e monte a reação de acordo com as instruções do fabricante. Após a incubação, purifique a reação de digestão com restrição utilizando um kit de purificação de DNA baseado em coluna de centrifugação. Quantifique o DNA utilizando um espectrofotômetro.
  2. Para confirmar a linearização, prepare um gel de agarose TAE a 1% contendo o corante de DNA brometo de etídio na concentração de 0,1 µg/mL. Misture 150 ng de DNA digerido com água e corante de carga. Carregue o gel de agarose com a amostra, plasmídeo não cortado e uma escada de DNA, e execute o gel de agarose a 100 V por 40 minutos em tampão Tris-acetato-EDTA (TAE) 1×. Visualize com um sistema de imagem para géis.
    CAUTION: A solução de brometo de etídio é um potente mutagênico e exige manipulação cuidadosa com o uso de equipamento de proteção individual (EPI) apropriado.
  3. Se o DNA plasmidial não possuir uma cauda poli(A) imediatamente após a UTR 3’, introduza-a por meio de PCR. Realize a PCR de acordo com as instruções do fabricante, utilizando uma polimerase de alta fidelidade e iniciadores adequadamente projetados. Certifique-se de que o amplicon inclua o promotor T7, o quadro de leitura aberto e uma cauda poli(A).
    NOTE: As tecnologias de "capping" podem ter requisitos específicos de sequência no promotor T7; portanto, esses requisitos podem ser atendidos por meio do design apropriado do iniciador direto. O iniciador reverso liga-se à extremidade da UTR 3’ e introduz uma cauda poli(A) (comprimento recomendado de pelo menos 80 T). Para construtos com alto teor de GC, recomenda-se PCR em etapas ascendentes e/ou adição de DMSO a 3%.
  4. Para confirmar a PCR bem-sucedida, prepare um gel de agarose TAE contendo brometo de etídio (ver etapa 1.2). Se o comprimento do construto for ≥1 kb ou <1 kb, prepare um gel a 1% ou 2%, respectivamente. Misture 5 µL da reação de PCR com água e corante de carga. Carregue o gel de agarose com a amostra e com uma escada de DNA, e execute-o a 100 V por 40 minutos em tampão TAE. Visualize com um sistema de imagem para géis.
  5. Após a confirmação do tamanho por PCR, purifique a reação de PCR utilizando um kit de purificação de DNA baseado em coluna de centrifugação. Elua em 15–20 µL de tampão de eluição (frequentemente fornecido com o kit de purificação de DNA) ou água livre de nucleases para concentrar o molde de DNA a ser usado na transcrição in vitro (IVT). Quantifique o DNA utilizando um espectrofotômetro.

2. Transcrição in vitro

  1. Antes de começar, pulverize e limpe a bancada, as luvas e as pipetas com uma solução de descontaminação de RNase. Para melhorar o rendimento e a qualidade, realize este procedimento em um ambiente de capela estéril.
  2. Descongele e monte os componentes de um kit de transcrição in vitro (IVT) baseado em T7 de acordo com as instruções do fabricante.
    NOTA: Alguns fabricantes recomendam o uso de ditiotreitol (DTT, 0,1 M) para limitar a oxidação da reação e melhorar a eficiência. Esta etapa é recomendada quando compatível com o kit. Se estiver usando dNTPs modificados, substitua o nucleotídeo não modificado equivalente pela mesma quantidade de nucleotídeo modificado. Avalie o rendimento de uma reação em meia escala, já que nenhuma melhoria substancial no rendimento foi observada com a reação completa. Ao sintetizar mais de um mRNA, recomenda-se criar uma mistura-mestre para reduzir erros e variabilidade na pipetagem.
  3. Pipete bem e misture brevemente, em seguida incube a 37 °C por 5 h com tampa aquecida para evitar condensação. Prolongue a incubação para a noite, se necessário, pois isso tem efeito mínimo sobre o rendimento ou a integridade do mRNA.
  4. Adicione 1 µL de DNase I e pipete completamente. Incube a 37 °C por 30 min.
  5. Purificação do RNA transcrito in vitro (IVT)
    1. Limpe a reação de IVT utilizando um kit de purificação de RNA baseado em coluna, conforme as instruções do fabricante (diferentes kits podem resultar em diferentes níveis de recuperação e apresentar capacidades de ligação variadas). Para a eluição, adicione 60 µL de água livre de nucleases e incube à temperatura ambiente por 5 min antes da centrifugação.
    2. Alternativamente, utilize a precipitação com cloreto de lítio como uma abordagem mais econômica e flexível.
      1. Adicione um volume igual de cloreto de lítio 7,5 M à reação, misture e incube a -20 °C durante a noite.
      2. Centrifugue a 18.300 × g por 20 min a 4 °C, em seguida remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet de RNA.
      3. Lave com 950 µL de etanol a 70% e centrifugue a 18.300 × g por 5 min a 4 °C. Remova o sobrenadante, deixe o pellet secar por aproximadamente 5 min à temperatura ambiente e reconstitua em água livre de nucleases (60 µL é o padrão; reduza o volume conforme o tamanho do pellet para aumentar a concentração).
        CAUTELA: O cloreto de lítio pode causar irritação na pele ou nos olhos se os EPIs adequados não forem utilizados. Use luvas e proteção ocular ao manipulá-lo. Além disso, o etanol é um líquido altamente inflamável e pode causar irritação ocular. Mantenha-o afastado de chamas expostas e use EPIs apropriados, incluindo proteção ocular.
  6. Quantifique o mRNA utilizando um espectrofotômetro. Certifique-se de que a razão A260/A280 do mRNA seja ~2,0 e confirme que a razão A260/A230 esteja entre 1,8 e 2,2.
  7. Para confirmar a transcrição IVT bem-sucedida, prepare um gel de agarose a 1% em tampão TAE (não desnaturante) contendo brometo de etídio. Misture 500 ng de mRNA com água e corante de carga, e siga as instruções do fabricante para o preparo da escada de RNA e as instruções de desnaturação. Carregue o gel de agarose e execute-o a 80 V por 40 min em tampão TAE. Visualize com um sistema de imagem para géis.
  8. Para confirmação adicional do tamanho correto do mRNA, analise as amostras em um Bioanalisador.
  9. Para evitar ciclos de congelamento e descongelamento, alíquota o mRNA no volume necessário para o experimento. Por exemplo, use 1,2 pmol de mRNA por poço em uma placa de 96 poços. Portanto, alíquota o volume apropriado para 1,2 pmol × n réplicas e armazene a -80 °C.

3. Transfecção reversa em HEK293

OBSERVAÇÃO: Para obter medidas temporais, é necessária uma linhagem celular que expresse constitutivamente o fragmento complementar de luciferase. Isso pode ser alcançado pela criação de uma linhagem celular estável por meio da transfeção de um plasmídeo que expresse o fragmento de luciferase necessário e subsequente seleção clonal. Isso permite ao usuário medir dinâmicas traducionais de mRNA com resolução temporal em qualquer contexto celular de escolha. Alternativamente, linhagens celulares que expressem o fragmento de luciferase necessário podem ser adquiridas comercialmente. Esses experimentos foram realizados utilizando células HEK293 que expressam constitutivamente o heterodímero complementar.

  1. Antes de começar, descongele o mRNA em gelo para evitar degradação.
  2. Prepare os complexos de transfeção. Para uma placa de 96 poços, são necessários 1,2 pmol de mRNA por poço. Se for realizar em duplicatas, prepare quantidade suficiente para 2,5 duplicatas para compensar erros de pipetagem. Portanto, combine 3 pmol de mRNA com meio Opti-MEM com soro reduzido até um volume final de 50 µL (20 µL/poço).
  3. Adicione 0,5 µL de reagente de transfeção baseado em lipídio catiônico (0,2 µL/poço), misture pipetando para cima e para baixo e incube à temperatura ambiente. Após 5 minutos de incubação, misture novamente pipetando para cima e para baixo, depois adicione 20 µL por poço em uma placa de microplaca de 96 poços, branca e com fundo plano. Sugere-se que os poços de transfeção sejam colocados no centro da placa, deixando os poços das bordas vazios.
  4. Prepare as células HEK293 removendo o meio e lavando com 2 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem Ca2+ e Mg2+. Remova a lavagem e adicione 500 µL de tripsina-EDTA, depois incube a 37 °C por 3 minutos.
  5. Durante a dissociação celular, preencha os poços das bordas da placa de 96 poços com PBS para diminuir a evaporação do meio durante o cultivo celular. Se todos os poços forem necessários, a placa pode ser inundada com PBS entre os poços.
  6. Adicione 4,5 mL de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com L-glutamina 1× e 10% de soro bovino fetal (FBS) para coletar as células. Realize a contagem celular utilizando um hemocitômetro ou contador automático de células.
  7. Transfira a quantidade necessária de células (suficiente para semear 1 × 105 células por poço) mais 3 poços extras (para compensar erros de pipetagem) para um tubo novo e centrifugue a 500 × g por 2 minutos.
  8. Remova o sobrenadante e re-suspenda as células no volume necessário de meio Leibovitz L-15 (sem fenol) suplementado com 10% de FBS e substrato Endurazine para células vivas (1:200) para garantir uma concentração final de 1 × 106 células/mL. Misture com uma pipeta serológica para assegurar a homogeneidade da mistura do Endurazine. Pipete 100 µL (1 × 105 células) das células re-suspensas por poço.
    NOTA: Se estiver realizando experimentos de curso temporal de 72 h, aumente o volume para 200 µL para evitar evaporação.
  9. Imediatamente após a transfeção, coloque as células em um leitor de placas (luminômetro) ajustado a 37 °C. Realize leituras em intervalos regulares com um tempo de integração de 1 s. Devido à eficiência do sistema de complementação, o sinal é detectável em minutos. Portanto, para obter uma leitura precisa da linha de base, este passo deve ser executado prontamente. Esses intervalos dependem do experimento e do instrumento; no entanto, nestes experimentos, medir a cada 12 minutos em experimentos de 18 h e a cada 48 minutos em experimentos de 72 h mostrou-se ideal. A luminiscência não requer filtro para medição; entretanto, observou-se uma melhor relação sinal-ruído ao utilizar um filtro de 530–540 nm.
    NOTA: Um sinal de Transferência de Energia por Ressonância de Bioluminescência (BRET) é gerado a partir da eGFP marcada com luciferase dividida; portanto, um filtro de 530–540 nm capturará tanto o sinal luminiscente quanto o fluorescente. Para evitar a captação do BRET, utilize um filtro de 460–480 nm ou, alternativamente, use uma proteína não fluorescente, como MYL3, como referência.

4. Análise dos dados

  1. Calcule as variações de expressão em unidades relativas de luminiscência (RLUs), normalizando o sinal de cada condição em relação ao seu primeiro ponto temporal (t0, normalizado à média das réplicas técnicas), já que o sinal no início do ensaio representa o nível de fundo.
  2. Reduza a variabilidade entre réplicas biológicas normalizando em relação a uma condição controle.
  3. Escolha a análise estatística para o ensaio, seja um único ponto temporal ou a área sob a curva (AUC), dependendo da pergunta em estudo.
    1. Para um único ponto temporal, utilize os pontos em que ocorre a expressão máxima (os quais dependem do alvo de interesse, POI) juntamente com o tempo final. Represente graficamente os RLUs calculados na etapa 4.1 no ponto temporal específico (por exemplo, 240 min) e analise-os utilizando um teste estatístico apropriado.
    2. Avalie a dinâmica da tradução e degradação proteica calculando a AUC para um intervalo de tempo específico (por exemplo, t0 a 240 min) ou para toda a duração do ensaio (por exemplo, t0 até o ponto final). Normalize o valor da AUC de cada réplica biológica à média do RNA mensageiro de referência, obtendo assim uma medida de variação de expressão na AUC que pode ser analisada por meio de testes estatísticos apropriados.

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Resultados

Existem várias maneiras pelas quais a relação custo-eficácia deste protocolo pode ser otimizada. Por exemplo, a reação de IVT foi miniaturizada para metade do volume recomendado pelo fabricante, e verificou-se que o rendimento resultante atendeu à quantidade necessária para experimentos in cellulo. Deve-se notar que o comprimento e a complexidade da sequência impactam o rendimento da IVT, portanto, uma otimização bem-sucedida do protocolo deve gerar pelo menos 50 µg de mRNA por reação de IVT. Assim como os kits ...

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Discussão

O campo dos terapêuticos baseados em mRNA expandiu-se rapidamente nos últimos anos, destacando a importância do design e otimização de sequências como uma etapa crítica no processo de desenvolvimento. Esforços significativos têm se concentrado na criação de ferramentas computacionais para prever as estruturas e composições de RNA mais eficazes, com atenção especial voltada para a otimização da sequência8,9. Embora essas ferramentas sejam poderosas, a validação ex...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Laura Itzhaki pela linhagem celular HEK293 LgBiT. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de projeto e uma bolsa de tradução do British Heart Foundation (G114642 e G919651 para CHW) e por uma Bolsa de Pesquisa em Ciências da Vida da GenScript (CAPB).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido AcéticoSigma-AldrichA6283Componente do tampão TAE
AgaroseSigma-AldrichA9539Eletroforese em gel
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BBiolanalisador utilizado para controle de qualidade de mRNA
CLARIOstar Plus LuminometerBMG Labtech430-501S-FLeitor de placas/luminômetro utilizado para medição de luminescência
CleanCap AGTrilink BiotechnologiesN-7113Capa 5' utilizada para IVT
DMEM, alta glicose, piruvatoThermo Fisher Scientific41966029Meio utilizado para cultura de células HEK293-LgBiT
DNase INew England BiolabsM0303Degrada o molde de DNA após a reação de IVT
Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco (PBS)Sigma-AldrichD8537Para lavagem celular e adição à placa para prevenir evaporação
EDTA, pH 8,0, livre de RNaseThermo Fisher ScientificAM9260Componente do tampão TAE
Brometo de EtídioSigma-AldrichE1510Corante para eletroforese em gel
Soro Bovino Fetal (FBS)Sigma-AldrichF7524Suplemento adicionado ao DMEM
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BiolabsE2040Kit de transcrição in vitro (IVT)
Meio Leibovitz L-15, sem fenol vermelhoThermo Fisher Scientific21083027Meio utilizado para cultura de HEK293-LgBiT durante medições de luminescência
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030-024Suplemento adicionado ao DMEM
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150Reagente de transfeção baseado em lipídios
Solução de Precipitação com Cloreto de LítioThermo Fisher ScientificAM9480Abordagem alternativa para purificação de mRNA após IVT
Monarch Spin PCR & DNA Cleanup KitNew England BiolabsT1130Kit de purificação após linearização do plasmídeo
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-WEspectrofotômetro utilizado para quantificação da concentração de DNA e mRNA
Nano-Glo Endurazine Live Cell SubstratePromegaN2570Substrato necessário para luminescência adicionado ao meio L-15 
NucleoSpin RNA Cleanup KitMacherey-Nagel12708612Purifica mRNA após reação de IVT
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom MicroplateThermo Fisher Scientific136101Placa utilizada para semeadura de HEK293-LgBiT e medições subsequentes
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985062Meio utilizado para reação de transfeção
Phusion High-Fidelity PCR KitNew England BiolabsE0553Kit de PCR
RiboRuler High Range RNA LadderThermo Fisher Scientific11883993Escada de RNA para eletroforese em gel
RNaseZapThermo Fisher ScientificR2020Aspersão descontaminante de RNase
TRIZMA BaseSigma-AldrichT6066Componente do tampão TAE
Solução de Tripsina-EDTASigma-AldrichT4174Reagente de dissociação celular
Água Destilada UltraPure livre de DNase/RNaseThermo Fisher Scientific10977035Utilizada para preparação do molde e para IVT

Referências

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  3. Ascanelli C, Lawrence E, Batho CAP, Wilson CH. A flexible, high-throughput system for studying live mRNA translation with HiBiT technology. Nucleic Acids Res. 2025;53(11).
  4. Qin S et al. mRNA-based therapeutics: Powerful and versatile tools to combat diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):166.
  5. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
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