É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Tradução de mRNA In Vitro Livre de Células em Lisados de Drosophila

368 visualizações

⸱

DOI:

10.3791/70844

⸱

12 de junho de 2026

 ,  ,  ,  , 
1mRNA and Cancer Laboratory, Subdirección de Investigación Básica, Instituto Nacional de Cancerología (INCan; National Institute of Cancer), 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnologico de Monterrey, 3Escuela de Ingeniería y Ciencias, Tecnologico de Monterrey

Neste artigo

Resumo

Aqui, fornecemos detalhes sobre como preparar lisados e realizar tradução in vitro usando embriões de Drosophila .

Resumo

A tradução in vitro de mRNA livre de células desempenhou um papel crucial na compreensão do processo de síntese proteica durante a expressão gênica em eucariotos. O desenvolvimento de lisados a partir de diferentes sistemas para tradução in vitro tem sido fundamental para estudar os papéis da maioria dos componentes da máquina de tradução e para dissecar muitas etapas do processo de síntese proteica. Diferentes aspectos da tradução e do controle translacional foram estudados usando lisados de Drosophila melanogaster. Este artigo fornece protocolos detalhados para preparar modelos sintéticos de mRNA, cultivar culturas de moscas vivas em grande escala, preparar lisados competentes para tradução a partir de embriões de Drosophila e realizar reações de tradução in vitro sem células. Este protocolo é adequado para qualquer espécie do gênero Drosophila — melanogaster, virilis, pseudoscura, grimshawi, hydei, etc. Comparamos ainda esse protocolo com outros sistemas de tradução e discutimos limitações, etapas críticas e solução de problemas. Resultados representativos são incluídos para ajudar a avaliar o desempenho e a reprodutibilidade do protocolo. Por fim, discutimos possíveis aplicações em biotecnologia e pesquisa.

Introdução

Por mais de um século, Drosophila provou ser um organismo-modelo poderoso e geneticamente manipulável para estudar muitos fenômenos e moléculas biológicas, incluindo controle translacional e a máquina detradução 1,2,3,4. A tradução in vitro livre de células da Drosophila tornou-se uma ferramenta potente para estudar a síntese de proteínas, pois pode recapitular muitos eventos observados in vivo. Assim, Drosophila é um sistema ideal para descobrir novas funções e moléculas que realizam a tradução e o controle translacional. Estudos iniciais estabeleceram um sistema in vitro, competente em translação, no artrópode relacionado a moscas Artemia salina5 e, posteriormente, em Drosophila hydei6.

Posteriormente, lisados responsivos a mRNAs exógenos foram desenvolvidos em Drosophila melanogaster. A maioria dos estudos sobre Drosophila em tradução in vitro foi realizada em embriões de diferentes idades, embora algumas variações do tampão de reação de tradução tenham sido usadas por diferentes grupos de pesquisa. Para comparação, os diferentes fenômenos estudados e as condições de reação de translação estão listados na Tabela 1. Além dos embriões, protocolos para tradução in vitro livre de células usando ovócitos de Drosophila 10,22,23,24,25,26 e lisados de células de Schneider ou Kc cultivados também foram desenvolvidos 17,27,28,29,30,31,32. Uma descrição dos componentes necessários para a tradução in vitro e uma comparação entre lisados de diferentes espécies são descritas nasreferências 33,34.

Embora o processo de tradução de mRNA seja conservado entre eucariotos, diferenças significativas entre táxons são encontradas principalmente na etapa de início da tradução, quando várias moléculas reprimem ou promovem a tradução ao longo do desenvolvimento, de maneira específica por táxon ouespécie 35,36. Esse protocolo é muito adequado para estudar a tradução de mRNA em insetos ao longo do desenvolvimento, para a qual lisados de Metazoários filogeneticamente distantes não podem ser usados, incluindo lisados comerciais de trigo ou coelho. De fato, esse protocolo pode recapitular os eventos de tradução que ocorrem durante a embriogênese, algo impossível ao usar lisados deoócitos 23. Até o momento, nenhuma comparação entre sistemas embrionários, oócitos e de células cultivadas de Drosophila foi realizada. Adicionar modificações pós-traducionais às proteínas sintetizadas in vitro é uma limitação deste protocolo em seu estado atual. Além disso, esse método não produz quantidades preparativas de proteína em comparação com métodos para produzir proteínas recombinantes em bactérias.

Aqui, descrevemos protocolos detalhados para cultivar rotineiramente gaiolas em grande escala de moscas Drosophila , preparar modelos sintéticos de mRNA, preparar lisados competentes para tradução a partir de embriões e realizar ensaios de tradução in vitro sem células. A Tabela de Materiais mostra os reagentes necessários ao longo do protocolo.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1) Construção de plasmídeos de molde para transcrição in vitro

  1. Selecione plasmídeos contendo uma região não traduzida (UTR) de 5', um cistron repórter, um UTR de 3' e uma cauda poli(A) a jusante de um promotor de RNA polimerase T7, T3 ou SP6. Certifique-se de que cada construto contenha um sítio de restrição único imediatamente a jusante da cauda poli(A) para linearização plasmídica antes da transcrição (Figura 1).
    NOTA: O sítio da enzima de restrição utilizado deve ser cuidadosamente escolhido para que o local de reconhecimento fique fora da sequência transcrita ou que permita que o DNA linearizado termine em A. Além disso, a enzima de restrição deve deixar um saliência romba ou de 5' na extremidade de 3' do molde. Saliências 3' podem resultar em produtos de transcrição aberrantes. Se uma enzima com saliência de 3' for usada, o fragmento deve ser embotado antes do uso.
  2. Verifique todos os conceitos por sequenciamento antes de usá-los como modelos para transcrição in vitro .
    NOTA: Construções repórteres luciferase Firefly (FLuc) com cauda poly(A)71 foram usadas para esse fluxo de trabalho. As construções FLuc são derivadas da fita cassetepLUC 12. Informações sobre vetores e kits estão listadas na Tabela de Materiais.

2) Transcrição in vitro de mRNAs capados e poliadenilados

  1. Linearize cada construção plasmídica usando o único sítio de restrição a jusante da cauda poli(A) (aqui, KpnI).
  2. Resolva o DNA linearizado por eletroforese em gel 1%-agarose, executada a 100 V por 1 hora.
  3. Extrair o DNA em gel e verificar sua integridade e linearização adequada por eletroforese em gel de agarosa idêntica.
    NOTA: Não é necessário purificar o DNA linearizado com gel — se o DNA for completamente cortado, então uma purificação em coluna ou precipitação por fenol/ETOH é suficiente.
  4. Transcreva o DNA linearizado purificado usando um kit de transcrição in vitro , conforme as instruções do fabricante. Inclua um análogo de 5' na reação de transcrição para estabilizar o RNA e estimular a tradução.
    NOTA: Um análogo funcional de cap, como o RNAm 7G(5′)ppp(5′)G, suporta estabilização de transcritos e estimulação por translação. Um análogo de condensação não funcional, como G(5′)ppp(5′)A, suporta estabilização de transcritos, mas não estimulação por translação. Esse inibidor da tradução é usado quando transcritos bicustrônicos são traduzidos para testar a presença de sítios internos de entrada de ribossomos (IRES) que conduzem a translação do segundo cistron7. Para testar a dependência de uma cauda poli(A), ela pode ser excluída no plasmídeo do modelo antes da transcrição ser realizada.
  5. Trate todas as reações de transcrição com DNase livre de RNase para remover o molde de DNA após a transcrição, conforme as instruções do fabricante. Todos os kits de transcrição in vitro fornecem a DNase livre de RNase.
  6. Purifique o transcrito por precipitação de cloreto de lítio ou limpeza de RNA em coluna conforme as instruções do fabricante.
    NOTA: Todos os kits de transcrição in vitro fornecem os reagentes cloreto de lítio.
  7. Quantifique por espectroscopia o transcrito purificado e avalie a integridade do mRNA por eletroforese em gel de 1% de agarose, executada a 100 V por 1 hora.
  8. Aliquota o mRNA e armazene a -70 °C até o uso.

3) Manutenção rotineira de uma cultura de Drosophila em grande escala

  1. Use a referência Drosophila melanogaster do tipo selvagem Oregon-R.
  2. Prepare comida para moscas de acordo com uma receita estabelecida por centro de referência.
    NOTA: Os autores usaram a receita37 do Bloomington Drosophila Stock Center como referência para preparação de alimentos. Detalhes dessa receita são apresentados na Tabela 237. A Figura 2 mostra o fluxo de trabalho geral desde a coleta de embriões até a quantificação da atividade da luciferase.
  3. Coloque uma gaiola cúbica ou cilíndrica de acrílico com aproximadamente 1 m de comprimento e 50 cm de diâmetro.
  4. Faça um furo de aproximadamente 30 cm de diâmetro na parte superior da gaiola e o sele com malha (Figura 3).
  5. Coloque papel úmido sobre a malha para fornecer água às moscas e substitua o papel úmido todos os dias (Figura 3).
  6. Mantenha a parte frontal da gaiola aberta e coberta com tecido para permitir o acesso ao interior da gaiola. Coloque acrílico na parte de trás da gaiola plástica para moscas, totalmente selado.
  7. Amplifique o estoque de moscas antes da coleta dos embriões e coloque ~1.000 filhotes dentro da gaiola. Mantenha a gaiola das moscas constantemente entre 22 e 25 °C.
    NOTA: Várias gaiolas para moscas com as mesmas dimensões e densidade de moscas podem ser mantidas ao mesmo tempo. Moscas depositam ovos por aproximadamente 15 dias e começam a morrer por volta do dia 20.
  8. Alimente as moscas todos os dias com pratos de suco de ágar-fruta cobertos com uma colher de levedura de padeiro reidratada contendo 200 μL de ácido acético ou vinagre.
  9. Para estabelecer a próxima geração de moscas, colete várias placas de embriões de 0 a 12 h de idade. Coloque os embriões em caixas plásticas de 22 cm × 17 cm × 10 cm contendo comida para moscas até uma profundidade de 3 cm. Certifique-se de que as caixas tenham um furo selado com malha, para permitir a circulação de ar e evitar que as larvas escapem (Figura 4). Adicione levedura ativa seca sobre o alimento e deixe os embriões crescerem a 25 °C.
  10. Após 3 dias, coloque papel dobrado de 5 cm de altura nas caixas para que as larvas do terceiro ínstar possam subir e se tornar pupas.
  11. Após 10 dias, coloque as caixas contendo moscas adultas recém-nascidas na gaiola. Deixe as moscas saírem das caixas e acasalarem na gaiola por 2 dias.
  12. Para obter embriões de uma idade específica para preparação do lisado, abra a gaiola cuidadosamente e coloque placas de suco de ágar dentro da gaiola durante o período de postura necessário.
  13. Retire os pratos e recolha os ovos usando uma pilha de peneiras.
    NOTA: Para lisados embrionários de 0 a 12 h, coloque dois pratos de suco de ágar na gaiola às 8h e remova-os às 20h para coleta do embrião.
    1. Colete embriões para preparação do lisado entre os dias 3 e 10 após a eclosão das moscas adultas.
    2. Paralelamente, colete embriões nos dias 2–4 e estabeleça uma nova geração de moscas em caixas contendo comida, conforme descrito acima.

4) Preparação de lisados de translação a partir de embriões de Drosophila de 0 a 12 h

NOTA: Este protocolo não inclui o tratamento com nuclease microcócica. Essa etapa foi omitida para evitar a possível degradação do mRNA relator exógeno caso a inativação da nuclease seja incompleta. A tradução de fundo deve ser monitorada em cada experimento usando um controle sem mRNA.
NOTA: Este método é derivado dos protocolos 7,12,14,15,16,17,22 descritos anteriormente.

  1. Prepare o tampão de lise embrionária conforme descrito na Tabela 2 e armazene-o a -20 °C em 1 mL de alíquotas.
    NOTA: Descongele cada alíquota até 2x para uso imediato.
  2. Colete embriões usando uma peneira.
    NOTA: O protocolo padrão utiliza embriões de 0 a 12 h-older, mas outras idades embrionais também podem ser adequadas para preparação do lisado.
  3. Lave os embriões extensivamente com água da torneira e depois com um tampão embrionário contendo 0,9% NaCl + 0,03% Triton X-100.
    NOTA: Embriões podem ser armazenados a 4 °C por até 24 horas antes do processamento.
  4. Descorione embriões por 5 minutos em 50% de tampão embrionário e 50% de alvejante doméstico (hipoclorito de sódio [NaOCl] 4–6% e hidróxido de sódio [NaOH] 0,02–0,1%).
    ATENÇÃO: Use luvas e óculos plásticos transparentes ao manusear água sanitária.
  5. Lave extensivamente com água da torneira. Seque embriões com papel e pese-os.
  6. Transfira embriões embalados para um moedor de tecido de vidro homogeneizador em gelo. Adicione 1 mL de tampão de lise embrionária por cada 1 g de embriões. Homogeneize os embriões no gelo com 20 traços.
  7. Transfira o homogeneado para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifuge a 15.900 × g por 20 minutos a 4 °C.
  8. Recupere a interfase em alíquotas de 50 μL no gelo. Congele as aliquotas em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C.
    NOTA: A interfase é uma solução líquida turva entre as fases superior e inferior. A fase superior é uma camada de lipídios brancos opacos altamente viscosos. A fase inferior é um pellet sólido.
    ATENÇÃO: Evite contaminar a solução de interfase de fases adjacentes.
    ATENÇÃO: Use luvas e óculos plásticos transparentes ao manipular nitrogênio líquido.

5) Reação de tradução in vitro

  1. Configure as reações de tradução em uma placa de 96 poços ou tubos individuais de PCR de 0,2 mL em um termociclador de PCR. Prepare cada reação de translação em um volume final de 17 μL, incluindo 5 μL de lisato embrionário e os componentes restantes da reação descritos na Tabela 2.
    NOTA: O lisado embrionário representa 30% do volume total da reação.
  2. Se proteínas recombinantes forem adicionadas à reação de tradução, dialise a proteína contra pH hepes-koh de 20 mM. Selecione o volume e o corte de peso molecular da fita de diálise de acordo com o volume da amostra e o tamanho da proteína.
    NOTA: A adição de proteínas recombinantes é relevante para o estudo de repressores translacionales ou ensaios dependentes de dose com fatores de iniciação. Evite adicionar PBS às proteínas recombinantes usadas na reação de tradução. Mantenha glicerol em ou abaixo de 5% na amostra de proteína ou na reação de tradução. Se possível, evite adicionar glicerol à reação.
  3. Desnature o mRNA aquecendo a 65 °C por 2 minutos e refrigerando rapidamente no gelo por 2 minutos antes da reação in vitro translation.
  4. Realize a tradução de cada mRNA em triplicada. Configure a reação da seguinte forma: 2,7 μL de coquetel de reação (Tabela 2) + 5 μL de lisado embrionário + mRNA (30 ng) + H2O a 17 μL de volume final. Como mistura master base, siga o coquetel de reação para uma reação na Tabela 2 e escale para o número de reações a serem realizadas. Incube a reação a 25 °C por 60 minutos.
    NOTA: ATP e GTP não são adicionados separadamente à reação padrão descrita aqui. Em nossas mãos, suplementar a reação com ATP/GTP adicional não melhorou a produção da FLuc e reduziu a translação sob as condições testadas. Portanto, a reação é realizada com o sistema regenerador de energia descrito na Tabela 2 , sem suplementação adicional de nucleotídeos.
  5. Programe o termociclador com um passo inicial de 5 minutos a 4 °C, seguido por 60 minutos a 25 °C e um passo final de 10 minutos a 4 °C.
  6. Interrompa a reação adicionando 20 μL de tampão de lise passiva fria 1×. Coloque a reação no gelo por mais 10 minutos.
  7. Armazene as amostras a -20 °C ou proceda à quantificação de luciferase.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

6) Quantificação da luciferase sintetizada

  1. Leve as reações à temperatura ambiente por 20 minutos antes de quantificar a atividade da FLuc.
  2. Leve 10 μL de cada reação de translação e 50 μL de substrato de luciferase (por pelo menos 2 horas antes do uso) à temperatura ambiente.
  3. Adicione o substrato de luciferase à reação de translação. Registre unidades relativas de luz usando um luminômetro automático ou manual. Programe o luminômetro para fazer 10 leituras espaçadas por 1 segundo.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Realizamos reações de translação para analisar a variabilidade da eficiência entre seis preparações independentes de lisato (ou seja, repetições biológicas) usando embriões de 0 a 12 horas de idade. Cada barra representa um triplicado técnico (Figura 5). Eficiência translacional semelhante foi observada, embora com certa variabilidade. Também comparamos a eficiência da tradução entre embriões de diferentes idades. Assim, testamos lisados de embriões de 0–2 h...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Lisados de Drosophila para tradução in vitro livre de células podem produzir resultados reprodutíveis. Embriões em diferentes idades e variações na composição do tampão têm sido usados para investigar uma ampla gama de fenômenos fundamentais na síntese de proteínas e sua maquinaria (Tabela 1). Aqui, descrevemos um método padrão adequado para embriões de qualquer idade para realizar estudos de forma precisa e quantitativa (Tabela 1

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

N.B-Á e G.H. foram apoiados pelo programa de financiamento intramuros do Instituto Nacional de Cáncer (Instituto Nacional de Cancerología, INCan), México; D.E.V. é bolsista posdoutoral do Programa Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación (SECIHTI) "Estancias posdoctorales por México para la Formación y Consolidación de las y los Investigadores por México, 2022". Agradecemos a Fannis Missirlis e Bety Osorio (CINVESTAV, México) pelas moscas.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Folha de alumínioReynoldsN/AFolha de alumínio doméstica padrão; qualquer marca comercial equivalente aceitável.
Mistura de aminoácidosPromegaL4461N/A
Vinagre de maçãHeinzN/AVinagre de maçã comercial (5% de acidez); qualquer marca equivalente aceitável.
Suco de maçã ou uvaJumexN/ASuco de uva comercial; ou qualquer marca comercial equivalente.
Ágar bacteriológicoMerck/Sigma-Aldrich9002-18-0N/A
Ácido bórico (H3BO3)Merck/Sigma-AldrichB6768BioReagent, grau de biologia molecular, ≥99,5%, pó; usado para preparação do tampão TBE.
Cápsula: Anti reverso cap (ARCA): 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G Estrutura de RNA capBioLabsS1411SN/A
Cápsula: m7G(5')ppp(5')G Estrutura análoga do RNA capNew England BiolabsS1404SN/A
Cápsula: Análogo de cap não funcional G(5´)ppp(5´)ANew England BiolabsS1406N/A
Tubo de centrífuga (15 mL)Corning430053N/A
Cocktail completo de inibidores de protease sem EDTARoche11836170001N/A
Fosfocreatina quinase do músculo de coelhoMerck/Sigma-AldrichC-3755N/A
Ácido fosfórico de creatina, sal dissódicaMerck1120A47950N/A
Levedura de padeiro desidratadaFleischmann'sN/ALevedura seca ativa comercial; qualquer marca equivalente aceitável.
Diethyl pirocarbornatoMerck/Sigma-AldrichD575897%(NNR)
DNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchD4004N/A
Drosophila melanogaster linha selvagem tipo Oregon-RBloomington Drosophila Stock Center, Indiana, EUAhttps://bdsc.indiana.edu/index.html ; linhagens mutantes de Drosophila melanogaster, bem como linhagens de referência selvagem de outras espécies de Drosophila, como virilis, pseudoscura, grinshawi, hydei, etc. também são fornecidas por este Centro de Estoque.
Ácido etileno-diamino-tetraacético (EDTA)Merck/Sigma-AldrichE9884Reagente ACS, 99,4-100,6%, pó; usado para preparação do tampão TBE.
HEPESSigmaSLBH4583V99,5%(titrage)
Peróxido de hidrogênio (H2O2)EquateN/APeróxido de hidrogênio comercial (~2,5-3,5% solução de peróxido de hidrogênio; qualquer marca equivalente aceitável.
Sistema de ensaio de luciferase in vitroThermo Fisher ScientificAM1344 e AM1348N/A
KOAc, também chamado de KCH3COOMerck/Sigma-AldrichVáriosN/A
Broth Lb (lennox)Merck/Sigma-AldrichL30221kg 
Sistema de ensaio de luciferasePromegaE1501N/A
Kit de transcrição in vitro MAXIscript T7, T3 ou SP6InvitrogenAM1316 e AM1312N/A
Mg(OAc)2, também chamado de Mg(CH3COO)2Merck/Sigma-AldrichVáriosN/A
NaCl (cloreto de sódio)J.T BakerB17W53Reagente ACS
OligonucleotídeosQualquer empresaN/ASequência específica.
Buffer de lise passiva 5XPromegaE1941N/A
Pontas de pipetaAxygenT-200-YPontas amarelas de 200 microliters.
Pontas de pipetaAxygenT-1000-BPontas azuis de 1ml.
Pontas de pipetaAxygenT-300Pontas transparentes de 0,5-10 microliters.
Ácido propiônicoMerck/Sigma-Aldrich79-09-04Reagente de grau ACS, ≥99,5%, líquido.
Mola de vidro de 5 mL PYREX®PYREX®7724-5N/A
Kit QIAprep spin plasmid miniprepQiagen27106N/A
Kit QIAquick de extração de gelQiagen28704N/A
Liater de reticulócitos de coelho (RRL)PromegaL4960N/A
Sistema de ensaio de luciferase Renilla (RLuc)PromegaE2820N/A
Inibidor de ribonuclease RNasinPromegaN2111AN/A
Kit de limpeza de RNA RNeasy minieluteQiagen74204N/A
Cassettes de diálise Slide-A-LyzerThermo Scientific87735 (No entanto, depende do tamanho de corte molecular).N/A
Hipoclorito de sódio (alvejante)CloroxN/AAlvejante comercial (~5-6% NaOCl); qualquer marca comercial equivalente com concentração semelhante aceitável.
EspermidinaMerck85558N/A
Peneira de aço inoxidávelN/AN/AQualquer fornecedor comercial.
Taq plus precisão DNA polimeraseStratagene600211-51N/A
Ácido ribonucleico de transferência (tRNA) de fígado bovino tipo XIMerck/Sigma-Aldrich9014-25-9 ou R4752N/A
Tris (base Tris)IBI ScientificIB70145Pó de grau de biologia molecular; usado para preparação do tampão TBE.
Triton X-100SigmaSLBX9437Grau Labora

Referências

  1. Marygold SJ, Attrill H, Lasko P. The translation factors of Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 2017;11(1):65-74.
  2. Hernández G, Vazquez-Pianzola P. eIF4E as a molecular wildcard in metazoans RNA metabolism. Biol Rev Camb Philos Soc. 2023;98(6):2284-306.
  3. Kong J, Lasko P. Translational control in cellular and developmental processes. Nat Rev Genet. 2012;13(6):383-94.
  4. Bayer LV, Milano SN, Bratu DP. The mRNA dynamics underpinning translational control mechanisms of Drosophila melanogaster oogenesis. Biochem Soc Trans. 2024;52(5):2087-99.
  5. Filipowicz W, et al. A protein binding the methylated 5′-terminal sequence, m7GpppN, of eukaryotic messenger RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976;73(5):1559-63.
  6. Sondermeijer PJA, Lubsen NH. Heat-shock peptides in Drosophila hydei and their synthesis in vitro. Eur J Biochem. 1978;88(2):331-9.
  7. Hernández G, Vazquez-Pianzola P, Sierra JM, Rivera-Pomar R. Internal ribosome entry site drives cap-independent translation of reaper and heat shock protein 70 mRNAs in Drosophila embryos. RNA. 2004;10(11):1783-97.
  8. Zapata JM, Martínez MA, Sierra JM. Purification and characterization of eukaryotic polypeptide chain initiation factor 4F from Drosophila melanogaster embryos. J Biol Chem. 1994;269(27):18047-52.
  9. Maroto FG, Sierra JM. Purification and characterization of mRNA cap-binding protein from Drosophila melanogaster embryos. Mol Cell Biol. 1989;9(5):2181-90.
  10. Andrews S, Snowflack DR, Clark IE, Gavis ER. Multiple mechanisms collaborate to repress nanos translation in the Drosophila ovary and embryo. RNA. 2011;17(5):967-77.
  11. Smibert CA, et al. Smaug, a novel and conserved protein, contributes to repression of nanos mRNA translation in vitro. RNA. 1999;5(12):1535-47.
  12. Gebauer F, et al. Translational control of dosage compensation in Drosophila by Sex-lethal: cooperative silencing via the 5′ and 3′ UTRs of msl-2 mRNA is independent of the poly(A) tail. EMBO J. 1999;18(21):6146-54.
  13. Pamudurti NR, et al. Translation of circRNAs. Mol Cell. 2017;66(1):9-21.e7.
  14. Vázquez-Pianzola P, Hernández G, Suter B, Rivera-Pomar R. Different modes of translation for hid, grim and sickle mRNAs in Drosophila. Cell Death Differ. 2007;14(2):286-95.
  15. Hernández G, et al. Two functionally redundant isoforms of Drosophila eIF4B are involved in cap-dependent translation, cell survival and proliferation. Eur J Biochem. 2004;271(14):2923-36.
  16. Hernández G, et al. Functional analysis of the AUG initiator codon context reveals novel conserved sequences that disfavor mRNA translation in eukaryotes. Nucleic Acids Res. 2024;52(3):1064-79.
  17. Tuschl T, et al. Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev. 1999;13(24):3191-7.
  18. Scott MP, Storti RV, Pardue ML, Rich A. Cell-free protein synthesis in lysates of Drosophila melanogaster cells. Biochemistry. 1979;18(8):1588-94.
  19. Clark IE, Wyckoff D, Gavis ER. Synthesis of the posterior determinant Nanos is spatially restricted by a novel cotranslational regulatory mechanism. Curr Biol. 2000;10(20):1311-4.
  20. Jeske M, et al. Rapid ATP-dependent deadenylation of nanos mRNA in a cell-free system from Drosophila embryos. J Biol Chem. 2006;281(35):25124-33.
  21. Jeske M, Moritz B, Anders A, Wahle E. Smaug assembles an ATP-dependent stable complex repressing nanos mRNA translation at multiple levels. EMBO J. 2011;30(1):90-103.
  22. Castagnetti S, Hentze MW, Ephrussi A, Gebauer F. Control of oskar mRNA translation by Bruno in a novel cell-free system from Drosophila ovaries. Development. 2000;127(5):1063-8.
  23. Gebauer F, Hentze MW. Studying translational control in Drosophila cell-free systems. Methods Enzymol. 2007;429:23-33.
  24. Hernández G, et al. Mextli is a novel eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein that promotes translation in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 2013;33(15):2854-64.
  25. Lie YS, Macdonald PM. In vitro translation extracts prepared from Drosophila ovaries and embryos. Biochem Biophys Res Commun. 2000;270(2):473-81.
  26. Peng Y, Gavis ER. The Drosophila hnRNP F/H homolog Glorund recruits dFMRP to inhibit nanos translation elongation. Nucleic Acids Res. 2022;50(12):7067-83.
  27. Sanders MM, Triemer DF, Olsen AS. Regulation of protein synthesis in heat-shocked Drosophila cells: soluble factors control translation in vitro. J Biol Chem. 1986;261(5):2189-96.
  28. Storti RV, Scott MP, Rich A, Pardue ML. Translational control of protein synthesis in response to heat shock in Drosophila melanogaster cells. Cell. 1980;22(3):825-34.
  29. Krüger C, Benecke BJ. In vitro translation of Drosophila heat-shock and non-heat-shock mRNAs in heterologous and homologous cell-free systems. Cell. 1981;23(2):595-603.
  30. Zhao F, Yu CH, Liu Y. Codon usage regulates protein structure and function by affecting translation elongation speed in Drosophila cells. Nucleic Acids Res. 2017;45(14):8484-92.
  31. Roy G, et al. The Drosophila poly(A) binding protein-interacting protein, dPaip2, is a novel effector of cell growth. Mol Cell Biol. 2004;24(3):1143-54.
  32. Wakiyama M, Yokoyama S. Posttranscriptional control of protein synthesis in Drosophila S2 cell-free system. Methods Mol Biol. 2014;1118:257-66.
  33. Spirin AS, Swartz JR. Cell-free protein synthesis systems: historical landmarks, classification, and general methods. In: Spirin AS, Swartz JR, editors. Cell-free protein synthesis. Weinheim: Wiley-VCH; 2008. p. 1-34.
  34. Gregorio NE, Levine MZ, Oza JP. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods Protoc. 2019;2(1):24.
  35. Hernández G, Altmann M, Lasko P. Origins and evolution of the mechanisms regulating translation initiation in eukaryotes. Trends Biochem Sci. 2010;35(2):63-73.
  36. Hernández G, Proud C, Preiss T, Parsyan A. On the diversification of the translational apparatus across eukaryotes. Comp Funct Genomics. 2012;2012:256848.
  37. Lakovaara S. Malt as a culture medium for Drosophila species. Drosoph Inf Serv. 1969;44:128.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Tradução Livre de CélulasTradução In VitroSíntese ProteicaMaquinaria de TraduçãoMoldes de mRNA SintéticoControle TranslacionalEmbriões de DrosophilaProtocolo de Tradução
Tradução de mRNA In Vitro Livre de Células em Lisados de Drosophila
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.