Um fluxo de trabalho de baixo custo e sem marcadores baseado em DeepLabCut para análise espontânea de marcha e locomoção em camundongos em movimento livre

Resumo

Apresentamos um fluxo de trabalho de baixo custo e sem marcadores usando o DeepLabCut para quantificar a marcha espontânea e a locomoção em camundongos em movimento livre. Esse protocolo integra aquisição de vídeo por câmera única, rastreamento sem marcadores de marcos anatômicos e extração de parâmetros locomotores espaço-temporais, fornecendo uma estrutura não invasiva e acessível para análise do comportamento motor, sem equipamentos especializados.

Resumo

A marcha é um biomarcador funcional amplamente utilizado para detectar alterações motoras em diversas doenças e condições, pois reflete mudanças na coordenação, força, equilíbrio e integração sensorimotora. No entanto, métodos tradicionais para analisar a marcha em modelos animais frequentemente exigem equipamentos caros, configurações complexas ou procedimentos invasivos que podem alterar comportamentos naturais. Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho de baixo custo e sem marcadores, baseado no DeepLabCut, um software de estimativa de pose de código aberto, para a análise quantitativa da marcha e da locomoção espontânea em camundongos em movimento livre. O método depende da aquisição de vídeo por uma única câmera, rastreamento sem marcador de marcos anatômicos e extração de parâmetros locomotores espaço-temporais, sem a necessidade de marcadores físicos ou equipamentos especializados. Para demonstrar a aplicabilidade do protocolo, ele foi implementado no modelo camundongo triplo transgênico da doença de Alzheimer (3xTg-AD) como um exemplo representativo de aplicação. Essa abordagem preserva a livre circulação e minimiza o estresse relacionado ao manuseio, permitindo uma avaliação não invasiva do comportamento motor. O protocolo é compatível com ambientes padrão de testes comportamentais. No geral, esse método oferece uma estrutura acessível e não invasiva para análise quantitativa da marcha e locomoção em pesquisas pré-clínicas.

Introdução

A marcha é um processo motor complexo que surge da interação em tempo real dos sistemas motor, sensorial e cognitivo, exigindo processamento coordenado do feedback sensorial, controle postural, planejamento motor e ativação muscular para gerar movimento estável^{e adaptativo 1}. Por causa dessa natureza integrativa, alterações na marcha são cada vez mais reconhecidas como indicadores funcionais de disfunção neurológica tanto na prática clínica quanto na pesquisa experimental. Em humanos e modelos animais, a análise da marcha permite a detecção de mudanças na mobilidade, risco de queda, fragilidade e capacidade funcional, e foi proposta como biomarcador para a progressão da doença e a eficácia da intervenção em múltiplas^{condições 2,3,4}.

Na pesquisa básica, especialmente em modelos murinos, avaliar a marcha espontânea e a atividade locomotora representa uma estratégia amplamente utilizada para caracterizar fenótipos motores e avaliar o impacto de perturbações fisiológicas e intervenções terapêuticas. A quantificação objetiva dos parâmetros locomotores permite a detecção de alterações motoras sutis que não são capturadas de forma confiável apenas pela inspeção visual, uma limitação especialmente relevante em estudos pré-clínicos que visam fenótipos precoces ou^{leves 5}. Nesse contexto, a análise da marcha emergiu como uma ferramenta valiosa para investigar alterações no comportamento motor e identificar mudanças funcionais associadas a diferentes condições experimentais, como doenças neurológicas e^{neurodegenerativas 6}.

A análise do comportamento motor e da marcha em modelos murinos tradicionalmente se baseou em plataformas tecnológicas especializadas projetadas para quantificar variáveis cinemáticas espaciais e temporais. Sistemas como passarelas iluminadas, plataformas instrumentadas e softwares comerciais de rastreamento de movimento são comumente utilizados; No entanto, sua dependência de equipamentos caros e infraestrutura dedicada limita significativamente o acesso para muitos^{laboratórios 7, 8, 9, 10}. Além das considerações econômicas, essas abordagens introduzem restrições experimentais adicionais. Vários sistemas exigem que os animais percorram corredores estreitos ou caminhos altamente iluminados, impondo padrões locomotores forçados que reduzem comportamentos espontâneos, enquanto outros dependem de marcadores físicos, manchas de tinta ou etiquetas adesivas fixadas aos membros. Tais intervenções podem induzir estresse, alterar a mecânica da marcha e confundir a interpretação fisiológica dos desfechos motores 11,12,13,14. Coletivamente, essas limitações destacam a necessidade de metodologias capazes de capturar a marcha sob condições naturais e livres, sem depender de procedimentos invasivos ou infraestrutura cara.

Avaliar a marcha durante a locomoção sem restrições permite a observação de padrões motores mais naturais, evitando restrições externas que regulam artificialmente velocidade, trajetória ou postura. Essa abordagem facilita a caracterização do comportamento locomotor sob condições minimamente restritas. DeepLabCut é uma estrutura de estimativa de pose de código aberto baseada em aprendizado profundo que utiliza redes neurais convolucionais para rastrear marcos anatômicos definidos pelo usuário sem a necessidade de marcadores físicos. Ao permitir o rastreamento pontual anatômico a partir de gravações de vídeo padrão, o DeepLabCut permite a extração de parâmetros cinemáticos enquanto reduz substancialmente o custo e a complexidade experimental^{15, 16, 17, 18}. Importante, o rastreamento sem marcadores minimiza interferências experimentais, tornando-o adequado para estudos de comportamento espontâneo. Essa abordagem sem marcador de câmera única é mais adequada para estudos que exigem quantificação acessível e não invasiva da atividade locomotora espontânea e das características bidimensionais relacionadas à marcha sob condições de movimento livre. No entanto, plataformas instrumentadas de marcha ou sistemas tridimensionais de captura de movimento são necessários quando variáveis biomecânicas diretas, como forças de reação ao solo, pressão plantar, ângulos articulares ou cinemática tridimensional completa do membro, são necessárias.

O objetivo deste artigo é apresentar um fluxo de trabalho de baixo custo e sem marcadores, baseado no DeepLabCut, para a quantificação não invasiva da marcha e da locomoção espontânea em camundongos em movimento livre, integrando aquisição de vídeo com câmera única, rastreamento de marcos anatômicos e extração de parâmetros locomotores espaço-temporais dentro de um fluxo de trabalho acessível que não exija hardware especializado ou manipulação invasiva. Este protocolo foca na implementação metodológica e nos resultados representativos do fluxo de trabalho.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê de Bioética do Instituto de Neurobiologia da Universidade Nacional Autônoma do México, sob o protocolo número 117.

1. Contexto de estudo

1. Use camundongos nas condições experimentais exigidas para o estudo. Neste artigo do protocolo, usamos o modelo de camundongo triplo transgênico da doença de Alzheimer (3xTg-AD), que abriga os transgenes APPSwe e tauP301L em um fundo knock-in PS1M146V, juntamente com camundongos não transgênicos como controles, como exemplo representativo de implementação de fluxo de trabalho.
2. Genótipe todos os animais antes do início do estudo.
3. Mantenha os camundongos com comida e água ad libitum sob condições controladas, consistindo em um ciclo de 12:12 h de luz a escuridão, temperatura de 22 °C ± 2 °C e umidade relativa de 60% ± 5%, sob supervisão veterinária.
4. Realize gravações durante a fase de luz após um período de habituação de 60 minutos, utilizando uma única sessão em campo aberto por animal para preservar o comportamento exploratório espontâneo e evitar a redução da atividade associada à exposição repetida à arena.
   NOTA: Neste artigo de protocolo, apresentamos gravações representativas exclusivamente para ilustrar o fluxo de trabalho e o tipo de saídas locomotoras e de marcha geradas pelo método, em vez de apoiar comparações biológicas entre grupos.

2. Materiais

1. Nós são os materiais e equipamentos listados na Tabela de Materiais e Equipamentos para o registro e análise da locomoção e marcha espontânea. Veja a Figura 1 para a montagem geral do setup experimental.

3. Habituação e registro da locomoção espontânea

1. Preparação e habituação animal
   1. Transfira cuidadosamente o camundongo de sua sala de alojamento para a sala de testes comportamentais pelo menos 60 minutos antes do experimento para permitir a habituação ambiental.
   2. Manter a sala de testes comportamentais sob condições ambientais controladas, incluindo temperatura constante de 20 °C–22 °C, intensidade padronizada de iluminação (120–150 lux medida em nível de arena) e ruído branco contínuo para minimizar estímulos auditivos externos.
   3. Durante o período de habituação, mantenha o animal em sua gaiola sem introduzir estímulos ou enriquecimentos adicionais. Manuseie os animais de acordo com as diretrizes institucionais de bem-estar animal para minimizar a variabilidade comportamental induzida pelo estresse.
   4. Manuseie o animal usando luvas limpas e movimentos lentos e deliberados. Levante o animal suavemente pela base da cauda e apoie o corpo com a mão oposta antes de colocá-lo na arena aberta.
      Nota: PASSO CRÍTICO: Manuseio inconsistente ou tempo de habituação insuficiente pode aumentar comportamentos relacionados à ansiedade e introduzir variabilidade nos parâmetros locomotores. Garanta procedimentos de habituação idênticos para todos os animais e sessões.
2. Preparação de arena e câmera em campo aberto
   1. Antes de cada sessão de gravação, limpe cuidadosamente a arena acrílica de campo aberto com etanol 70% (v/v) para remover odores residuais e sinais de cheiro anteriores. Deixe a superfície secar completamente antes de usar.
   2. Manuseie etanol 70% em um local bem ventilado, mantenha-o longe de fontes de calor ou ignição e deixe a arena secar completamente antes do uso.
   3. Coloque a arena em campo aberto com segurança sobre a plataforma de madeira, garantindo que a estrutura seja estável e livre de vibrações.
   4. Inspecione as paredes acrílicas transparentes e a superfície fosca do piso para confirmar que estão livres de poeira, umidade ou resíduos refletivos que possam interferir no rastreamento de vídeo.
   5. Posicione lâmpadas laterais externas de luz branca em ambos os lados da arena em um ângulo aproximado de 30–45° em relação ao plano da arena para fornecer iluminação uniforme em toda a área de gravação e minimizar sombras, reflexos ou brilho excessivo. Ajuste a posição da lâmpada antes de cada sessão e verifique se a iluminação no nível da arena permanece dentro da faixa alvo de 120-150 lux.
   6. Posicione a câmera abaixo da arena em configuração de visão inferior, a uma distância fixa de aproximadamente 80 cm do plano da arena, garantindo visibilidade completa da área de gravação. Note que essa distância ideal pode precisar ser ajustada dependendo da abertura da lente e do campo de visão (FOV) da câmera específica para manter a cobertura total da arena.
   7. Conecte a câmera ao sistema de computador e inicie o software de aquisição de vídeo antes de apresentar o animal.
   8. Ajuste o foco da câmera e o campo de visão para garantir que toda a superfície da arena esteja visível e bem resolvida.
   9. Adquira uma imagem de referência para calibração espacial colocando a grade de tabuleiro de xadrez ou padrão de calibração com dimensões conhecidas no plano da arena.
      NOTA: PASSO CRÍTICO: Alinhamento preciso da câmera, distância fixa e iluminação consistente são essenciais para uma estimativa confiável da pose sem marcadores. Desvios na geometria ou nas condições de iluminação podem reduzir a precisão do acompanhamento e comprometer a comparabilidade dos dados entre sessões.
      NOTA: Materiais alternativos, incluindo aço inoxidável, podem ser usados para a estrutura de suporte externa, desde que o sistema permaneça estável e o alinhamento de registro seja preservado.
      NOTA: Uma arena opaca ou materiais alternativos de parede também podem ser usados, especialmente quando se deseja controle adicional da entrada visual externa, desde que o sistema de gravação permaneça estável e a interferência visual externa seja minimizada.
      NOTA: As dimensões da arena usadas neste protocolo correspondem à configuração empregada para gravar mouses em movimento livre. Essas dimensões podem ser ajustadas de acordo com o roedor utilizado e o protocolo adotado para campo aberto, desde que a visibilidade completa dos animais, calibração espacial e condições consistentes de aquisição sejam mantidas.
3. Registro do comportamento locomotor espontâneo
   1. Antes de colocar o mouse na arena, exiba brevemente o identificador animal no quadro de vídeo para garantir a associação visual direta entre a gravação e a sessão experimental correspondente.
   2. Inicie a gravação de vídeo antes de colocar o mouse no centro da arena em campo aberto para garantir a captura do comportamento exploratório inicial desde o início da sessão.
   3. Coloque o mouse suavemente no centro da arena do campo aberto.
   4. Grave a locomoção espontânea continuamente por 3 minutos sem introduzir distúrbios visuais, auditivos ou táteis. No protocolo atual, apenas uma sessão de gravação era realizada por mouse.
   5. Monitore o vídeo ao vivo na tela do computador para confirmar a gravação ininterrupta e a captura adequada dos movimentos do animal.
   6. Verifique periodicamente o alinhamento das câmeras e a uniformidade da iluminação entre as sessões para garantir condições de registro consistentes entre os animais.
   7. Ao final do período de gravação, pare a aquisição de vídeo e retire cuidadosamente o animal da arena usando o mesmo procedimento de manuseio descrito acima.
   8. Devolve o animal à gaiola e permita que ele descanse antes de qualquer procedimento adicional.
      NOTA: Evite reposicionar o animal durante a gravação, pois interferências externas podem alterar padrões espontâneos de marcha e afetar a análise a jusante.
4. Limpeza, armazenamento de dados e conclusão de sessão
   1. Limpe novamente a arena de campo aberto com etanol 70% (v/v) após cada sessão e deixe secar completamente antes de introduzir o próximo animal.
   2. Certifique-se de que nenhum etanol ou odor residual permaneça na superfície da arena antes de introduzir o próximo animal.
   3. Documente o identificador do animal, data e hora da sessão, condição experimental e nome do operador imediatamente após cada gravação.
   4. Se outros animais forem testados, repita o procedimento a partir da etapa 3.1.1 sob condições ambientais e experimentais idênticas.
   5. Salve cada arquivo de vídeo em uma pasta dedicada usando uma convenção padronizada de nomes (por exemplo, AnimalID_SessionDate_Trial1.mp4).
   6. Ao final do dia experimental, desligue o sistema de câmeras e o equipamento de iluminação para evitar desvios nas configurações de iluminação durante as sessões.
      NOTA: Embora o etanol 70% tenha sido usado no protocolo atual por ser um desinfetante comumente usado nesse tipo de procedimento, desinfetantes compatíveis com acrílico também podem ser usados para evitar deterioração progressiva da superfície, desde que a arena esteja completamente seca e livre de odor residual antes da próxima gravação.
      NOTA: Quando possível, múltiplas arenas podem ser preparadas para permitir a troca imediata entre sessões e facilitar a progressão contínua do experimento entre animais.
      Veja a Figura 1 para os materiais e a montagem do montagem experimental, incluindo a plataforma de madeira (Figura 1A), a arena de acrílico (Figura 1B), o sistema de iluminação lateral (Figura 1C), o posicionamento da câmera na vista inferior (Figura 1D) e o conjunto experimental completo (Figura 1E).

Figura 1: Configuração experimental para gravação de vídeo da locomoção na arena de campo aberto. (A) estrutura de suporte para a arena; (B) arena de campo aberto acrílica colocada na plataforma; (C) iluminação lateral para garantir iluminação uniforme; (D) posicionamento da câmera para registrar movimento por baixo; (E) configuração completa. Pontas de seta brancas indicam a orientação da fonte de luz na Figura 1C e da câmera na Figura 1D. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Processamento de Vídeo e Análise Cinemática

1. Preparação de vídeo e controle de qualidade
   1. Adquira vídeos brutos em . MOV e convertê-los para .avi formato para compatibilidade com o DeepLabCut, mantendo parâmetros constantes de taxa de quadros e resolução.
   2. Brecolha todos os arquivos de vídeo bruto imediatamente após a aquisição em uma pasta dedicada no computador de análise e aplique uma convenção padronizada de nomenclatura (por exemplo, AnimalID_Session_Date).
   3. Revise cada vídeo na íntegra para confirmar que a gravação está completa e livre de interrupções, erros de quadros ou corrupção. Vídeos com erros de aquisição devem ser excluídos da análise.
   4. Converta os vídeos para MP4 (H.264) ou formato AVI não comprimido se o formato original não for compatível com o DeepLabCut.
   5. Opcionalmente, realize um corte temporal das imagens de vídeo para eliminar intervalos não experimentais no início e no final da sessão (por exemplo, durante a introdução ou remoção do animal da arena experimental).
   6. Confirme que a resolução e a taxa de quadros correspondem aos parâmetros de aquisição usados durante a gravação e permanecem consistentes em todas as sessões.
   7. Verifique se toda a superfície da arena está visível dentro do quadro de vídeo e que nenhuma parte do corpo está persistentemente ocluída durante a locomoção.
   8. Coloquetodos os vídeos verificados e processados em um diretório designado para análise do DeepLabCut.
      NOTA: PASSO CRÍTICO: Taxas de quadros inconsistentes, visibilidade parcial da arena ou desfoque de movimento reduzem diretamente a precisão do rastreamento. Vídeos que não atendem aos critérios de qualidade não devem ser incluídos no treinamento ou inferência do modelo.
2. Criação e configuração do projeto
   1. Designe uma biblioteca de vídeos para o projeto, usando os mesmos vídeos destinados à análise ou um subconjunto representativo para treinamento em rede.
   2. Inicie o ambiente Python e importe o pacote DeepLabCut.
   3. Crie um novo projeto DeepLabCut usando o comando:
   4. deeplabcut.create_new_project('NomeDeProjeto', 'Autor', 'CaminhoVídeo').
   5. Defina os pontos de referência anatômicos (partes do corpo) de interesse no arquivo config.yaml, garantindo definições claras e anatomicamente consistentes.
   6. As definições das partes do corpo devem ser otimizadas para a questão experimental e permanecer idênticas em todos os animais e sessões.
3. Extração de quadro e rotulagem de partes do corpo
   1. Especifique start, stop, numframes2extract e cropping_parameters no arquivo config.yaml de acordo com o comprimento do vídeo e o layout espacial.
   2. Extraia os quadros representativos usando: deeplabcut.extract_frames(config_path, 'automático', 'kmeans'/'uniforme').
   3. Revise os quadros extraídos para confirmar a inclusão de variações na postura corporal, orientação, posição dos membros e cobertura da fase de marcha ao longo da gravação. Se posturas específicas, configurações dos membros ou fases locomotoras estiverem sub-representadas, extraia estruturas adicionais para representar melhor essas condições.
   4. Quando forem necessárias fases específicas do ciclo de marcha, extraia manualmente os quadros usando: deeplabcut.extract_frames(config_path, 'manual').
   5. Inicie a interface gráfica de rotulagem usando: deeplabcut.label_frames(config_path).
   6. Rotule todos os marcos anatômicos predefinidos mostrados na Figura 2, incluindo o quadro de vídeo representativo durante a aquisição (Figura 2A), a detecção automática de pontos do corpo sobreposta ao quadro original (Figura 2B) e a representação esquemática dos marcos do corpo definidos e dos pontos de referência da arena usados para análise (Figura 2C). Siga critérios anatômicos consistentes (por exemplo, nariz: ponta anterior do focinho; base da cauda: junção entre a espinha e a cauda)
   7. Rotule os quatro membros de forma consistente, colocando cada ponto de referência no centro da pata sobre as almofadas plantares no contato com o solo.
   8. Salve e inspecione os rótulos usando: deeplabcut.check_labels(config_path) e corrija anotações imprecisas se necessário.
   9. Quando possível, peça a um segundo avaliador treinado para rotular um subconjunto de quadros para avaliar a consistência entre avaliadores.
      NOTA: PASSO CRÍTICO: Rotulagem inconsistente ou anatomicamente imprecisa é uma fonte importante de erros de rastreamento a jusante. Garanta o cumprimento rigoroso das definições de marcos em todos os quadros.
4. Treinamento em redes neurais
   1. Treine o modelo de estimativa de pose para 200 épocas e obtenha um erro médio final de treinamento (RMSE) de 3,27 pixels e um erro médio de teste de 3,59 pixels, correspondendo ao desempenho estável de rastreamento sob as condições de aquisição descritas.
   2. Crie os conjuntos de dados de treinamento e avaliação usando: deeplabcut.create_training_dataset(config_path).
   3. Ajuste o parâmetro de Fração de Treinamento no config.yaml para definir a proporção de imagens usadas para treinamento.
   4. Verifique a disponibilidade da GPU rodando: nvidia-smi.
   5. Comece o treinamento em rede usando: deeplabcut.train_network(config_path, save_epochs=5, épocas=200).
   6. Monitore a perda do treinamento e pare o treinamento assim que os valores de perda se estabilizarem e nenhuma melhora adicional for observada.
   7. Se o treinamento for interrompido, retome a partir do último checkpoint salvo.
   8. Avalie o modelo treinado usando: deeplabcut.evaluate_network(config_path) e registre o erro médio de pixel.
   9. Se o erro exceder o limite aceitável para a configuração experimental, adicione quadros rotulados adicionais ou refine anotações e repita o treinamento.
      NOTA: Os limiares aceitáveis de erro de pixel podem variar dependendo da resolução da câmera e do tamanho da arena, mas devem permanecer consistentes entre os experimentos.
5. Análise de vídeo e quantificação da marcha
   1. Considere os pontos com valor de verosimilhança abaixo de 0,3 como ausentes.
   2. Interpole linearmente pontos faltantes apenas quando as lacunas são ≤3 quadros consecutivos; exclua intervalos maiores da análise.
   3. Defina as fases de locomotora usando um limiar de velocidade central do corpo de 10 cm/s.
   4. Exclua movimentos abaixo desse limite e eventos transitórios menores que 3 quadros.
   5. Execute inferência em vídeos experimentais usando: deeplabcut.analyze_videos(config_path, [video_path], save_as_csv=Verdadeiro).
   6. Gere vídeos rotulados usando: deeplabcut.create_labeled_video(config_path, [video_path]) para confirmar visualmente a qualidade do rastreamento (Figura 2).
   7. Defina o parâmetro pcutoff no config.yaml para 0,6 para aplicar um limiar de confiança durante a visualização e avaliação do acompanhamento.
   8. Importar os arquivos CSV de saída para o ambiente de computação estatística listado na Tabela de Materiais, juntamente com o correspondente pacote de análise e os scripts personalizados fornecidos no Material Suplementar 1 para quantificação comportamental.
   9. Converta índices de quadros para tempo usando a taxa de amostragem original do vídeo.
   10. Calibre dimensões espaciais transformando coordenadas de pixels em unidades físicas usando as dimensões conhecidas da arena e os pontos de referência dos cantos da arena rastreados.
   11. Realize controle de qualidade nas coordenadas rastreadas antes da extração métrica.
   12. Considere pontos com valor de verosimilhança abaixo de 0,3 como ausentes e substitua-os por interpolação linear quando apropriado.
   13. Identifique trajetórias de outliers durante a inspeção visual e corrija-as ou exclua-as quando necessário.
   14. Defina segmentos de marcha usando critérios cinemáticos sincronizados baseados no deslocamento do centro do corpo e no movimento dos membros posteriores.
   15. Exclua comportamentos não locomotores, como empapamento, curva e escovamento.
   16. Calibre e refina manualmente os limiares de definição de acordo com as condições experimentais e o modelo animal para manter apenas períodos locomotores robustos e contínuos para análise.
   17. Calcule métricas de marcha derivadas de relações geométricas e temporais entre marcos rastreados usando segmentos locomotores contínuos filtrados (Tabela 1). Essas incluíram comprimento da passada, comprimento do passo, largura do passo, cadência, duração da passada, duração do passo, tempo da postura, tempo do balanço, amplitude ipsilateral e medidas específicas de deslocamento do membro.
   18. Extraia métricas de campo aberto da gravação completa usando os mesmos dados de rastreamento (Tabela 1). Essas incluíram a distância total percorrida, velocidade média, tempo gasto em movimento, porcentagem do tempo em movimento, número e duração das caminhadas, e distância acumulada percorrida nas zonas central, periférica e de canto.
   19. Compile todas as saídas em um arquivo mestre estruturado para análise estatística posterior.
   20. Gerar representações visuais (por exemplo, trajetórias, mapas de calor, deslocamento baseado no tempo, padrões de marcha e gráficos de coordenação entre membros) usando os ambientes computacionais listados na Tabela de Materiais e os scripts de plotamento descritos acima.
   21. Visualizações representativas sincronizadas de confiança pontual, detecção de pontos de marcha, classificação exploratória de zonas e coordenação inter-membros são fornecidas no Vídeo Suplementar 1 e no Vídeo Suplementar 2 para facilitar a interpretação do fluxo de trabalho analítico.
6. Controle de qualidade e backup de dados
   1. Inspecione visualmente um subconjunto aleatório de vídeos rotulados para confirmar a consistência anatômica entre quadros e sessões.
   2. Compare posições de referência previstas com rótulos anotados para verificar a estabilidade e generalização do modelo.
   3. Salve uma cópia completa do projeto, incluindo config.yaml, etiquetas originais, pesos de rede treinados e arquivos de saída.
   4. Documente as versões de software usadas no fluxo de trabalho, incluindo DeepLabCut, Python, PyTorch, CUDA e o ambiente de computação estatística, juntamente com as especificações da GPU e a data da análise.
   5. Gere um relatório resumido dos erros médios e tempos de processamento a partir de evaluation-results.csv.
   6. Faça backup de todo o projeto em um arquivo local e em um servidor institucional ou armazenamento seguro em nuvem.
7. Ambiente computacional e recursos de reprodutibilidade
   1. Capture gravações originais de vídeo em . Formato MOV com resolução de 1080 × 1920 pixels e aproximadamente 60 FPS.
   2. Pré-processar e transcodificar os vídeos para .avi formato.
   3. Durante essa etapa de conversão, corte a região de interesse, redimensione-a para uma resolução quadrada de 720 × 720 pixels e padronize a taxa de quadros para um constante de 60 FPS para garantir uma quantificação temporal precisa durante a análise cinemática subsequente.
   4. Implemente o fluxo de trabalho de rastreamento sem marcadores usando DeepLabCut versão 3.0.0rc13 em um ambiente Python configurado com Python 3.12.12, PyTorch 2.5.1 e CUDA 11.8.
   5. Treine o modelo de estimativa de pose para 200 épocas e obtenha um erro médio final de treinamento (RMSE) de 3,27 pixels e um erro médio de teste de 3,59 pixels.
   6. Realize análise pós-rastreamento usando o ambiente de computação estatística e os scripts personalizados fornecidos no Material Suplementar 1 para marcha e quantificação em campo aberto.
   7. Use um limiar de velocidade central do corpo de 10 cm/s para identificar as partidas de caminhada. Preencha lacunas de até 3 quadros entre as épocas locomotoras e exclua movimentos transitórios menores que 3 quadros para manter segmentos contínuos de marcha para análise.
   8. Forneça as configurações relevantes de config.yaml, scripts de análise representativa, arquivos de vídeo e rastreamento de exemplo, e pesos de modelos no Material Suplementar 1.
   9. Forneça detalhes adicionais de implementação, métricas de avaliação de modelos, especificações de hardware e parâmetros de análise específicos de cada caso no Material Suplementar 1, quando aplicável.
      NOTA: Ajuste esses parâmetros de acordo com as condições de aquisição usadas em cada experimento.

Figura 2: Fluxo de trabalho representativo para rastreamento de pontos corporais sem marcadores e análise de marcha a partir de gravações de vídeo. (A) Quadro representativo de vídeo de um camundongo se movendo livremente dentro da arena de campo aberto durante a aquisição. (B) Exemplo de detecção automática de pontos do corpo sobreposta ao quadro original após a estimativa da pose, ilustrando os marcos anatômicos usados para análise. (C) Representação esquemática dos marcos definidos do corpo e dos pontos de referência da arena usados para reconstrução da marcha, calibração espacial e análise quantitativa de locomotoria. Pontos de referência e pontos de referência da arena: focinho, garganta, centro do corpo, centro do corpo esquerdo (bcl), centro do corpo direito (bcr), quadril esquerdo (hipl), quadril direito (hipr), base da cauda, centro da cauda, ponta da cauda, pata dianteira esquerda (lfp), pata traseira esquerda (lhp), pata dianteira direita (rfp), pata traseira direita (RHP), superior esquerda (tl), superior direita (tr), inferior esquerda (bl) e inferior direita (br). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Resultados

Após a aplicação do fluxo de trabalho de rastreamento e análise, o processamento automatizado reconstruiu a locomoção espontânea em campo aberto usando o marco do centro do corpo definido e gerou resultados quantitativos adequados para análise posterior. Gráficos de trajetória representativos ilustram como o protocolo captura o deslocamento espacial através da arena, ocupação temporal e dinâmica de velocidade durante a exploração livre. As variáveis de campo aberto mostradas nesta seção foram calculadas a partir da grava...

Discussão

Este estudo apresenta uma abordagem de baixo custo e sem marcadores para analisar a locomoção espontânea e a marcha em camundongos em movimento livre, utilizando aquisição de vídeo padrão e estimativa de pose baseada em DeepLabCut, dentro de um fluxo de trabalho acessível. O fluxo de trabalho permite a extração de variáveis relacionadas à marcha e locomotora a partir de gravações de vídeo, preservando o comportamento locomotor natural e reduzindo interferências experimentais. Nesse senti...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
70% etanol	Genérico	N/A	Limpeza da arena entre sessões
Lâmpadas de luz branca ajustáveis	Genérico	N/A	Manter iluminação constante (100–150 lx)
Cortinas pretas/controle de brilho	Genérico	N/A	Reduzir luz externa/reflexos
Modelo de grade em xadrez	Genérico	N/A	Imagem de referência de calibração espacial
DeepLabCut (v3.0.0rc13)	Open-source	N/A	Software de estimativa de pose
Câmera de vídeo digital (HD, 16:9; ≥60 fps)	Genérico	N/A	Configurações fixas entre sessões
Estação de trabalho com GPU da Nvidia	Construção personalizada	N/A	Hardware para treinamento/inferência de modelo
Luxímetro	Genérico	N/A	Verificar iluminação no nível da arena
PyTorch	Pytorch Foundation	N/A	Framework necessário pelo DeepLabCut
Arena de campo aberto em acrílico transparente (42 × 42 × 42 cm)	Feito sob medida / In-house	N/A	Arena de campo aberto
Suporte para câmera sob a arena (visão de 90°)	Feito sob medida / In-house	N/A	Suporte estável para gravação inferior
CUDA	Nvidia Corporation	N/A	Processamento paralelo acelerado por GPU
Linguagem de programação R	R Foundation	N/A	Linguagem de programação para análise de dados