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Artigo de investigação

Mecanismo e validação experimental dos flavonoides totais do rizoma drynariae no tratamento da artrite gotosa

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DOI:

10.3791/70849

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5 de junho de 2026

 ,  , 
1School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, 2Quality department, Beijing Tongrentang Kangyang Industry Development Co., Ltd, 3Engineering Research Center of Good Agricultural Practice for Chinese Crude Drugs, Ministry of Education

Neste artigo

Resumo

Os flavonoides totais do Rhizoma Drynariae (TFRD) aliviam a artrite gotosa (AG) suprimindo a infiltração de células inflamatórias e reduzindo os níveis de TNF-α, IL-6 e IL-17A, principalmente por meio da inibição das vias de sinalização de AKT, MAPK e NF-κB, destacando seu potencial terapêutico anti-inflamatório e imunomodulador.

Resumo

A artrite gotosa (AG) é uma doença inflamatória das articulações causada pela deposição de cristais de urato monossódico (MSU) na área articular e nos tecidos ao redor. Na medicina tradicional chinesa, o rizoma Drynariae (Gusuibu) há muito tempo é amplamente utilizado no tratamento clínico da AG, e os flavonoides são considerados seus principais constituintes bioativos. Essa pesquisa utilizou farmacologia em redes para construir uma rede componente-alvo de flavonoides totais do Rhizoma Drynariae (TFRD) contra a GA, identificando assim componentes-chave, alvos centrais e vias relacionadas. Modelos de ratos foram estabelecidos por injeção intra-articular de uma suspensão de cristal de urato monossódico e tratados com TFRD ou o controle positivo, colchicina, por gavage oral. Após a coleta da amostra, os resultados de predição baseada em redes farmacêuticas foram posteriormente validados utilizando metabolômica sérica de ratos, ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) e análise por Western blot. A análise da farmacologia em rede indicou que os efeitos anti-GA do TFRD são mediados por alvos-chave, incluindo IL6, AKT1, TNF, EGFR, JUN e PTGS2, e estão principalmente associados a vias relacionadas à inflamação, imunológico e apoptose, como IL-17, TNF, NF-κB, MAPK, PI3K-AKT, JAK-STAT e as vias de sinalização dos receptores das células T. Da mesma forma, a metabolômica também revelou os papéis fundamentais da resposta inflamatória. A coloração por hematoxilina e eosina (H&E) confirmou que a TFRD reduziu a infiltração das células inflamatórias. O ensaio ELISA confirmou que o grupo TFRD inibiu significativamente a expressão dos fatores inflamatórios TNF-α, IL-6 e IL-17A no tecido sinovial. A análise por Western blot revelou que a TFRD inibiu a hiperfosforilação induzida por GA de AKT, MAPK p38 e NF-κB p65 no tecido sinovial de rato. A TFRD pode efetivamente amenizar as mudanças desencadeadas pela inflamação nos ratos de AG ao modular diretamente fatores inflamatórios e vias relacionadas.

Introdução

A artrite gotosa (AG) é uma doença inflamatória das articulações desencadeada pela deposição de cristais de urato monossódico (MSU) dentro e ao redor das articulações, que estimulam a áreaarticular 1,2. A patogênese da AG envolve uma complexa interação de predisposição genética, influências ambientais e desregulação metabólica, caracterizada principalmente por hiperuricemia resultante de produção excessiva de ácido úrico ou excreção renalinsuficiente 3,4. Isso leva ao acúmulo sistêmico de cristais de urato nos tecidos renais e nos espaços articulares, onde ativam o sistema imunológico inato e provocam intensas cascatasinflamatórias 5,6. Nos últimos anos, uma série de estudos mostrou que a prevalência global da AG aumentou em paralelo com o aumento da incidência de obesidade e síndrome metabólica, levando a comprometimento funcional e impondo um peso socioeconômico substancial aos indivíduosafetados 7. A estratégia de tratamento para artrite gotosa foca-se no controle da inflamação articular local aguda e no controle dos níveis de ácido úrico alongo prazo 8,9. No entanto, a utilidade das farmacoterapias existentes é frequentemente limitada por seus perfis de efeitos adversos e contraindicações específicas. Por exemplo, anti-inflamatórios não esteroides geralmente são evitados em pacientes com doença renal crônica devido ao risco associado de causar ou agravar a lesão renalaguda 10,11. Da mesma forma, o agente redutor de urato alopurinol carrega um risco bem documentado de reações adversas cutâneas graves, como a síndrome de Stevens–Johnson, enquanto a benzbromarona pode induzir hepatotoxicidadesignificativa 11,12,13,14,15. Portanto, permanece uma necessidade premente de desenvolver terapêuticas mais seguras, de aplicação mais ampla e mecanicamente direcionadas para o manejo eficaz da AG.

Na medicina tradicional chinesa (MTC), a AG se enquadra em categorias diagnósticas como "Doença de Lijie" (dor nas articulações), "Gout bi" (impedimento da gota) e "Yu Zhuo bi" (impedimento de estase-turbidez). Intervenções da MTC para AG oferecem efeitos sinérgicos por meio de ações anti-inflamatórias e analgésicas, modulação do metabolismo do ácido úrico, melhora da microcirculação e preservação da função articular, tornando-a uma área de destaque da pesquisacontemporânea 16,17,18,19. Rhizoma Drynariae (Gusuibu), derivado do rizoma seco de Drynaria fortunei (Kunze) J.Sm., uma samambaia perene da família Polypodiaceae, é comumente usado na prática clínica para tratar a AG. Os compostos bioativos do rizoma Drynariae contêm principalmente flavonoides, fenilpropanoides, triterpenoides, ácidos fenólicos e seus glicosídeos 20,21. Entre eles, os flavonoides representam a classe de compostos mais amplamente estudada nos últimosanos 22, 23 e 24. Estudos anteriores demonstraram que os flavonoides possuem propriedades anti-inflamatórias e antioxidantesnotáveis 25.

Pesquisas preliminares descobriram que os flavonoides totais do Rhizoma Drynariae (TFRD) podem suprimir efetivamente respostas inflamatórias em osteoartrite, artrite reumatoide e outras condições inflamatóriasarticulares 26,27,28. No entanto, os mecanismos subjacentes da TFRD contra a AG ainda precisam ser investigados a fundo. Portanto, este estudo busca empregar uma abordagem integrada que combine farmacologia em rede, metabolômica e experimentos de biologia molecular para explorar e validar os mecanismos específicos e a eficácia terapêutica da TFRD no tratamento da AG. Espera-se que uma investigação sistemática dos mecanismos multicomponentes, múltiplos alvos e de múltiplas vias subjacentes ao tratamento da TFRD contra a AG avance na descoberta de medicamentos e forneça opções inovadoras e soluções práticas para o manejo clínico da AG.

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Protocolo

Este estudo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética Animal do Hospital da Amizade China-Japão (Nº de aprovação: zryhyy21-22-08-10) e realizado seguindo as diretrizes institucionais para o cuidado ético e uso de animais de laboratório.

Previsão e Triagem de Alvos Relacionados ao TFRD e associados ao GA
Os constituintes químicos do Rhizoma Drynariae foram recuperados do Banco de Dados e Plataforma de Análise de Sistemas de Farmacologia da Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP) usando "Rhizoma Drynariae" como termode busca 29. A triagem para constituintes potencialmente bioativos foi realizada com base nos critérios de biodisponibilidade oral (OB) ≥ 30% e semelhança com o medicamento (DL) ≥ 0,18, 30,31,32. A partir do conjunto resultante de compostos, os componentes flavonoides foram posteriormente identificados e selecionados de acordo com suas estruturas químicas. Esses componentes flavonoides, doravante chamados de flavonoides totais do Rhizoma Drynariae (TFRD), foram incorporados na análise a jusante. Ao recuperar os genes-alvo associados ao TFRD do banco de dados TCMSP, seus símbolos geneais padronizados correspondentes foram anotados usando o banco de dadosUniProt 33. Usando "gota" como termo de busca, alvos relacionados a doenças foram recuperados do banco de dados GeneCards para estabelecer um conjunto de genes candidatos34.

Estabelecimento da rede composto-alvo
A interseção entre alvos associados à TFRD e alvos relacionados à AG foi identificada e definida como os principais alvos terapêuticos mediadores dos efeitos anti-AG da TFRD, e o conjunto sobreposto foi visualizado usando um diagrama de Venn. Além disso, uma rede regulatória de "TFRD - alvos - GA" foi construída e analisada usando o softwareCytoscape 35.

Rede de interação proteína-proteína
Os principais alvos terapêuticos da TFRD contra a AG foram importados para um banco de dados online para gerar uma rede de interação proteína-proteína (PPI), com a pontuação mínima de interação exigida definida como "alta confiança (0,700)"36. A rede PPI foi otimizada usando o software Cytoscape, e os 30 principais alvos centrais classificados por centralidade de grau foram selecionados para gerar um gráfico debarras 37,38.

Análise de enriquecimento de vias KEGG
A análise de enriquecimento de vias KEGG foi realizada nesses alvos centrais usando o software R e o banco de dadosBioconductor 38,39. Vias com valor p < 0,05 foram consideradas estatisticamente significativas. Após excluir vias relacionadas à doença e ao metabolismo, uma rede de interação via-alvo foi visualizada no Cytoscape. Entre esses caminhos, os 20 melhores caminhos classificados pelo valor crescente de P foram apresentados em um gráfico de barras.

Preparação de medicamentos
Para a preparação de uma suspensão cristalina de urato monossódico (MSU), 500 mg de cristais MSU foram pesados usando uma balança analítica, dispersos em 10 mL de soro fisiológico normal e 2 mL de Tween 80, e aquecidos durante a agitação magnética. A mistura foi então ajustada para um volume final de 20 mL com soro fisiológico normal para obter uma suspensão de 25 mg/mL. Após o autoclav, a suspensão era armazenada a 4 °C até o uso. A dose clínica comum para TFRD é de 750 mg por dia para um adulto de 70 kg, correspondendo a uma dose de rato de 67,5 mg/kg de peso corporal por dia. O TFRD foi dissolvido em água destilada até uma concentração de 6,75 mg/mL e armazenado a 4 °C para uso posterior. De acordo com o método de normalização da área superficial corporal, a dose oral equivalente de colchicina (o medicamento positivo) em ratos convertida da dose clínica humana (0,6 mg/60 kg) é 0,062 mg/kg. Uma solução de colchicina foi preparada em água destilada a uma concentração de 0,0062 mg/mL e armazenada a 4 °C para uso posterior.

Animais
Um total de 36 ratos machos de seis semanas de Sprague–Dawley (SD) (220 ± 10 g) foram usados neste estudo (licença animal nº SCXK [Jing] 2025-0008). Os animais eram alojados no Centro de Animais de Laboratório do Hospital da Amizade China-Japão sob condições dietéticas padrão, com temperatura de 22–24 °C e umidade de 50–70%.

Estabelecimento e intervenção do modelo
Após uma semana de aclimatação, os ratos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (n = 9 cada): controle, modelo, TFRD e fármaco positivo. A randomização foi realizada usando uma tabela de números aleatórios. A coleta e análise dos dados foram realizadas em condições de cegueira. Todos os tratamentos eram realizados uma vez ao dia por gávage oral. Todas as intervenções foram aplicadas uma vez ao dia por gavage oral às 08:00 por sete dias consecutivos. Os grupos controle e modelo em branco receberam soro fisiológico normal (10 mL/kg), enquanto os grupos TFRD e positivo receberam suas respectivas suspensões em volume equivalente (10 mL/kg). No quarto dia das intervenções, o grupo controle em branco recebeu uma injeção intra-articular de soro fisiológico normal estéril, enquanto ratos do grupo-modelo, TFRD e positivo foram injetados com uma suspensão de cristais MSU para induzir artrite gotosa aguda. Antes da injeção, os ratos foram anestesiados usando um sistema de anestesia isoflurana. Cada rato no modelo, TFRD e os grupos fármacos positivos receberam 200 μL da suspensão MSU na cavidade da articulação do tornozelo esquerdo. Após a retirada da agulha, uma pressão suave foi aplicada no local da injeção com um cotonete estéril por vários segundos para evitar vazamentos.

Coleta e processamento de amostras
72 horas após a indução do modelo, os ratos foram anestesiados e posicionados em posição deitada. Após a desinfecção abdominal, a cavidade peritoneal foi aberta e os intestinos foram suavemente retraídos para expor a aorta abdominal. Uma agulha de coleta de sangue era inserida paralelamente ao vaso para coletar sangue da aorta abdominal, que era imediatamente transferido para tubos heparinizados pré-resfriados em banho de água gelada. As amostras foram centrifugadas a 3000 × g por 10 minutos a 4 °C para obter soro, que foi aliquotado e armazenado a -80 °C para perfilamento metabolômico subsequente. Os animais foram então eutanasiados por asfixia com CO₂. O pelo ao redor da articulação do tornozelo esquerdo foi raspado, e a pele e os músculos ao redor foram cuidadosamente removidos para expor a estrutura articular intacta. O tecido sinovial, que se apresenta como uma membrana fina e esbranquiçada que revestea a cápsula articular, foi suavemente isolado da fáscia adjacente usando pinças finas. As amostras coletadas nas juntas foram fixadas em paraformaldeído a 4% a 4 °C por 72 horas. Depois, parte do tecido articular foi descalcificada em solução de descalcificação com EDTA, com a solução renovada semanalmente por 8 semanas. A descalcificação completa foi confirmada por teste de punção com agulha: se havia resistência, a descalcificação continuava até que o tecido estivesse totalmente penetrável.

Após a descalcificação, as articulações do tornozelo eram seccionadas sagitalmente, colocadas em fitas cassete de processamento e submetidas à desidratação por etanol em gradiente. Os tecidos foram eliminados em xileno, infiltrados com parafina e incorporados em blocos de parafina. Seções de 6 μm de espessura eram cortadas usando um microtomo automático, flutuadas em banho-maria a 40 °C e montadas em lâminas adesivas. Após secar a 60 °C por 30 minutos, as seções foram desparafinizadas, coradas com hematoxilina e eosina (H&E) segundo protocolos padrão e, finalmente, cobertas com bálsamo neutro. Imagens completas do slide foram obtidas usando um scanner digital de slides.

Análise metabolômica sérica
Amostras de soro dos grupos modelo e TFRD foram descongeladas a 4 °C antes do processamento. Para cada amostra, 100 μL de soro foram transferidos para um tubo de microcentrífuga e combinados com 400 μL de solvente de extração pré-resfriado (metanol: acetonitril, 1:1, v/v) contendo padrões internos. A mistura era em vórtice por 1 minuto, seguida de sonicação em banho de água gelada por 10 minutos. Depois, foi incubado a -40 °C por 1 hora para facilitar a precipitação de proteínas e posteriormente centrifugado a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C. O sobrenadante obtido após a centrifugação foi cuidadosamente coletado e transferido para frascos de autoamostragem para análise UHPLC–MS. Além disso, volumes iguais de sobrenadante de cada amostra dentro do mesmo grupo foram agrupados para gerar amostras de controle de qualidade (QC).

Após a detecção de metabólitos em amostras de soro dos dois grupos, os dados brutos da espectrometria de massa foram processados por software dedicado para detecção, extração, alinhamento e integração automatizados de picos, resultando em uma matriz de dados estruturada das características espectrais iônicas. As características espectrais detectadas foram comparadas com bibliotecas espectrais metabolômicas estabelecidas para identificar metabólitos derivados da TFRD que haviam entrado na circulação sistêmica. Características não identificadas e aquelas que continham valores excessivamente ausentes foram removidas do conjunto de dados. O conjunto de dados curado foi reindexado e estruturado em um formatopadronizado 40.

A expressão diferencial dos metabólitos entre os dois grupos foi avaliada calculando tanto a variação de dobras (FC, expressa como a razão intergrupo) quanto a significância estatística (valor p). Metabólitos que atingem o limiar de |log₂FC| ≥ 1 e P < 0,05 foram definidos como metabólitos (DEMs) expressos diferencialmente. Os resultados da triagem foram resumidos visualmente usando métodos como gráficos vulcânicos. Os metabólitos diferenciais triados foram posteriormente importados para o banco de dados PubChem para obter seus identificadores canônicos (CIDs)41. Os IDs KEGG correspondentes foram então obtidos com base nos CIDs. Por fim, os IDs KEGG foram importados para uma plataforma de análise metabolômica para realizar análise de enriquecimento de vias metabólicas e identificar as vias de sinalização significativamente associadas aos DEMs.

ELISA
Amostras de tecido sinonovial foram congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e pulverizadas até virar um pó fino. Aproximadamente 100 mg do pó foram pesados usando uma balança de precisão eletrônica, misturados com 1 mL de PBS gelado e homogeneizados em gelo usando um homogeneizador de vidro. O homogenado foi centrifugado a 10.000 × g por 5 minutos a 4 °C, e o sobrenadante foi coletado para detecção subsequente do ELISA. Antes da análise, o kit ELISA foi deixado se equilibrar à temperatura ambiente por 30 minutos. Todos os reagentes, incluindo padrões diluídos em série, tampão de lavagem, solução de trabalho com anticorpos marcada com biotina e solução conjugada enzimática, foram preparados de acordo com as instruções do fabricante. Posteriormente, 100 μL de padrões em diferentes concentrações e amostras foram adicionados aos poços designados da microplaca pré-revestida. A placa foi selada e incubada a 37 °C por 90 minutos. Após a incubação, o conteúdo era descartado e os poços eram lavados quatro vezes. Em seguida, 100 μL de solução ativa de anticorpos biotinilados foram adicionados a cada poço, seguidos por incubação a 37 °C por 60 minutos e mais uma etapa de lavagem. Em seguida, foram introduzidos 100 μL de solução de trabalho conjugada enzimática, e a placa foi incubada a 37 °C por 30 minutos, seguida de lavagens adicionais. Um substrato cromogênico foi então adicionado, e a placa foi incubada no escuro a 37 °C por 10 minutos. A reação foi interrompida adicionando 100 μL de solução de parada, e a absorvância foi medida a 450 nm usando um leitor de microplaca. Uma curva padrão foi construída ajustando os valores de densidade óptica (OD) dos padrões com suas concentrações correspondentes, e as concentrações amostrais foram calculadas de acordo.

Western blot
Tecidos sinoviais eram rapidamente congelados e moídos mecanicamente até virar um pó fino. Uma porção medida do pó foi lisada em um volume apropriado de tampão RIPA gelado, suplementado com protease e inibidores de fosfatase (1:100, v/v), seguida de incubação no gelo por 30 minutos. Os lisados foram então centrifugados a 10.000 × g por 5 minutos a 4 °C, e os supernatantes foram cuidadosamente coletados. As concentrações de proteína foram quantificadas usando um ensaio de BCA, e todas as amostras foram ajustadas para concentrações iguais com o tampão RIPA. As proteínas foram separadas via SDS-PAGE e transferidas para as membranas do PVDF. As membranas foram bloqueadas e então incubadas com anticorpos primários (diluição 1:1000), seguidas por anticorpos secundários (diluição 1:5000). Os sinais proteicos foram visualizados usando um sistema de detecção ECL, e as intensidades das bandas foram quantificadas usando o software Image Lab (Versão 5.2.1). Os níveis relativos de expressão foram normalizados contra β-actina.

Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas usando o software SPSS (versão 20.0). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DS). Para comparações entre múltiplos grupos, foi utilizada análise unidirecional da variância (ANOVA) quando a suposição de homogeneidade da variância foi satisfeita, seguida pelo teste LSD para comparações post hoc par a par. Se a homogeneidade de variância não fosse atingida, foi realizada a ANOVA de Welch, seguida pelo teste T3 de Dunnett para comparações múltiplas. Um valor-p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

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Resultados

Componentes principais do TFRD
Os potenciais ingredientes bioativos do Rhizoma Drynariae foram recuperados do banco de dados TCMSP, resultando em 71 candidatos. Esses 71 constituintes ativos foram então submetidos a um processo de triagem baseado na biodisponibilidade oral (OB ≥ 30%) e na semelhança do fármaco (DL ≥ 0,18), que resultou na identificação de 18 compostos. Refinamento adicional dessa lista revelou que 10 desses compostos ativos eram flavonoides, ...

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Discussão

A AG é uma forma comum de artrite inflamatória. Atualmente, o manejo clínico depende principalmente de anti-inflamatórios não esteroides (AINEs), corticosteroides e agentes que reduzem ourato 42. No entanto, a administração combinada desses medicamentos causa uma série de efeitos adversos aos pacientes e impõe uma carga metabólica significativa ao fígado e aosrins. Isso é particularmente prejudicial para pacientes com insuficiência hepática...

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Divulgações

Os autores relatam que não há conflitos de interesse neste trabalho.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4% de paraformaldeídoSolarbioP1110
Buffer de Carga de Proteína 5XSolarbioP1040
Anticorpo AKTTecnologia de Sinalização Celular4691S
Solução de Diluente de AnticorposBeyotime BiotecnologiaP0268
Banco de dados de biocondutores & nbsp;https://www.bioconductor.org/
ColchicinaShanghai Yuanye Co., Ltd
Banco de dados GeneCards https://www.genecards.org/
Hematoxilina e Eosina (H&; E) Kit de TingimentoSolarbioG1120
MetaboAnalyst 6.0 plataforma online  https://www.metaboanalyst.ca/
Mouse IL-17A ELISA Kit4a Biotech Co LtdCME0041
Mouse IL-6 ELISA Kit4a Biotech Co LtdCME0006
Mouse TNF-α ELISA Kit4a Biotech Co LtdCME0004
NF-κ Anticorpo B p65Tecnologia de Sinalização Celular8242T
Leite desnatadoSolarbioD8340
p38 Anticorpo MAPKAbclonalA14401
Coquetel Inibidor de FosfataseBeyotime BiotecnologiaP1081
Anticorpo Fosfo-AKT (Ser473)Tecnologia de Sinalização Celular4060S
Fosfo-NF-κ Anticorpo B p65Tecnologia de Sinalização Celular3031S
Anticorpo MAPK Fosfo-p38AbclonalAP0526
Fenilmetilsulfonil Fluoreto (PMSF)SolarbioR0010
Membrana de Polivinilideno Flúor (PVDF)MilliporeIPVH00010
PubChem databashttps://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
R software www.r project.org/
Buffer de Lise RIPASolarbioR0010
Água livre de RNaseAmbionAM9937
Ratos SDBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. 
Buffer de eletroforese SDS-PAGEServicebioG2144
Banco de Dados STRINGhttps://string-db.org/
Buffer TBST (10X)SolarbioT1085
TCMSPhttps://old.tcmsp-e.com
Tampão de Transferência Tris-GlicinaServicebioG2017
TFRDBeijing Qihuang Pharmaceutical Co., Ltd.
UniProt database https://www.uniprot.org/
Anticorpo β-ActinBiotecnologia Zhongshan JingqiaoTA-09

Referências

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