Este estudo apresenta um método de alimentação à base de gelatina que permite a administração oral precisa, não invasiva e baseada em massa corporal em peixes-zebra adultos. O protocolo demonstra aceitação confiável do feed e, como prova de princípio, entrega bem-sucedida do MK-801, o que resultou nos efeitos comportamentais esperados.
Artigo de método
Uma abordagem simples e precisa baseada em ração para a administração oral de medicamentos em peixes
Neste artigo
Resumo
Resumo
Métodos típicos para administração de medicamentos em peixes (por exemplo, dosagem de béquer, injeções intraperitoneais ou gavage oral) são demorados, imprecisos e/ou desperdiçadores. Como esses métodos também são estressantes para os animais, eles são pouco adequados para administração repetida ou de longo prazo de medicamentos e experimentos comportamentais sensíveis a confusões relacionadas ao manuseio, limitando assim a utilidade dos modelos de peixes em pesquisas biomédicas. Para superar esses obstáculos, foi desenvolvido um método de alimentação à base de gelatina para permitir uma dosagem rápida e precisa de medicamentos em peixes com mínima perturbação. O método envolve preparar pedaços de ração individualmente personalizados, compostos por gelatina, extrato de camarão de salmoura, spirulina e o medicamento de escolha. As propriedades maleáveis ao calor da gelatina permitem que uma única preparação homogênea seja liquefeita, porcionada com precisão de acordo com a massa corporal individual e resolidificada em pedaços personalizados. Como prova de princípio, o antagonista do receptor NMDA MK-801 (4 mg kg⁻1) foi administrado a peixes-zebra adultos antes do novo teste no aquário, resultando em efeitos comportamentais consistentes com redução do comportamento semelhante à ansiedade. Essa abordagem é bem adequada para farmacologia comportamental e é facilmente adaptável a outros organismos modelo aquáticos.
Introdução
O peixe-zebra (Danio rerio) é amplamente utilizado em pesquisas biomédicas para estudar desenvolvimento, fisiologia, comportamento efarmacologia 1,2,3. No entanto, a utilidade do peixe-zebra para estudos farmacológicos, especialmente em animais adultos, é limitada pela disponibilidade de métodos de administração de medicamentos que são precisos e minimamentedisruptivos 4.
Técnicas de administração de medicamentos comumente usadas no peixe-zebra, como dosagem de béquer, injeção intraperitoneal e gavage oral, apresentam desvantagens significativas. A exposição por imersão corporal total via dosagem em béquer oferece controle limitado sobre a absorção de fármacos, resulta em resíduos substanciais de compostos e introduz variabilidade devido às diferenças na taxa de absorção e na estabilidade do composto 5,6,7. Abordagens baseadas em injeção e gavage oral permitem uma dosagem mais precisa, mas exigem anestesia, contenção e manuseio repetido, tudo isso podendo induzir respostas de estresse enquanto aumenta o risco de lesão ou hipóxia, potencialmente confundindo medições comportamentais efisiológicas 8,9,10. Essas limitações são particularmente problemáticas para experimentos que envolvem administração repetida ou de longo prazo de medicamentos.
Para enfrentar esses desafios, foi desenvolvido um método de alimentação à base de gelatina que permite a administração rápida, precisa e não invasiva de medicamentos nopeixe-zebra 11. Essa abordagem permite que compostos farmacológicos sejam incorporados em pequenos pedaços de ração individualmente adaptados, compostos por gelatina, extrato de camarão de salmoura e spirulina. A administração de medicamentos baseada em ração é uma alternativa não invasiva que está alinhada com os princípios das 3Rs (substituição, redução e refinamento) na pesquisa ética com animais. Embora estudos anteriores tenham demonstrado a viabilidade da administração de medicamentos baseada em ração em peixes-zebra adultos 12,13,14, as abordagens existentes dependem de matrizes alimentares heterogêneas ou volumes fixos de ração que não levam em conta a variação individual na massa corporal. O método descrito aqui aborda essas limitações ao permitir a calibração da dose baseada em peso.
Este protocolo fornece uma descrição detalhada e passo a passo da preparação e administração de ração à base de gelatina em peixes-zebra adultos. Embora o método seja demonstrado por meio de um ensaio comportamental, o novo teste em aquário, ele é amplamente aplicável a outras áreas da biologia do peixe-zebra e espera-se que seja adaptável para uso em outros organismos modelo aquáticos. Esse protocolo oferece uma solução prática para pesquisadores que buscam administração eficiente, reproduzível e de baixo estresse em peixes-zebra, especialmente para estudos que exigem manipulação farmacológica precisa, repetida e/ou de longo prazo.
Protocolo
Peixes-zebra machos e fêmeas adultos AB e TL (4–12 meses) foram usados neste estudo. Todos os animais foram criados e alojados na Wayne State University. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais de acordo com as diretrizes da Wayne State University. Os peixes foram mantidos em condições padrão em racks de alta densidade (temperatura 27,5 ± 0,5 °C, condutividade da água 500 μS ± 10 μS e pH 7,5 ± 0,2) com ciclo luz:escuro de 14 h:10 h (luzes acesas às 08:00 h). Os peixes eram alimentados duas vezes ao dia, com ração seca pela manhã e camarão de salmoura recém-eclodidos à tarde. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Pesagem de peixes e cálculo do volume de ração
- Encha um béquer de vidro de 100 mL com aproximadamente 50 mL de água do sistema e coloque-o em uma balança digital. A balança.
- Faça uma rede suave com um único peixe do aquário deles usando uma rede fina. Toque brevemente a rede em um papel toalha seco para remover o excesso de água.
- Transfira cuidadosamente o peixe para dentro do béquer, garantindo que nenhuma água derrame sobre a balança.
- Registre o peso e use esse peso medido para calcular o volume de alimentação necessário com base em 1% do volume por peso corporal (V/BW) para cada peixe individual.
2. Preparação do extrato de camarão salmoura
- Suspenda o pó de camarão em salmoura em água destilada até uma concentração final de 250 mg/mL. Mexa por 1 h em temperatura ambiente. Centrifugar a suspensão a 12.500 × g por 10 minutos em temperatura ambiente e manter o sobrenadante.
- Repita a centrifugação mais uma vez e colete novamente o sobrenadante.
- Armazene o extrato de camarão de salmoura a −20 °C até 6 meses.
3. Preparação de ração à base de gelatina
- Descongele o extrato de camarão de salmoura antes da preparação e calcule as massas-alvo de gelatina (12% p/v), spirulina (4% p/v) e, se aplicável, compostos farmacológicos necessários para o volume desejado de ração para gelatina.
- Pesar o pó de spirulina e gelatina (de origem suína; Bloom ≈ 300 g) em tubos microcentrífugas separados de 1,5 mL e registre a massa real em cada tubo. Certifique-se de que a massa medida esteja igual ou acima da massa alvo para o volume final pretendido.
- Adicione os volumes apropriados de extrato de camarão de salmoura, composto medicamentoso e água ao tubo contendo espirulina para alcançar concentrações finais de 4% de p/v de spirulina e 80 mg/mL de extrato de camarão de salmoura.
- Faça vórtice completamente para homogeneizar. Transfira o volume necessário da mistura da etapa anterior para o tubo contendo gelatina para obter uma concentração final de gelatina de 12% w/v.
- Coloque o tubo sobre um bloco de aquecimento pré-aquecido a 45 °C por 5 minutos, fazendo vórtices intermitentes até que a gelatina esteja completamente dissolvida. Se a dissolução estiver incompleta, mexa suavemente usando um bastão de madeira ou metal estéril para ajudar na homogeneização.
- Aliquota a mistura totalmente homogeneizada (até 100 μL por tubo) em tubos microcentrífugas marcados de 1,5 mL.
- Armazene aliquotas a −20 °C durante a noite para permitir a solidificação completa e facilitar o manuseio durante a alimentação.
4. Formação de pedaços individuais de ração
- Reaqueça a mistura de gelatina aliquotada a 45 °C até estar totalmente liquefeita antes da alimentação.
- Faça vórtice na mistura de gelatina liquefeita cuidadosamente.
- Pipete o volume correspondente a 1% da massa corporal do peixe sobre uma folha de filme de parafina para formar pedaços individuais (Figura 1).
NOTA: Para facilitar o manuseio e armazenamento, coloque uma folha de película de parafina dentro de uma placa de Petri antes de dispensar o volume. Isso permite que a parafina permaneça plana e facilita a transferência dos pedaços preparados para −20 °C para armazenamento. - Coloque os pedaços a −20 °C por pelo menos 20 minutos para permitir a resolidificação.
- Deixe os pedaços no gelo até alimentá-los.
5. Administração de ração de gelatina
- Transfira os peixes do suporte de alojamento para a sala de comportamento e permita que eles se habituem por 1 hora.
- Isole temporariamente cada peixe no aquário usando barreiras transparentes por 2 a 5 minutos antes da alimentação.
- Usando pinças, coloque o pedaço individualizado de gelatina correspondente a 1% do peso corporal do peixe na superfície da água à frente de cada peixe isolado.
- Observe cada peixe para confirmar o consumo total do pedaço de ração em até 5 minutos.
- Depois que os peixes consumirem a ração, remova as barreiras e devolva os peixes aos seus aquários de origem ou proceda a procedimentos experimentais.
NOTA: Um exemplo desenvolvido que descreve a preparação da ração e o cálculo das quantidades-alvo e reais de dosagem é fornecido no Arquivo Suplementar 1, com valores de exemplo também apresentados na Tabela 1.
Resultados
A palatabilidade da gelatina
Para avaliar a palatabilidade da ração, os peixes-zebra adultos AB e TL receberam uma ração à base de gelatina por cinco dias consecutivos no lugar da alimentação matinal (Figura 2). Todos os peixes da TL consumiram a ração em até 5 minutos na primeira exposição, enquanto os peixes AB precisaram de exposição repetida, com 15 de 16 indivíduos consumindo consistentemente a ração após quatro dias consecutivos de aclimatação (Figura 2A). A análise do tempo de consumo da alimentação usando uma ANOVA tripartita (cepa × sexo × dia) revelou efeitos principais significativos da tensão (F₁,₁₂₅ = 19,4, P < 0,0001) e do dia (F₄,₁₂₅ = 5,80, P < 0,001), mas nenhum efeito principal do sexo (F₁,₁₂₅ = 0,24, P = 0,63). Interações significativas foram observadas entre a tensão e o dia (F₄,₁₂₅ = 3,35, P = 0,012) e entre tensão, dia e sexo (F₄,₁₂₅ = 2,55, P = 0,04). Peixes TL de ambos os sexos consumiram a ração rapidamente desde a primeira exposição (4–20 s), enquanto peixes AB apresentaram tempos iniciais de consumo mais longos (7–144 s) que diminuíram ao longo dos dias (Figura 2B). Nos dias quatro e cinco, todos os peixes, exceto um macho AB, consumiram a ração em até 10 segundos. Aproximadamente 95% dos peixes consomem a ração com gelatina dentro de 30 segundos após a apresentação, após 2–3 dias de aclimatação, conforme relatadoanteriormente 15,16.
Efeito comportamental do MK-801 administrado com ração com gelatina
Para demonstrar a eficácia da administração de medicamentos à base de gelatina, o MK-801, um antagonista do receptor N-metil-D-aspartato (NMDAR), foi administrado usando alimentação com gelatina. A distância do fundo durante a exploração de um tanque novo foi medida como uma leitura comportamental. Sabe-se que o MK-801 altera a locomoção e comportamentos semelhantes à ansiedade ou evitação de predadores em peixes-zebra adultos17. Peixes-zebra adultos AB foram aclimatados ao procedimento de alimentação recebendo pedaços de gelatina sem o medicamento por dois dias consecutivos para garantir familiaridade e consumo confiável. No terceiro dia, os peixes designados para o grupo de tratamento receberam uma dose única de MK-801 (4 mg kg⁻1) incorporada à ração com gelatina. Peixes de controle receberam apenas um pedaço idêntico contendo gelatina (veículo (água). A ração foi administrada 30 minutos antes da avaliação comportamental no novo teste do aquário.
Comportamentos semelhantes à ansiedade ou evitativos de predadores, medidos pela distância do fundo, foram analisados usando uma ANOVA 2 × 2 (droga × sexual), que revelou um efeito principal significativo do MK-801 (Figura 3) (F₁,₆₉ = 24,5, P < 0,001). Peixes tratados com drogas passavam mais tempo perto do topo do aquário, um padrão comumente interpretado como redução de comportamento ansioso ou evitação de predadores. Não houve efeito principal do sexo (F1,69=2,52, P=0,12) ou da interação entre drogas (F1,69=1,0, P=0,32). Testes t corrigidos por FDR confirmaram que o MK-801 aumentou a distância inferior tanto em mulheres (P = 0,0076) quanto em machos (P = 0,023).
Em conjunto, esses achados demonstram que a alimentação à base de gelatina permite a entrega oral eficaz de compostos farmacológicos, produzindo mudanças esperadas induzidas pelo medicamento no comportamento de residência no fundo do fundo no novo teste em tanque.
Figura 1: Preparação de ração com gelatina. A alimentação de gelatina era pipetada em filme de parafina em pedaços individualmente ajustados correspondendo a 1% da massa corporal e deixada para fixar a −20 °C. Esse número foi modificado a partir de Ochocki et al.11. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 2: Consumo de ração à base de gelatina por peixes-zebra adultos. (A) Porcentagem de peixes AB e TL de ambos os sexos que consumiram a ração dentro de 5 minutos após a administração. (B) Tempo para consumo de alimentação para peixes AB e TL por sexo. Peixes que não consumiram a ração foram excluídos da análise do horário de consumo. Os dados são mostrados como média ± s.e.m.; n = 8 peixes por cepa e sexo. Esse número foi modificado a partir de Ochocki et al.11. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 3: Efeitos comportamentais da administração de antagonistas do receptor NMDA. MK-801 (4 mg/kg) foi administrado 30 minutos antes do novo teste em aquário em peixes-zebra adultos AB de ambos os sexos. A distância do fundo do aquário foi usada como medida de comportamento de ansiedade/evitação de predadores. Os dados são apresentados como gráficos de caixa e bigode mostrando a mediana (linha central), a faixa interquartil (caixa) e ±1,5× a faixa interquartil (bigodes). *P < 0,05 baseado em taxa de falsa descoberta – testes t corrigidos par a par. Tamanhos de amostra: veículo feminino, n = 20; fêmea MK-801, n = 19; veículo masculino, n = 19; macho MK-801, n = 15. Cinco animais foram excluídos da análise porque não consumiram a ração com gelatina. Esse número foi modificado a partir de Ochocki et al.11. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
| Componente | Concentração de Estoque | Concentração de alvos | Massa/Volume Alvo | Massa/Volume Real |
| Gelatina | - | 12% (s/v) | 60 mg | 62 mg |
| Spirulina | - | 4% (por semana) | 20 mg | 25 mg |
| Extrato de camarão de salmoura | 250 mg/mL | 80 mg/mL | 160 μL | 200 μL |
| Droga | 10 mg/mL | 0,4 mg/μL (4 mg/kg a 1% de gordura corporal) | 20 μL | 25 μL |
| Água | - | - | 320 μL | 400 μL |
| Volume Total de Alimentação Líquida | - | - | 500 μL | 625 μL |
| Volume Tatal da Alimentação Finalizada | - | - | 500 μL | 516,7 μL |
Tabela 1: Exemplo de preparação de ração com gelatina. Concentrações de estoque, alvo e massas ou volumes reais hipotéticos usados para preparar uma ração à base de gelatina para administração de 4 mg/kg de medicamentos administrada a 1% do peso corporal.
Arquivo Suplementar 1: Exemplo de preparação de ração à base de gelatina para múltiplos peixes. Exemplo resolvido demonstrando a formulação da ração contendo medicamento e o cálculo de volumes de dosagem individualizados com base no peso corporal individual. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
O método de alimentação à base de gelatina apresentado aqui supera limitações importantes das abordagens de administração de medicamentos comumente usadas em peixes-zebra, permitindo uma dosagem individualizada baseada em massa corporal com manuseio mínimo. Isso melhora a precisão experimental e a reprodutibilidade. A natureza maleável ao calor da gelatina permite que uma única preparação homogênea seja liquefeita, porcionada com precisão e resolidificada em pedaços individualizados, garantindo uma distribuição uniforme do medicamento enquanto acomoda a variabilidade de tamanho entre indivíduos. Além disso, a administração oral por meio de gelatina evita o estresse e o potencial dano associados aos métodos baseados em injeção, representando um refinamento importante sob o quadro das 3Rs4.
As vantagens dessa abordagem dependem da execução precisa. Vários fatores processuais são críticos para uma implementação bem-sucedida. A medição precisa da massa corporal individual é essencial, pois os peixes-zebra adultos podem apresentar uma heterogeneidade substancial de tamanho mesmo dentro de grupos de idade, sexo e cepa, com a massa corporal variando quase três vezes entre osindivíduos 11, 18 e 19. A homogeneização completa do composto dentro da matriz de gelatina é igualmente importante para garantir uma dosagem consistente entre as porções de ração. Por fim, aclimatar os peixes à alimentação com gelatina antes da administração do medicamento reduz a recusa à alimentação; Recomenda-se confirmação visual da ingestão de ração para garantir a entrega precisa da dose.
Mesmo com uma execução adequada, no entanto, existem alguns desafios práticos na administração de medicamentos baseada em ração. Um possível problema é a colocação inadequada dos pedaços de ração, que pode resultar na rápida desintegração do alimento após a colocação na água. Isso normalmente resulta de controle e/ou mistura inadequado de temperatura durante a preparação, aquecimento prolongado ou ciclos repetidos de congelamento-descongelamento das matérias-primas. Para evitar isso, a dissolução completa da gelatina deve ser garantida por meio de aquecimento/mistura adequada, e os caldos preparados devem ser alicotados em porções descartáveis que sejam descongeladas apenas uma vez e usadas prontamente. Para preparações sensíveis, recomenda-se preparar um pedaço adicional de ração, que pode ser adicionado a um béquer de água, confirmando a colocação correta antes da experimentação. Para compostos que reduzem a palatabilidade alimentar, a aceitação pode ser melhorada incorporando atrativos como suco de mariscos12˒13 ou atrativos comerciais depeixes 20. No presente estudo, extrato de camarão salmouro foi usado para melhorar a palatabilidade e se mostrou eficaz. Alternativamente, administrar várias doses menores pode melhorar o consumo enquanto se alcança a exposição acumulada desejada. Além dessas considerações práticas, a entrega baseada em ração também possui limitações farmacocinéticas inerentes. Como em todos os métodos de administração oral, a absorção gastrointestinal pode atrasar ou reduzir a biodisponibilidade em relação às abordagens baseadas em injeção, e a estabilidade dos compostos dentro da matriz alimentar pode variar.
Apesar da aclimatação, uma pequena proporção de animais pode não consumir a ração com gelatina e deve ser excluída da análise, pois podem não receber a dose esperada do medicamento. As taxas de recusa normalmente variam de 2,4% a 6,4%15,16, e portanto não representam um grande obstáculo metodológico. A ingestão de ração também pode variar entre as cepas. Esse efeito de cepa é consistente com relatos anteriores indicando que o fundo genético pode influenciar a latência para se aproximar doalimento 20. Esses fatores devem ser considerados ao projetar experimentos. Recomenda-se o relato da conformidade alimentar junto com a identidade da cepa para melhorar a transparência e a reprodutibilidade.
Outra limitação importante do presente estudo é que o protocolo foi desenvolvido e validado exclusivamente em peixes-zebra adultos e, portanto, não é diretamente transferível para o estágio larval. Esse método depende da dosagem individualizada baseada em massa corporal e da ingestão de pedaços discretos de gelatina. Isso é viável em adultos, mas impraticável em larvas devido ao pequeno tamanho da abertura, comportamento alimentar baseado em suspensão e dificuldade em obter medições confiáveis de massa corporal individual. Consequentemente, a adaptação para aplicações larvais exigiria modificações substanciais. Essas modificações podem incluir o desenvolvimento de partículas em microescala e estratégias alternativas de entrega.
Comparado aos métodos baseados em ração descritos anteriormente, essa abordagem oferece precisão de dosagem superior e facilidade de uso. Alimentos comerciais de gelatina exigem porção de material heterogêneo, limitando a precisãode dose 12, enquanto outros métodos administram quantidades uniformes a todos os animais e assumem a mesma massacorporal 14,21. Ao permitir a dosagem individualizada, o método de alimentação à base de gelatina descrito aqui evita doses insuficientes ou excessivas e melhora o controle experimental; Isso também faz com que a dosagem de medicamentos em peixes-zebra adultos esteja alinhada com as melhores práticas em roedores, que normalmente dosam com base no peso. Esse método também é muito adequado para estudos que exigem manipulação farmacológica precisa e repetida, pois resulta em estresse mínimo. Isso inclui aplicações em neurociência comportamental, neurofarmacologia e pesquisa em envelhecimento. Também é vantajoso para compostos que interagem com anestésicos ou apresentam baixa estabilidade em ambientes aquosos. Embora demonstrada aqui em peixes-zebra adultos, a abordagem é facilmente adaptável a outros organismos modelo aquáticos. No geral, essa técnica aprimora a precisão da dosagem, o bem-estar animal e a flexibilidade metodológica, ampliando a utilidade dos modelos de peixes na pesquisa biomédica.
Divulgações
Este protocolo baseia-se em trabalhos anteriormente publicados no Journal of Experimental Biology, Ochocki AJ, Kenney JW, 202311. O presente artigo fornece uma orientação metodológica detalhada e ampliada para a reprodutibilidade.
Agradecimentos
Esse trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R35GM142566) ao J.W.K.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| (+) MK-801 hydrogen maleate powder | SIGMA-ALDRICH | M107-5MG | |
| Gelatin From porcine skin powder | SIGMA-ALDRICH | G1890-100G | Gel strength ~300 g Bloom, Type A, Bioreagent |
| Mikro Fine Dried Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | https://www.brineshrimpdirect.com/mikro-fine-dried-brine-shrimp-16-ounce | Fine < 400 micron |
| Spirulina powder | Brine Shrimp Direct | https://www.brineshrimpdirect.com/spirulina-powder-spirulina-powder-2-oz | 99% Pure blue green algae |
Referências
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Reimpressões e permissões
