Modelo Murino para Transeção Seletiva dos Nervos Autonômicos Intestinais

Resumo

Esse protocolo visa permitir a transeção precisa e seletiva dos nervos simpáticos e parassimpáticos que inervam o intestino em camundongos usando a artéria mesentérica superior como um marco anatômico consistente, fornecendo um modelo focado e reproduzível para estudar a regulação autônoma da fisiologia intestinal e doenças.

Resumo

Os nervos autônomos compreendem os sistemas simpático e parassimpático, que atuam de maneira amplamente antagônica para regular diversas funções fisiológicas. Com o crescente interesse nos papéis da inervação autonômica na fisiologia e patologia intestinal, há uma necessidade crescente de modelos experimentais que permitam a manipulação precisa dos estípulos simpáticos e parassimpáticos direcionados ao intestino. Aqui, apresentamos um protocolo cirúrgico para transectar seletivamente os nervos simpático e parassimpático que inervam o intestino. Utilizando a artéria mesentérica superior (SMA) como marco anatômico reprodutível, essa abordagem permite a identificação confiável de feixes de nervos autônomos intestinais e a subsequente transseção direcionada. Em contraste com abordagens de denervação mais amplas, como ganglionectomia ou vagotomia subdiafragmática, essa abordagem visa alcançar uma transeção mais localizada anatomicamente dos feixes autônomos direcionados ao intestino, o que pode ajudar a reduzir a interferência extra-intestinal. A lesão é controlável e tipicamente associada a sangramento mínimo, o que favorece a consistência do procedimento e a recuperação pós-operatória. Embora a cirurgia exija treinamento microcirúrgico adequado, o protocolo é adaptável, permitindo que os usuários adaptem parâmetros-chave para objetivos experimentais específicos. Importante, esse modelo oferece uma plataforma prática para investigar os papéis dos nervos simpáticos e parassimpáticos na regulação da função intestinal sob condições fisiológicas e de doença. Este artigo tem como objetivo descrever o procedimento em detalhes para facilitar sua adoção por novos usuários em suas pesquisas.

Introdução

O trato gastrointestinal está sob controle contínuo do sistema nervoso autônomo (SNA), com vias simpáticas e parassimpáticas coordenando aspectos fundamentais da fisiologia intestinal, incluindo motilidade, secreção, função da barreira epitelial e homeostase^{imune 1,2}. No cólon, entradas simpáticas extrínsecas podem exercer efeitos dependentes da região em múltiplos compartimentos celulares, ressaltando que perturbações amplas do SNA podem obscurecer fenótipos^{intestinais específicos do local 1}. Por outro lado, circuitos parassimpáticos, classicamente mediados por sinalização vagal e mecanismos colinérgicos a jusante, são cada vez mais reconhecidos como essenciais para manter o equilíbrio imunológico intestinal e moldar as respostas mucosas, motivando ainda mais estratégias experimentais que podem separar contribuições simpáticas e parassimpáticas com precisão^{anatômica 2}.

Além da regulação fisiológica, a atividade autonômica surgiu como um modificador relevante da biologia das doenças intestinais, incluindo o câncer colorretal (CCR). Trabalhos recentes em CRC demonstram um programa bidirecional nervo simpático–mesenquimal, no qual a sinalização β2-adrenérgica e fibroblastos associados ao câncer que expressam NGF reforçam interações neural-estromais e promovem a progressão tumoral, fornecendo evidências diretas de que circuitos simpáticos podem ser funcionalmente acoplados à patogênese³ da CRC. Paralelamente, a sinalização colinérgica tem sido associada ao crescimento do CRC e às características imunes associadas ao tumor, como demonstrado pela inibição farmacológica do receptor muscarínico 3 em um modelo ortotópico de camundongos e pela conexão da sinalização colinérgica com expressão de pontos de verificação imune e outras características^{malignas 4,5}. Importante destacar que influências autonômicas sobre doenças intestinais também podem convergir com outros moduladores, como o estresse psicológico e a microbiota intestinal. O sistema nervoso entérico pode transmitir sinais de estresse para inflamação intestinal⁶, e sinais microbianos podem engajar circuitos intestino-cérebro que sintonizam neurônios simpáticos intestino-extrínseco, apoiando coletivamente uma estrutura multifatorial na qual a regulação neural se cruza com a ecologia imune e^{microbiana 6,7}.

Essas linhas convergentes de evidências destacam a necessidade de abordagens experimentais que possam isolar efeitos autônomos direcionados ao intestino com precisão anatômica suficiente para apoiar a inferência causal tanto em contextos fisiológicos quanto patológicos. Apesar do rápido progresso no mapeamento de circuitos e neuromodulação, muitas intervenções comumente utilizadas ainda são limitadas em especificidade de órgãos. Manipulação farmacológica sistêmica, simpatectomia química e vagotomia subdiafragmática podem influenciar amplas saídas autonômicas e, assim, alterar pontos de ajuste imunes e metabólicos além do intestino, complicando a atribuição causal a entradas neurais específicas do^{cólon 8}. Por exemplo, circuitos vagais podem suprimir a produção de citocinas^{inflamatórias 9}, e a estimulação vaga pode modular a função endócrina pancreática e a dinâmica β celular, ilustrando que intervenções a montante ou não seletivas podem introduzir efeitos extraintestinais que confundem a interpretação dos fenótipos^{intestinais 10}. Essas limitações são particularmente importantes para estudos que visam isolar mecanismos autônomos restritos pelo cólon na fisiologia e patologia. O objetivo geral do método é, portanto, possibilitar a transeção anatômica e seletiva de fibras simpáticas e parassimpáticas dirigidas ao intestino em camundongos, fornecendo um modelo prático para interrogar a regulação autonômica intestinal com impacto fora do alvo reduzido.

Em resumo, este protocolo relata uma abordagem mais precisa de denervação autonômica intestinal murina, com mínima interrupção da inervação autônoma de outros órgãos abdominais, aumentando assim a interpretabilidade ao reduzir o viés potencial dos efeitos extra-intestinais.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal (IACUC) do Hospital da Amizade de Pequim, Universidade Médica Capital (nº 24-2026). Machos adultos selvagens C57BL/6J foram usados neste estudo (8–10 semanas de idade, 20–30 g). Informações detalhadas sobre reagentes e equipamentos são fornecidas na Tabela de Materiais.

Critérios de inclusão: Ratos da mesma linhagem, sexo e faixa etária foram usados em cada experimento para minimizar a variabilidade biológica. Foram incluídos apenas animais saudáveis que demonstrassem atividade normal, comportamento de tosa, ingestão de alimento e água, e produção de fezes durante o período de aclimatação. Além disso, os camundongos foram aclimatados à instalação animal por pelo menos 7 dias antes da cirurgia.

Critérios de exclusão: Os camundongos foram excluídos em casos de sangramento descontrolado ou lesão vascular maior durante cirurgia, perfuração intestinal ou dano tecidual significativo incompatível com a sobrevivência. Animais que não conseguiram se recuperar da anestesia, definidos como não se tornarem ambulatórios dentro de 2 horas após a cirurgia, também foram excluídos. Critérios adicionais de exclusão incluíram complicações pós-operatórias, como deiscência persistente da ferida, infecção grave ou perda de peso superior a 15% em 48 horas ou 20% em qualquer período de 72 horas. Ratos com identificação cirúrgica errada do ramo nervoso, confirmada por avaliação histológica pós-hoc, também foram excluídos do estudo.

1. Preparação pré-operatória

1. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos.
2. Administre analgesia preventiva a todos os camundongos 30 minutos antes da cirurgia para evitar sensibilização à dor. Administrar meloxicam (5 mg/kg de peso corporal) por injeção subcutânea.
3. Pré-aqueça a almofada térmica a 37 °C e coloque-a sob a plataforma cirúrgica.
4. Borrife a área cirúrgica (incluindo a câmara de indução da anestesia) com etanol 75% e limpe cuidadosamente com papel toalha. Coloque toalhas de papel suficientes no fundo da câmara de indução.
5. Inspecione a câmara de indução da anestesia e os tubos para confirmar que não há vazamentos. Reabasteça e garanta um suprimento adequado de isoflurano. Induzir anestesia com 3%–3,5% de isoflurano administrado em 1 L/min de oxigênio. Monitore o mouse continuamente; Um plano cirúrgico é normalmente alcançado em 1–2 minutos.
6. Coloque o rato em posição supina com os quatro membros totalmente estendidos e segure com fita hipoalergênica. Ajuste e prenda o cone do nariz. Reduza o isoflurano para 1,5%–2,5% para manutenção. Avalie a profundidade anestésica pela ausência de resposta de retirada do pedal (sem reação ao beliscão do dedo) e respiração regular (55–65 respirações/min).
   NOTA: Durante procedimentos microcirúrgicos prolongados, a profundidade anestésica é monitorada continuamente além do plano cirúrgico inicial. Além de avaliar o reflexo de retirada do pedal e a frequência respiratória a cada 5–10 minutos, monitoramos o padrão respiratório (por exemplo, regularidade e profundidade) e a frequência cardíaca por meio de observação visual ou contato com a parede torácica. A cor da membrana mucosa (avaliada a partir das patas ou lábios) também é verificada periodicamente para garantir oxigenação adequada. Se o camundongo apresentar sinais de anestesia por aliviamento, como aumento da frequência respiratória (>80 respirações/min), movimentos espontâneos ou retorno do reflexo pedal, a concentração de isoflurano é aumentada em incrementos de 0,25%–0,5% até que um plano cirúrgico adequado seja restaurado. Por outro lado, se a respiração se tornar superficial ou irregular, ou se a frequência cardíaca cair acentuadamente, o isoflurano é reduzido em 0,25%–0,5% até que a função cardiorrespiratória volte a ser estável. Esse ajuste dinâmico garante que o camundongo permaneça em uma profundidade anestésica adequada durante todo o procedimento, minimizando a depressão cardiorrespiratória.
7. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento e lesões da córnea sob anestesia.
8. Raspe os pelos abdominais desde o nível da sínfise púbica até a área abaixo da margem costal usando um barbeador elétrico. Depois, mova a plataforma cirúrgica sob um estereoscópio.
9. Desinfete o local cirúrgico usando swabs de povidona-iodo em padrão concêntrico para fora (do centro para a periferia), cobrindo a área desde abaixo do xifoide até a sínfise púbica e lateralmente até ambos os flancos. Repita 3 vezes. Depois limpo com etanol 70% da mesma forma. Certifique-se de que o campo esteja livre de pelos soltos.
10. Use uma máscara cirúrgica e um boné descartável, use um avental cirúrgico estéril e coloque luvas estéreis.
11. Cubra o rato com uma cortina estéril com fenestras. Ajuste a fenestração para aproximadamente 2 × 3 cm e alinhe-a com a linha média abdominal para expor totalmente o campo operatório. Prenda os quatro cantos do cortinado.

2. Laparotomia e exposição

1. Usando pinças estériles, levante delicadamente uma pequena dobra de pele apenas craniana em relação à sínfise púbica. Com tesouras estéreis de ponta afiada, faça uma pequena incisão inicial no ápice (~0,3 cm), depois estenda a incisão da pele de forma craniana ao longo da linha média por 1,5–2,0 cm.
   NOTA: Após inserir as pontas afiadas da tesoura na abertura inicial, incline as pontas para cima e realize um "corte de empurrão" controlado ao longo da superfície inferior da pele para evitar cortar muito fundo e ferir a musculatura abdominal ou as vísceras. Use pinças e tesouras para dissecar de forma direta o tecido conjuntivo subcutâneo solto da musculatura da parede abdominal subjacente. Dissecar um pouco mais largo que a incisão cutânea para facilitar a exposição subsequente.
2. Aproximadamente 0,5 cm caudal até o processo xifoide, insira cuidadosamente as pontas das pinças finas estéreis na linha alba e levante uma pequena tenda de tecido.
3. Usando tesouras estéreis de ponta afiada, crie uma pequena abertura (2–3 mm) no local levantado. Neste ponto, o peritônio liso e/ou órgãos subjacentes (por exemplo, um lobo hepático) devem ser visíveis.
4. Insira uma lâmina de tesoura estéril de ponta romba na cavidade peritoneal, mantendo-a próxima à parede abdominal. Sob visualização direta, estenda a incisão ao longo da linha alba em direção à direção craniana até que o comprimento total coincida com a incisão cutânea.
   NOTA: Mantenha a ponta da tesoura inclinada para cima durante todo o tempo e siga apenas sob visão direta para garantir que não haja laços intestinais ou vasos sanguíneos sob a tesoura.

3. Identificação da artéria mesentérica superior e da transeção nervosa

1. Retraia suavemente a parede abdominal lateralmente usando fitas estéreis para expor a cavidade peritoneal.
2. Aplique pressão moderada com um cotonete na parede abdominal para permitir que os intestinos se exteriorizem. Mova suavemente o intestino delgado, cólon e ceco para o lado esquerdo do rato.
   NOTA: Cubra o intestino exposto com uma almofada de algodão estéril ou gaze umedecida com solução fisiológica estéril morna (≈37 °C) para evitar o ressecamento do tecido e a perda de calor.
3. Com a mão direita, desloce suavemente o estômago, o duodeno e o cólon em bloco em direção ao quadrante superior esquerdo com um cotonete estéril e umedecido (ou micropinça de ponta romba). A aorta abdominal, anterior à coluna, deve ser claramente visível nesse estágio, às vezes parcialmente coberta por uma pequena quantidade de gordura retroperitoneal.
4. Identifique a veia renal esquerda e o tronco celíaco. A artéria mesentérica superior (SMA) surge como um único ramo arterial a partir da parede anterior da aorta abdominal, tipicamente ~2–4 mm caudal até o tronco celíaco e no nível ou um pouco acima do nível da veia renal esquerda.
   NOTA: A veia renal esquerda é uma veia escura e espessa que percorre horizontalmente a face anterior da aorta abdominal antes de drenar para a veia cava inferior. O tronco celíaco geralmente é o primeiro ramo arterial principal que surge da parede anterior da aorta abdominal, localizado logo na veia craniana (superior) da veia renal esquerda, e comumente se trifurca nas artérias hepática, esplênica e gástrica esquerda. Em contraste, a SMA é um tronco único sem ramos hepáticos/esplênicos. Ele entra na raiz do mesenterio e fornece o jejuno, o íleo e o cólon proximal; Traçar seu curso até o mesenterio pode ajudar a confirmar a identificação correta.
5. Identifique os feixes branco-leitos, semelhantes a cordões, que correm paralelos à SMA como fibras nervosas alvo. O feixe nervoso localizado acima da AME corresponde às fibras parassimpáticas, enquanto o feixe localizado abaixo da AME corresponde às fibras simpáticas (Figura 1A).
6. Usando micropinças e microtesouras, separe muito delicadamente o tecido adiposo e linfático ao redor da SMA para expor totalmente as fibras nervosas. Levante suavemente o feixe nervoso simpático ou parassimpático com micropinças para separá-lo da SMA, depois transecto-o rápida e cuidadosamente (Figura 1).
   NOTA: Durante a dissecação, mantenha as pontas das pinças e tesouras orientadas em direção à parede lateral da artéria e evite direcionar os instrumentos verticalmente para planos mais profundos. Se ocorrer sangramento grave (por exemplo, hemorragia da AME ou aorta abdominal que não pode ser controlada em 30 s aplicando pressão com um cotonete estéril), o procedimento é imediatamente interrompido. O animal é eutanasiado humanamente enquanto ainda está sob anestesia e é excluído de todas as análises subsequentes. Esse ponto final é pré-definido de acordo com os critérios humanos aprovados pela IACUC para evitar sofrimento desnecessário. Orientações adicionais para solução de problemas para complicações intraoperatórias comuns são fornecidas no Arquivo Suplementar 1.

4. Fechamento da cavidade abdominal

1. Remova todas as gazes/almofadas intraabdominais. Inspecione cuidadosamente a cavidade abdominal em busca de sangramentos ativos, com atenção especial ao campo de dissecção da SMA, ao local de transeção nervosa e às bordas do corte da parede abdominal.
2. Irrige suavemente a cavidade peritoneal com um pequeno volume de soro salino estéril morno (0,5–1,0 mL), depois retire cuidadosamente o excesso de fluido usando um cotonete seco e estéril.
3. Realize um instrumento e contagem com gaze/algodão para garantir que nenhum material estranho seja retido dentro da cavidade abdominal.
4. Usando sutura absorvível 6-0, feche o peritônio e a camada muscular com um ponto contínuo começando por uma extremidade da incisão. Cada mordida deve incorporar o peritônio e a musculatura da parede abdominal em ambos os lados.
   NOTA: Levante as bordas da ferida com pinças e coloque cada ponto sob visualização direta para evitar prender o intestino ou o omento subjacentes. Se necessário, desloque suavemente os intestinos para longe da incisão usando um cotonete umedecido.
5. Feche a pele com pontos interrompidos usando sutura 5-0 trançada de seda não absorvível. Coloque pontos em intervalos de ~2 mm e faça nós com tensão moderada, aproximando (mas sem estrangular) as bordas da pele para evitar isquemia.
   NOTA: Uma má deposição da ferida pode resultar em hérnia incisional. Certifique-se de que a camada muscular esteja bem vedada e que as bordas da pele estejam bem alinhadas.
6. Limpe suavemente a incisão fechada da pele mais uma vez com um swab de povidona-iodo.
7. Marque o rato (orelha ou cauda) com a data da cirurgia.
8. Remova o cone do nariz e transfira o mouse para uma gaiola de recuperação limpa e macia, colocada sobre uma almofada térmica de 37 °C (carcaça simples). Mantenha o animal em reclinação lateral para reduzir o risco de aspiração.
   NOTA: Confirme que a base de aquecimento permanece estável a 37 °C para evitar hipotermia. Se necessário, administre 1 mL de solução salina estéril morna por via subcutânea para suporte de volume.
9. Monitore continuamente o camundongo até que ele recupere totalmente a consciência e consiga manter uma posição deitada de forma independente.
   NOTA: A analgesia pós-operatória foi continuada com meloxicam (5 mg/kg, subcutâneo, uma vez a cada 24 horas por até 48 horas após a cirurgia), com avaliação veterinária adicional caso sinais de dor persistente ou sofrimento fossem observados.

5. Parâmetros de monitoramento pós-operatório

NOTA: O monitoramento pós-operatório foi realizado duas vezes ao dia nas primeiras 72 horas e depois diariamente durante toda a duração do estudo. Os parâmetros avaliados incluíram:

1. Monitore a aparência geral, incluindo tosa, condição do pelagem, postura e nível de atividade.
2. Meça o peso corporal diariamente; Defina uma perda de mais de 15% do peso corporal pré-operatório dentro de 48 horas ou 20% em qualquer período de 72 horas como um desfecho humanitário.
3. Inspecione o local cirúrgico em busca de sinais de infecção, deiscência ou corrimento.
4. Monitore o comportamento, incluindo movimentos espontâneos, resposta ao manuseio e sinais de sofrimento (por exemplo, vocalização e inquietação).
5. Avalie qualquer animal que apresente sinais persistentes de dor ou sofrimento apesar da análise de analgesia pela equipe veterinária e, se necessário, faça a eutanasia do animal.

Resultados

Usando a AME como um marco anatômico consistente, feixes de nervos autônomos intestinais podem ser identificados como estruturas finas, brancas como perolas, correndo paralelas ao vaso. Com base em sua posição anatômica em relação à SMA, o feixe superior foi designado como feixe parassimpático presumido e o feixe inferior como feixe simpático presumido (Figura 1A,D). Um resultado positivo intraoperatório é alcançado quando o fibrado alvo é c...

Discussão

A AME murina surge da parede anterior da aorta abdominal, inferior ao tronco celíaco, e fornece entrada arterial para as principais vísceras abdominais, incluindo o^{intestino 14}. À frente da AME estão o cólon e seu mesenterio, enquanto na parte posterior está intimamente relacionada à veia renal esquerda e à aorta abdominal; A veia mesentérica superior normalmente percorre seu lado direito. Em camundongos, a SMA é extremamente delicada e está cercada por órgãos crí...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
5-0 silk braided non-absorbable suture	Ethicon	W500
6-0 PGA Suture	Jinhuan	CR631
Anesthesia Induction Chambers	RWD Life Science	V100
Animal Anesthesia Machine	RWD Life Science	R500IP
Anti-Choline Acetyltransferase antibody	Abcam	ab181023
Artificial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment	Akorn	59399-162-35
C57BL/6J Mice	Shanghai Model Organisms CenterTechnology	SM-001
Cholera Toxin Subunit B (CTB), Alexa FluorTM 555 Conjugate	Thermo Scientific	C34776
Compound Microscope	Yuyan Instruments	512
DAPI and Hoechst Nucleic Acid Stains	Invitrogen	D3571
Fast Green	Thermo Scientific	F7252
Fine Hemostatic Forceps	Jinzhong surgical instrument	JCG020
Hypoallergenic Surgical Tape	3M Blenderm	70200419342
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10
Micro Forceps(Curved)	Jinzhong surgical instrument	WCC200
Micro Forceps(Straight)	Jinzhong surgical instrument	WCC190
Micro Needle holders	Jinzhong surgical instrument	WBA050
Micro scissors	Jinzhong surgical instrument	Y3F010
Micro syringe	Hamilton	7632-01
Ophthalmic Scissors(pointed tip)	Jinzhong surgical instrument	JC2303
Ophthalmic Scissors(rounded tip)	Jinzhong surgical instrument	JC2303
Povidone-Iodine Swabstick	Winner Medical	206
Tissue and Cell Fixative (4% Paraformaldehyde, PFA)	MedChemExpress	HY-DY3003
Tissue OCT-Freeze Medium	Sakura	C2077
Tyrosine Hydroxylase (E2L6M) Rabbit Monoclonal Antibody	Cell Signaling Technology	58844S