Dispositivo Universal de Carga de Pressão para Imagem de Células Vivas sob Estresse Mecânico Fisiológico Sustentado

Summary

O dispositivo de carregamento por pressão descrito aqui permite imagens ópticas em time-lapse de células cultivadas e é compatível com pratos padrão de cultura celular e microscópios invertidos. Usando esse dispositivo, o microambiente de pressão hidrostática tumoral é confirmado como o aprimorador da transdução do sinal de cálcio, fornecendo uma plataforma viável para estudar a transdução mecânica do sinal no microambiente tumoral.

Abstract

Este protocolo descreve um dispositivo de carga de pressão hidrostática que facilita a observação microscópica em tempo real das células aderentes durante a estimulação sustentada da pressão hidrostática, e é compatível com placas comerciais de cultivo celular de 3,5 cm. O aparelho consiste em uma câmara de cultivo hermética fabricada a partir de uma base de alumínio, uma cobertura de poli(metacrilato de metil) opticamente transparente, portas de entrada/saída de gás integradas à tampa e uma janela de observação selada. Ao se conectar a uma fonte de gás regulada, o dispositivo mantém uma pressão hidrostática estável (0–200 kPa, ajustável) enquanto permite o contraste contínuo de fase ou imagem de fluorescência. Usando esse dispositivo de carga de pressão, efeitos dependentes de dose induzidos pela pressão sobre o fenótipo e comportamentos celulares, como morfologia, proliferação e migração, podem ser registrados. Além disso, sinais fluorescentes também podem ser gravados em tempo real. Aqui, a heterogeneidade e dinâmica da sinalização Ca 2^⁺ desencadeada por pressão em células MDA-MB-231 e células HeLa do câncer de mama foram observadas e quantificadas por microscopia de fluorescência invertida usando imagens em time-lapse. Essa plataforma integra carga mecânica com imagens de células vivas para superar limitações dos sistemas convencionais de endpoint, fornecendo uma ferramenta universal para estudos mecanobiológicos.

Introduction

Numerosas células, tecidos e órgãos experimentam forças compressivas sustentadas ou intermitentes como parte de sua^{fisiologia 1}. Por exemplo, as células alveolares são submetidas a pressurização cíclica durante a^{respiração 2}, enquanto as células epiteliais da bexiga suportam cargas mecânicas durante a retenção^{urinar 3}. Em contextos patológicos como tumores sólidos, células cancerígenas são continuamente expostas a forças compressivas originadas do confinamento espacial e da pressão elevada do fluido^{intersticial 4}. De forma semelhante, em outras doenças como degeneração do menisco e fibrose pulmonar, as células^{meniscales 5} e as células epiteliais alveolares⁶ também sofrem estresses mecânicos sustentados devido à tensão e pressão derivada da rigidez da matriz.

Há evidências crescentes que confirmam que a pressão mecânica atua como um potente regulador do fenótipo e comportamento celular ^7,8. Em células não malignas, o estresse compressivo aumenta a proliferação das células-tronco periodontais e induz a fusão osteoclasta por meio de protuberâncias^{invasivas 9}. Por outro lado, em modelos de câncer, a compressão apresenta efeitos de janus: ela suprime a proliferação e migração das células do melanoma enquanto ativa simultaneamente a reprogramação transcriptômica que promove a^{quimiorresistência 10,11}. Além disso, a compressão volumétrica causada pela pressão hiperosmótica pode induzir aglomeração intracelular e estimular a redistribuição da concentração de proteínas e da força iônica por meio da separação em fase líquido-líquido (LLPS), que altera profundamente os comportamentos e o destino celular. Essa perturbação física aumenta a expansão dos organoides intestinais por meio da sinalização ativada Wnt/β-catenina e aumenta a autorrenovação das células-tronco^{intestinais 12}. Além disso, no núcleo celular, LLPS induzida por mudanças de volume está envolvida no controle transcricional gênico por meio da coordenação da iniciação, elongação e terminação da^{transcrição 13,14}.

Para investigar quantitativamente esses efeitos biológicos induzidos pela pressão, sistemas experimentais capazes de aplicar estímulos compressivos bem definidos e homogêneos são essenciais. Para células cultivadas in vitro, que são cercadas por um meio aquoso, a pressão hidrostática serve como um meio primário e fisiologicamente relevante para aplicar tais forças compressivas, amplamente adotado para estudar a mecanotransdução celular¹⁵. A pressão hidrostática pode aumentar a atividade da fosfatase alcalina e acelerar a osteogênese das células-tronco mesenquimatosas derivadas do adiposo humano sem suplementação de fatores^{osteoindutivos 16}. Na doença hepática gordurosa não alcoólica, forças mecânicas como pressão hidrostática podem contribuir para a hipertensão portal sem fibrose significativa, ressaltando seu papel na diversidade^{tecidual 17}. Embora a pressão hidrostática desempenhe um papel importante na regulação fisiopatológica, estudos mecanicistas da pressão hidrostática enfrentam uma limitação crítica: câmaras de pressão convencionais impedem a observação em tempo real de células vivas durante a estimulação. A maioria dos sistemas experimentais permite apenas a análise de pontos finais, mascarando dinâmicas espaciais e temporais de eventos de mecanotransdução, como a mecano-ativação Piezo1, heterogeneidade do fluxo Ca²⁺ e reorganização do citoesquelto. Essa lacuna limitou a compreensão de como a pressão hidrostática impulsiona a diversidade de fenótipos em tumores ou outros tecidos.

Para suprir essa lacuna tecnológica, foi desenvolvida uma nova plataforma experimental que permite a observação em tempo real das respostas celulares a pressão hidrostática precisamente controlada por meio de imagens ópticas. Esse sistema integra três capacidades principais: (1) aplicação de pressão hidrostática sustentada em uma faixa de 0–100 kPa via um controlador ajustável de pressão de gás (o manômetro tem uma faixa de 0–200 kPa, e as pressões aplicadas podem ser selecionadas com base em parâmetros fisiológicos. Por exemplo, com base nos estresses compressivos relatados de vários tipos celulares: 8-16 kPa para células estromais da medula óssea^{humana 18}, 12–24 kPa para células musculares lisas^{vasculares 19}, e 0–15 kPa para células epiteliais mamárias^{humanas 20}.); (2) imagem contínua de células vivas com alta resolução temporal durante a aplicação de pressão hidrostática; e (3) manutenção das condições de cultura fisiológica ao longo de experimentos prolongados. Essa abordagem permite a visualização direta de processos dinâmicos, incluindo recrutamento e ativação do canal Piezo1, ondas de sinalização de cálcio e remodelação do citoesqueleto que ocorrem em resposta à estimulação mecânica. Além disso, este dispositivo é compatível com a maioria das placas de cultivo e microscópios invertidos comercialmente disponíveis, tornando-o altamente conveniente para uso em laboratórios. A capacidade de monitorar esses eventos bioquímicos intracelulares em tempo real fornece insights sem precedentes sobre como as células detectam e se adaptam à pressão hidrostática. Ao capturar a sequência temporal dos eventos de mecanotransdução, que incluem a detecção inicial da força, sinalização a jusante e mudanças fenotípicas, essa plataforma oferece uma ferramenta poderosa para investigar os mecanismos fundamentais pelos quais a pressão hidrostática influencia o comportamento celular em contextos fisiológicos e patológicos.

Protocol

1. Materiais

1. Especificações do dispositivo (Veja a Figura 1)
   1. Prepare os componentes com base nas especificações mencionadas abaixo:
      Base: alumínio (Ø 56 mm, altura 15 mm), janela central Ø 40 mm.
      Tampo: PMMA (Ø 56 mm) com: 6 × furos roscados M3, porta de gás Luer-lock, junta de silicone (diâmetro interno 25 mm, diâmetro externo 32 mm, espessura 0,8 mm)
      Regulador de pressão: (faixa de 0–200 kPa)
2. Células e reagentes
   1. Use MDA-MB-231 e células HeLa neste estudo. Use meio L-15, médio RPMI 1640, soro de bezerro recém-nascido (NCS), solução antibiótico-antimicótica a 1% e uma sonda de imagem de cálcio para cultura celular e marcação com Ca²⁺.

2. Preparação do dispositivo

1. Fabricação
   1. O design personalizado é o componente central deste estudo. Usinar com precisão a base de alumínio e a cobertura de PMMA de acordo com as especificações ( Veja Figura 1 e Figura Suplementar 1).
   2. Corte a vedação de silicone e processe até o tamanho necessário.
      NOTA: A transmitância óptica do material PMMA é suficiente para imagens padrão de luz transmitida. Todos os componentes eram esterilizáveis e biocompatíveis para experimentos subsequentes de cultura celular. Não são impostos requisitos especiais sobre as tolerâncias de fabricação desta câmara (uma tolerância de ±0,1 mm foi adotada neste estudo).
2. Esterilização
   1. Para esterilizar a base (alumínio), autoclave a 121 °C por 20 minutos.
   2. Para esterilizar a tampa (PMMA), passe com etanol a 75% e depois esterilize por UV por 30 minutos.
   3. Esterilize a junta de silicone autoclavando a 121 °C por 20 minutos.

3. Processamento celular

1. Cultura celular
   1. Células de sementes em recipientes de 35 mm com confluência de 30%–70%. Cultive as células por 24 horas em meio RPMI-1640 ou L15 (suplementado com 10% de NCS) em uma incubadora de_CO2 a 37 °C com 5% de CO₂.
   2. Para a passagem celular, dissocie as células com 0,25% de tripsina e termine a digestão com meio completo. Use as células para resemeadura quando atingirem 70%–80% de confluência.
2. Coloração Ca²⁺
   1. Remova o meio e lave as células duas vezes com Solução Salítica Balanceada Hank's (HBSS) pré-aquecida em um armário de biossegurança.
   2. Tinga o Ca²⁺ intercelular com uma sonda de imagem de cálcio de 5 μM em meio sem soro. Incube as células por 20 minutos a 37 °C em um ambiente protegido pela luz.
   3. Remova o corante, lave as células três vezes com HBSS e depois desesterifique por 30 minutos em meio sem soro.

4. Montagem do dispositivo (Figura 2)

1. Transfira o prato de cultura para a janela central da câmara de pressão, depois remova o meio de cultura.
2. Coloque a junta esterilizada na panela de cultura.
3. Alinhe a tampa sobre a chaminé da junta de prato.
4. Aperte os parafusos na diagonal primeiro apertando-os manualmente até sentir resistência, depois adicionando 1,5 volta adicional usando um mecanismo controlado por torque.
5. Conecte o tubo de gás de silicone à porta Luer-lock e injete gás misto no dispositivo para verificar vazamentos.
6. Desconecte o tubo de gás de silicone e injete meio fresco no prato de cultura celular através da porta Luer-lock usando uma seringa estéril de 5 mL.

5. Carga de pressão e imagem

1. Conecte o tubo de gás de silicone (diâmetro interno de 4 mm) da porta Luer-lock na junta de silicone ao manômetro digital e ao tanque de combustível.
2. Monte o dispositivo montado no palco do microscópio.
3. Calibre a pressão.
   1. Valide a estabilidade da faixa de 0–200 kPa usando o bitològ.
      NOTA: Um gás misto contendo 75% de nitrogênio, 20% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono é utilizado para a cultura de células HeLa. Um gás misto contendo 80% de nitrogênio e 20% de oxigênio é usado para a cultura celular de MDA-MB-231. O tipo de gás usado no experimento de carga por pressão pode ser substituído de acordo com o tipo de célula, o tipo de meio ou requisitos experimentais específicos. Nenhum componente é específico do modelo, e as dimensões do módulo de detecção de pressão e de sua tubulação de entrada podem ser selecionadas conforme necessário.
4. Defina a pressão alvo (por exemplo, 100 kPa) via regulador de pressão digital.
5. Inicie a imagem assim que a pressão alvo for atingida.
6. Imagem
   1. Ajuste o palco, confirme a área de imagem e certifique-se de que as células estejam em foco.
   2. Adquira imagens de fluorescência de células coradas usando um microscópio de fluorescência invertida equipado com objetivo de 20×, com os seguintes parâmetros: tempo de exposição de 400 ms, intervalos de intervalo de 5 s e duração total de imagem de 10 min (filtro FITC: Ex/Em = 490/525 nm, corte = 515 nm).
   3. Imagem em condições não pressurizadas por 10 minutos para garantir o funcionamento adequado do sistema e obter dados de sinal de base.
   4. Após abrir a válvula de gás para a pressão de carga, reajuste a altura do estágio para garantir que as células estejam em foco e, em seguida, comece a obter imagens de sinais dinâmicos de cálcio.
   5. Selecione a lente objetiva com base na espessura inferior do prato de cultura e na distância de trabalho da objetiva. Escolha o tempo de exposição utilizado para permitir o monitoramento das oscilações do sinal de cálcio, evitando descolorimento excessivo e danos fotoelétricos.
   6. Ajuste os parâmetros de acordo com o tipo de sonda e os requisitos experimentais ao observar outros sinais dinâmicos.

6. Solução de problemas

1. Consulte a Tabela 1 para conselhos de solução de problemas.

7. Análise estatística

1. Apresente todos os dados como média ± desvio padrão (DS). O software GraphPad Prism (EUA) foi usado para comparar resultados entre dois grupos pelo teste t do Student não pareado. Considere as diferenças como estatisticamente significativas quando **p < 0,01, ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001.

Results

Para verificar a função de imagem em tempo real desse dispositivo de carga de pressão hidrostática, foi observada a dinâmica dos sinais de cálcio nas células tumorais após a aplicação da pressão hidrostática. Células confluentes MDA-MB-231, HeLa e A549 foram semeadas em pratos de cultura de 35 mm para uso subsequente. Após serem coradas com uma sonda de imagem de cálcio, as células cultivadas sem soro foram submetidas a uma pressão hidrostática de 40 kPa. Após 10 minutos de carga de pres...

Discussion

Esse protocolo mostrou um dispositivo de carga de pressão universalmente adaptável que permitia observação em tempo real da dinâmica da mecanotransdução sob pressão hidrostática ajustável. Ao integrar uma cobertura de PMMA opticamente transparente com uma base de alumínio usinada com precisão, o sistema supera a limitação crítica das câmaras convencionais, que só podem realizar análises de endpoints. Este dispositivo de carregamento por pressão, funcionando com um microscópio invertido p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiótico-Antimicoótico (100x)	Thermo Fisher Scientific, EUA	15140122	Concentração de 1% em meio completo
Autoclave	Panasonic, Japão	MLS-3751-PC	Para esterilizar a base de alumínio e a vedação de silicone
Gabinete de Biossegurança	Thermo Fisher Scientific, EUA	Armários de Segurança Biológica da Série 1300 A2 Classe II, Tipo A2	Proporciona um ambiente estéril para o manuseio celular
Cal-520 AM, indicador de cálcio permelado por células	AAT Bioquest, EUA	21131	Para detecção dinâmica da concentração de íons cálcio em células vivas
Prato de Cultura Celular (35 mm)	BIOFIL, China	TCD010035	Panela padrão de 35 mm usada para semear células
Base de Câmara (Alumínio)	Quanyi, China	/	Projetados sob medida & Oslash; 56 mm, H 15 mm, janela central e Oslash; 40 mm
Tampa da Câmara (PMMA)	Quanyi,  China	/	Projetados sob medida & Oslash; 56 mm, com 6 vezes; Orifícios roscados M3, porta de gás Luer-lock
Incubadora CO2	Thermo Fisher Scientific, EUA	HERAcell 3111	Mantém condições de cultura em 37° C com ou sem 5% de CO2
HBSS (Solução Equilibrada de Sal de Hanks)	Beyotime, China	C0219	Para lavar células antes e depois da coloração
Linha celular HeLa	Centro de Recursos Celulares, Instituto de Ciências Médicas Básicas, CAMS/PUMC, China	CRM-CCL-2	Células humanas de câncer cervical
Microscópio de Fluorescência Invertida	Nikon, Japão	Eclipse Ti2	Para imagem por fluorescência
O L-15 Médio de Leibovitz	Thermo Fisher Scientific, EUA	41300039	Para cultura celular MDA-MB-231
Linha celular MDA-MB-231	Centro de Recursos Celulares, Instituto de Ciências Médicas Básicas, CAMS/PUMC, China	CRM-HTB-26	Células humanas de câncer de mama
Soro para Bezerros de Recém-Nascidos (NCS)	Thermo Fisher Scientific, EUA	16010142	Concentração de 10% em meio completo
Regulador de Pressão	Hongrun, China	DP20	Alcance: 0-200 kPa
RPMI 1640 Médio	Thermo Fisher Scientific, EUA	31800022	Para cultura celular MDA-MB-231
Seringa Estéril (5 mL)	KDL, China	1101010198	Para injetar meio ou reagentes através da porta Luer-lock
Tripsina (0,25%)	Thermo Fisher Scientific, EUA	2520056	Para células aderentes dissociativas para passagem