Protocolo Computacional para Quantificar Mudanças Transcriptômicas Associadas a Artesunato em Tecido Cerebral Experimental de Malária Cerebral usando DESeq2

Oche Ambrose George; Adedoyin Igunnu; Joshua Oluwatope Adebayo

doi:10.3791/70870

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Artigo de método

Protocolo Computacional para Quantificar Mudanças Transcriptômicas Associadas a Artesunato em Tecido Cerebral Experimental de Malária Cerebral usando DESeq2

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DOI:

10.3791/70870

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31 de julho de 2026

Oche Ambrose George^*¹ , Adedoyin Igunnu^*¹ , Joshua Oluwatope Adebayo^*¹

¹Department of Biochemistry, University of Ilorin

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A malária cerebral experimental (MEC) causa neuroinflamação e disfunção da barreira hematoencefálica. Usando GSE162535, esse fluxo de trabalho reprodutível baseado em RNA-seq compara cérebros controle (CB), ECM (MB) e tratados com artesunato (AB), realizando análises de QC, PCA e DESeq2. Ele identifica alterações transcricionais impulsionadas por MCE e avalia a modulação mediada por artesunatos das vias inflamatórias e neurovasculares.

Resumo

O sequenciamento de RNA (RNA-seq) é amplamente utilizado para definir programas transcricionais associados à doença, mas fluxos de trabalho consistentes e completos são necessários para garantir comparações reprodutíveis entre grupos experimentais e facilitar resultados biologicamente interpretáveis. Aqui, é apresentado um protocolo completo de análise de RNA-seq para avaliar alterações transcriptômicas cerebrais na malária cerebral experimental (MEC) e após o tratamento com artesunato, utilizando o conjunto público de dados GSE162535. O fluxo de trabalho analisa três grupos — cérebro controle (CB), cérebro ECM (MB) e cérebro COM tratamento com artesunato (AB) — partindo de uma matriz de contagem de HTSeq. Após importar e formatar contagens brutas, o protocolo constrói um conjunto de dados DESeq2 com CB como nível de referência, filtra genes de baixa contagem e realiza controle de qualidade usando visualização do tamanho da biblioteca, análise de componentes principais e agrupamento de distâncias de amostra. A expressão diferencial é então calculada para três contrastes primários (MB vs CB, AB vs MB, AB vs CB), com a contração de variação de multiplicar log2 aplicada para estimação estável do tamanho do efeito. O protocolo exporta tabelas completas e significativas de expressão diferencial, gera gráficos vulcânicos e gráficos MA, e produz mapas de calor dos genes mais variáveis e genes diferencialmente expressos de alto nível por contraste. Para apoiar a interpretação mecanicista, o fluxo de trabalho inclui extração direcionada de marcadores imunes (por exemplo, citocinas, quimiocinas, marcadores de ativação microglial, genes BBB/endoteliais) e realiza análises de Ontologia Gênica e enriquecimento KEGG para conjuntos genéticos significativamente regulados para alta e para baixo. Esse protocolo fornece um modelo reprodutível para caracterizar programas transcripcionais neuroinflamatórios associados à ECM e para quantificar a modulação associada a artesunatos dessas assinaturas.

Introdução

A malária cerebral (MC) é uma complicação neurológica potencialmente fatal da infecção por Plasmodium falciparum e continua sendo um dos principais contribuintes para a mortalidade por malária, apesar dos avanços no manejo de casos. A MC é caracterizada por encefalopatia aguda, disfunção microvascular, ativação endotelial e perturbação da barreira hematoencefálica (BBB), com neuroinflamação a jusante que pode levar ao coma e, entre os sobreviventes, sequelas neurocognitivas^{persistentes 1}. A patogênese da MC é multifatorial e envolve respostas inflamatórias do hospedeiro interagindo com fatores derivados de parasitas e do hospedeiro na interface neurovascular, dificultando a inferição dos mecanismos causais apenas a partir dos desfechos^{clínicos 1}.

Modelos experimentais de malária cerebral (ECM), particularmente infecção por Plasmodium berghei ANKA em camundongos C57BL/6, fornecem uma plataforma manejável para investigar a imunopatologia específica do cérebro, lesão da BBB e sinalização neuroinflamatória em um ambiente^controlado ^2,3. Esses modelos têm sido usados para mapear respostas celulares e moleculares entre os estágios da doença e para testar intervenções adjuntas in vivo ^2,3. No entanto, a patobiologia da ECM é complexa e altamente dinâmica, e ensaios direcionados podem não realizar mudanças coordenadas no nível das vias que ocorrem em múltiplos programas imunes e neurovasculares.

O artesunato é a terapia parenteral de primeira linha recomendada para malária grave e demonstrou um benefício substancial na sobrevivência em comparação com a quinina, em bases de evidências^{chave 4}. Embora a eliminação rápida do parasita seja central para a eficácia do artesunato, os desfechos neurológicos provavelmente refletem tanto a redução do parasita quanto a modulação secundária das vias inflamatórias e^{neurovasculares} ^1,4. Compreender como o tratamento com artemisinina remodela os programas de transcrição cerebral durante a ECM pode, portanto, fornecer insights mecanicistas que complementam dados de eficácia clínica e pode identificar vias candidatas para estratégias neuroprotetoras adjuntas.

O sequenciamento de RNA (RNA-seq) permite um perfil genômico imparcial e amplo das respostas transcricionais em doenças e tratamentos, apoiando a análise diferencial de expressão e a interpretação funcional posterior. Repositórios públicos como o NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) fornecem conjuntos de dados curados adequados para reanálise reprodutível, incluindo GSE162535, que contém RNA-seq cerebral de cérebros controle (CB), cérebros ECM (MB) e cérebros ECM tratados com ^artesunato (AB)5. Para apoiar a descoberta reprodutível a partir desses conjuntos de dados, são necessários estruturas estatísticas robustas para a expressão diferencial baseada em contagem, e ferramentas de enriquecimento são necessárias para interpretar mudanças em nível gênico em termos de vias e processos biológicos.

Este estudo apresenta um fluxo de trabalho reproduzível e completo de análise de RNA-seq para tecido cerebral em grupos controle (CB), malária cerebral experimental (MB) e tratados com artesunato (AB). A novidade deste artigo está em seu pipeline padronizado baseado em DESeq2, incorporando contrastes biologicamente relevantes pré-definidos (MB vs CB, AB vs MB e AB vs CB), rigorosos resultados de controle de qualidade (avaliação do tamanho da biblioteca, análise de componentes principais e mapas de calor de distância amostral) e interpretação integrada a jusante por meio do enriquecimento de vias Gene Ontology (GO) e KEGG usando clusterProfiler ^6,7. Além disso, o fluxo de trabalho implementa interpretação estruturada baseada em painel imunológico, permitindo a caracterização sistemática das respostas transcricionais neuroinflamatórias, imunes e neurovasculares. Ao combinar rigor estatístico, transparência e resultados prontos para publicação, esse protocolo oferece uma estrutura robusta e reutilizável para analisar a desregulação transcriptômica associada à ECM e avaliar a modulação orientada pelo tratamento em estudos pré-clínicos sobre malária.

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Protocolo

Este estudo utilizou dados públicos de RNA-seq e não envolveu novos experimentos em humanos ou animais. Portanto, aprovação ética e consentimento informado não eram necessários (Tabela de Materiais).

1. Preparar o ambiente computacional e a estrutura das pastas

Configurar hardware e sistema operacional
1. Use uma estação de trabalho ou laptop com pelo menos 8 GB de RAM (16 GB recomendados) e ≥10 GB de espaço livre em disco para downloads e saídas.
2. Use Windows, macOS ou Linux com permissão para instalar pacotes R e gravar arquivos no diretório de trabalho.
Instale o software necessário
1. Instale o R (versão 4.2 ou posterior). Instale o RStudio Desktop (recomendado) para executar o fluxo de trabalho de forma interativa e gerenciar o diretório do projeto.
Crie um diretório de projeto e pastas de saída
1. Crie uma nova pasta para a análise (por exemplo, GSE162535_RNAseq_DESeq2). Defina essa pasta como o diretório de trabalho R.
2. Crie as pastas de saída exatamente da seguinte forma:
  1. Crie resultados/. Crie resultados/figura/. Crie resultados/tabelas/.
Instalar pacotes R necessários
1. Instale pacotes CRAN: tidyverse, pheatmap e RColorBrewer. Instalar pacotes Bioconductor: DESeq2, apeglm (opcional), clusterProfiler e org. Mm.eg.db.
2. Carregue os pacotes necessários no início do script: DESeq2, tidyverse, pheatmap, RColorBrewer, clusterProfiler, org. Mm.eg.db, e ggplot2. Defina uma seed para reprodutibilidade executando set.seed(123).
Aplique salvaguardas de integridade e privacidade dos dados
1. Armazene os arquivos baixados apenas no diretório do projeto. Restringa o acesso ao diretório do projeto se o ambiente contiver dados sensíveis ou sob embargo. Grave versões do software exportando sessionInfo() para resultados/sessionInfo.txt ao final do fluxo de trabalho.
  NOTA: Este protocolo realiza uma análise in silico dos dados públicos de contagem de RNA-seq e não envolve o manuseio de amostras biológicas.

2. Obter a matriz de contagem RNA-seq e definir os grupos experimentais

Baixe os arquivos do conjunto de dados GEO para GSE162535
1. Baixe o arquivo de contagem do HTSeq para GSE162535 do GEO e salve-o no diretório do projeto como GSE162535_All.HTSeq.counts.txt.gz. Verifique a integridade do arquivo confirmando que o arquivo abre sem erro usando gzfile() e read.delim().
Carregue as contagens do HTSeq em R
1. Importe a tabela de contagem comprimida usando read.delim(gzfile(...), cabeçalho = TRUE, check.names = FALSE, quote = "", comment.char = ""). Inspecione o objeto importado usando str(), head() e colnames() para confirmar que:
  1. A primeira coluna contém identificadores de genes (por exemplo, AccID). As colunas restantes contêm contagens em nível de amostra.
Padronizar tipos de dados e resolver identificadores genéticos duplicados
1. Defina colunas de amostra como todas as colunas, exceto a coluna do identificador de gene (AccID). Forçar todas as colunas de amostra a contagens de inteiros. Colapse identificadores de genes duplicados somando contagens entre linhas que compartilham o mesmo AccID.
2. Converta a tabela colapsada em um quadro de dados padrão. Defina os nomes das linhas para o identificador do gene e remova a coluna do identificador da matriz de contagem.
Verifique a estrutura da matriz de contagem
1. Confirme que a matriz de contagem tem 12 colunas de exemplo. Confirme que os nomes das colunas de exemplo seguem o formato AB_1..AB_4, CB_1..CB_4 e MB_1.MB_4.
2. Pare a execução se a matriz de contagem não tiver 12 colunas.
Criar e validar metadados de amostra
1. Crie uma tabela de metadados de exemplo (colData) contendo as seguintes colunas:
  1. Exemplo: identificadores únicos correspondentes aos nomes das colunas da matriz de contagem. Grupo: condição biológica atribuída a cada amostra.
2. Recupere as anotações amostrais correspondentes para o conjunto de dados GSE162535 do Gene Expression Omnibus (GEO).
3. Verifique a identidade de cada amostra usando informações de acesso GEO e campos de anotação de amostra que descrevem a condição experimental. Mapee cada identificador de amostra na matriz de contagem para sua anotação GEO verificada.
4. Atribuir cada amostra verificada a um dos seguintes grupos: cérebro controle (CB), cérebro experimental de malária cerebral (MB) ou cérebro experimental de malária cerebral (AB) tratado com artesunatos.
5. Organize a tabela de metadados de modo que a ordem da amostra corresponda à ordem das colunas da matriz de contagem.
6. Compare identificadores de amostra na tabela de metadados com a matriz de contagem para confirmar correspondência um-para-um. Codifica a variável de grupo como um fator, com níveis ordenados como CB, MB e AB.
7. Defina CB como nível de referência para definir o grupo cerebral controle como referência para análise diferencial de expressão a jusante.
8. Defina os nomes das linhas da tabela de metadados iguais aos identificadores da amostra.
  NOTA:Os rótulos de grupo não eram atribuídos apenas pela ordem das amostras na matriz de contagem. As identidades das amostras foram verificadas de forma independente usando metadados GEO e informações de acesso antes do alinhamento com a matriz de expressão, para melhorar a reprodutibilidade e reduzir o risco de classificação incorreta da amostra.

3. Construir o conjunto de dados DESeq2 e realizar controle básico de qualidade

Sanitizar a matriz de contagem
1. Substitua os valores faltantes na matriz de contagem por zero. Confirme a ausência de valores ausentes usando resumos is.na() por colunas.
Crie o conjunto de dados DESeq2
1. Crie um DESeqDataSet usando DESeqDataSetFromMatrix() com: countData = counts; colData = sample_info; Design = ~ grupo.
Filtrar genes de baixa contagem
1. Remova genes com contagens totais <10 em todas as amostras usando dds <- dds[rowSums(counts(dds)) >= 10, ]. Registre o número de genes retidos imprimindo o resumo do objeto.
Avalie o tamanho das bibliotecas
1. Calcule o tamanho das bibliotecas como as somas das colunas da matriz de contagem filtrada. Gerar um gráfico de barras do tamanho da biblioteca e salvá-lo como resultados/figura/library_sizes.pdf.
2. Inspecione o gráfico de tamanho da biblioteca e confirme que nenhuma amostra possui profundidade de sequenciamento extrema inconsistente com o desenho do estudo.

4. Executar o DESeq2 e gerar objetos de transformação para visualização

Ajuste ao modelo DESeq2
1. Execute modelagem diferencial de expressão usando dds <- DESeq(dds). Mantenha o objeto DDS ajustado para todas as extrações de resultados a jusante.
Crie matrizes de expressão transformadas
1. Calcule a transformação logarítmica regularizada usando rld <- rlog(dds, blind = FALSE). Calcule a transformação estabilizadora de variância usando vsd <- vst(dds, cega = FALSO). Use RLD e VSD para PCA, clustering e heatmaps.
  NOTA: Use blind = FALSE para preservar a estrutura de variância dependente do grupo.

5. Realizar controle de qualidade global usando PCA e clustering de distância amostra a amostra

Gerar análise de componentes principais (PCA)
1. Calcule PCA usando plotPCA(rld, intgroup = "group", returnData = TRUE). Extraia a variância percentual explicada para PC1 e PC2. Plote PC1 vs PC2 usando ggplot2, rotulando pontos pelo nome da amostra e colorindo por grupo.
2. Salve o gráfico PCA como resultados/figura/PCA_samples.pdf. Confirme que a biologia se replica agrupando por grupo e que nenhuma amostra se separa como um valor fora da curva.
Gerar um mapa de calor da distância da amostragem
1. Calcule distâncias de amostragem par a par usando dist(t(assay(vsd))). Converta o objeto de distância em uma matriz para visualização. Crie uma tabela de anotação em colunas contendo o fator de grupo para cada amostra.
2. Plote a matriz de distâncias usando pheatmap() e salve como resultados/figura/sample_distance_heatmap.pdf. Confirme que as amostras se agrupam principalmente por grupo.

6. Calcule a expressão diferencial para os três contrastes primários

Defina os contrastes
1. Defina o efeito da doença como ECM vs controle: MB vs CB. Defina o efeito do tratamento dentro da ECM como tratado com artesunato vs ECM: AB vs MB. Defina tratamento versus linha de base como tratado com artesunato vs controle: AB vs CB.
Extrair resultados do DESeq2 com retração por variação de dobra-log2
1. Extraia os resultados brutos de cada contraste usando resultados (dds, contraste = c("grupo", grupoA, grupoB)). Shrink log2 fold muda usando lfcShrink(dds, contrast = c("group", groupA, groupB), res = res, type = "normal").
2. Converta resultados em um frame de dados e armazene o identificador do gene como uma coluna chamada gene_id. Ordene os resultados por valor-p nominal para reporte estável.
3. Salve cada tabela completa de resultados em resultados/tabelas/ como:
  1. DESeq2_MB_vs_CB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_MB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_CB_all_genes.csv
    NOTA: Se a redução falhar devido à configuração do encapsulamento, execute novamente com um tipo alternativo de encolhimento suportado na instalação local.
Definir limiares de significância e exportar conjuntos de genes significativos
1. Defina genes diferencialmente expressos (DEGs) usando: valor p ajustado (FDR) < 0,05 e variação absoluta log2 vezes ≥ 1. Filtre cada contraste para excluir genes com valores p ajustados ausentes.
2. Exporte tabelas DEG significativas para: resultados/tabelas/DESeq2_MB_vs_CB_sig.csv, resultados/tabelas/DESeq2_AB_vs_MB_sig.csv, resultados/tabelas/DESeq2_AB_vs_CB_sig.csv
Resuma as contagens de DEG por contraste
1. Calcule o número de genes significativos por contraste. Salve a tabela resumida como resultados/tabelas/DE_summary_counts.csv.

7. Gerar gráficos vulcânicos para cada contraste.

Crie uma função de plotamento vulcânica.
1. Calcule -log10 (valor p ajustado) para cada gene. Classifique cada gene como Up, Down ou Não Significativo usando os limiares: FDR < 0,05 e |log2FC| ≥ 1.
2. Plote log2FC (eixo x) vs -log10(FDR) (eixo y) usando ggplot2. Adicione linhas de limiar tracejadas em log2FC = ±1 e -log10(0,05).
Parcelas de vulcões de exportação
1. Salve cada gráfico como PDF em resultados/figura/: volcano_MB_vs_CB.pdf, volcano_AB_vs_MB.pdf, volcano_AB_vs_CB.pdf.
  NOTA: Use limites consistentes de eixo entre contrastes para apoiar a comparação visual entre figuras.

8. Gerar gráficos MA para cada contraste

Exporte gráficos de MA para um único PDF.
1. Abra um dispositivo PDF chamado results/fig/MA_plots.pdf. Plote os gráficos MA para cada objeto de resultado bruto do DESeq2 usando plotMA(). Rotule cada parcela com o nome de contraste. Feche o dispositivo PDF.

9. Gerar mapas de calor de expressão para variabilidade global e genes DE específicos de contraste.

Plote os genes das principais variáveis em todas as amostras.
1. Calcule a variância linha a linha entre amostras a partir da matriz do ensaio vsd. Selecione os 100 genes mais variáveis. Centre-se cada gene na média entre as amostras.
2. Gerar um mapa de calor usando pheatmap() com anotações de grupos de amostra. Salve a figura como resultados/figura/heatmap_top100_variable_genes.pdf.
Plote os genes diferencialmente expressos mais acima para cada contraste.
1. Selecione os 50 principais genes por meio do valor p ajustado para cada contraste. Extraia a matriz de expressão da DSV e o centro médio por gene. Gere um mapa de calor para cada contraste e salve como:
2. resultados/fig/heatmap_top50_MB_vs_CB.pdf, results/fig/heatmap_top50_AB_vs_MB.pdf, results/fig/heatmap_top50_AB_vs_CB.pdf
  NOTA: Aumente a largura e a altura do PDF se as etiquetas de linha estiverem ativadas.

10. Realizar uma análise direcionada de marcadores imunológicos.

Resuma genes imunes selecionados através dos contrastes.
1. Defina um conjunto de marcadores imunológicos: Il6, Il1b, Il10, Tnf, Ifng, Il21 e Icam1. Extraia log2FC, valor p e valor p ajustado para esses genes de cada tabela de resultados de contraste.
2. Junte os três resumos de contraste por identificador de gene. Salve a tabela fundida como resultados/tabelas/immune_genes_summary.csv.
Gere um mapa de calor de marcadores imunes (rlog).
1. Identifique genes imunes presentes na matriz transformada do ensaio. Extraia a matriz de expressão rlog para os genes imunes presentes.
2. Expressão do centro médio por gene. Gere e salve o mapa de calor para resultados/figuras/heatmap_immune_genes.pdf.

11. Realizar análise estendida do painel imunológico por categoria funcional

Defina painéis imunológicos.
1. Defina painéis de marcadores imunes por categoria, incluindo: citocinas pró-inflamatórias e genes de resposta ao interferon, genes anti-inflamatórios e reguladores, quimiocinas, marcadores de ativação microglial, marcadores de astrócitos, marcadores de BBB e ativação endotelial, marcadores de células T e marcadores de exaustão, marcadores de monócitos/macrófagos, genes da via do complemento e genes de estresse oxidativo e morte celular.
Extraia os resultados do painel imunológico de DE para cada contraste.
1. Crie uma tabela de mapeamento dos símbolos genéticos para as categorias imunes. Filtre cada tabela de resultados de contraste para os genes do painel imunológico. Junte o mapeamento de categorias a cada tabela de resultados filtrada.
2. Concatene as três tabelas imunes específicas de contraste em uma única tabela. Salve a tabela combinada como resultados/tabelas/immune_panels_DE_all_contrasts.csv. Gerar um mapa de calor classificado de expressão imunológica.
3. Identifique genes do painel imunológico presentes na matriz de ensaio rld. Anexe etiquetas de categoria aos nomes das linhas para preservar a classificação dos painéis na figura. Plote o mapa de calor do rlog com anotações de grupos de exemplo.
Salve as saídas.
1. Salvar como: resultados/figura/heatmap_immune_panels_all.pdf, resultados/figura/heatmap_immune_panels_all.png

12. Gerar gráficos de vulcão com sobreposição imune

Crie plots de vulcão imunes com sobreposição.
1. Marque genes como imunes ou não imunes ao anexar o painel imunológico mapeado a cada tabela de resultados de contraste. Plote todos os genes não imunes como pontos de fundo cinza. Plote genes imunes coloridos por categoria imune em primeiro plano. Adicione linhas de limiar em log2FC = ±1 e -log10(0,05).
Exporte plots de vulcão imune e sobreposição.
1. Guarde os gráficos de vulcão imune de MB vs CB como:
  1. resultados/figura/volcano_MB_vs_CB_immune_overlay.pdf
  2. resultados/figura/volcano_MB_vs_CB_immune_overlay.png
2. Salve os gráficos de vulcão AB vs MB imunes como:
  1. resultados/figura/volcano_AB_vs_MB_immune_overlay.pdf
  2. resultados/figura/volcano_AB_vs_MB_immune_overlay.png
    NOTA: Painéis genéticos imunes selecionados foram pré-definidos e agrupados em categorias funcionais; a lista completa de símbolos gênicos com anotações é fornecida na Tabela Suplementar S1. Essa tabela garante transparência e reprodutibilidade, permitindo o reuso direto e a validação de análises baseadas em painéis entre os estudos.

13. Realizar análise de enriquecimento funcional (GO e KEGG)

Defina conjuntos gênicos para enriquecimento
1. Para cada contraste (MB vs CB e AB vs MB), extraia genes significativamente diferenciados expressos (DEGs) usando um limiar ajustado de p-value de < 0,05 e um limiar absoluto de variação de fold log₂ ≥ 1.
2. Divida os DEGs em genes com regulação máxima (log₂FC > 0) e genes com regulação negativa (log₂FC < 0).
Defina o conjunto genético de fundo (universo)
1. Use todos os genes retidos após a filtragem de contagem no conjunto de dados DESeq2 como o universo de fundo. Extraia símbolos genéticos do objeto DESeq2 filtrado. Converta símbolos genéticos de fundo em identificadores Entrez usando a função bitr() com org. Mm.eg.db.
  NOTA: O uso de um conjunto genético de fundo consistente garante resultados de enriquecimento imparcial.
Mapear identificadores de genes para enriquecimento
1. Converta símbolos gênicos de cada conjunto DEG para identificadores Entrez usando bitr(). Manter apenas genes mapeados com sucesso para o enriquecimento KEGG. Pule a análise de enriquecimento para um conjunto de genes se nenhum gene for mapeado com sucesso.
  NOTA: O enriquecimento Gene Ontology (GO) utiliza símbolos gênicos, enquanto o enriquecimento KEGG requer identificadores Entrez.
Realizar enriquecimento de ontologia gênica (GO) (Processo Biológico)
1. Execute o enriquecimento GO usando enrichGO() com OrgDb = org. Mm.eg.db. Set keyType = "SYMBOL" e ontologia (ont) = "BP". Especifique o universo como todos os símbolos genéticos filtrados do conjunto de dados DESeq2.
2. Use pAdajustMethod = "BH" para correção em múltiplos testes. Aplique limiares de significância de pvalueCutoff = 0,05 e qvalueCutoff = 0,05. Restringa o tamanho dos conjuntos de genes usando minGSSize = 10 e maxGSSize = 500.
3. Exporte os resultados do enriquecimento do GO para os resultados/tabelas/diretório. Gerar barras gráficas dos termos GO mais enriquecidos e salvar para resultados/figura/.
Realizar o enriquecimento de rotas KEGG
1. Execute o enriquecimento KEGG usando enrichKEGG() com organismo = "mmu". Forneça identificadores Entrez dos conjuntos DEG como genes de entrada. Use o fundo mapeado de Entrez como o universo.
2. Aplicar pAdajustMethod = "BH". Use os limiares de significância de pvalueCutoff = 0,05 e qvalueCutoff = 0,05. Restringa o tamanho dos conjuntos de genes usando minGSSize = 10 e maxGSSize = 500.
3. Exporte tabelas de enriquecimento KEGG para resultados/tabelas/. Gerar barras gráficas de caminhos KEGG enriquecidos e salvar para resultados/figuras/.
  NOTA: O enriquecimento KEGG pode não devolver resultados se o mapeamento gênico for insuficiente; Esses casos são tratados sem interromper o fluxo de trabalho.

14. Realizar análise de enriquecimento apenas imunológica (módulo opcional)

Construir conjuntos genéticos específicos do sistema imunológico
1. Defina genes do painel imunológico com base em categorias funcionais selecionadas. Intersectam listas DEG com genes do painel imunológico. Divida os DEGs específicos do sistema imunológico em conjuntos regulados para cima e para baixo para cada contraste.
Realize enriquecimento em conjuntos genéticos específicos do sistema imunológico.
1. Aplique os mesmos procedimentos de enriquecimento GO e KEGG descritos na Seção 13. Use configurações idênticas de universo de fundo e parâmetros. Salve as saídas usando nomes de arquivo contendo o rótulo "imune" para distingui-las dos resultados globais de enriquecimento.

15. Gerar plots de pontos de enriquecimento (módulo opcional)

Resultados de enriquecimento de carga.
1. Importe tabelas de enriquecimento GO ou KEGG dos resultados/tabelas/diretório.
Transforme métricas de enriquecimento.
1. Converta os valores de GeneRatio do formato fracionário (x/y) para razões numéricas. Calcule −log₁₀ (p-valores ajustados) para visualização.
Gerar gráficos de pontos.
1. Plote a razão gênica no eixo x e as descrições enriquecidas de termos no eixo y. Escale o tamanho do ponto pela contagem de genes e a cor por −log₁₀ (valor p ajustado).
2. Selecione os termos mais enriquecidos com base na classificação ajustada do valor do p. Salve os plots de pontos como arquivos PDF e PNG no diretório results/fig/.

16. Salvar as informações da sessão e finalizar a execução

Exportar informações da sessão.
1. Salve a saída sessionInfo() nos resultados/sessionInfo.txt no documento versão R e versões de pacotes.
Confirmar conclusão bem-sucedida
1. Confirme que o fluxo de trabalho gerado: Figuras em resultados/figura/, tabelas em resultados/tabelas/.
2. Confirme que as três saídas principais de contraste existem e não estão vazias: DESeq2_MB_vs_CB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_MB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_CB_all_genes.csv

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Resultados

Avaliação da qualidade dos dados e estrutura transcriptômica global

Dados de RNA-seq de 12 amostras cerebrais (CB, MB, AB; n = 4 por grupo) foram processados usando o fluxo de trabalho padronizado. Após filtrar genes de baixa contagem (≥10 contagens totais), o conjunto de dados foi mantido para análises posteriores. A análise de componentes principais (PCA) das contagens transformadas em rlog demonstrou separação das amostras por grupo experim...

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Discussão

Este estudo apresenta um fluxo de trabalho reproduzível baseado em DESeq2 para a análise de dados de RNA-seq em massa entre contrastes biológicos predefinidos. O protocolo integra pré-processamento padronizado, atribuição verificada de metadados, normalização, teste de expressão diferencial e saídas estruturadas a jusante, permitindo a geração consistente e transparente de resultados transcriptômicos. Ao definir explicitamente etapas analíticas e parâmetros, o fluxo de trabalho é projeta...

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Divulgações

Os autores não têm interesses concorrentes.

Agradecimentos

Os autores não têm agradecimentos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
clusterProfiler (R package)	Bioconductor	RRID:SCR_016884	Análise de enriquecimento funcional (GO e vias KEGG)
DESeq2 (R package)	Bioconductor	RRID:SCR_015687	Análise de expressão diferencial de dados RNA-seq baseados em contagem
ggplot2 (R package)	CRAN	RRID:SCR_014601	Visualização de gráficos PCA, gráficos vulcão e figuras resumidas
GitHub (opcional)	GitHub Inc.	RRID:SCR_002630	Controle de versão e compartilhamento de scripts reproduzíveis
HTSeq-count RNA-seq dataset (GSE162535)	NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)	RRID:SCR_005012	Matriz de contagem RNA-seq em massa usada como entrada para análise
matrixStats (R package)	CRAN	RRID:SCR_016361	Cálculo eficiente de estatísticas de linha/coluna (por exemplo, variância)
openxlsx (R package)	CRAN	RRID:SCR_019215	Exportação de tabelas de resultados para o formato Excel
Sistema operacional	Microsoft / Apple / Linux	N/A	Windows 10+, macOS ou Linux suportado
org.Mm.eg.db (R package)	Bioconductor	RRID:SCR_002815	Banco de dados de anotação de genes de camundongo para mapeamento de ID de genes
Visualizador de PDF	Qualquer	N/A	Visualização de figuras de saída (PCA, mapas de calor, gráficos vulcão)
Computador pessoal ou estação de trabalho	Qualquer	N/A	Mínimo de 16 GB de RAM recomendado para análise de RNA-seq
pheatmap (R package)	CRAN	RRID:SCR_016418	Visualização em mapa de calor da expressão gênica e agrupamento
R Statistical Software (versão ≥ 4.2)	R Foundation for Statistical Computing	RRID:SCR_001905	Ambiente computacional central para toda a análise de RNA-seq
RColorBrewer (R package)	CRAN	RRID:SCR_015742	Paletas de cores para mapas de calor e gráficos
RStudio Desktop	Posit Software	RRID:SCR_000432	Ambiente de desenvolvimento integrado (IDE) para script e reprodutibilidade
Arquivo de metadados da amostra (formato CSV)	Gerado / anotações GEO	N/A	Anotação de amostra curada ligando amostras aos grupos CB, MB e AB
stringr (R package)	CRAN	RRID:SCR_019195	Processamento de string para visualização e formatação de enriquecimento
tibble (R package)	CRAN	RRID:SCR_019186	Manipulação de data frame e estruturas de dados organizadas
tidyverse (suite de pacotes R)	CRAN	RRID:SCR_019186	Manipulação, transformação e visualização de dados

Referências

Storm J, Craig AG. Pathogenesis of cerebral malaria—inflammation and cytoadherence. Front Cell Infect Microbiol. 2014;4:100.
Hinduja S, Kunieda M. Modelling of ECM and EDM processes. CIRP Annals. 2013 Jan 1;62(2):775–97.
Soares SMA, Gualberto ACM, da Costa AC, Gonçalves DA, Gameiro J. A high-fat diet protects C57BL/6 mice from Plasmodium berghei ANKA infection in an experimental malaria study. Front Trop Dis. 2023;4:1188902.
Manzoni G, Try R, Guintran JO, Christiansen-Jucht C, Jacoby E, Sovannaroth S, Zhang Z, Banouvong V, Shortus MS, Reyburn R, Chanthavisouk C. Progress towards malaria elimination in the Greater Mekong Subregion: perspectives from the World Health Organization. Malaria Journal. 2024 Mar 1;23(1):64.
Wang Q, Tang Y, Pan Z, Yuan Y, Zou Y, Zhang H, et al. RNA-seq-based transcriptome analysis of the anti-inflammatory effect of artesunate in early treatment of a mouse cerebral malaria model. Mol Omics. 2022;18(8):716–30.
Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014;15(12):550.
Anders S, Huber W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 2010;11(10):R106.
Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. bioinformatics. 2010 Jan 1;26(1):139-40.
McCarthy DJ, Chen Y, Smyth GK. Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation. Nucleic Acids Res. 2012;40(10):4288–97.
Conesa A, Madrigal P, Tarazona S, Gomez-Cabrero D, Cervera A, McPherson A, et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 2016;17:13.
Yu G, Wang LG, Han Y, He QY. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012;16(5):284–7.
Hänzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 2013 Jan 16;14(1):7.
Shen-Orr SS, Gaujoux R. Computational deconvolution: extracting cell type–specific information from heterogeneous samples. Curr Opin Immunol. 2013;25(5):571–8.
Subramanian A, Tamayo P, Mootha VK, Mukherjee S, Ebert BL, Gillette MA, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(43):15545–50.
Stark R, Grzelak M, Hadfield J. RNA sequencing: the teenage years. Nat Rev Genet. 2019;20(11):631–56.

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