Artigo de método

Estabelecimento de um modelo de célula Het-1A induzida por ácidos e análise funcional do eixo miR-107/FGFRL1

DOI:

10.3791/70874

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29 de maio de 2026

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1Department of Gastroenterology, Longyan First Hospital, 2Department of Gastroenterology, The Affiliated TCM Hospital of Guangzhou Medical University, 3Department of Gastroenterology, The Affiliated TCM Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, 4Department of Gastroenterology, Jiaozhou Central Hospital of Qingdao, 5Clinical Nutrition Department, Jiaozhou Central Hospital of Qingdao, 6Department of Gastroenterology, People's Hospital of Wenshang County

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo celular de esofagite por refluxo induzido por HCl usando células Het-1A e para investigar o eixo miR-107/FGFRL1 usando ensaios moleculares e celulares.

Resumo

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Evidências extensas sugerem que microRNAs (miRNAs) desempenham um papel fundamental nos processos fisiopatológicos gastrointestinais. No entanto, seus mecanismos específicos na esofagite por refluxo (ER) ainda são pouco compreendidos. Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo de RE induzido por ácido e investigar o eixo miR-107/FGFRL1 usando ensaios moleculares e celulares. Realizamos análises amostrais clínicas, incluindo coleta sérica de pacientes com E R (n=94) e controles saudáveis (n=94), seguidas pela detecção quantitativa via RT-qPCR. In vitro, foi estabelecido um modelo de lesão induzida por ácido usando células Het-1A expostas ao ácido clorídrico. Além disso, a validação funcional das células foi realizada usando ensaios de viabilidade de células MTT e ensaios com repórter de dupla luciferase. Resultados representativos indicam que o miR-107 foi reduzido no soro de pacientes com RE e em células Het-1A tratadas com ácido. O miR-107 mediava alterações induzidas pelo ácido clorídrico na viabilidade e nos níveis de inflamação das células Het-1A ao direcionar diretamente o FGFRL1 e está associado a alterações na viabilidade celular e inflamação por meio do direcionamento do FGFRL1. Esse protocolo possibilita a investigação de mecanismos mediados por miR-107/FGFRL1 em ER. Essa abordagem fornece uma plataforma reprodutível para estudar mecanismos moleculares em ER.

Introdução

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A esofagite por refluxo (ER) é uma doença digestiva na qual o ácido gástrico e o conteúdo gástrico refluem repetidamente para o esôfago, resultando em inflamação, erosão ou até ulceração da mucosa esofágica, cuja gravidade está relacionada à natureza do material refluxado, à frequência do refluxo e à resistência da mucosaesofágica 1,2. Como um tipo altamente prevalente de doença por refluxo gastroesofágico (DRGE), a RE apresenta uma incidência crescente e um impacto global cada vez maisampliado 3. A apresentação clínica inespecífica da ER geralmente leva a um diagnóstico errado ou subdiagnóstico. Além disso, o curso recorrente da doença frequentemente evolui para complicações gastrointestinais mais graves, impondo grandes encargos fisiológicos e socioeconômicos aos pacientes4. O manejo clínico padrão da RE normalmente envolve farmacoterapia (como inibidores da bomba de prótons), procedimentos endoscópicos minimamente invasivos oucirurgia 5,6. No entanto, a eficácia terapêutica é frequentemente limitada por efeitos adversos relacionados à medicação e pela morbidade procedural. Dada a compreensão incompleta da patogênese molecular dos RE, elucidar seus mecanismos subjacentes pode revelar novos alvos terapêuticos e os RE informar o desenvolvimento de estratégias de tratamento mais eficazes e específicas para cada paciente. Esse protocolo visa estabelecer um modelo RE in vitro e investigar o papel regulatório do eixo miR-107/FGFRL1 usando ensaios moleculares e celulares.

MicroRNAs (miRNAs) foram amplamente documentados como participantes da patogênese de diversas doenças humanas por meio de sua capacidade de regular a tradução de mRNA por meio de ligação específica desequência 7. Por exemplo, o miR-3682-3p afeta a via Wnt/β-catenina ao regular a expressão de FHL1, levando à progressão do câncer deesôfago 8. miR-21-5p e miR-223-3p afetam o curso da esofagite eosinofílica (EOE) ao mediar a expressão dos genes-alvoa jusante 9. MiR-107 é um miRNA codificado no cromossomo 10 em humanos que atraiu significativa atenção em pesquisas devido às suas implicações em vários processostumorigênicos 10,11,12. Evidências atuais indicam que o miR-107 é um mediador de hotspots no câncer gástrico e no câncer deesôfago 13,14, mas suas funções fisiopatológicas e mecanismos regulatórios em doenças digestivas não neoplásicas precisam ser investigados a fundo. No entanto, modelos in vitro apropriados e abordagens analíticas integradas para estudar a função do miR-107 em RE continuam limitados.

O refluxo ácido gástrico é amplamente reconhecido como o principal fator patogênico responsável pela lesão mucosa esofágica noRE 15. Estudos recentes propõem que o mecanismo patogênico da RE envolve não lesão direta da mucosa causada pelos sucos gástricos, mas sim a estimulação da liberação de quimiocinas das células epiteliais esofágicas, iniciando uma cascata de danos teciduais mediados porinflamação 16. Para investigar os mecanismos moleculares subjacentes a esse processo, tratamos células Het-1A com ácido clorídrico para estabelecer um modelo in vitro de lesão ácida que replica as principais características patológicas do dano epitelial causado pelo refluxo ácido. Essa abordagem fornece um sistema controlado e reprodutível para imitar a lesão epitelial induzida por ácidos in vitro. Exploramos sistematicamente o papel regulador do miR-107 na inflamação e apoptose associadas à RE, bem como seu potencial diagnóstico. Esse protocolo possibilita a investigação da regulação mediada por miRNA de vias inflamatórias e apoptóticas em células epiteliais esofágicas. Comparado aos modelos animais in vivo tradicionais e culturas celulares primárias, o modelo Het-1A induzido por HCl, combinado com ensaios funcionais de miR-107, oferece estabilidade, controlabilidade e reprodutibilidade excepcionais, tornando-o particularmente adequado para estudar danos epiteliais induzidos por ácido, regulação pós-transcricional mediada por miRNA e respostas inflamatórias em células esofágicas17. Esse método é particularmente adequado para estudos que investigam mecanismos moleculares de lesão epitelial induzida por ácidos e regulação mediada por miRNA. Quando combinada com análises clínicas de pacientes, essa abordagem pode ser combinada com dados clínicos para apoiar estudos mecanicistas em RE.

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Protocolo

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1. Recrutamento de pacientes

  1. Conduzir o estudo de acordo com a Declaração de Helsinque.
  2. Obtenha aprovação para o protocolo de pesquisa do Comitê de Ética do Hospital Central de Jiaozhou, em Qingdao (Número de Aprovação: 2023033-01).
  3. Certifique-se de que todos os participantes forneçam consentimento informado assinado antes do início do estudo.
  4. Identificar e inscrever 94 pacientes com esofagite por refluxo (ER) do Hospital Central de Jiaozhou, em Qingdao.
  5. Inclua 94 voluntários saudáveis como grupo de controle.
  6. Diagnosticar todos os pacientes com RE por gastroscopia para confirmar lesões e erosões da mucosa esofágica. Agrupe os pacientes de acordo com o critériode classificação 18 de Los Angeles.
  7. Incluiu pacientes com RE que apresentam desconforto no sistema digestivo que durou mais de 3 meses, sem histórico de cirurgia gastrointestinal superior e forneceram consentimento informado assinado para este estudo.
  8. Exclua pacientes com esôfago de Barrett, varizes esofágicas, estenose esofágica, úlceras profundas ou lesões tumorais malignas por meio de gastroscopia.

2. Coleta de amostras de soro

  1. Colete 5 mL de sangue venoso em jejum de cada participante entre 8h e 10h após um jejum noturno de pelo menos 8 horas.
  2. Centrifuge o sangue coletado a 4 °C 3000 × g por 15 minutos.
  3. Colete o sobrenadante cuidadosamente após a centrifugação.
  4. Armazene o soro separado a -80 °C no freezer até a medição subsequente.
    NOTA: Amostras podem ser armazenadas a −80 °C para armazenamento de longo prazo e processadas posteriormente

3. Cultura celular

  1. Compre linhas celulares escamosas escámicas esofágicas humanas Het-1A em um banco celular comercial. Descongele rapidamente as células em um banho-maria a 37 °C em 1–2 minutos.
  2. Reanimar células de Het-1A e cultivá-las em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina.
  3. Defina os parâmetros da incubadora para 37°C e 5% de CO₂ para manutenção da cultura celular.
  4. Substitua o meio a cada 2 dias e as células de passagem em 80–90% de confluência usando 0,25% de tripsina-EDTA.

4. Indução celular

  1. Inocular as células Het-1A em placas de 6 poços e ajustar a densidade celular para 2×105células-poço – 1 em meio completo de 2 mL.
  2. Dilua ácido clorídrico concentrado (HCl) com soro tampado com fosfato (PBS) e ajuste o pH para 4,0.
    ATENÇÃO: Ácido clorídrico é corrosivo e irritante. Manuseie ácido clorídrico usando equipamentos de proteção individual apropriados (incluindo óculos de segurança, luvas e jaleco) e trabalhe em uma exaustão química
  3. Adicione 2 mL da solução preparada de HCl a cada poço para induzir as células.
  4. Descarte a solução de HCl e lave as células duas vezes com PBS pré-aquecido antes dos ensaios em cada ponto temporal.
  5. Meça a viabilidade da célula usando um ensaio MTT em 0, 10, 20 e 30 min.

5. Reação em cadeia quantitativa da polimerase em tempo real (RT-qPCR)

  1. Extraia RNA total das células Het-1A usando um reagente fenol-clorofórmio.
  2. Avalie a pureza e concentração de RNA usando um espectrofotômetro NanoDrop, confirmando uma razão A260/A280 entre 1,8 e 2,0.
  3. Configure o sistema de amplificação de transcrição reversa usando o kit de transcrição reversa.
  4. Realize transcrição reversa em uma máquina de PCR a 37°C por 15 minutos, 85°C por 5 segundos, e depois mantenha a 4°C.
  5. Gerar DNA circular (cDNA) por meio de transcrição reversa.
  6. Realize reações RT-qPCR em um volume de reação de 20 μL usando a mistura master SYBR Green PCR.
  7. Defina as condições de ciclo da PCR da seguinte forma: desnaturação inicial a 95 °C por 10 minutos, seguida por 40 ciclos a 95 °C por 15 s e 60 °C por 1 minuto.
  8. Use gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e RNA nuclear pequeno (U6) como controles internos para miR-107 e FGFRL1.
  9. Calcule os dados usando o método 2-ΔΔCt.
  10. Quantifique o conteúdo de mRNA de fatores inflamatórios (IL-6, IL-8) e moléculas regulatórias relacionadas à apoptose (Fas, p53) por RT-qPCR.

6. Transfecção celular

  1. Cultive células Het-1A estaticamente em placas de 6 poços com densidade de 2×105 células·poço-1 até atingirem a fase de crescimento logarítmico.
  2. Obtenha oligonucleotídeos sintéticos (miR-107 mimic/ov-FGFRL1; 50 nM), plasmídeos com regulação negativa (inibidor de miR-107; 100 nM) e seus respectivos fragmentos de controle negativo de um fornecedor comercial.
  3. Transfecte os fragmentos mencionados acima em células usando reagente lipofectamina por 48 horas.

7. Viabilidade celular

  1. Semente células Het-1A em placas de 96 poços com densidade de 5×103 células·poço de 1 em meio de 100 μL por poço e cultive durante a noite.
  2. Adicione solução de metil-tiazolino tetrazólio (MTT) (20 μL, 5 mg·mL-1, concentração final 0,5 mg·mL-1) às células Het-1A e incube por 4 horas a 37 °C.
  3. Adicione o dimetil sulfóxido (DMSO, 150 μL) e faça vórtice na mistura por 10 minutos.
  4. Meça o valor de absorvância (490 nm) de cada poço por meio de um leitor de microplacas.
  5. Defina 3 poços replicados por grupo e repita 3 vezes independentes.

8. Ensaio ELISA

  1. Detecte IL-6 e IL-8 nas células usando o kit ELISA seguindo o procedimento operacional padrão do fabricante.
  2. Repita o procedimento três vezes independentemente.

9. Previsão de alvo e ensaio de atividade de luciferase

  1. Prever alvos potenciais do miR-107 usando bancos de dados miRDB e ENCORI. Identificar alvos sobrepostos e verificar os sítios complementares de ligação.
  2. Identifique sítios de ligação complementares entre miR-107 e FGFRL1.
  3. Clone e obtenha o tipo selvagem FGFRL1 3'UTR contendo sítios de ligação miR-107 (wt-FGFRL1). Gerar mutantes específicos do sítio de ligação (mut-FGFRL1).
  4. Células Het-1A co-transfectas com mimetismo/inibidor de wt/mut-FGFRL1 e miR-107 (ou controles NC).
  5. Meça a atividade da luciferase usando um sistema de ensaio repórter de dupla luciferase.

10. Análise estatística

  1. Realize a análise ROC usando o GraphPad Prism inserindo os dados de expressão, selecionando a função curva ROC e exportando os resultados.
  2. Avalie as diferenças entre grupos por meio do teste t de Student (para dois grupos) ou análise unilateral da variância (ANOVA; para múltiplos grupos), seguido pelo teste post hoc de Tukey.
  3. Considere p < 0,05 como estatisticamente significativo.
  4. As informações detalhadas dos dados originais foram resumidas na Tabela 1 suplementar.

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Resultados

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Recrutamento de pacientes e características de base Esses resultados descrevem a expressão e o desempenho diagnóstico do miR-107 em pacientes com ER. A Tabela 1 registra as características gerais dos controles saudáveis e dos pacientes com ER. Os resultados não mostram diferenças estatisticamente significativas entre os dois grupos em termos de gênero, idade e histórico médico subjacente (p > 0,05), indicando comparabilidade.

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Discussão

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RE é uma doença inflamatória da mucosa esofágica causada por refluxo gastroesofágico com uma ampla gama de sintomas que podem afetar a qualidade de vida e apresentar risco de desenvolver complicaçõesgraves 19. Em condições fisiológicas normais, o estômago permanece protegido contra ácido gástrico e bile devido aos seus mecanismos inerentes de defesa. Em contraste, o esôfago, que não possui uma barreira robusta contra o muco, é mais suscetível a danos causados por ...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projeto de Tecnologia de Medicina Tradicional Chinesa de Guangzhou e Medicina Integrada Tradicional Chinesa e Ocidental (Número da Bolsa: 20242A011007). Projeto de Pesquisa Científica da Administração Provincial de Medicina Tradicional Chinesa de Guangdong (Número da Bolsa: 20262041).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Coleção de Cultura do Tipo Americano  Manassas, EUABanco de Células Comerciais
Dimetil sulfóxido  Sigma, AlemanhaD4540
Kit de ensaio repórter de dupla luciferasePromega, EUAE1910Sistema de ensaio repórter de dupla luciferase
FastStart Universal SYBR Green Master KitRoche, Alemanha4913850SYBR Green PCR master mix
Soro fetal bovinoGibco, NY, EUA10100147C
GenePharma CompanyXangai, China
Cloreto de hidrogênioSigma-Aldrich, MO, EUA1099730001
IL-6 ELISA KitR& D Systems, EUAD6050Kit ELISA
IL-8 ELISA KitR& D Systems, EUAD8000CKit ELISA
IncubadoraForma Scientific, MA, EUA311 S/N29035
Lipofectamina 3000Invitrogen, EUAL3000015Reagente de lipofectamina
Metil tiazolil-tetrazólioSigma, AlemanhaM5655
Leitor de microplacasBioTek, VT, EUAELx808
Espectrofotômetro NanoDropThermo, MA, EUAND-1000
Penicilina/estreptomicinaGibco, NY, EUA15070063
Kit RT PrimeScriptTakara, JapãoDRR047AKit de transcrição reversa
TRIzol Thermo, MA, EUA10296010Reagente fenol-clorofórmio
Freezer de ultrabaixa temperatura  Haier, Qingdao, ChinaDW-86W100

Referências

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