$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os experimentos envolvendo Caenorhabditis elegans foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de organismos laboratoriais na Universidade Normal de Pequim.
Figura 1: Visão geral da marcação endógena fluorescente mediada por CRISPR/Cas9 em C. elegans. Fluxo de trabalho esquemático ilustrando as principais etapas da geração e validação de knock-in fluorescente endógeno. Na fase de projeto e construção, um gene alvo enriquecido em linha germinativa e um local de inserção são selecionados, pDD162 é usado como plasmídeo CRISPR/Cas9 para a expressão de Cas9 e guia de RNA, e pPD95.75 é usado como a espinha dorsal doadora na qual a marca fluorescente (por exemplo, GFP) e os braços de homologia esquerdo e direito são subclonados. Na fase de microinjeção, a mistura de injeção CRISPR/Cas9 (incluindo o plasmídeo gRNA/Cas9, o molde doador e os marcadores de co-injeção) é entregue na gônada de hermafroditas jovens adultos, seguida pela recuperação em placas semeadas. Na fase de validação, descendentes marcadores positivos são selecionados para genotipagem posterior, incluindo identificação por PCR de eventos knock-in e confirmação por sequenciamento de DNA, e linhas knock-in bem-sucedidas são posteriormente examinadas por microscopia de fluorescência para avaliar a expressão germinativa e a localização subcelular da proteína marcada. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
1. Selecionar um gene-alvo enriquecido em linha germinativa
- Identificar genes candidatos com expressão predominante na gônada ou nas células germinativas usando bancos de dados públicos e literatura publicada.
- Selecione um local de marcação apropriado com base nas características das proteínas. Registre a isoforma selecionada e a posição de inserção da etiqueta para o design posterior do RNA-guia e do modelo doador (Figura 1).
2. Projetar o modelo de RNA guia e doador
- Identifique uma sequência de RNA-guia (gRNA) de 20 nt a montante de um motivo adjacente ao protoespaçador (PAM; NGG), a sequência necessária para o reconhecimento Cas9, e posicioná-la o mais próximo possível do local pretendido de inserção da etiqueta.
- Avalie gRNAs candidatos usando uma ferramenta de design online (por exemplo, a ferramenta de design IDT CRISPR) com o genoma de C. elegans selecionado. Selecione um guia com forte eficiência prevista de corte no alvo e sem locais de alto risco previstos fora do alvo.
- Clone a sequência de gRNA na região entre o promotor de U6 e o andaime de gRNA dentro da espinha dorsal do plasmídeo de expressão CRISPR.
NOTA: Primers de projeto incorporando a sequência de gRNA como saliências. Realize amplificação por PCR seguida de montagem baseada em recombinação homóloga, um método de clonagem independente da ligação que elimina a digestão enzimática de restrição e permite a clonagem em uma etapa diretamente no vetorde expressão 15.
- Confirme a inserção correta por sequenciamento de Sanger.
- Construa o plasmídeo doador usando uma etiqueta fluorescente ladeada por braços de homologia esquerdo de aproximadamente 1.000 pb e braços de homologia direito de 1.000 pb, derivados do locus-alvo.
NOTA: Amplifique os braços de homologia a partir do DNA genômico N2 preparado como lisado de vermes usando digestão da proteinase K. Primers de design com 15–20 pb sobrepõem-se ao vetor linearizado e ao fluorescente. Monte os braços de homologia e marque na espinha dorsal via recombinação homóloga em uma única reação. Insira a etiqueta fluorescente imediatamente após o códon inicial ATG para a marcação N-terminal ou antes do códon de parada para a marcação C-terminal. Inclua uma sequência de ligação entre o gene alvo e a etiqueta fluorescente para manter o dobramento e a função adequadas das proteínas. Use o linker para reduzir a interferência estérica entre os parceiros de fusão e garantir que tanto o linker quanto a tag sejam inseridos no quadro com a sequência de codificação. Selecione cuidadosamente o local de inserção para evitar perturbar domínios funcionais conhecidos ou previstos, peptídeos de sinal ou regiões transmembranas (Arquivo Suplementar 1).
- Introduza substituições silenciosas na sequência do molde homólogo do doador para interromper a sequência de ligação PAM ou guia, sem alterar a sequência proteica, e evitar que o Cas9 seja recortado após a integração.
NOTA: Incorpore mutações pontuais sinônimas em primers usados para amplificação do braço de homologia, direcionando codons dentro da região PAM.
- Confirme a integridade da sequência doadora tanto em braços de homologia quanto em junções de etiquetas por meio do sequenciamento de Sanger.
NOTA: Armazene plasmídeos verificados a −20 °C para armazenamento de curto prazo ou −80 °C para armazenamento de longo prazo.
3. Prepare a mistura de injeção
- Monte a mistura de injeção combinando o plasmídeo de expressão CRISPR, o plasmídeo doador (construído com base em pPD95,75) e marcadores de co-injeção em ddH₂O estéril para um volume final de 10 μL nas concentrações listadas na Tabela 1.
NOTA: Otimize as concentrações empiricamente para equilibrar a legibilidade dos marcadores, a recuperação dos candidatos e a sobrevivência pós-injeção.
- Centrifuge a mistura de injeção a 10.000 × g. por 10–20 minutos para pelletar material particulado e evitar entupimento do capilar de microinjeção.
| Componente | Função | Concentração de trabalho (ng/μL) |
| pDD162 | Plasmídeo CRISPR/Cas9 (expressão de Cas9 e gRNA) | 50-100 |
| Plasmídeo doador (espinha dorsal pPD95.75) | Molde de doador HDR carregando uma etiqueta fluorescente ladeada por braços de homologia de ~1 kb | 50-100 |
| pRF4 | Marcador de coinjeção (fenótipo de rolo) | 50-100 |
| pPD122.11 | Marcador de co-injeção (expressão GFP) | 5-10 |
| Estéril ddH2O | Levar ao volume final | – |
Tabela 1: Composição da mistura de injeção e funções do plasmídeo. A mistura de injeção contém plasmídeo de expressão CRISPR, plasmídeo doador, pRF4 e pPD122.11 nas concentrações indicadas, totalizando um volume de 10 μL.
4. Carregar e preparar a agulha de injeção
- Puxe capilares de vidro para agulhas de microinjeção usando um puxador de agulhas configurado para produzir um afunilamento longo com ponta afiada adequada para injeção gonadal.
NOTA: Otimize empiricamente os parâmetros do puller. Parâmetros iniciais de exemplo: calor = 540, puxão = 20, velocidade = 100.
ATENÇÃO: Manuseie cuidadosamente as agulhas puxadas para evitar lesões por perfuração. Use pinças ao manusear agulhas e descarte as agulhas usadas em um recipiente para objetos cortantes.
- Aqueça uma micropipeta capilar e partia-a em duas partes para criar uma ferramenta de carga.
NOTA: Ponteiras de carregamento comerciais podem ser usadas como alternativa.
- Prenda uma lâmpada aspiradora de borracha na extremidade larga da micropipeta microcapilar encurtada.
- Aspire aproximadamente 1 μL de mistura de mistura clarificada de injeção sobrenadante no carregador.
NOTA: O volume exato não é crítico. Certifique-se de que a solução preencha a ponta da agulha.
- Insira o carregador na parte de trás da agulha de injeção e dispense delicadamente a mistura de injeção.
- Coloque a agulha carregada na horizontal por 10 minutos para permitir que a solução se acomode em direção à ponta e confirme a coluna contínua.
- Monte a agulha no microscópio de injeção e coloque a ponta em foco usando óptica de campo claro.
- Abra a ponta da agulha tocando suavemente com a borda de uma capa de cobertura em óleo de halocarbonetos e teste o fluxo.
NOTA: Ajuste a pressão de injeção (30–80 psi) para gerar uma bolha aproximadamente igual ao diâmetro da gónada dentro de 1 s16.
5. Preparar minhocas para injeção
NOTA: Prepare as placas de Meio de Crescimento Nematoide (NGM) e o tampão M9 conforme descritoanteriormente 17. Mantenha vermes em placas semeadas com Escherichia coli OP50 (doravante OP50) e realize injeções no fundo N2.
- Selecione hermafroditas L4 de uma placa saudável e incube a 20 °C por 10 horas para obter jovens adultos com linhas germinativas bem desenvolvidas.
- Transfira minhocas para uma placa sem sementes para reduzir a transmissão bacteriana.
- Prepare uma almofada seca de agarose a 2% em uma lâmina de vidro e aplique uma gota de óleo de halocarbono.
- Transfira uma minhoca para a almofada de agarose usando um apanhador de cílios.
- Imobilize o verme e oriente a gônada para a injeção.
ATENÇÃO: Complete as injeções em 20–30 minutos para evitar a dessecação.
6. Realizar microinjeção gonadal
Figura 2: Localização do sincitío gônade distal para microinjeção em jovens adultos C. elegans hermafroditos. (A) Imagem de campo claro de baixa ampliação de um jovem adulto hermafrodita montado. Ambos os braços gônadas são visíveis; O local da injeção é indicado para um braço (flecha) como exemplo representativo. A região encaixada marca a área mostrada em maior ampliação no painel B. (B) Vista DIC com maior ampliação da gônada distal correspondente à região encaixada no painel A. A seta indica a posição da injeção dentro do sincitío gonadal distal, onde a mistura de injeção é administrada. Barras de escala: 100 μm (A) e 20 μm (B). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
- Localize um verme imobilizado e identifique a gônada usando um objetivo de baixa ampliação.
- Posicione a agulha usando controles de micromanipuladores.
- Oriente o verme em um ângulo de 20–40° em relação à agulha.
- Foque na linha germinativa distal usando maior ampliação.
- Avance a minhoca em direção à agulha e posicione a ponta dentro do sincito gonadal (Figura 2).
- Injete a solução e confirme a entrega por inchaço visível da gônada.
NOTA: Otimize a pressão de injeção (30–80 psi), a pressão de compensação (0,1–0,5 psi) e a duração da injeção (0,1–0,3 s).
ATENÇÃO: Pressão ou volume excessivos podem causar rompimento de vermes.
- Retire a agulha e reposicione para as injeções seguintes.
NOTA: Realize uma injeção unilateral para maximizar a sobrevivência, ou uma injeção bilateral para aumentar a eficiência da edição.
- Adicione um buffer M9 para liberar minhocas e transfira cada verme para uma placa de recuperação individual.
- Injeções repetidas para 20–25 vermes.
NOTA: Substitua a agulha se ela entupiu ou se danificar.
- Incube vermes injetados a 20 °C por 2–3 dias para permitir a recuperação.
7. Selecionar candidatos F1 para identificar linhas knock-in positivas
- Analise a prole F1 para marcadores de co-injeção e selecione animais positivos para marcadores.
NOTA: Exemplos de marcadores alternativos de coinjeção fluorescente com diferentes especificidades de tecido e propriedades espectrais são fornecidos na Tabela Suplementar 1.
NOTA: Selecione animais que expressem ambos os marcadores para maior confiabilidade. Priorize ninhadas com alta frequência de marcadores ("ninhadas do jackpot").
- Transfira cada verme F1 para uma placa individual e permita a postura de ovos por 1–2 dias.
- Lisar cada verme F1 em tampão de proteinase K para preparar os modelos de PCR.
NOTA: Armazene lisados a −80 °C se não for processado imediatamente.
- Realize PCR por junção usando um primer genômico fora do braço de homologia e um primer interno do tag.
NOTA: Manter as placas correspondentes de animais F1 positivos para PCR.
8. Selecionar a prole F2 para isolar linhas homozigotas de knock-in e confirmar a integração
- Isolar a prole F2 das linhas F1 positivas para PCR em placas individuais.
- Permitir que vermes F2 produzam descendentes e lisar adultos para genotipagem.
NOTA: Armazene lisados a −20 °C, se necessário.
- Realize PCR usando espoletas flanqueando os braços de homologia para distinguir alelos do tipo selvagem e knock-in pelo tamanho do produto.
- Confirme a integração correta por sequenciamento Sanger em ambas as junções de inserção.
- Verifique a expressão e localização da fluorescência germinativa usando microscopia de fluorescência.
- Expanda as linhas homozigóticas confirmadas e mantenha estoques.
NOTA: Linhas validadas por criopreservação para armazenamento a longo prazo.