Um fluxo de trabalho de microinjeção CRISPR/Cas9 para marcação fluorescente endógena na linha germinativa de Caenorhabditis elegans , visando obter linhas homozigotas knock-in para análise in vivo de localização de proteínas.
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Artigo de método
Marcação Endógena Fluorescente Mediada por CRISPR/Cas9 de Genes Específicos da Linhagem Germântica em Caenorhabditis elegans
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Resumo
Resumo
A localização proteica na linha germinativa de Caenorhabditis elegans (C. elegans) é central para interpretar a função gênica durante a gametogênese, embora abordagens convencionais de transgenes frequentemente produzam expressão variável e podem ser silenciadas nas células germinativas. Aqui, é descrito um fluxo prático de trabalho CRISPR/Cas9 inserindo uma etiqueta fluorescente em um locus endógeno, permitindo a geração de alelos knock-in estáveis que relatam a distribuição proteica sob regulação nativa. O protocolo cobre estágios-chave do procedimento: seleção de uma estratégia de marcação adequada para a proteína alvo, administração de reagentes CRISPR por microinjeção gonadal em hermafroditas jovens adultos e recuperação de animais injetados para triagem. Candidatos knock-in são identificados por genotipagem baseada em PCR ao longo de duas gerações para isolar vermes homozigóticos e verificar o alelo editado. Por fim, a microscopia confocal é usada para verificar a fluorescência da linha germinativa e avaliar a localização subcelular in vivo. O fluxo de trabalho é projetado para ser reproduzível e amplamente aplicável a genes enriquecidos em germlinagem, proporcionando uma rota direta para estabelecer cepas homozigóticas marcadas para análises de desenvolvimento e biologia celular.
Introdução
Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um modelo bem estabelecido para estudar o desenvolvimento reprodutivo e a gametogênese, devido ao seu curto ciclo de vida, corpo transparente e alta tratabilidadegenética 1. C. elegans existe principalmente como hermafroditas autofertilizantes, cuja gônada primeiro passa por espermatogênese e depois muda para a oogênese. Esse modo reprodutivo simplifica a manutenção da tensão e facilita a obtenção de linhashomozigóticas 2. A transcriptômica espacial recente expandiu substancialmente a lista de genes enriquecidos na gônada e revelou padrões de expressão específicos para sexo pronunciados em todo o sistema reprodutor em C. elegans3. Mais recentemente, o sequenciamento de RNA unicelular possibilitou a reconstrução das trajetórias de desenvolvimento das células germinativas e a inferência das redes reguladoras gênicas que regem aespermatogênese 4. Juntos, esses conjuntos de dados geram listas de candidatos detalhadas, mas a interpretação funcional frequentemente requer observar o comportamento das proteínas in vivo — especificamente, definir quando e onde as proteínas correspondentes se localizam e como seus padrões mudam ao longo do desenvolvimento da linhagem germinativa.
A transgênese convencional em C. elegans frequentemente depende da microinjeção gonadal de DNA plasmídico, que gera facilmente matrizes extracromossômicas de múltiplascópias 5. No entanto, na linha germinativa, esses arranjos frequentemente são robustamente silenciados, um mecanismo que acredita-se ajudar a manter a integridade da linha germinativa ao restringir a expressão a partir de DNA repetitivo, preservando assim a função germinativa e a estabilidade da informação genética ao longo dasgerações 6,7. Como resultado, construtos de expressão de transgenes que são facilmente expressos em tecidos somáticos podem ser fracos ou inconsistentes na linha germinativa. Mesmo quando a expressão é detectável, efeitos do número de cópias e elementos regulatórios modificados podem alterar a dosagem e o momento da proteína, potencialmente confundindo conclusões sobre localização e dinâmica nativas. Para resolver essas limitações, o bombardeio de micropartículas e a Inserção de Cópia Única mediada por Mos1 (MosSCI) são amplamente usados para gerar linhas transgênicas integradas de baixa ou simplescópia 8, 9, 10. Essas abordagens podem melhorar a expressão na linha germinal, mas diferem em custo, capacidade de produção e em quão bem reproduzem a regulação endógena. A edição genômica CRISPR/Cas9 oferece uma rota mais direta ao inserir uma etiqueta fluorescente no locus endógeno por meio de reparo dirigido por homologia, gerando alelos knock-in estáveis que relatam localização e dinâmica de proteínas sob controle regulatórionativo 11,12,13,14.
Aqui, é descrito um fluxo prático para a marcação endógena fluorescente mediada por CRISPR/Cas9 em C. elegans , aplicado a genes selecionados com base em padrões de expressão enriquecidos por germinação relatados. O protocolo descreve a seleção do alvo, modelo e guia do doador no design de RNA, microinjeção gonadal e triagem posterior para isolar linhas homozigotas knock-in, seguidas pela validação por genotipagem. Essa abordagem é amplamente aplicável a genes expressos pela linha germinativa em diferentes estágios de desenvolvimento e permite análises quantitativas da localização e dinâmica das proteínas in vivo. Esse fluxo de trabalho oferece uma estratégia prática para marcar genes expressos na linha germinativa e para analisar a localização e dinâmica de proteínas in vivo sob controle regulatório nativo.
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Protocolo
Todos os experimentos envolvendo Caenorhabditis elegans foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de organismos laboratoriais na Universidade Normal de Pequim.
Figura 1: Visão geral da marcação endógena fluorescente mediada por CRISPR/Cas9 em C. elegans. Fluxo de trabalho esquemático ilustrando as principais etapas da geração e validação de knock-in fluorescente endógeno. Na fase de projeto e construção, um gene alvo enriquecido em linha germinativa e um local de inserção são selecionados, pDD162 é usado como plasmídeo CRISPR/Cas9 para a expressão de Cas9 e guia de RNA, e pPD95.75 é usado como a espinha dorsal doadora na qual a marca fluorescente (por exemplo, GFP) e os braços de homologia esquerdo e direito são subclonados. Na fase de microinjeção, a mistura de injeção CRISPR/Cas9 (incluindo o plasmídeo gRNA/Cas9, o molde doador e os marcadores de co-injeção) é entregue na gônada de hermafroditas jovens adultos, seguida pela recuperação em placas semeadas. Na fase de validação, descendentes marcadores positivos são selecionados para genotipagem posterior, incluindo identificação por PCR de eventos knock-in e confirmação por sequenciamento de DNA, e linhas knock-in bem-sucedidas são posteriormente examinadas por microscopia de fluorescência para avaliar a expressão germinativa e a localização subcelular da proteína marcada. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
1. Selecionar um gene-alvo enriquecido em linha germinativa
- Identificar genes candidatos com expressão predominante na gônada ou nas células germinativas usando bancos de dados públicos e literatura publicada.
- Selecione um local de marcação apropriado com base nas características das proteínas. Registre a isoforma selecionada e a posição de inserção da etiqueta para o design posterior do RNA-guia e do modelo doador (Figura 1).
2. Projetar o modelo de RNA guia e doador
- Identifique uma sequência de RNA-guia (gRNA) de 20 nt a montante de um motivo adjacente ao protoespaçador (PAM; NGG), a sequência necessária para o reconhecimento Cas9, e posicioná-la o mais próximo possível do local pretendido de inserção da etiqueta.
- Avalie gRNAs candidatos usando uma ferramenta de design online (por exemplo, a ferramenta de design IDT CRISPR) com o genoma de C. elegans selecionado. Selecione um guia com forte eficiência prevista de corte no alvo e sem locais de alto risco previstos fora do alvo.
- Clone a sequência de gRNA na região entre o promotor de U6 e o andaime de gRNA dentro da espinha dorsal do plasmídeo de expressão CRISPR.
NOTA: Primers de projeto incorporando a sequência de gRNA como saliências. Realize amplificação por PCR seguida de montagem baseada em recombinação homóloga, um método de clonagem independente da ligação que elimina a digestão enzimática de restrição e permite a clonagem em uma etapa diretamente no vetorde expressão 15. - Confirme a inserção correta por sequenciamento de Sanger.
- Construa o plasmídeo doador usando uma etiqueta fluorescente ladeada por braços de homologia esquerdo de aproximadamente 1.000 pb e braços de homologia direito de 1.000 pb, derivados do locus-alvo.
NOTA: Amplifique os braços de homologia a partir do DNA genômico N2 preparado como lisado de vermes usando digestão da proteinase K. Primers de design com 15–20 pb sobrepõem-se ao vetor linearizado e ao fluorescente. Monte os braços de homologia e marque na espinha dorsal via recombinação homóloga em uma única reação. Insira a etiqueta fluorescente imediatamente após o códon inicial ATG para a marcação N-terminal ou antes do códon de parada para a marcação C-terminal. Inclua uma sequência de ligação entre o gene alvo e a etiqueta fluorescente para manter o dobramento e a função adequadas das proteínas. Use o linker para reduzir a interferência estérica entre os parceiros de fusão e garantir que tanto o linker quanto a tag sejam inseridos no quadro com a sequência de codificação. Selecione cuidadosamente o local de inserção para evitar perturbar domínios funcionais conhecidos ou previstos, peptídeos de sinal ou regiões transmembranas (Arquivo Suplementar 1). - Introduza substituições silenciosas na sequência do molde homólogo do doador para interromper a sequência de ligação PAM ou guia, sem alterar a sequência proteica, e evitar que o Cas9 seja recortado após a integração.
NOTA: Incorpore mutações pontuais sinônimas em primers usados para amplificação do braço de homologia, direcionando codons dentro da região PAM. - Confirme a integridade da sequência doadora tanto em braços de homologia quanto em junções de etiquetas por meio do sequenciamento de Sanger.
NOTA: Armazene plasmídeos verificados a −20 °C para armazenamento de curto prazo ou −80 °C para armazenamento de longo prazo.
3. Prepare a mistura de injeção
- Monte a mistura de injeção combinando o plasmídeo de expressão CRISPR, o plasmídeo doador (construído com base em pPD95,75) e marcadores de co-injeção em ddH₂O estéril para um volume final de 10 μL nas concentrações listadas na Tabela 1.
NOTA: Otimize as concentrações empiricamente para equilibrar a legibilidade dos marcadores, a recuperação dos candidatos e a sobrevivência pós-injeção. - Centrifuge a mistura de injeção a 10.000 × g. por 10–20 minutos para pelletar material particulado e evitar entupimento do capilar de microinjeção.
| Componente | Função | Concentração de trabalho (ng/μL) |
| pDD162 | Plasmídeo CRISPR/Cas9 (expressão de Cas9 e gRNA) | 50-100 |
| Plasmídeo doador (espinha dorsal pPD95.75) | Molde de doador HDR carregando uma etiqueta fluorescente ladeada por braços de homologia de ~1 kb | 50-100 |
| pRF4 | Marcador de coinjeção (fenótipo de rolo) | 50-100 |
| pPD122.11 | Marcador de co-injeção (expressão GFP) | 5-10 |
| Estéril ddH2O | Levar ao volume final | – |
Tabela 1: Composição da mistura de injeção e funções do plasmídeo. A mistura de injeção contém plasmídeo de expressão CRISPR, plasmídeo doador, pRF4 e pPD122.11 nas concentrações indicadas, totalizando um volume de 10 μL.
4. Carregar e preparar a agulha de injeção
- Puxe capilares de vidro para agulhas de microinjeção usando um puxador de agulhas configurado para produzir um afunilamento longo com ponta afiada adequada para injeção gonadal.
NOTA: Otimize empiricamente os parâmetros do puller. Parâmetros iniciais de exemplo: calor = 540, puxão = 20, velocidade = 100.
ATENÇÃO: Manuseie cuidadosamente as agulhas puxadas para evitar lesões por perfuração. Use pinças ao manusear agulhas e descarte as agulhas usadas em um recipiente para objetos cortantes. - Aqueça uma micropipeta capilar e partia-a em duas partes para criar uma ferramenta de carga.
NOTA: Ponteiras de carregamento comerciais podem ser usadas como alternativa. - Prenda uma lâmpada aspiradora de borracha na extremidade larga da micropipeta microcapilar encurtada.
- Aspire aproximadamente 1 μL de mistura de mistura clarificada de injeção sobrenadante no carregador.
NOTA: O volume exato não é crítico. Certifique-se de que a solução preencha a ponta da agulha. - Insira o carregador na parte de trás da agulha de injeção e dispense delicadamente a mistura de injeção.
- Coloque a agulha carregada na horizontal por 10 minutos para permitir que a solução se acomode em direção à ponta e confirme a coluna contínua.
- Monte a agulha no microscópio de injeção e coloque a ponta em foco usando óptica de campo claro.
- Abra a ponta da agulha tocando suavemente com a borda de uma capa de cobertura em óleo de halocarbonetos e teste o fluxo.
NOTA: Ajuste a pressão de injeção (30–80 psi) para gerar uma bolha aproximadamente igual ao diâmetro da gónada dentro de 1 s16.
5. Preparar minhocas para injeção
NOTA: Prepare as placas de Meio de Crescimento Nematoide (NGM) e o tampão M9 conforme descritoanteriormente 17. Mantenha vermes em placas semeadas com Escherichia coli OP50 (doravante OP50) e realize injeções no fundo N2.
- Selecione hermafroditas L4 de uma placa saudável e incube a 20 °C por 10 horas para obter jovens adultos com linhas germinativas bem desenvolvidas.
- Transfira minhocas para uma placa sem sementes para reduzir a transmissão bacteriana.
- Prepare uma almofada seca de agarose a 2% em uma lâmina de vidro e aplique uma gota de óleo de halocarbono.
- Transfira uma minhoca para a almofada de agarose usando um apanhador de cílios.
- Imobilize o verme e oriente a gônada para a injeção.
ATENÇÃO: Complete as injeções em 20–30 minutos para evitar a dessecação.
6. Realizar microinjeção gonadal
Figura 2: Localização do sincitío gônade distal para microinjeção em jovens adultos C. elegans hermafroditos. (A) Imagem de campo claro de baixa ampliação de um jovem adulto hermafrodita montado. Ambos os braços gônadas são visíveis; O local da injeção é indicado para um braço (flecha) como exemplo representativo. A região encaixada marca a área mostrada em maior ampliação no painel B. (B) Vista DIC com maior ampliação da gônada distal correspondente à região encaixada no painel A. A seta indica a posição da injeção dentro do sincitío gonadal distal, onde a mistura de injeção é administrada. Barras de escala: 100 μm (A) e 20 μm (B). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
- Localize um verme imobilizado e identifique a gônada usando um objetivo de baixa ampliação.
- Posicione a agulha usando controles de micromanipuladores.
- Oriente o verme em um ângulo de 20–40° em relação à agulha.
- Foque na linha germinativa distal usando maior ampliação.
- Avance a minhoca em direção à agulha e posicione a ponta dentro do sincito gonadal (Figura 2).
- Injete a solução e confirme a entrega por inchaço visível da gônada.
NOTA: Otimize a pressão de injeção (30–80 psi), a pressão de compensação (0,1–0,5 psi) e a duração da injeção (0,1–0,3 s).
ATENÇÃO: Pressão ou volume excessivos podem causar rompimento de vermes. - Retire a agulha e reposicione para as injeções seguintes.
NOTA: Realize uma injeção unilateral para maximizar a sobrevivência, ou uma injeção bilateral para aumentar a eficiência da edição. - Adicione um buffer M9 para liberar minhocas e transfira cada verme para uma placa de recuperação individual.
- Injeções repetidas para 20–25 vermes.
NOTA: Substitua a agulha se ela entupiu ou se danificar. - Incube vermes injetados a 20 °C por 2–3 dias para permitir a recuperação.
7. Selecionar candidatos F1 para identificar linhas knock-in positivas
- Analise a prole F1 para marcadores de co-injeção e selecione animais positivos para marcadores.
NOTA: Exemplos de marcadores alternativos de coinjeção fluorescente com diferentes especificidades de tecido e propriedades espectrais são fornecidos na Tabela Suplementar 1.
NOTA: Selecione animais que expressem ambos os marcadores para maior confiabilidade. Priorize ninhadas com alta frequência de marcadores ("ninhadas do jackpot"). - Transfira cada verme F1 para uma placa individual e permita a postura de ovos por 1–2 dias.
- Lisar cada verme F1 em tampão de proteinase K para preparar os modelos de PCR.
NOTA: Armazene lisados a −80 °C se não for processado imediatamente. - Realize PCR por junção usando um primer genômico fora do braço de homologia e um primer interno do tag.
NOTA: Manter as placas correspondentes de animais F1 positivos para PCR.
8. Selecionar a prole F2 para isolar linhas homozigotas de knock-in e confirmar a integração
- Isolar a prole F2 das linhas F1 positivas para PCR em placas individuais.
- Permitir que vermes F2 produzam descendentes e lisar adultos para genotipagem.
NOTA: Armazene lisados a −20 °C, se necessário. - Realize PCR usando espoletas flanqueando os braços de homologia para distinguir alelos do tipo selvagem e knock-in pelo tamanho do produto.
- Confirme a integração correta por sequenciamento Sanger em ambas as junções de inserção.
- Verifique a expressão e localização da fluorescência germinativa usando microscopia de fluorescência.
- Expanda as linhas homozigóticas confirmadas e mantenha estoques.
NOTA: Linhas validadas por criopreservação para armazenamento a longo prazo.
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Resultados
Seguindo o protocolo, jovens hermafroditas adultos foram microinjetados gonadalmente com um plasmídeo CRISPR/Cas9 (pDD162), um doador de plasmídeo codificando uma etiqueta knock-in GFP ladeada por braços de homologia de cerca de 1 kb (pPD95.75) e marcadores de co-injeção (pRF4 e pPD122.11). Um gene-alvo enriquecido em germline foi usado como exemplo representativo para gerar um alelo knock-in estável e homozigótico que relata localização proteica sob controle regulatório nativo.
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Discussão
Esse fluxo de trabalho foi projetado para gerar linhas knock-in estáveis e homozigóticas, nas quais uma etiqueta fluorescente é inserida no locus endógeno para relatar a localização da proteína sob controle regulatórionativo 5,6,7,8,9,10. Na prática, o sucesso é melhor avaliado por uma cadeia...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Esse trabalho foi apoiado por subsídios do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2023YFA1801100 a L.M.), da Natural Science Foundation of China (32400698 a P.W., 32270774 a L.M.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agar | Beijing Lablead Biotech Co., Ltd. | QZ02 | Componente para preparação de placas de ágar NGM |
| Agarose | NOVON | ZZ14011 | Prepare pastilhas de agarose a 2% |
| Caenorhabditis elegans strain N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Linha de fundo para injeção | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5425 | Esclarecer a mistura de injeção |
| Colesterol | Beijing Chemical Reagents Company | 57-88-5 | Componente para preparação de placas de ágar NGM |
| Plasmídeo marcador de co-injeção rol-6 (su1006) (pRF4) | Guangshuo Ou Lab | Marcador roller para enriquecer candidatos | |
| Microscópio confocal | ZEISS | LSM880 + Airyscan | Validar expressão/localização de GFP |
| Di-Potássio fosfato de hidrogênio (K2HPO4) | Sinapharm | CAS: 7758-11-4 | Componente para preparação de placas de ágar NGM |
| Di-Sódio fosfato de hidrogênio (Na2HPO4) | Sinapharm | CAS: 7558-79-4 | Componente para preparação de buffer M9 |
| Escada de DNA | Mei5 Biotechnology, Co., Ltd. | MF288-01 | Referência de tamanho para géis de agarose |
| Backbone do plasmídeo doador (pPD95.75) | Addgene | 1494 | Backbone para construção de doador HDR |
| Sistema de eletroforese | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | 112-0630 | Separar amplicons de PCR em géis de agarose para triagem de junção e genotipagem de zigose |
| Estirpe de Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Fonte de alimento para vermes | |
| Plasmídeo marcador de co-injeção fluorescente (pPD122.11) | Fire Lab | Co-marcador GFP para enriquecer candidatos | |
| Microscópio estereoscópico fluorescente | SOPTOP | SZX12-HT | Tela de vermes vivos para marcadores fluorescentes de co-injeção |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Mei5 Biotechnology, Co., Ltd. | MF079-plus-01 | Visualização de bandas de DNA |
| Capiláres de vidro | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Usado com puxador de agulha para fazer agulhas de injeção |
| Óleo de halocarboneto 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | Prevenir ressecamento durante injeção |
| Incubadora | Wuhan Ruihua Instrument & Equipment Co., Ltd. | HP400S | Manter vermes na temperatura padrão |
| Sulfato de magnésio (MgSO4) | Sinapharm | CAS: 7487-88-9 | Componente para preparação de placas de ágar NGM e buffer M9 |
| Pipetas microcapilares | KIMBLE | 71900-50 | Aquecidas e quebradas para criar ferramenta de carregamento |
| Unidade microinjetora | Eppendorf | FemtoJet 4i | Entregar pulsos de pressão controlados da mistura de injeção na gonada distal através de uma agulha de microinjeção (acionado por pedal) |
| Vidro de cobertura para microscópio | Fisherbrand | 12545A 22×30-1 | Prepare pastilhas de agarose a 2% para montagem e imobilização de vermes durante microinjeção; Abra pontas de agulha de injeção contra a borda do slide |
| Microscópio para microinjeção | ZEISS | Axio Observer.A1 | Microscópio de injeção |
| Puxador de agulha | Sutter Instrument Company | Modelo P97 | Puxar capilares de vidro em agulhas de injeção |
| Termociclador PCR | Bio-Rad | C1000 Touch Thermal Cycler | Amplificação PCR |
| pDD162 (Peft-3::Cas9 + Empty sgRNA) | Addgene | 47549 | Expressão de Cas9 + sgRNA |
| Peptona | Gibco | 308723 | Componente para preparação de placas de ágar NGM |
| Fosfato de potássio di-hidrogênio (KH2PO4) | Sinapharm | CAS: 7778-77-0 | Componente para preparação de placas de ágar NGM e buffer M9 |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Sinapharm | CAS: 7647-14-5 | Componente para preparação de placas de ágar NGM e buffer M9 |
| Microscópio estereoscópico | Motic | K400L | Escolha e montagem de vermes em pastilhas de agarose e realiza os passos de recuperação pós-injeção |
Referências
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Reimpressões e permissões
