Receptor de manose tipo C 2 prevê desfecho ruim no glioma e está associado a fenótipos invasivos e alterações relacionadas à β-catenina/EMT

Resumo

Análises de coorte pública e experimentos baseados em células de glioma identificam o MRC2 como um marcador de prognóstico ruim associado ao aumento da proliferação, migração, invasão e alterações relacionadas à β-catenina/EMT no glioma.

Resumo

O glioma continua sendo uma malignidade letal do sistema nervoso central, e biomarcadores adicionais que melhorem a estratificação prognóstica e informem a exploração terapêutica ainda são necessários. Este estudo avaliou o receptor de manose tipo C (MRC2/Endo180) integrando coortes transcriptômicas públicas com validação in vitro . Perfis de expressão e anotações clínicas correspondentes foram obtidos do The Cancer Genome Atlas (TCGA) e do projeto Genotype-Tissue Expression (GTEx) para comparações tumor–normal e rastreamento pan-câncer, e associações prognósticas foram examinadas mais detalhadamente na coorte Chinese Glioma Genome Atlas (CGGA). A expressão de MRC2 foi avaliada em linhagens celulares de glioma por transcrição reversa por PCR quantitativa (RT-qPCR) e imunobloting, e o knockdown estável de MRC2 foi estabelecido em células U87 e U251 usando RNAs lentivirais de curva curta (shRNAs). O crescimento celular e a clonogenicidade foram avaliados usando CCK-8 e ensaios de formação de colônias, enquanto migração e invasão foram avaliadas por ensaios de inserção de membrana porosa. Marcadores relacionados à transição (EMT) de CDK4, CDK6 e β-catenina/epitelial–mesenquimal-mesenquimalo (EMT) foram analisados por imunobloting. Em todos os conjuntos de dados, o MRC2 foi elevado no glioma, e uma expressão mais alta esteve associada a pior sobrevivência geral, sobrevivência específica da doença e intervalo sem progressão. In vitro, a depleção de MRC2 reduziu a proliferação, clonogenicidade, migração e invasão, acompanhadas por diminuição dos níveis de proteínas CDK4 e CDK6 e alterações na β-catenina e nos marcadores relacionados à EMT. Juntos, esses achados apoiam o MRC2 como um biomarcador prognóstico candidato associado a fenótipos de glioma agressivo e justificam investigações mecanicistas e in vivo adicionais.

Introdução

Gliomas representam os tumores primários mais comuns que surgem no sistema nervoso central e representam uma fração substancial das neoplasias^{intracranianas 1,2}. Estudos epidemiológicos estimam uma incidência da ordem de alguns casos por 100.000 pessoas a cada ano, com diferenças geográficas e relacionadas ao sexo relatadas entre as^{populações 3,4}. Clinicamente, os gliomas abrangem um amplo espectro de comportamentos: gliomas de grau inferior podem seguir um curso prolongado, enquanto doenças de alto grau — particularmente glioblastoma — permanecem rapidamente fatais para a maioria dos^pacientes 5,6,7,8. As classificações modernas da OMS integram histologia com características moleculares chave (por exemplo, mutação IDH, alteração do promotor TERT, metilação do promotor MGMT e codeleção 1p/19q), o que refina o diagnóstico e informa o^{prognóstico 9,10}. Apesar do manejo multimodal que combina cirurgia, radioterapia e quimioterapia, a recidiva é comum, e os desfechos a longo prazo para tumores de alto grau permanecem ruins. Portanto, identificar marcadores prognósticos adicionais e vulnerabilidades alvo continua sendo uma prioridade urgente.

MRC2 (receptor de manose tipo C 2; também conhecido como Endo180/CD280/uPARAP) é um membro transmembrana da família dos receptores de lectina^{tipo C 11}. É enriquecido em compartimentos estromais e imunológicos, como fibroblastos e macrófagos, e participa da renovação da matriz extracelular (ECM), da remodelação relacionada à fibrose e das interações tumor-microambiente^12,13. Estruturalmente, MRC2 contém uma região rica em cisteína N-terminal, um domínio fibronectina tipo II que liga o colágeno, múltiplos domínios tipo C semelhantes a lectinas, um segmento transmembrana e uma cauda^{citoplasmática 14,15}. Por meio da internalização e remodelação do colágeno, o MRC2 pode facilitar a motilidade celular e a invasão tecidual, e o elevado MRC2 tem sido associado a comportamentos agressivos em vários tipos de câncer, incluindo mama, pâncreas, próstata, melanoma e^glioblastoma 11,14,16,17,18 . Trabalhos anteriores também sugerem conexões entre MRC2 e programas de sinalização pró-invasiva (por exemplo, vias associadas ao TGF-β), atividade de metaloproteinase da matriz e mudanças fenotípicas semelhantes a EMT, além de papéis nos estados fibroblastos e macrófagos associados ao^câncer 17,18,19,20,21 . No entanto, o significado clínico do MRC2 no glioma e as consequências funcionais da desregulação do MRC2 nas células de glioma permanecem incertos.

Embora o MRC2 tenha sido implicado na remodelação da matriz extracelular e comportamento invasivo em várias malignidades, sua importância clínica no glioma não foi sistematicamente estabelecida entre coortes transcriptômicas independentes, e seus efeitos associados ao fenótipo em células de glioma não foram avaliados dentro de um quadro integrado que combine análise de conjuntos públicos com validação funcional. Este estudo, portanto, hipotetizou que o MRC2 está associado a desfechos clínicos adversos e fenótipos malignos no glioma. Para responder a essa questão, foram integrados exames pan-cancerígenos, validação independente de coortes de glioma e experimentos de knockdown estável em linhagens celulares de glioma para avaliar a importância prognóstica do MRC2 e sua associação com proliferação, migração, invasão e mudanças em marcadores relacionados à β-catenina/EMT. Como o MRC2 pertence à família dos receptores de manose e a progressão do glioma também é moldada pelo microambiente tumoral, uma análise exploratória adicional da expressão do MRC1 pelo status de IDH foi incluída para fornecer informações contextuais sobre as diferenças relacionadas ao sistema imunológico entre subtipos de glioma.

A novidade deste trabalho reside na avaliação combinada do MRC2 em conjuntos de dados públicos de glioma e ensaios funcionais in vitro , fornecendo assim evidências clínicas e experimentais complementares para sua relevância no glioma. Comparado a análises de coorte única ou estudos exclusivos de células, esse fluxo de trabalho integrado oferece várias vantagens práticas. A incorporação de TCGA, GTEx e CGGA possibilita validação entre coortes e reduz a dependência de um único conjunto de dados. Além disso, o acoplamento de análises de coorte pública com ensaios de knockdown por células de glioma relaciona associações clínicas a evidências em nível de fenótipo. Por fim, o uso de leituras complementares, incluindo RT-qPCR, imunobloting, CCK-8, formação de colônias e ensaios de inserção de membrana porosa, possibilita a avaliação paralela de mudanças transcricionais, em nível proteico, proliferativas e relacionadas à motilidade. O desenho geral do estudo e o fluxo de trabalho analítico são resumidos na Figura 1. Juntas, essa estratégia melhora a robustez e a interpretabilidade biológica dos achados em relação a abordagens apenas de bioinformática ou de ensaio único.

Protocolo

Este estudo utilizou conjuntos de dados públicos e desidentificados (TCGA, GTEx e CGGA) e linhas celulares comerciais estabelecidas. Não houve participantes humanos recém-recrutados, informações identificáveis do paciente ou espécimes derivados do paciente. Todas as análises foram conduzidas de acordo com as diretrizes institucionais e internacionais relevantes para o uso de dados disponíveis publicamente. Portanto, não foi necessária aprovação ética institucional adicional ou consentimento informado para este estudo.

1. Fluxo de trabalho de bioinformática e pré-processamento de dados

Perfis de expressão gênica e anotações clínicas correspondentes foram obtidos de fontes públicas, incluindo o Atlas do Genotipo do Câncer (TCGA), o projeto Genotype-Tissue Expression (GTEx) e o Atlas Genomico do Glioma Chinês (CGGA). Matrizes de expressão e metadados clínicos foram importados para R e harmonizados de acordo com identificadores amostrais. Entradas duplicadas ou não correspondidas foram removidas, e amostras sem informações essenciais de sobrevivência foram excluídas das análises de sobrevivência. Os valores de expressão de MRC2 e as variáveis clinicopatológicas correspondentes foram extraídos para análises posteriores. Para comparações tumor-normais, a expressão de MRC2 foi comparada entre tipos de câncer usando dados apenas de TCGA quando tecidos normais correspondentes estavam disponíveis e usando dados integrados TCGA–GTEx quando controles normais adicionais foram necessários. Para análises focadas em glioma, os pacientes das coortes TCGA-LGG e CGGA foram estratificados em grupos de alta e baixa expressão de acordo com o nível mediano de expressão MRC2 da coorte. Foram então realizadas análises de sobrevivência de Kaplan-Meier, análise de características operacionais dependentes do tempo do receptor (ROC) e regressão de riscos proporcionais de Cox para avaliar a relevância prognóstica do MRC2. Os modelos de Cox incluíram covariáveis disponíveis, como idade, sexo, grau da OMS e outras variáveis clinicopatológicas, dependendo da completude dos dados dentro de cada coorte. Análises de subgrupos foram realizadas de acordo com variáveis incluindo idade, subtipo histológico, grau da OMS, status de mutação IDH, status de codeleção 1p/19q e informações relacionadas ao tratamento, quando disponíveis. As figuras foram geradas usando fluxos de trabalho padrão de plotagem estatística no R e no GraphPad Prism.

2. Análises pan-cancerígenas e análises de expressão e sobrevivência

A expressão de MRC2 foi comparada entre tecidos tumorais e normais entre tipos de câncer utilizando conjuntos de dados TCGA e GTEx. As diferenças foram visualizadas usando diagramas de caixa e resumidas usando gráficos de radar. Análises de regressão de riscos proporcionais de Cox foram realizadas para avaliar associações entre expressão e sobrevivência geral (SO) de MRC2, sobrevivência específica da doença (DSS) e intervalo livre de progressão (PFI) entre tipos de câncer. Razões de risco e níveis de significância correspondentes foram visualizados usando plots florestais e mapas de calor.

3. Validação prognóstica e análises de subgrupos em coortes de glioma

Na coorte de glioma de grau inferior da TCGA (TCGA-LGG), os pacientes foram estratificados em grupos de expressão de alto e baixo MRC2. Análises de sobrevivência Kaplan–Meier foram realizadas para comparar OS, DSS e PFI entre os grupos. Curvas de características operacionais do receptor (ROC) dependentes do tempo foram geradas para avaliar o desempenho preditivo. Análises de regressão de Cox univariadas e multivariadas foram realizadas para avaliar o valor prognóstico independente do MRC2. A validação externa foi realizada usando o conjunto de dados de glioma CGGA, incluindo análise de sobrevivência de Kaplan–Meier, análise ROC e regressão de Cox. Análises de subgrupos foram realizadas para avaliar a expressão de MRC2 entre variáveis clinicopatológicas, incluindo idade, grau tumoral, subtipo histológico, status de mutação na IDH, status de codeleção 1p/19q e variáveis relacionadas ao tratamento.

4. Expressão de MRC1 em gliomas mutantes IDH versus gliomas selvagens IDH

A associação entre a expressão de MRC1 e o status de mutação da IDH foi avaliada usando a plataforma web GlioVis e o conjunto de dados TCGA GBMLGG. Os casos foram agrupados com base no status anotado de IDH em gliomas mutantes IDH e IDH-wildtype. A expressão do mRNA MRC1 foi consultada dentro do conjunto de dados selecionado, e os níveis de expressão entre os dois grupos foram comparados usando a função de análise estatística embutida da plataforma. Distribuições de expressões por grupo foram exibidas como geradas pela plataforma, e significância estatística foi definida como P < 0,05.

5. Cultura celular

Linhagens celulares de glioma humano e astrócitos humanos normais foram obtidos de repositórios celulares estabelecidos. As células foram cultivadas no meio de Águia modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e mantido a 37 °C em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO₂ e aproximadamente 95% de umidade relativa. As células U87 e U251 foram selecionadas para experimentos de perda de função porque a triagem inicial no painel de células de glioma testada mostrou que essas duas linhagens celulares expressavam níveis relativamente maiores de MRC2 e, portanto, eram adequadas para análises funcionais baseadas em knockdown.

6. Redução lentiviral do MRC2

RNAs curtos em forma de grampo (shRNAs) direcionados ao MRC2 e um controle não direcionado foram clonados em vetores lentivirais. Partículas lentivais foram produzidas pela co-transfecção de células HEK293T com plasmídeos de transferência e embalagem de plasmídeos usando um reagente de transfecção padrão. Os supernadantes virais foram coletados às 48 h e 72 h após a transfecção, centrifugados a 2.100 × g por 5 minutos para remover células de embalagem e detritos celulares, e então passaram por um filtro de 0,45 μm antes do uso imediato ou armazenamento a −80 °^{C 19}. Os supernadantes contendo vírus foram usados imediatamente ou alicotados e armazenados a −80 °C. Ciclos repetidos de congelamento-descongelamento foram evitados. Células de glioma foram infectadas com partículas lentivirais na presença de polibrene. Após a infecção, as células foram selecionadas com puromicina para estabelecer linhas celulares estáveis de knockdown. As sequências utilizadas foram as seguintes: sh-MRC2-1: 5′-GAAATGAATGAGCAGCAAGAA-3′; sh-MRC2-2: 5′-CCGGTATTGCTATAAGGTT-3′; sh-NC: 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′.

7. Validação do knockdown do MRC2 por RT-qPCR e imunoblotting

O RNA total foi extraído usando reagente TRIzol, e o cDNA foi sintetizado usando um kit de transcrição reversa, conforme as instruções do fabricante. A PCR quantitativa foi realizada usando a química verde SYBR sob as seguintes condições de ciclo: desnaturação inicial a 95 °C por 30 s, seguida por 40 ciclos de 95 °C por 5 s e 60 °C por 30 s, com análise da curva de dissociação realizada ao final da amplificação. As sequências de espoletas foram as seguintes: MRC2 para frente, 5′-GGCAAGGACAAGAAGTGCGTGT-3′; MRC2 reverso, 5′-CTTTGGTGACGTTGCTGCTT-3′; GAPDH para frente, 5′-TCCACCCATGGCAAATTCC-3′; e GAPDH reverso, 5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′. A expressão relativa de mRNA foi calculada usando o método comparativo_{C t} (2^-ΔΔCt) com GAPDH como controle^{interno 20}. A imunoblocação foi realizada em paralelo para confirmar o knockdown do MRC2 no nível de proteína. Para a RT-qPCR, três réplicas biológicas independentes foram analisadas, e cada amostra foi processada em triplicado técnico.

8. Ensaio de proliferação celular

A proliferação celular foi avaliada usando o ensaio CCK-8. As células foram semeadas em placas de 96 poços com densidade apropriada e cultivadas para os períodos indicados. A cada ponto de tempo, o reagente CCK-8 era adicionado a cada poço e incubado conforme as instruções do fabricante, após o que a absorvância a 450 nm era medida usando um leitor de microplacas. Pelo menos três réplicas biológicas independentes foram realizadas.

9. Ensaio de formação de colônias

As células foram semeadas em baixa densidade em placas de seis poços e cultivadas por 10 a 14 dias. As colônias foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 15 minutos em temperatura ambiente e tingidas com violeta cristalino a 0,1% por 15 minutos. As colônias foram lavadas com soro salino tamponado com fosfato (PBS), secas ao ar e contadas manualmente ou usando o software de análise^{de imagem 21}. Pelo menos três réplicas biológicas independentes foram realizadas.

10. Ensaios de migração e invasão celular

A migração e invasão celular foram avaliadas usando ensaios de inserção de^{membrana porosa 22}. Para ensaios de invasão, as inserções superiores foram pré-revestidas com gel de matriz extracelular; Para ensaios de migração, foram usados inserts não revestidos. Células suspensas em meio sem soro foram adicionadas à câmara superior, e o meio contendo soro foi colocado na câmara inferior como quimioatrator. Após a incubação, células não migratórias na superfície superior da membrana foram suavemente removidas com um cotonete. Células que migraram ou invadiram a superfície inferior foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 15 minutos, coradas com violeta cristalino a 0,1% por 15 minutos, enxaguadas com soro salino tamponado com fosfato frio, secas ao ar e analisadas sob microscópio invertido a ×200 de ampliação. As células foram contadas em cinco campos microscópicos selecionados aleatoriamente por inserção. Pelo menos três réplicas biológicas independentes foram realizadas.

11. Análise de Western blot

As células foram lisadas em tampão RIPA suplementado com inibidores de protease, e a concentração de proteína foi determinada por meio de um ensaio de BCA. Quantidades iguais de proteína total foram separadas pelo SDS-PAGE e transferidas para as membranas do PVDF. As membranas foram bloqueadas em leite desnatado a 5% por 1 hora em temperatura ambiente e incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 °C. Os seguintes anticorpos primários e diluições de trabalho foram usados para o western bloting: anti-MRC2 (1:5.000), anti-CDK4 (1:1.000), anti-CDK6 (1:2.000), anti-β-catenina (1:5.000), anti-E-cadherina (1:10.000), anti-N-cadherina (1:3.000) e anti-β-actina (1:5.000). Após a lavagem, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários anti-IgG de camundongo conjugados com peroxidase de raiz-forte ou anti-IgG de coelho (1:5.000) por 1 hora em temperatura ambiente. Os sinais foram visualizados usando quimioluminescência, e as intensidades das bandas foram quantificadas e normalizadas para β-actina. Pelo menos três réplicas biológicas independentes foram realizadas.

12. Análise estatística

Análises estatísticas foram realizadas usando R e GraphPad Prism. As curvas de sobrevivência foram comparadas usando o teste log-rank. Modelos de regressão proporcional a hazards de Cox foram usados para análises univariadas e multivariadas. Para experimentos baseados em células, os dados são apresentados como média ± SD. Antes dos testes paramétricos, a normalidade era avaliada usando o teste de Shapiro–Wilk. Para dados normalmente distribuídos, as diferenças entre os dois grupos foram avaliadas usando o teste t de Student, e comparações entre múltiplos grupos foram realizadas usando ANOVA unidirecional. Se as suposições de normalidade não fossem satisfeitas, os testes não paramétricos correspondentes eram utilizados. Os valores p foram ajustados para testes múltiplos usando o procedimento de taxa de falsa descoberta de Benjamini–^{Hochberg 23,24}. Um P < de dois lados de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Expressão pan-cancerígena e paisagem prognóstica do MRC2
Análises pan-câncer foram realizadas inicialmente para caracterizar o padrão de expressão e a relevância prognóstica do MRC2 em malignidades humanas. Comparações baseadas nos conjuntos de dados TCGA e GTEx mostraram que a expressão de MRC2 diferia significativamente entre tecidos tumorais e normais em múltiplos tipos de câncer (Figuras 2A, 2B). Um resumo do gráfico ...

Discussão

A terapia padrão para glioma depende da resseção máxima segura, seguida de radioterapia e quimioterapia, sendo mais comumente temozolomida⁴. No entanto, a infiltração difusa frequentemente limita a remoção cirúrgica completa e contribui para a recaída inevitável, especialmente em doenças de alto^{grau 3,25}. Diversas características moleculares — incluindo metilação do promotor MGMT, mutação IDH, co-deleção 1...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
anticorpo anti-CDK4	Proteintech Group, Inc., EUA	11026-1-AP	Anticorpo primário para o Western blotting. RRID: AB_2078702.
Anticorpo anti-CDK6	Proteintech Group, Inc., EUA	66278-1-IG	Anticorpo primário para o Western blotting. RRID: AB_2881661.
anticorpo anti-E-cadherina	Proteintech Group, Inc., EUA	20874-1-AP	Anticorpo primário para o Western blotting. RRID: AB_10697811.
Anticorpo anti-MRC2	Proteintech Group, Inc., EUA	86028-1-RR	Anticorpo primário para o Western blotting. RRID: AB_2879692.
Anticorpo anti-N-cadherina	Proteintech Group, Inc., EUA	22018-1-AP	Anticorpo primário para o Western blotting. RRID: AB_2813891.
Anticorpo anti-β-actina	Proteintech Group, Inc., EUA	66009-1-IG	Anticorpo de controle de carga para western bloting. RRID: AB_2687938.
Anticorpo anti-β-catenina	Proteintech Group, Inc., EUA	51067-2-AP	Anticorpo primário para o Western blotting. RRID: AB_2086128.
Kit de ensaio proteico BCA	Beyotime Biotechnology, China	P0012	Kit de ensaio de proteínas BCA para determinação da concentração de proteínas.
Kit de Contagem de Células-8 (CCK-8)	Laboratórios Dojindo, Japão	CK04-500T	Ensaio de viabilidade/proliferação celular.
Sistema de imagem por quimioluminescência	Uvitec Limited, França	Manual Avançado do Alliance Q9	Sistema de aquisição de imagem para detecção de manchas ocidentais.
Incubadora CO2	Equipamentos genéricos de laboratório	Não especificado	Incubadora umidificada de CO2 usada para cultura celular a 37 °C; C e 5% CO2.
Solução de violeta cristalina (0,1%)	Beyotime Biotechnology, China	C0121-100 mL	Solução de coloração violeta cristalina usada com uma concentração de trabalho de 0,1%.
DMEM, glicose alta	Gibco, Thermo Fisher Scientific, EUA	C11995500BT	Meio basal para cultura celular de glioma.
Soro fetal bovino (FBS)	ExCell Bio, China	FSP500	Suplemento sérico para cultura celular.
GlioVis	gliovis.bioinfo.cnio.es	Não aplicável	Plataforma web para visualização e análise de conjuntos de dados de expressão de tumores cerebrais, especialmente gliomas.
GraphPad Prisma	Software GraphPad, EUA	Versão 10.4.0	Software de análise estatística e gráficos. RRID: SCR_002798.
HEK293T células	Coleção de Cultura de Tipos da Academia Chinesa de Ciências, Xangai, China	GNHu43	Linha celular de embalagem usada para produção de lentivirais. RRID: CVCL_0063.
IgG Anti-Camundongo conjugado com HRP (H+L)	Proteintech Group, Inc., EUA	SA00001-1	Anticorpo secundário para o Western blotting. RRID: AB_2722565.
IgG Anti-Coelho de Cabra conjugado com HRP (H+L)	Proteintech Group, Inc., EUA	SA00001-2	Anticorpo secundário para o Western blotting. RRID: AB_2722564.
Astrócitos humanos	Coleção de Cultura de Tipos da Academia Chinesa de Ciências, Xangai, China	Não disponível publicamente	Astrócitos humanos normais usados como controle não tumoral; Número de catálogo não disponível publicamente.
Microscópio invertido	Equipamentos genéricos de laboratório	Não especificado	Microscópio invertido usado para aquisição de imagens em ensaios de migração e invasão.
Matriz matrigel	Corning, EUA	354234	Matriz de membrana do embasamento usada para revestir insertos para ensaios de invasão.
Leitor de microplacas	Equipamentos genéricos de laboratório	Não especificado	Leitor de microplacas usado para medição de absorção a 450 nm em ensaios CCK-8.
Kit de Preparação em Gel PAGE, 10%	EpiZyme, China	PG212	Kit de preparação de gel SDS-PAGE.
Kit de Preparação em Gel PAGE, 7,5%	EpiZyme, China	PG111	Kit de preparação de gel SDS-PAGE.
Solução de paraformaldeído (4%)	Beyotime Biotechnology, China	P0099-100 mL	Fixador de paraformaldeído a 4% para formação de colônias e ensaios de migração/invasão.
Solução de penicilina-estreptomicina	Gibco, Thermo Fisher Scientific, EUA	15140163	Suplemento antibiótico para cultura celular.
Polybrene	Beyotime Biotechnology, China	C0351-1 mL	Solução de brometo de hexadimetrina (10 mg/mL) é usada para facilitar a transdução lentiviral.
Marcador proteico prestained	Elabscience, China	E-IR-R331	Marcador de peso molecular de proteína.
PrimeScript RT Reagent Kit	Takara Bio Inc., Japão	RR047A	Kit de transcrição reversa para síntese de cDNA.
Puromicina	Beyotime Biotechnology, China	ST551-10 mg	Puromicina diidrocloreto usada para seleção de células estáveis de knockdown.
Membrana PVDF	Beyotime Biotechnology, China	FFP20	Membrana PVDF hidrofílica (0,45 & micro; m) para transferência de western blot.
R	Fundação R para Computação Estatística, Áustria	Versão 4.5.1	Ambiente de computação estatística usado para análises bioinformáticas. RRID: SCR_001905.
Buffer de lise RIPA	Beyotime Biotechnology, China	P0013B	Buffer de lise RIPA (forte) para extração de proteínas.
SDS-PAGE carregador de buffer (5×)	Beyotime Biotechnology, China	P0015L	Buffer de carregamento de amostras de proteína.
SYBR Premix Ex Taq II	Takara Bio Inc., Japão	RR066A	Mix master qPCR.
Inserts Transwell, 8.0-& micro; m tamanho dos poros	Corning, EUA	3422	Inserções de cultura celular com 8.0 & micro; membrana de policarbonato do tamanho de m dos poros; Formato padrão de 24 poços para ensaios de migração e invasão.
Reagente Trizol	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, EUA	10296010CN	Reagente de extração de RNA.
Células gliomas de U251	Coleção Nacional de Culturas Celulares Autenticadas, China	SCSP-559	Linha celular de glioma humano usada para ensaios de knockdown e funcional. RRID: CVCL_0021.
Células gliomas U87	Coleção Nacional de Culturas Celulares Autenticadas, China	SCSP-5432	Linha celular de glioma humano usada para ensaios de knockdown e funcional. RRID: CVCL_0022.