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Artigo de investigação

Efeitos da Regulação da Expressão de SPRY2 e miR-590-5p na Autofagia em Condrócitos Modelo de Osteoartrite Humana

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DOI:

10.3791/70883

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31 de julho de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, 2Guangxi University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O estresse inflamatório em um modelo de condrócitos C28/I2 induzido por IL-1β aumentou o miR-590-5p e reduziu a expressão do SPRY2. A modulação desse eixo alterou a expressão de Beclin-1, LC3-II e Bcl-2, sugerindo uma via reguladora putativa miR-590-5p/SPRY2 que pode influenciar as respostas associadas à autofagia e a sobrevivência dos condrócitos na osteoartrite.

Resumo

A osteoartrite (OA) é uma doença degenerativa articular prevalente caracterizada por destruição progressiva da cartilagem e perda da homeostase dos condrócitos. Embora a autofagia desregulada contribua para a patogênese da OA, os mecanismos moleculares que regem as respostas associadas à autofagia em condrócitos permanecem incompletamente compreendidos. Este estudo investigou o papel do eixo regulador miR-590-5p/SPRY2 em um microambiente inflamatório de OA utilizando condrócitos humanos C28/I2 induzidos por IL-1β. Um modelo in vitro de OA foi estabelecido tratando células C28/I2 com IL-1β. A expressão de miR-590-5p e SPRY2 foi avaliada usando PCR quantitativa e Western bloting. Abordagens de ganho e perda de função foram empregadas para avaliar os efeitos do SPRY2 e do miR-590-5p nos marcadores associados à autofagia Beclin-1 e LC3-II, bem como na proteína relacionada à sobrevivência Bcl-2. Análises bioinformáticas e experimentos de resgate foram usados para investigar a relação regulatória entre o miR-590-5p e o SPRY2. O tratamento com IL-1β aumentou significativamente a expressão de miR-590-5p enquanto reduzia os níveis de mRNA e proteína SPRY2 (P < 0,05). A superexpressão do SPRY2 diminuiu significativamente a expressão de Beclin-1 e LC3-II, com reduções de aproximadamente 65% e 77%, respectivamente (P < 0,05). Em contraste, a superexpressão de miR-590-5p aumentou a expressão de Beclin-1, LC3-II e Bcl-2, enquanto a inibição de miR-590-5p reverteu esses efeitos e restaurou a expressão do SPRY2. Análises funcionais apoiaram o SPRY2 como uma alvo regulatório a jusante do miR-590-5p. Esses achados identificam o eixo miR-590-5p/SPRY2 como um importante regulador da expressão de marcadores associados à autofagia e da sobrevivência dos condrócitos em condições inflamatórias, sugerindo sua possível relevância como alvo terapêutico na OA.

Introdução

Como a forma mais prevalente de artrite no mundo, a osteoartrite (OA) é uma das principais causas de dor, comprometimento de mobilidade e deficiência física, impondo um ônus substancial aos sistemas de saúde e àsociedade 1. Patologicamente, a OA é caracterizada por degeneração progressiva da cartilagem articular, inflamação sinovial e remodelação patológica do ossosubcondral 1. Estimativas epidemiológicas indicam que aproximadamente 303 milhões de pessoas no mundo são afetadas pela OA, e espera-se que esse número aumente com o envelhecimento da população e o aumento das taxas deobesidade 2. Na China, a prevalência da artrite sintomática do joelho é estimada em 8,1%, com prevalência desproporcionalmente maior entre mulheres e populaçõesrurais 3. Apesar da alta prevalência, as opções de tratamento atuais permanecem em grande parte limitadas ao manejo dos sintomas por meio de anti-inflamatórios não esteroides (AINEs) e intervenção cirúrgica para doençaavançada 4. A ausência de medicamentos modificadores da osteoartrite (DMOADs) reflete uma compreensão incompleta dos mecanismos moleculares que regulam a homeostase e a sobrevivência doscondrócitos 5.

A integridade estrutural e funcional da cartilagem articular depende dos condrócitos residentes, que mantêm a renovação da matriz extracelular (MEC) por meio de um equilíbrio entre atividades anabólicas ecatabólicas 6. Durante a progressão da artrosio, os condrócitos são expostos a estresse mecânico anormal e mediadores pró-inflamatórios, particularmente interleucina-1β (IL-1 β) e fator de necrose tumoral α (TNF-α), que promovem uma transição da síntese matricial para a degradação damatriz 6. Aβ IL-1 contribui para a destruição da cartilagem ao estimular a produção de metaloproteinases da matriz (MMPs) e aggrecanases, enquanto suprime a síntese de colágeno tipo II eproteoglicanos 7. Além disso, aIL-1 β induz estresse oxidativo e disfunção mitocondrial, levando à apoptose condrócita eà senescência 8. Consequentemente, identificar vias de sinalização intracelular que regulam a sobrevivência dos condrócitos em condições inflamatórias continua sendo uma prioridade para a pesquisa com OA.

Autofagia é uma via evolutivamente conservada de degradação lisossômica que mantém a homeostase celular por meio da remoção e reciclagem de organelas danificadas e agregadosproteicos 9. A autofagia basal é essencial para a sobrevivência celular e o equilíbrio energético; No entanto, a autofagia desregulada pode contribuir para a progressão dadoença 9. Na OA, a autofagia é geralmente considerada uma resposta protetora que ajuda os condrócitos a se adaptarem ao estresse celular e resistirem àapoptose 10. Estudos anteriores sugeriram que a atividade autofágica diminui durante a progressão da OA, especialmente em doenças em estágio avançado, resultando em controle celular de qualidade comprometido e aumento da perda decondrócitos 11. Várias proteínas são comumente usadas como indicadores de atividade associada à autofagia. Beclin-1 participa da iniciação do autofagossomo, enquanto a conversão da proteína associada ao microtúbulo 1 da cadeia leve 3 (LC3-I para LC3-II) é amplamente utilizada como marcador da formação doautofagossomo 12. Em contraste, o linfoma de células B 2 (Bcl-2) inibe a autofagia dependente de Beclin-1 enquanto também exerce efeitos antiapoptóticos13. No entanto, a interpretação dos marcadores associados à autofagia requer cautela, pois medições estáticas de LC3-II e Beclin-1 não conseguem distinguir independentemente a formação aprimorada de autofagossomos da degradação lisossômica comprometida. Apesar dessas limitações, a modulação das vias relacionadas à autofagia continua sendo uma estratégia terapêutica promissora para a OA.

MicroRNAs (miRNAs) são RNAs curtos e não codificantes que regulam a expressão gênica pós-transcricionalmente ao se ligar a sequências complementares dentro das regiões 3′-não traduzidas (3′-UTRs) dos RNAs mensageiros alvo, resultando na degradação do mRNA ou repressãotraducional 14. A expressão aberrante de miRNA tem sido implicada na patogênese da OA por meio de efeitos sobre inflamação, apoptose e remodelação daECM 15. Entre essas moléculas, o miR-590-5p tem chamado atenção devido ao seu papel regulador no metabolismo ósseo e em outros processos patológicos. Estudos anteriores mostraram que o miR-590-5p promove a diferenciação osteogênica e suprime a adipogênese em células-troncomesenquimatosas 16. Em modelos de câncer, o miR-590-5p apresenta funções dependentes do contexto como regulador oncogênico ou supressorde tumores 17. Além disso, perfis alterados de expressão de microRNA, incluindo membros da família miR-590, foram implicados na remodelação patológica dos tecidos articulares durante aOA 18. No entanto, evidências obtidas de modelos de células-tronco ou câncer não podem ser diretamente extrapoladas para condrócitos articulares maduros. Portanto, o papel do miR-590-5p na regulação das respostas dos condrócitos no microambiente inflamatório da OA permanece incompletamente compreendido.

Para investigar os potenciais mecanismos a jusante do miR-590-5p na OA, foram realizadas análises de predição de alvos in silico , identificando o Sproty2 (SPRY2) como um alvo putativo a jusante. O SPRY2 pertence à família de proteínas Sprouty, que regulam negativamente a sinalização da tirosina quinase receptora e suprimem a ativação da via RAS/MAPK/ERK 19. Como a sinalização MAPK influencia a diferenciação de condrócitos, respostas inflamatórias e autofagia, o SPRY2 pode representar um importante nó regulador na fisiopatologiada OA 20. Estudos anteriores indicam que o SPRY2 pode suprimir respostas inflamatóriasnos modelos 21 de artrite reumatoide, participar da regulação relacionada à apoptose nos sistemasepiteliais 22, e está associado a respostas relacionadas à autofagia em modelos de lesão isquêmica23. Embora essas observações sugiram que o SPRY2 participa da regulação tanto da apoptose quanto da autofagia, seu papel nos condrócitos articulares permanece pouco caracterizado. Portanto, foi hipotetizado que miR-590-5p e SPRY2 formam um eixo regulatório que influencia a sobrevivência dos condrócitos sob estresse inflamatório.

Com base nessas observações, foi proposto que o miR-590-5p modula as respostas associadas à autofagia em condrócitos regulando a expressão do SPRY2. Embora miR-590-5p e SPRY2 tenham sido estudados individualmente em outros contextos biológicos, sua relação funcional em condrócitos OA ainda não foi estabelecida. No presente estudo, um modelo de OA induzido por IL-1β em condrócitos humanos C28/I2 foi utilizado para examinar os padrões de expressão de miR-590-5p e SPRY2 e avaliar seus efeitos na expressão de Beclin-1, LC3-II e Bcl-2. Ao investigar o eixo regulatório miR-590-5p/SPRY2, este estudo fornece insights sobre os mecanismos epigenéticos subjacentes à sobrevivência dos condrócitos e identifica um potencial alvo terapêutico para a OA.

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Protocolo

Este estudo foi conduzido exclusivamente com a linha celular de condrócitos humanos C28/I2, disponível comercialmente. Nenhum participante humano, amostras de tecido humano, materiais derivados de pacientes ou animais vivos estiveram envolvidos nesta pesquisa. Portanto, a aprovação do Conselho de Revisão Institucional (IRB) e do Comitê de Cuidados e Uso Institucionais de Animais (IACUC) não eram necessárias, de acordo com as diretrizes institucionais e nacionais. As ferramentas, produtos químicos, kits e reagentes usados no protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cultura celular e construção de modelos OA

A linhagem celular de condrócitos humanos C28/I2 (detalhes fornecidos na Tabela de Materiais) foi obtida de um fornecedor comercial. Para garantir a reprodutibilidade experimental, as células foram autenticadas usando perfil de repetição curta em tandem (STR) e testadas rotineiramente para confirmar a ausência de contaminação por micoplasmas. Células entre as passagens 3 e 8 foram usadas em todos os experimentos. As células foram mantidas no DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina (todos os reagentes de cultura estão detalhados na Tabela de Materiais) a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% deCO2.

Para estabelecer o modelo in vitro de osteoartrite (OA), células C28/I2 foram estimuladas com IL-1β humano recombinante. Com base na literaturaestabelecida 6,7, experimentos preliminares de otimização dose-resposta projetados para induzir um estado catabólico robusto sem citotoxicidade imediata excessiva, as células foram tratadas com 20 ng/mL de IL-1β por 24 horas.

2. Agrupamento experimental e transfecção

Para elucidar as vias mecanicísticas, o estudo foi dividido em três principais módulos experimentais, cada um com no mínimo três réplicas biológicas independentes:

  1. Ganho/Perda de Função do SPRY2:
    As células foram atribuídas ao Controle, modelo OA, OA + vetor vazio (NC), plasma de superexpressão OA + SPRY2 (OE-SPRY2) e pequenos grupos de RNA interferentes correspondentes (si-NC e três construtos específicos si-SPRY2: si-695, si-800, si-896) para rastrear a eficiência da interferência.
  2. Modulação miR-590-5p:
    As células foram divididas em grupos Controle, modelo OA, OA + MIMIC NC, OA + miR-590-5p mimic, OA + inibidor NC e OA + miR-590-5p inibidores.
  3. Validação funcional da relação regulatória miR-590-5p/SPRY2:
    Para avaliar melhor a relação regulatória proposta entre miR-590-5p e SPRY2, células foram submetidas a condições de miR-590-5p mimeticamente e inibidor para determinar se a modulação miR-590-5p alterou a expressão do SPRY2 no modelo OA.
    Para transfecção, as células C28/I2 foram semeadas em placas de 6 poços em 2 × 10 célulasde 5 poços. Ao atingir 70%–80% de confluência, as transfecções foram realizadas usando um reagente comercial de transfecção à base de lipídios, de acordo com o protocolo do fabricante e procedimentos estabelecidos para entrega de pequenos RNAs em condrócitos24. Brevemente, plasmídeos (OE-SPRY2 e NC; 2 μg/poço) e oligonucleotídeos (miR-590-5p mimetiz/inibidor e siRNAs; 50 nM) foram diluídos em meio sérico reduzido. Os complexos de DNA/RNA lipídicos foram incubados em temperatura ambiente por 15 minutos antes de serem adicionados gota a gota às células em DMEM sem soro. Às 6 horas após a transfecção, o meio foi substituído por DMEM completo contendo 10% de FBS, e as células foram cultivadas por mais 48 horas antes da extração de RNA e proteínas.

3. detecção de qPCR

O RNA total e o miRNA foram isolados usando um kit dedicado de extração de miRNA, de acordo com o protocolo do fabricante. A pureza e concentração de RNA foram avaliadas usando um espectrofotômetro UV-Vis, e amostras com razões A260/A280 de 1,8–2,0 foram usadas para análises posteriores. Reagentes comerciais de transcrição reversa foram usados para sintetizar cDNA. O procedimento de ciclo da qPCR foi o seguinte: 95 °C por 10 minutos; 40 ciclos de 95 °C por 10 s, 58 °C por 30 s e 72 °C por 30 s; seguida por análise da curva de fusão para verificar a especificidade do primer e a ausência de dímeros do primer. β-actina e U6 serviram como controles internos para mRNA e miRNA, respectivamente. A expressão gênica relativa foi calculada usando o método 2-ΔΔCt 25. Todas as sequências de espoletão, incluindo as de Col-II, SPRY2, Beclin-1, LC3, Bcl-2, miR-590-5p e genes de referência, estão listadas na Tabela 1.

Nome de base Primer frontal (5′-3′)Primer reverso (5′-3′)
U6ATTGGAACGATACAGAAGATTGGAACGCTTCACGAATTTG
miR-590-5pGCGTAAGGCACGCGGTGAGTGCAGGGTCCGAGGTATT
β-actinaTGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCCCCCTAGAAGCA
SPRY2TAAGCCACTGAGCAAGGAAGATTGGAAGGTAACACCATAAAAAGG
BCL-2TGGGATTCCTGCGGATTGACTCAGTCTACTTCCTCTGTGATGTTG
Beclin-1TCCCGTGGAATGGAATGAATGAGAGTAAGGAACAAGTCGGTATCTCTCTG
LC3-IICATCCAACCAAAATCCCGGTGAGCTGTAAGCGCCTTTTTTAA

Tabela 1: Sequências de primer usadas para análise quantitativa de PCR (qPCR). Sequências de primer direto e reverso usadas para amplificação e quantificação de transcritos alvo e controles internos de referência por qPCR.

Salvo especificação em contrário, os dados são expressos como média ± desvio padrão (DS). A significância estatística foi determinada usando ANOVA unidirecional seguida pelo teste post hoc S-N-K. Símbolos indicam: *P < 0,05 vs. Controle; #P < 0,05 vs. o modelo indicado ou grupo controle negativo; &P < 0,05 vs. OA+Inibidor-NC.

4. Detecção de manchas ocidentais

As células foram colhidas e lisadas usando tampão RIPA suplementado com coquetéis inibidores de protease e fosfatase, seguindo procedimentos estabelecidos de extração proteica e imunoblotagem. Após centrifugação a 14.000 × g por 15 minutos a 4 °C para remover detritos celulares, o sobrenadante foi coletado e as concentrações de proteína foram quantificadas usando um kit de ensaio de proteínas BCA. Quantidades iguais de lisado proteico (30 μg) foram desnaturadas, resolvidas por SDS-PAGE por 1,5 hora e transferidas para membranas de PVDF a 300 mA por 1,5 h26. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado em soro tampão Tris contendo 0,1% Tween 20 (TBST) por 1 hora em temperatura ambiente, seguida por incubação a 4 °C por 16 horas com anticorpos primários específicos (por exemplo, anti-SPRY2, diluição 1:1000). Após três lavagens em TBST, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP apropriados em temperatura ambiente por 2 horas. As bandas proteicas foram visualizadas usando um sistema de detecção ECL e quantificadas pelo software ImageJ.

5. Análise estatística

Os dados foram analisados usando software de análise estatística. Todos os experimentos foram realizados com pelo menos três réplicas biológicas independentes (n ≥ 3), e os dados quantitativos são apresentados como a média ± desvio padrão (DS). Antes dos testes paramétricos, a normalidade dos dados era avaliada usando o teste de Shapiro-Wilk, e a homogeneidade da variância era avaliada. A significância estatística entre múltiplos grupos foi avaliada usando análise unidirecional da variância (ANOVA), seguida pelo teste post hoc Student-Newman-Keuls (S-N-K) para comparações múltiplas. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

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Resultados

Estabelecimento do modelo inflamatório de condrócitos in vitro

Para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à patologia da osteoartrite, foi estabelecido um modelo inflamatório in vitro usando condrócitos humanos C28/I2 estimulados com IL-1β. A validade desse modelo foi confirmada pela avaliação da expressão da cadeia alfa 1 tipo II de colágeno (Col-II), um componente primário da matriz extracelular da cartilagem hialina e um...

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Discussão

Estudos anteriores mostraram que os miRNAs regulam a autofagia em múltiplos estágios, incluindo iniciação, elongamento da vesícula ematuração 27. O envolvimento dos miRNAs na patogênese da OA tem sido cada vez mais documentado, especialmente por meio de efeitos sobre inflamação, apoptose, remodelação extracelular da matriz e vias relacionadas à autofagia. MiR-590-5p foi associado à homeostase celular e aos processos associados aocâncer 28,2...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Departamento de Geriatria do Hospital Ruikang, Universidade de Medicina Chinesa de Guangxi, por fornecer instalações experimentais e suporte técnico para este estudo. Os autores também agradecem à equipe do laboratório e aos colegas pela ajuda na coleta e análise dos dados. Esse trabalho foi apoiado pelo Projeto de Pesquisa em Ciências Naturais da Universidade de Medicina Chinesa de Guangxi (Bolsa nº 2022MS039; LncRNA-GAS5 media a expressão do SPRY2 para inibir a autofagia em condrócitos OA do joelho de camundongo: estudo do mecanismo e efeito da intervenção precoce da Prescrição Huayu Qushi) e a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Fundação Regional) (Bolsa nº 82160912; Discussão sobre o mecanismo de Skp2, ubiquitinação, degradação da inibição de FoxO1 da autofagia de condrócitos OA no joelho e efeito da intervenção precoce da prescrição de Huayu Qushi.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anti-β-actin antibodyProteintech66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938Controle de carga interna para análise de Western blot
Anti-SPRY2 antibodyProteintech11383-1-AP ; RRID: AB_2196324Detecção da expressão da proteína SPRY2
BCA protein assay kitThermo Fisher Scientific23225Determinação da concentração total de proteína
C28/I2 human chondrocyte cell linePunocelCP-H107Modelo in vitro de condrócito para estudos de osteoartrite
Complete DMEMKeyGen BiotecKGM12800SMeio basal para cultura celular de rotina
CWBIO Ultrapure miRNA extraction kitCWBIOCW0627SIsolamento de RNA total e miRNA
ECL detection systemThermo Fisher Scientific32106Visualização quimioluminescente de bandas de proteína
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco1891605Suplemento de crescimento para cultura celular
GraphPad Prism version 9.0GraphPad SoftwareN/AAnálise estatística e geração de gráficos
HiScript II Q RT SuperMixVazymeR223-01Transcrição reversa de mRNA para cDNA
ImageJ softwareNational Institutes of HealthN/AQuantificação da intensidade das bandas do Western blot
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000015Transfecção de plasmídeos e oligonucleotídeos
miR-590-5p mimic, inhibitor, and NCsRiboBioCustom synthesizedModulação da expressão de miR-590-5p
miRNA 1st Strand cDNA Synthesis KitVazymeMR101-02Transcrição reversa de miRNA para cDNA
Opti-MEM mediumGibco31985-062Preparação de complexos de transfecção
Penicillin-streptomycinGibco15140122Prevenção de contaminação bacteriana na cultura celular
Protease and phosphatase inhibitor cocktailsMedChemExpressHY-K0010Proteção das proteínas durante a extração
PVDF membranesMillipore SigmaISEQ00010Membrana de transferência de proteína para imunoblotting
Recombinant human IL-1βMedChemExpressHY-P78459Indução de condições inflamatórias semelhantes à OA
RIPA bufferBeyotimeP0013BLisado celular e extração de proteínas
si-SPRY2 constructs and si-NCGenePharmaCustom synthesizedSilenciamento da expressão de SPRY2
SPRY2 overexpression plasmid (OE) and empty vector (NC)GeneChemCustom constructedAvaliação dos efeitos da superexpressão de SPRY2
UV-VIS spectrophotometer (NanoDrop 2000)Thermo Fisher ScientificND-2000Medição da concentração e pureza de RNA

Referências

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