Efeitos da Regulação da Expressão de SPRY2 e miR-590-5p na Autofagia em Condrócitos Modelo de Osteoartrite Humana

Resumo

O estresse inflamatório em um modelo de condrócitos C28/I2 induzido por IL-1β aumentou o miR-590-5p e reduziu a expressão do SPRY2. A modulação desse eixo alterou a expressão de Beclin-1, LC3-II e Bcl-2, sugerindo uma via reguladora putativa miR-590-5p/SPRY2 que pode influenciar as respostas associadas à autofagia e a sobrevivência dos condrócitos na osteoartrite.

Resumo

A osteoartrite (OA) é uma doença degenerativa articular prevalente caracterizada por destruição progressiva da cartilagem e perda da homeostase dos condrócitos. Embora a autofagia desregulada contribua para a patogênese da OA, os mecanismos moleculares que regem as respostas associadas à autofagia em condrócitos permanecem incompletamente compreendidos. Este estudo investigou o papel do eixo regulador miR-590-5p/SPRY2 em um microambiente inflamatório de OA utilizando condrócitos humanos C28/I2 induzidos por IL-1β. Um modelo in vitro de OA foi estabelecido tratando células C28/I2 com IL-1β. A expressão de miR-590-5p e SPRY2 foi avaliada usando PCR quantitativa e Western bloting. Abordagens de ganho e perda de função foram empregadas para avaliar os efeitos do SPRY2 e do miR-590-5p nos marcadores associados à autofagia Beclin-1 e LC3-II, bem como na proteína relacionada à sobrevivência Bcl-2. Análises bioinformáticas e experimentos de resgate foram usados para investigar a relação regulatória entre o miR-590-5p e o SPRY2. O tratamento com IL-1β aumentou significativamente a expressão de miR-590-5p enquanto reduzia os níveis de mRNA e proteína SPRY2 (P < 0,05). A superexpressão do SPRY2 diminuiu significativamente a expressão de Beclin-1 e LC3-II, com reduções de aproximadamente 65% e 77%, respectivamente (P < 0,05). Em contraste, a superexpressão de miR-590-5p aumentou a expressão de Beclin-1, LC3-II e Bcl-2, enquanto a inibição de miR-590-5p reverteu esses efeitos e restaurou a expressão do SPRY2. Análises funcionais apoiaram o SPRY2 como uma alvo regulatório a jusante do miR-590-5p. Esses achados identificam o eixo miR-590-5p/SPRY2 como um importante regulador da expressão de marcadores associados à autofagia e da sobrevivência dos condrócitos em condições inflamatórias, sugerindo sua possível relevância como alvo terapêutico na OA.

Introdução

Como a forma mais prevalente de artrite no mundo, a osteoartrite (OA) é uma das principais causas de dor, comprometimento de mobilidade e deficiência física, impondo um ônus substancial aos sistemas de saúde e à^{sociedade 1}. Patologicamente, a OA é caracterizada por degeneração progressiva da cartilagem articular, inflamação sinovial e remodelação patológica do osso^{subcondral 1}. Estimativas epidemiológicas indicam que aproximadamente 303 milhões de pessoas no mundo são afetadas pela OA, e espera-se que esse número aumente com o envelhecimento da população e o aumento das taxas de^{obesidade 2}. Na China, a prevalência da artrite sintomática do joelho é estimada em 8,1%, com prevalência desproporcionalmente maior entre mulheres e populações^{rurais 3}. Apesar da alta prevalência, as opções de tratamento atuais permanecem em grande parte limitadas ao manejo dos sintomas por meio de anti-inflamatórios não esteroides (AINEs) e intervenção cirúrgica para doença^{avançada 4}. A ausência de medicamentos modificadores da osteoartrite (DMOADs) reflete uma compreensão incompleta dos mecanismos moleculares que regulam a homeostase e a sobrevivência dos^{condrócitos 5}.

A integridade estrutural e funcional da cartilagem articular depende dos condrócitos residentes, que mantêm a renovação da matriz extracelular (MEC) por meio de um equilíbrio entre atividades anabólicas e^{catabólicas 6}. Durante a progressão da artrosio, os condrócitos são expostos a estresse mecânico anormal e mediadores pró-inflamatórios, particularmente interleucina-1β (IL-1 β) e fator de necrose tumoral α (TNF-α), que promovem uma transição da síntese matricial para a degradação da^{matriz 6}. Aβ IL-1 contribui para a destruição da cartilagem ao estimular a produção de metaloproteinases da matriz (MMPs) e aggrecanases, enquanto suprime a síntese de colágeno tipo II e^{proteoglicanos 7}. Além disso, aIL-1 β induz estresse oxidativo e disfunção mitocondrial, levando à apoptose condrócita e^{à senescência 8}. Consequentemente, identificar vias de sinalização intracelular que regulam a sobrevivência dos condrócitos em condições inflamatórias continua sendo uma prioridade para a pesquisa com OA.

Autofagia é uma via evolutivamente conservada de degradação lisossômica que mantém a homeostase celular por meio da remoção e reciclagem de organelas danificadas e agregados^{proteicos 9}. A autofagia basal é essencial para a sobrevivência celular e o equilíbrio energético; No entanto, a autofagia desregulada pode contribuir para a progressão da^{doença 9}. Na OA, a autofagia é geralmente considerada uma resposta protetora que ajuda os condrócitos a se adaptarem ao estresse celular e resistirem à^{apoptose 10}. Estudos anteriores sugeriram que a atividade autofágica diminui durante a progressão da OA, especialmente em doenças em estágio avançado, resultando em controle celular de qualidade comprometido e aumento da perda de^{condrócitos 11}. Várias proteínas são comumente usadas como indicadores de atividade associada à autofagia. Beclin-1 participa da iniciação do autofagossomo, enquanto a conversão da proteína associada ao microtúbulo 1 da cadeia leve 3 (LC3-I para LC3-II) é amplamente utilizada como marcador da formação do^{autofagossomo 12}. Em contraste, o linfoma de células B 2 (Bcl-2) inibe a autofagia dependente de Beclin-1 enquanto também exerce efeitos antiapoptóticos¹³. No entanto, a interpretação dos marcadores associados à autofagia requer cautela, pois medições estáticas de LC3-II e Beclin-1 não conseguem distinguir independentemente a formação aprimorada de autofagossomos da degradação lisossômica comprometida. Apesar dessas limitações, a modulação das vias relacionadas à autofagia continua sendo uma estratégia terapêutica promissora para a OA.

MicroRNAs (miRNAs) são RNAs curtos e não codificantes que regulam a expressão gênica pós-transcricionalmente ao se ligar a sequências complementares dentro das regiões 3′-não traduzidas (3′-UTRs) dos RNAs mensageiros alvo, resultando na degradação do mRNA ou repressão^{traducional 14}. A expressão aberrante de miRNA tem sido implicada na patogênese da OA por meio de efeitos sobre inflamação, apoptose e remodelação da^{ECM 15}. Entre essas moléculas, o miR-590-5p tem chamado atenção devido ao seu papel regulador no metabolismo ósseo e em outros processos patológicos. Estudos anteriores mostraram que o miR-590-5p promove a diferenciação osteogênica e suprime a adipogênese em células-tronco^{mesenquimatosas 16}. Em modelos de câncer, o miR-590-5p apresenta funções dependentes do contexto como regulador oncogênico ou supressor^{de tumores 17}. Além disso, perfis alterados de expressão de microRNA, incluindo membros da família miR-590, foram implicados na remodelação patológica dos tecidos articulares durante a^{OA 18}. No entanto, evidências obtidas de modelos de células-tronco ou câncer não podem ser diretamente extrapoladas para condrócitos articulares maduros. Portanto, o papel do miR-590-5p na regulação das respostas dos condrócitos no microambiente inflamatório da OA permanece incompletamente compreendido.

Para investigar os potenciais mecanismos a jusante do miR-590-5p na OA, foram realizadas análises de predição de alvos in silico , identificando o Sproty2 (SPRY2) como um alvo putativo a jusante. O SPRY2 pertence à família de proteínas Sprouty, que regulam negativamente a sinalização da tirosina quinase receptora e suprimem a ativação da via RAS/MAPK/^{ERK 19}. Como a sinalização MAPK influencia a diferenciação de condrócitos, respostas inflamatórias e autofagia, o SPRY2 pode representar um importante nó regulador na fisiopatologia^{da OA 20}. Estudos anteriores indicam que o SPRY2 pode suprimir respostas inflamatórias^{nos modelos} 21 de artrite reumatoide, participar da regulação relacionada à apoptose nos sistemas^{epiteliais 22}, e está associado a respostas relacionadas à autofagia em modelos de lesão isquêmica²³. Embora essas observações sugiram que o SPRY2 participa da regulação tanto da apoptose quanto da autofagia, seu papel nos condrócitos articulares permanece pouco caracterizado. Portanto, foi hipotetizado que miR-590-5p e SPRY2 formam um eixo regulatório que influencia a sobrevivência dos condrócitos sob estresse inflamatório.

Com base nessas observações, foi proposto que o miR-590-5p modula as respostas associadas à autofagia em condrócitos regulando a expressão do SPRY2. Embora miR-590-5p e SPRY2 tenham sido estudados individualmente em outros contextos biológicos, sua relação funcional em condrócitos OA ainda não foi estabelecida. No presente estudo, um modelo de OA induzido por IL-1β em condrócitos humanos C28/I2 foi utilizado para examinar os padrões de expressão de miR-590-5p e SPRY2 e avaliar seus efeitos na expressão de Beclin-1, LC3-II e Bcl-2. Ao investigar o eixo regulatório miR-590-5p/SPRY2, este estudo fornece insights sobre os mecanismos epigenéticos subjacentes à sobrevivência dos condrócitos e identifica um potencial alvo terapêutico para a OA.

Protocolo

Este estudo foi conduzido exclusivamente com a linha celular de condrócitos humanos C28/I2, disponível comercialmente. Nenhum participante humano, amostras de tecido humano, materiais derivados de pacientes ou animais vivos estiveram envolvidos nesta pesquisa. Portanto, a aprovação do Conselho de Revisão Institucional (IRB) e do Comitê de Cuidados e Uso Institucionais de Animais (IACUC) não eram necessárias, de acordo com as diretrizes institucionais e nacionais. As ferramentas, produtos químicos, kits e reagentes usados no protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cultura celular e construção de modelos OA

A linhagem celular de condrócitos humanos C28/I2 (detalhes fornecidos na Tabela de Materiais) foi obtida de um fornecedor comercial. Para garantir a reprodutibilidade experimental, as células foram autenticadas usando perfil de repetição curta em tandem (STR) e testadas rotineiramente para confirmar a ausência de contaminação por micoplasmas. Células entre as passagens 3 e 8 foram usadas em todos os experimentos. As células foram mantidas no DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina (todos os reagentes de cultura estão detalhados na Tabela de Materiais) a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de_CO2.

Para estabelecer o modelo in vitro de osteoartrite (OA), células C28/I2 foram estimuladas com IL-1β humano recombinante. Com base na literatura^{estabelecida 6,7}, experimentos preliminares de otimização dose-resposta projetados para induzir um estado catabólico robusto sem citotoxicidade imediata excessiva, as células foram tratadas com 20 ng/mL de IL-1β por 24 horas.

2. Agrupamento experimental e transfecção

Para elucidar as vias mecanicísticas, o estudo foi dividido em três principais módulos experimentais, cada um com no mínimo três réplicas biológicas independentes:

1. Ganho/Perda de Função do SPRY2:
   As células foram atribuídas ao Controle, modelo OA, OA + vetor vazio (NC), plasma de superexpressão OA + SPRY2 (OE-SPRY2) e pequenos grupos de RNA interferentes correspondentes (si-NC e três construtos específicos si-SPRY2: si-695, si-800, si-896) para rastrear a eficiência da interferência.
2. Modulação miR-590-5p:
   As células foram divididas em grupos Controle, modelo OA, OA + MIMIC NC, OA + miR-590-5p mimic, OA + inibidor NC e OA + miR-590-5p inibidores.
3. Validação funcional da relação regulatória miR-590-5p/SPRY2:
   Para avaliar melhor a relação regulatória proposta entre miR-590-5p e SPRY2, células foram submetidas a condições de miR-590-5p mimeticamente e inibidor para determinar se a modulação miR-590-5p alterou a expressão do SPRY2 no modelo OA.
   Para transfecção, as células C28/I2 foram semeadas em placas de 6 poços em 2 × 10 células^{de 5} poços. Ao atingir 70%–80% de confluência, as transfecções foram realizadas usando um reagente comercial de transfecção à base de lipídios, de acordo com o protocolo do fabricante e procedimentos estabelecidos para entrega de pequenos RNAs em condrócitos²⁴. Brevemente, plasmídeos (OE-SPRY2 e NC; 2 μg/poço) e oligonucleotídeos (miR-590-5p mimetiz/inibidor e siRNAs; 50 nM) foram diluídos em meio sérico reduzido. Os complexos de DNA/RNA lipídicos foram incubados em temperatura ambiente por 15 minutos antes de serem adicionados gota a gota às células em DMEM sem soro. Às 6 horas após a transfecção, o meio foi substituído por DMEM completo contendo 10% de FBS, e as células foram cultivadas por mais 48 horas antes da extração de RNA e proteínas.

3. detecção de qPCR

O RNA total e o miRNA foram isolados usando um kit dedicado de extração de miRNA, de acordo com o protocolo do fabricante. A pureza e concentração de RNA foram avaliadas usando um espectrofotômetro UV-Vis, e amostras com razões A260/A280 de 1,8–2,0 foram usadas para análises posteriores. Reagentes comerciais de transcrição reversa foram usados para sintetizar cDNA. O procedimento de ciclo da qPCR foi o seguinte: 95 °C por 10 minutos; 40 ciclos de 95 °C por 10 s, 58 °C por 30 s e 72 °C por 30 s; seguida por análise da curva de fusão para verificar a especificidade do primer e a ausência de dímeros do primer. β-actina e U6 serviram como controles internos para mRNA e miRNA, respectivamente. A expressão gênica relativa foi calculada usando o método ^{2-ΔΔCt 25}. Todas as sequências de espoletão, incluindo as de Col-II, SPRY2, Beclin-1, LC3, Bcl-2, miR-590-5p e genes de referência, estão listadas na Tabela 1.

Nome de base	Primer frontal (5′-3′)	Primer reverso (5′-3′)
U6	ATTGGAACGATACAGAAGATT	GGAACGCTTCACGAATTTG
miR-590-5p	GCGTAAGGCACGCGGTG	AGTGCAGGGTCCGAGGTATT
β-actina	TGGCACCCAGCACAATGAA	CTAAGTCATAGTCCCCCCTAGAAGCA
SPRY2	TAAGCCACTGAGCAAGGAAGAT	TGGAAGGTAACACCATAAAAAGG
BCL-2	TGGGATTCCTGCGGATTGAC	TCAGTCTACTTCCTCTGTGATGTTG
Beclin-1	TCCCGTGGAATGGAATGAATGAGA	GTAAGGAACAAGTCGGTATCTCTCTG
LC3-II	CATCCAACCAAAATCCCGGT	GAGCTGTAAGCGCCTTTTTTAA

Tabela 1: Sequências de primer usadas para análise quantitativa de PCR (qPCR). Sequências de primer direto e reverso usadas para amplificação e quantificação de transcritos alvo e controles internos de referência por qPCR.

Salvo especificação em contrário, os dados são expressos como média ± desvio padrão (DS). A significância estatística foi determinada usando ANOVA unidirecional seguida pelo teste post hoc S-N-K. Símbolos indicam: *P < 0,05 vs. Controle; #P < 0,05 vs. o modelo indicado ou grupo controle negativo; &P < 0,05 vs. OA+Inibidor-NC.

4. Detecção de manchas ocidentais

As células foram colhidas e lisadas usando tampão RIPA suplementado com coquetéis inibidores de protease e fosfatase, seguindo procedimentos estabelecidos de extração proteica e imunoblotagem. Após centrifugação a 14.000 × g por 15 minutos a 4 °C para remover detritos celulares, o sobrenadante foi coletado e as concentrações de proteína foram quantificadas usando um kit de ensaio de proteínas BCA. Quantidades iguais de lisado proteico (30 μg) foram desnaturadas, resolvidas por SDS-PAGE por 1,5 hora e transferidas para membranas de PVDF a 300 mA por 1,5 h²⁶. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado em soro tampão Tris contendo 0,1% Tween 20 (TBST) por 1 hora em temperatura ambiente, seguida por incubação a 4 °C por 16 horas com anticorpos primários específicos (por exemplo, anti-SPRY2, diluição 1:1000). Após três lavagens em TBST, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP apropriados em temperatura ambiente por 2 horas. As bandas proteicas foram visualizadas usando um sistema de detecção ECL e quantificadas pelo software ImageJ.

5. Análise estatística

Os dados foram analisados usando software de análise estatística. Todos os experimentos foram realizados com pelo menos três réplicas biológicas independentes (n ≥ 3), e os dados quantitativos são apresentados como a média ± desvio padrão (DS). Antes dos testes paramétricos, a normalidade dos dados era avaliada usando o teste de Shapiro-Wilk, e a homogeneidade da variância era avaliada. A significância estatística entre múltiplos grupos foi avaliada usando análise unidirecional da variância (ANOVA), seguida pelo teste post hoc Student-Newman-Keuls (S-N-K) para comparações múltiplas. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Estabelecimento do modelo inflamatório de condrócitos in vitro

Para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à patologia da osteoartrite, foi estabelecido um modelo inflamatório in vitro usando condrócitos humanos C28/I2 estimulados com IL-1β. A validade desse modelo foi confirmada pela avaliação da expressão da cadeia alfa 1 tipo II de colágeno (Col-II), um componente primário da matriz extracelular da cartilagem hialina e uma marca registrada dos condrócitos saudáveis. A análise quantitativa revelou que a exposição ao IL-1β levou a uma redução estatisticamente significativa na expressão do mRNA do Col-II em relação ao grupo controle. Essa alteração fenotípica indica uma mudança inicial para um estado catabólico semelhante ao microambiente osteoartrítico, fornecendo assim um modelo fundamental para estudos mecanicistas subsequentes (Figura 1).

Figura 1: Estabelecimento do modelo in vitro de osteoartrite (OA) em condrócitos humanos C28/I2. As células foram tratadas com 20 ng/mL de IL-1β por 24 horas. A expressão relativa do mRNA do Col-II foi determinada por qPCR, com β-actina servindo como controle de normalização. Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão (SD) de três réplicas biológicas independentes (n = 3). A análise estatística foi realizada usando ANOVA unidirecional. *P < 0,05 em comparação com o grupo de controle. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Validação da eficiência de superexpressão do SPRY2 em células C28/I2

Antes de avaliar o papel funcional do Sprouty2 (SPRY2) nesse modelo, a eficiência de transfecção do vetor de superexpressão SPRY2 foi verificada. Condrócitos foram transfectados com plasmídeo de superexpressão (OE) ou com um vetor controle vazio negativo (NC). Tanto as análises qPCR quanto as análises Western blot mostraram uma regulação robusta para cima do SPRY2 nos níveis de mRNA e proteína no grupo OE, em comparação com os grupos NC e controle não tratado. Esses dados, apresentados na Figura 2, confirmam que o sistema experimental manteve níveis elevados de SPRY2, permitindo a investigação de seus efeitos biológicos específicos.

Figura 2: Validação da superexpressão do SPRY2 em condrócitos C28/I2. As células foram transfectadas com um vetor vazio (NC) ou um plasmídeo de superexpressão SPRY2 (OE). Os níveis relativos de mRNA e proteína do SPRY2 foram avaliados por qPCR e Western blot, respectivamente. β-actina era utilizada como controle interno de carga. Os dados são expressos como a média ± DS (n = 3). *P < 0,05 em comparação com o grupo NC. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

A superexpressão do SPRY2 atenua a autofagia e modula marcadores de apoptose em condições inflamatórias

Experimentos subsequentes buscaram determinar se o SPRY2 funciona como regulador da autofagia e da apoptose no contexto inflamatório. Após o estabelecimento do modelo de OA, o tratamento com IL-1β sozinho induziu um aumento significativo nos marcadores de autofagia Beclin-1 e LC3-II, sugerindo uma resposta autofágica compensatória ao estresse inflamatório. Simultaneamente, a expressão de Bcl-2 foi elevada no grupo modelo. No entanto, a introdução do vetor de superexpressão SPRY2 alterou significativamente esse perfil. Como mostrado na Figura 3, o grupo Modelo+OE-SPRY2 apresentou uma redução significativa tanto nos níveis de mRNA de Beclin-1 quanto de LC3-II em comparação com os grupos Modelo e Modelo+NC. Além disso, a superexpressão do SPRY2 atenuou a elevação de Bcl-2 induzida por inflamação. Esses achados sugerem que o SPRY2 regula negativamente a expressão de marcadores associados à autofagia em condrócitos inflamatórios.

Figura 3: A superexpressão do SPRY2 atenua a autofagia e modula marcadores de apoptose sob condições inflamatórias induzidas por IL-1β. Os níveis relativos de expressão de mRNA de SPRY2, Bcl-2, Beclin-1 e LC3-II foram quantificados por qPCR nos grupos Controle, Modelo (tratado com IL-1β), Modelo+NC e Modelo+OE-SPRY2. β-actina servia como controle interno. Os dados são apresentados como a média ± DS (n = 3). A significância estatística foi determinada por ANOVA unidirecional seguida pelo teste post hoc S-N-K. *P < 0,05 em comparação com o grupo de controle; #P < 0,05 comparado ao grupo Modelo+NC. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

MiR-590-5p regula para cima os marcadores associados à autofagia e promove a sobrevivência dos condrócitos

Em seguida, foi investigado o impacto funcional do miR-590-5p em marcadores associados à autofagia e à sobrevivência. Como mostrado na Figura 4, a transfecção com um miR-590-5p imitador no modelo OA aumentou significativamente a expressão de Bcl-2, Beclin-1 e LC3-II, em contraste com os efeitos inibitórios observados após a superexpressão do SPRY2. Por outro lado, a inibição de miR-590-5p reduziu significativamente a expressão de Bcl-2 e Beclin-1, enquanto a redução de LC3-II não atingiu significância estatística. Esses resultados sugerem que o miR-590-5p aumenta a expressão de marcadores associados à autofagia e Bcl-2 relacionado à sobrevivência em condrócitos, justificando uma investigação adicional sobre seus potenciais alvos regulatórios a jusante.

Figura 4: miR-590-5p aumenta a expressão de marcadores associados à autofagia e a expressão de Bcl-2 relacionada à sobrevivência. Os níveis relativos de expressão de mRNA de Bcl-2, Beclin-1 e LC3-II foram medidos por qPCR no modelo OA após transfecção com um miR-590-5p mimético, inibidor ou seus respectivos controles negativos (NC). β-actina serviu como controle de normalização. Os dados são mostrados como a média ± DS (n = 3). *P < 0,05 comparado ao grupo Model+Mimic-NC; #P < 0,05 em comparação com o grupo Model+Inibidor-NC (para Bcl-2 e Beclin-1). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

IL-1β modula o eixo miR-590-5p/SPRY2 e a expressão do marcador associado à autofagia

Para elucidar os mecanismos regulatórios a montante que controlam o SPRY2 e sua relação com o miR-590-5p, seus perfis de expressão foram examinados sob condições inflamatórias. Após a observação morfológica do modelo celular C28/I2 induzido por IL-1β (Figura 5A), as eficiências de transfecção para manipulação genética SPRY2 foram verificadas. Tanto as análises qPCR quanto as análises de Western blot confirmaram regulação robusta de alta do SPRY2 no grupo de superexpressão (OE) e knockdown bem-sucedido entre os pequenos grupos de RNA interferente (siRNA) em comparação com seus respectivos controles (Figuras 5B e 5C). Por outro lado, os níveis de miR-590-5p foram significativamente aumentados após o tratamento com IL-1β.

Figura 5: Observação morfológica e validação das eficiências de transfecção SPRY2. (A) Observação morfológica de células C28/I2 após tratamento com IL-1β (20×, micrografia de contraste de fase). (B) Níveis relativos de expressão de mRNA e proteína do SPRY2 nos grupos de controle, NC e superexpressão (OE) do SPRY2. (C) Imagens representativas de Western blot confirmando a superexpressão do SPRY2 (à esquerda) e o knockdown do SPRY2 por siRNAs específicos (si-896, si-800, si-695) em comparação com controles (à direita). β-actina servia como controle interno de carga. Os dados são expressos como a média ± DS (n = 3). *P < 0,05 em comparação com o grupo de controle. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Para determinar se esse padrão de expressão inverso refletia uma relação regulatória potencial, o TargetScan Human 7.1 foi usado para identificar um sítio de ligação potável de 8 mers para has-miR-590-5p dentro do 3′-UTR do SPRY2 humano (nucleotídeos 236–243). O alinhamento de sequências na Figura 6 ilustra a complementaridade prevista-região semente. Experimentos de resgate foram então realizados para examinar funcionalmente se a modulação miR-590-5p alterou a expressão do SPRY2 no modelo OA. Após confirmar as eficiências de transfecção do mimetismo e inibidor do miR-590-5p (Figuras 7A, B), ensaios de resgate mostraram que a inibição do miR-590-5p reverteu a supressão associada à OA da expressão do mRNA SPRY2 (Figura 7C). O miMêmita miR-590-5p não reduziu ainda mais a expressão de SPRY2 além da supressão marcada induzida pela IL-1β, enquanto a inibição de miR-590-5p aumentou significativamente a expressão de SPRY2 em relação ao controle negativo para inibidores. Esses achados apoiam uma relação regulatória inversa e suposta entre miR-590-5p e SPRY2 em condrócitos inflamatórios.

Figura 6: Previsão in silico da suposta interação regulatória miR-590-5p/SPRY2. A análise bioinformática foi realizada usando o TargetScan Human 7.1^31,32 para identificar supostos sítios de ligação ao miRNA. O esquema ilustra o alinhamento de sequências previstas e a complementaridade da região semente entre has-miR-590-5p e o 3′-UTR do SPRY2 humano (nucleotídeos 236–243). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 7: Efeitos da modulação miR-590-5p na expressão do SPRY2 em condrócitos. As eficiências de transfecção foram confirmadas por qPCR para o miR-590-5p mimeticamente (A) e inibidor (B) em relação aos seus respectivos controles. (C) A expressão relativa do mRNA SPRY2 foi medida entre os grupos experimentais indicados após a modulação miR-590-5p no modelo OA. U6 e β-actina foram usadas como controles internos para quantificação de miRNA e mRNA, respectivamente. Os dados são apresentados como média ± DS (n = 3). *P < 0,05 em comparação com o grupo de controle; #P < 0,05 em comparação com o respectivo grupo Mimic-NC ou Inibidor-NC; &P < 0,05 em comparação com o grupo OA+Inibidor-NC. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Consistente com os resultados da Figura 4, mudanças nos marcadores associados à autofagia foram paralelas aos efeitos esperados pela redução da expressão do SPRY2, sugerindo que o miR-590-5p pode aumentar sua expressão ao aliviar a inibição mediada pelo SPRY2. Em conjunto, esses achados apoiam um eixo de sinalização suposto no qual IL-1β aumenta a pressão de miR-590-5p, miR-590-5p suprime a expressão de SPRY2, e a redução de SPRY2 está associada ao aumento da expressão de marcadores de Beclin-1 e LC3-II.

DISPONIBILIDADE DE DADOS:

Os dados deste estudo estão fornecidos no Arquivo Suplementar 1.

Arquivo Suplementar 1: Os conjuntos de dados usados para este estudo, incluindo dados de origem qPCR, imagens de fontes de Western blot e resultados de análises estatísticas.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Estudos anteriores mostraram que os miRNAs regulam a autofagia em múltiplos estágios, incluindo iniciação, elongamento da vesícula e^{maturação 27}. O envolvimento dos miRNAs na patogênese da OA tem sido cada vez mais documentado, especialmente por meio de efeitos sobre inflamação, apoptose, remodelação extracelular da matriz e vias relacionadas à autofagia. MiR-590-5p foi associado à homeostase celular e aos processos associados ao^câncer 28,29,30. Em contextos esqueléticos e relacionados à cartilagem, o miR-590-5p foi relatado como promovendo a diferenciação condrogênica de células-tronco mesenquimatosas humanas 16, enquanto nos modelos de condrócitos OA pode regular a proliferação, apoptose e respostas inflamatórias ao direcionar a FGF^18,24. No entanto, ainda não está claro se o miR-590-5p afeta as respostas relacionadas à autofagia em condrócitos da OA.

Portanto, RNAInter e TargetScan foram usados para explorar potenciais mediadores a jusante, e ambas as análises sugeriram o SPRY2 como um alvo associado ao miR-590-5p. O TargetScan Human 7.1^31,32 identificou um sítio previsto de 8 mers de ligação à região da semente nos nucleotídeos 236–243 do SPRY2 3′-UTR (Figura 6). SPRY2 é um regulador negativo da sinalização receptora tirosina quinase/MAPK e é expressa em múltiplos tecidos¹⁹. A transferência gênica intraarticular SPRY2 foi relatada como atenuante da artrite induzida por adjuvante em^{ratos 21}. A superexpressão do SPRY2 pode inibir o crescimento, invasão, migração e citocinese celular mediada por HGF/^{SF, enquanto} a perda da função do Spry2 tem sido associada à hiperativação do MAPK-ERK e ao aumento da proliferação das células^{B 34}. O SPRY2 também foi implicado na regulação²² relacionada à apoptose, no controle de migração^{associado a miRNAs 35} e nas respostas relacionadas à autofagia em modelos^{isquêmicos 23}. Juntos, esses estudos apoiam o SPRY2 como um nó regulador que liga sinalização inflamatória, vias relacionadas à sobrevivência e respostas associadas à autofagia.

Dada a relação anteriormente não relatada entre miR-590-5p e SPRY2 em condrócitos OA, a previsão bioinformática de sua possível interação motivou investigações experimentais adicionais. Os resultados atuais mostraram que o SPRY2 foi significativamente reduzido, enquanto o miR-590-5p foi aumentado nos condrócitos C28/I2 estimulados com IL-1β, implicando esse eixo nas respostas inflamatórias dos condrócitos. Funcionalmente, a superexpressão do SPRY2 diminuiu a expressão de Beclin-1 e LC3-II, apoiando um efeito inibitório na expressão de marcadores associados à autofagia. Por outro lado, a inibição de miR-590-5p reduziu a expressão de Beclin-1 e Bcl-2 e restaurou a expressão de SPRY2, consistente com uma relação regulatória inversa suposta. Como o Bcl-2 pode inibir a autofagia dependente de Beclin-1 enquanto exerce efeitos antiapoptóticos13, a elevação concomitante do Bcl-2 com Beclin-1 e LC3-II deve ser interpretada de forma específica para o contexto. Neste modelo inflamatório de OA, a regulação para cima do Bcl-2 pode refletir principalmente uma resposta antiapoptótica relacionada à sobrevivência, enquanto o aumento da expressão de Beclin-1 e LC3-II pode refletir alívio da supressão associada ao SPRY2. Esses achados sugerem um modelo no qual o miR-590-5p coordena a sinalização relacionada à sobrevivência dos condrócitos e a expressão de marcadores de autofagia suprimindo o SPRY2 sob estresse inflamatório.

Embora este estudo forneça valiosos insights mecanicistas sobre o eixo miR-590-5p/SPRY2, várias limitações devem ser reconhecidas. Primeiro, todos os experimentos foram realizados em um sistema in vitro 2D usando a linhagem celular C28/I2 imortalizada. Esse modelo simplificado não pode recapitular totalmente o estresse biomecânico, as interações multicelulares e o microambiente inflamatório da cartilagem articular in vivo, limitando a aplicabilidade imediata e translacional dos achados. Segundo, embora previsões bioinformáticas e ensaios de resgate apoiem uma relação regulatória suposta entre miR-590-5p e SPRY2, a ausência de um ensaio de repórter de dupla luciferase impede a confirmação definitiva da ligação física direta entre miR-590-5p e o SPRY2 3′-UTR. Terceiro, medições estáticas de Beclin-1 e LC3-II não conseguem distinguir o aumento da formação de autofagossomos de degradação autolisossômica comprometida; portanto, estudos futuros devem avaliar o fluxo autofágico utilizando abordagens como o tratamento com Bafilomicina A1 ou ensaios repórteres fluorescentes em tandem. Trabalhos futuros também devem incluir um painel mais amplo de marcadores fenotípicos de OA (por exemplo, MMP13 e ADAMTS5), condrócitos humanos primários, modelos 3D de explant de cartilagem e modelos in vivo de OA como desestabilização do menisco medial, para avaliar os efeitos a longo prazo da modulação miR-590-5p e SPRY2.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anti-β-actin antibody	Proteintech	66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938	Controle de carga interna para análise de Western blot
Anti-SPRY2 antibody	Proteintech	11383-1-AP ; RRID: AB_2196324	Detecção da expressão da proteína SPRY2
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific	23225	Determinação da concentração total de proteína
C28/I2 human chondrocyte cell line	Punocel	CP-H107	Modelo in vitro de condrócito para estudos de osteoartrite
Complete DMEM	KeyGen Biotec	KGM12800S	Meio basal para cultura celular de rotina
CWBIO Ultrapure miRNA extraction kit	CWBIO	CW0627S	Isolamento de RNA total e miRNA
ECL detection system	Thermo Fisher Scientific	32106	Visualização quimioluminescente de bandas de proteína
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	1891605	Suplemento de crescimento para cultura celular
GraphPad Prism version 9.0	GraphPad Software	N/A	Análise estatística e geração de gráficos
HiScript II Q RT SuperMix	Vazyme	R223-01	Transcrição reversa de mRNA para cDNA
ImageJ software	National Institutes of Health	N/A	Quantificação da intensidade das bandas do Western blot
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000015	Transfecção de plasmídeos e oligonucleotídeos
miR-590-5p mimic, inhibitor, and NCs	RiboBio	Custom synthesized	Modulação da expressão de miR-590-5p
miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit	Vazyme	MR101-02	Transcrição reversa de miRNA para cDNA
Opti-MEM medium	Gibco	31985-062	Preparação de complexos de transfecção
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122	Prevenção de contaminação bacteriana na cultura celular
Protease and phosphatase inhibitor cocktails	MedChemExpress	HY-K0010	Proteção das proteínas durante a extração
PVDF membranes	Millipore Sigma	ISEQ00010	Membrana de transferência de proteína para imunoblotting
Recombinant human IL-1β	MedChemExpress	HY-P78459	Indução de condições inflamatórias semelhantes à OA
RIPA buffer	Beyotime	P0013B	Lisado celular e extração de proteínas
si-SPRY2 constructs and si-NC	GenePharma	Custom synthesized	Silenciamento da expressão de SPRY2
SPRY2 overexpression plasmid (OE) and empty vector (NC)	GeneChem	Custom constructed	Avaliação dos efeitos da superexpressão de SPRY2
UV-VIS spectrophotometer (NanoDrop 2000)	Thermo Fisher Scientific	ND-2000	Medição da concentração e pureza de RNA