É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de investigação
* These authors contributed equally
O estresse inflamatório em um modelo de condrócitos C28/I2 induzido por IL-1β aumentou o miR-590-5p e reduziu a expressão do SPRY2. A modulação desse eixo alterou a expressão de Beclin-1, LC3-II e Bcl-2, sugerindo uma via reguladora putativa miR-590-5p/SPRY2 que pode influenciar as respostas associadas à autofagia e a sobrevivência dos condrócitos na osteoartrite.
A osteoartrite (OA) é uma doença degenerativa articular prevalente caracterizada por destruição progressiva da cartilagem e perda da homeostase dos condrócitos. Embora a autofagia desregulada contribua para a patogênese da OA, os mecanismos moleculares que regem as respostas associadas à autofagia em condrócitos permanecem incompletamente compreendidos. Este estudo investigou o papel do eixo regulador miR-590-5p/SPRY2 em um microambiente inflamatório de OA utilizando condrócitos humanos C28/I2 induzidos por IL-1β. Um modelo in vitro de OA foi estabelecido tratando células C28/I2 com IL-1β. A expressão de miR-590-5p e SPRY2 foi avaliada usando PCR quantitativa e Western bloting. Abordagens de ganho e perda de função foram empregadas para avaliar os efeitos do SPRY2 e do miR-590-5p nos marcadores associados à autofagia Beclin-1 e LC3-II, bem como na proteína relacionada à sobrevivência Bcl-2. Análises bioinformáticas e experimentos de resgate foram usados para investigar a relação regulatória entre o miR-590-5p e o SPRY2. O tratamento com IL-1β aumentou significativamente a expressão de miR-590-5p enquanto reduzia os níveis de mRNA e proteína SPRY2 (P < 0,05). A superexpressão do SPRY2 diminuiu significativamente a expressão de Beclin-1 e LC3-II, com reduções de aproximadamente 65% e 77%, respectivamente (P < 0,05). Em contraste, a superexpressão de miR-590-5p aumentou a expressão de Beclin-1, LC3-II e Bcl-2, enquanto a inibição de miR-590-5p reverteu esses efeitos e restaurou a expressão do SPRY2. Análises funcionais apoiaram o SPRY2 como uma alvo regulatório a jusante do miR-590-5p. Esses achados identificam o eixo miR-590-5p/SPRY2 como um importante regulador da expressão de marcadores associados à autofagia e da sobrevivência dos condrócitos em condições inflamatórias, sugerindo sua possível relevância como alvo terapêutico na OA.
Como a forma mais prevalente de artrite no mundo, a osteoartrite (OA) é uma das principais causas de dor, comprometimento de mobilidade e deficiência física, impondo um ônus substancial aos sistemas de saúde e àsociedade 1. Patologicamente, a OA é caracterizada por degeneração progressiva da cartilagem articular, inflamação sinovial e remodelação patológica do ossosubcondral 1. Estimativas epidemiológicas indicam que aproximadamente 303 milhões de pessoas no mundo são afetadas pela OA, e espera-se que esse número aumente com o envelhecimento da população e o aumento das taxas de
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Este estudo foi conduzido exclusivamente com a linha celular de condrócitos humanos C28/I2, disponível comercialmente. Nenhum participante humano, amostras de tecido humano, materiais derivados de pacientes ou animais vivos estiveram envolvidos nesta pesquisa. Portanto, a aprovação do Conselho de Revisão Institucional (IRB) e do Comitê de Cuidados e Uso Institucionais de Animais (IACUC) não eram necessárias, de acordo com as diretrizes institucionais e nacionais. As ferramentas, produtos químicos, kits e reagentes usados no protocolo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Cultura c....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Estabelecimento do modelo inflamatório de condrócitos in vitro
Para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à patologia da osteoartrite, foi estabelecido um modelo inflamatório in vitro usando condrócitos humanos C28/I2 estimulados com IL-1β. A validade desse modelo foi confirmada pela avaliação da expressão da cadeia alfa 1 tipo II de colágeno (Col-II), um componente primário da matriz extracelular da cartilagem hialina e um.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Estudos anteriores mostraram que os miRNAs regulam a autofagia em múltiplos estágios, incluindo iniciação, elongamento da vesícula ematuração 27. O envolvimento dos miRNAs na patogênese da OA tem sido cada vez mais documentado, especialmente por meio de efeitos sobre inflamação, apoptose, remodelação extracelular da matriz e vias relacionadas à autofagia. MiR-590-5p foi associado à homeostase celular e aos processos associados aocâncer 28,2.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Os autores agradecem ao Departamento de Geriatria do Hospital Ruikang, Universidade de Medicina Chinesa de Guangxi, por fornecer instalações experimentais e suporte técnico para este estudo. Os autores também agradecem à equipe do laboratório e aos colegas pela ajuda na coleta e análise dos dados. Esse trabalho foi apoiado pelo Projeto de Pesquisa em Ciências Naturais da Universidade de Medicina Chinesa de Guangxi (Bolsa nº 2022MS039; LncRNA-GAS5 media a expressão do SPRY2 para inibir a autofagia em condrócitos OA do joelho de camundongo: estudo do mecanismo e efeito da intervenção precoce da Prescrição Huayu Qushi) e a Fundação Nacio....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anti-β-actin antibody | Proteintech | 66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938 | Controle de carga interna para análise de Western blot |
| Anti-SPRY2 antibody | Proteintech | 11383-1-AP ; RRID: AB_2196324 | Detecção da expressão da proteína SPRY2 |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | Determinação da concentração total de proteína |
| C28/I2 human chondrocyte cell line | Punocel | CP-H107 | Modelo in vitro de condrócito para estudos de osteoartrite |
| Complete DMEM | KeyGen Biotec | KGM12800S | Meio basal para cultura celular de rotina |
| CWBIO Ultrapure miRNA extraction kit | CWBIO | CW0627S | Isolamento de RNA total e miRNA |
| ECL detection system | Thermo Fisher Scientific | 32106 | Visualização quimioluminescente de bandas de proteína |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 1891605 | Suplemento de crescimento para cultura celular |
| GraphPad Prism version 9.0 | GraphPad Software | N/A | Análise estatística e geração de gráficos |
| HiScript II Q RT SuperMix | Vazyme | R223-01 | Transcrição reversa de mRNA para cDNA |
| ImageJ software | National Institutes of Health | N/A | Quantificação da intensidade das bandas do Western blot |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000015 | Transfecção de plasmídeos e oligonucleotídeos |
| miR-590-5p mimic, inhibitor, and NCs | RiboBio | Custom synthesized | Modulação da expressão de miR-590-5p |
| miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Vazyme | MR101-02 | Transcrição reversa de miRNA para cDNA |
| Opti-MEM medium | Gibco | 31985-062 | Preparação de complexos de transfecção |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Prevenção de contaminação bacteriana na cultura celular |
| Protease and phosphatase inhibitor cocktails | MedChemExpress | HY-K0010 | Proteção das proteínas durante a extração |
| PVDF membranes | Millipore Sigma | ISEQ00010 | Membrana de transferência de proteína para imunoblotting |
| Recombinant human IL-1β | MedChemExpress | HY-P78459 | Indução de condições inflamatórias semelhantes à OA |
| RIPA buffer | Beyotime | P0013B | Lisado celular e extração de proteínas |
| si-SPRY2 constructs and si-NC | GenePharma | Custom synthesized | Silenciamento da expressão de SPRY2 |
| SPRY2 overexpression plasmid (OE) and empty vector (NC) | GeneChem | Custom constructed | Avaliação dos efeitos da superexpressão de SPRY2 |
| UV-VIS spectrophotometer (NanoDrop 2000) | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Medição da concentração e pureza de RNA |
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.