Visualização e Quantificação do Pareamento de Bases de RNA Intermolecular em Clusters de RNA in vitro usando repórteres de RNA de brócolis divididos

Summary

Este protocolo descreve um ensaio visual usando repórteres de RNA de Brócolis divididos para detectar e quantificar o pareamento de bases intermoleculares em clusters de RNA in vitro.

Abstract

O agrupamento de RNA, impulsionado por interações intermoleculares multivalentes RNA–RNA, pode ocorrer in vitro na ausência de proteínas. Embora sondagens químicas e simulações computacionais tenham sido usadas para prever essas interações, os métodos para avaliar diretamente o pareamento de bases intermoleculares em clusters de RNA continuam limitados. Este estudo apresenta um ensaio visual baseado em repórteres de RNA de Brócolis divididos conjugados com RNAs de interesse marcados fluorescente. O ensaio permite a detecção e quantificação do pareamento de bases intermoleculares em aglomerados de RNA. O sistema de brócolis dividido contém sequências repórteres complementares que se dimerizam para formar o aptamero de RNA de brócolis. A estrutura resultante de RNA dimerizado se liga ao DFHBI-1T, um fluoróforo que emite fluorescência verde ao se ligar. Após o agrupamento de RNA, o aparecimento da fluorescência verde relata pareamento de bases mediado pelas sequências complementares de repórteres entre os RNAs de interesse. A medição da fluorescência DFHBI-1T permite a avaliação quantitativa de como as condições de agrupamento de RNA in vitro influenciam o pareamento de bases intermoleculares entre essas sequências repórteres.

Introduction

RNAs transcritos in vitro podem se auto-montar em aglomerados visíveis com a adição de sais e reagentes de aglomeração^molecular 1,2,3,4,5. Notavelmente, esses clusters de RNA podem se formar na ausência de outros componentes celulares, incluindo proteínas, indicando que, sob condições específicas, interações intermoleculares RNA–RNA são suficientes para impulsionar a condensação de RNA in vitro.

Entre os vários tipos de interações intermoleculares RNA–RNA, o pareamento de bases intermoleculares recebeu atenção substancial no campo de^condensados 1,2,4,6,7,8,9,10. Essas interações podem ser impulsionadas por sequências complementares expostas ("códigos postais") entre transcritos, como demonstrado pelo coagrupamento dos mRNAs BNI1 e SPA2 no fungo filamentoso Ashbya gossypii² ou pela oligomerização do mRNA de oskar em Drosophila melanogaster ^6,7. Alternativamente, o pareamento de bases intermoleculares pode ser promovido pela remodelação das estruturas secundárias de RNA, expondo sequências complementares que, de outra forma, estariam estruturalmente embebedidas. Esse mecanismo foi observado em RNAs repetidos in^silico-9 e riboswitches de guanidina in vitro¹⁰. Tanto sequências complementares expostas quanto a remodelação estrutural de RNA podem ser medidas usando sondagens^{químicas 11,12} ou abordagens de^simulação 4,9,13,14. No entanto, métodos que visualizam diretamente o pareamento de bases intermoleculares em ensaios in vitro de clustering de RNA continuam limitados.

Ensaios de RNA pull-down usando os pareamentos de bases 15,16,17 e a eletroforese em gel ^4,6,7 são comumente usados para estudar o pareamento de bases de RNA intermolecular in vitro. No entanto, esses métodos carecem da resolução espacial para distinguir o pareamento de bases dentro de aglomerados daquele fora deles. Além disso, isolar clusters de RNA para análise a jusante é tecnicamente desafiador, pois requer preservação da estabilidade do cluster enquanto garante a compatibilidade do buffer com ensaios subsequentes.

Um ensaio visual baseado em repórteres de RNA de Brócolis^{divididos 18} conjugados a RNAs marcados fluorescentemente de interesse já foi empregado anteriormente para permitir a detecção direta do pareamento de bases intermoleculares durante condensação de RNA in vitro⁴. Nesse contexto, o sistema Brócolis dividido relata a probabilidade de interações intermoleculares entre repórteres ou entre RNAs que os transportam sob condições definidas de agrupamento in vitro . Assim, o ensaio investiga como o contexto da sequência e fatores ambientais influenciam a propensão para o pareamento de bases intermoleculares dentro de um ambiente semelhante a um cluster de RNA.

O sistema de Brócolis dividido consiste em duas sequências complementares de RNA, superior e inferior, que se dimerizam para reconstituir o aptámero do RNA de Brócolis (Figuras 1A–C)¹⁸. Após a dimerização, o aptamero se liga ao fluoróforo DFHBI-1T, resultando em fluorescência verde (Figuras 1A–C)¹⁸. Usando esse sistema, a extensão do pareamento de bases intermoleculares entre sequências complementares repórteres dentro dos clusters de RNA é demonstrada como dependendo do dobramento do RNA. Ao comparar a razão entre a fluorescência do DFHBI-1T e os níveis de RNA entre diferentes condições experimentais, a influência das condições in vitro no pareamento intermolecular de bases mediado por repórteres dentro dos clusters de RNA pode ser avaliada quantitativamente.

Este ensaio complementa abordagens de puxão de RNA para baixo e eletroforese em gel para estudar o pareamento intermolecular de bases em aglomerados de RNA. No entanto, a detecção robusta de sinais pode exigir reagentes de aglomeração molecular, e a sensibilidade é limitada pela eficiência da dimerização e dobramento dos RNAs de brócolis divididos superior e inferior .

Protocol

Esse protocolo fornece um método passo a passo para implementar esse ensaio e discute suas aplicações. Os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de moldes de DNA para transcrição in vitro de RNA

1. Anexe uma sequência promotora T7 na extremidade 5′ de cada molde de DNA contendo as sequências de aptamers de Brócolis divididas para transcrição in vitro de RNA. Use as sequências de aptamers Brócolis divididas (superior e inferior) sozinhas ou insira-as em qualquer posição a jusante do promotor T7, com ou sem uma sequência adicional de RNA de interesse.
   NOTA: As sequências para o promotor T7, repórteres de brócolis divididos e primers usados para amplificar os moldes de DNA estão listadas na Tabela 1.
   NOTA: A RNA polimerase T7 prefere fortemente iniciar a transcrição com um "G" na posição +1. A presença de Gs adicionais imediatamente a jusante nas posições +2 e +3 pode aumentar o rendimento de transcrição¹⁹. No entanto, quando a sequência a jusante começa com G, como nas construções superior e inferior que começam com dois Gs, a transcrição pode ser iniciada em diferentes^{posições 20}. Como resultado, as transcrições podem conter um, dois ou três Gs na extremidade 5′ (por exemplo, GATCC, GGATCC ou GGGATCC), o que pode afetar a interpretação do pareamento de bases nas construções projetadas.
2. Use blocos gênicos comercialmente sintetizados, plasmídeos ou fragmentos de DNA como modelos para PCR. Se o molde original não contiver um promotor T7, use um primer frontal com um saliência de promotor T7 de 5′ junto com o primer reverso apropriado.
3. Prepare uma reação de PCR de 50 μL em um tubo de PCR de 200 μL contendo 2,5 μL de espoletas de 10 μM para frente e para trás, molde de DNA de 20 ng, 25 μL de 2× mistura mestre de alta fidelidade e água sem nuclease. Misture bem pipetando para cima e para baixo e centrifuge a 2.000 × g por 2 segundos.
4. Execute a reação de PCR em um ciclador térmico usando o seguinte programa: 98 °C por 30 s (1 ciclo); 98 °C por 10 s, temperatura otimizada de recozimento para 30 s, e 72 °C para 30 s por kilobase (35 ciclos); 72 °C por 2 minutos (1 ciclo).
   NOTA: Determine a temperatura otimizada de recozimento usando uma ferramenta online, como uma calculadora de Tm. Os produtos de PCR podem ser armazenados a 4 °C após a conclusão.
5. Misture 2 μL de produto PCR com 8 μL de água livre de nuclease e 2 μL de 6× de corante de carga. Coloque a mistura em um gel de agarose a 1% para eletroforese.
   NOTA: O produto de PCR deve aparecer como uma única banda. Se várias faixas forem observadas, retire a faixa correta e purifique-a usando um kit de extração em gel antes de prosseguir.
6. Purifique o produto de PCR ou o DNA extraído em gel usando um kit de purificação de DNA e elute em água livre de nuclease de 20–30 μL em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
7. Meça a concentração e pureza do DNA usando um espectrofotômetro de microvolume. Certifique-se de que A260/A280 seja aproximadamente 1,8 e A260/A230 maior que 2,0.
   NOTA: Se A260/A230 estiver abaixo de 2,0, realize uma etapa adicional de purificação.
8. Armazene o molde de DNA a −20 °C até o uso.

2. Preparação da reação transcricional in vitro de RNA

1. Limpe a superfície de trabalho, os suportes de tubos e as pipetas com solução de descontaminação de RNase. Use pontas filtradas sem RNase.
2. Soluções de buffer de reação de descongelamento e nucleotídeos (ATP, CTP, GTP, UTP) fornecidos com o kit de transcrição T7, junto com UTP-Cy5, em gelo. Centrifuge todos os tubos a 2.000 × g por 2 s antes do uso.
   NOTA: Proteja o UTP-Cy5 da luz.
3. Calcule o número de bases de timina no molde de DNA (excluindo o promotor T7) e determine os volumes necessários de UTP e UTP-Cy5 para uma reação de transcrição de 20 μL. Mantenha uma densidade consistente de marcação entre as espécies de RNA.
   NOTA: Por exemplo, para marcar um RNA contendo 100 bases de uracilos com aproximadamente três uracilos marcados com Cy5, adicione 4,5 μL de 1 mM UTP-Cy5 e 1,9 μL de 75 mM UTP.
4. Prepare uma reação de transcrição de 20 μL combinando 2 μL de ATP, CTP e GTP, volumes calculados de UTP (todos fornecidos com o kit) e UTP-Cy5, 2 μL 10× tampão de reação, mistura enzimática de 2 μL, molde de DNA de 200 ng e água livre de nuclease. Misture bem pipetando para cima e para baixo e centrifuge a 2.000 × g por 2 segundos.
5. Incube a reação a 37 °C por 6 horas.
6. Adicione 1 μL de DNase fornecida com o kit. Misture bem pipetando para cima e para baixo e centrifuge a 2.000 × g por 2 segundos.
7. Incube a 37 °C por mais 15 minutos.
8. Transfira a reação (~20 μL) para um tubo de 1,5 mL. Adicione 115 μL de água sem nuclease e 15 μL de solução de parada de acetato de amônio fornecida com o kit. Misture bem pipetando para cima e para baixo e centrifuge a 2.000 × g por 2 segundos.
   NOTA: Um kit comercial de purificação de RNA pode ser usado em vez dos Passos 2.9–3.7.
9. Adicione 150 μL de fenol/clorofórmio e misture suavemente.
   ATENÇÃO: Manuseie fenol/clorofórmio em uma exaustão química.
10. Centrifuge a 16.000 × g por 10 minutos a 4 °C.
11. Transfira a fase aquosa superior para um novo tubo.
    NOTA: Evite perturbar a interfase; a camada inferior pode parecer azul devido ao corante não incorporado.
12. Adicione um volume igual de clorofórmio e misture bem.
    ATENÇÃO: Manuseie o clorofórmio em uma exaustão química.
13. Centrifuge a 16.000 × g por 2 minutos a 4 °C.
14. Repita os passos 2.11–2.13.
15. Transfira a camada aquosa (~100–150 μL) para um novo tubo. Adicione 900 μL de isopropanol e misture bem.
16. Aliquot em três volumes iguais em tubos separados.
    NOTA: Cada alíquota é suficiente para múltiplas reações de agrupamento de RNA.
17. Armazene a −20 °C durante a noite ou até um mês.

3. Purificação de RNA transcrito in vitro

1. Centrifuge a amostra de RNA em isopropanol a 16.000 × g por 15 minutos a 4 °C.
2. Remova cuidadosamente o isopropanol sem perturbar o pellet de RNA.
3. Adicione 1 mL de etanol 70% preparado em água sem nuclease.
4. Centrifuge a 16.000 × g por 2 minutos a 4 °C.
5. Remova o etanol e repita os Passos 3.3–3.4.
6. Durante a lavagem final com etanol, remova a maior parte do etanol usando uma pipeta de 1000 μL. Centrifuge brevemente a 2.000 × g por 2 s em uma minicentrífuga de bancada e remova qualquer etanol restante usando uma pipeta de 20 μL.
7. Seque o pellet de RNA ao ar por 1–2 minutos em temperatura ambiente (RT).
8. Ressuspenda o pellet de RNA em água livre de nuclease de 20 μL. Mantenha a amostra no gelo e proteja-a da luz.
9. Meça a concentração e pureza de RNA usando um espectrofotômetro de microvolume. Certifique-se de que A260/A280 seja aproximadamente 2,0 e A260/A230 maior que 2,0.

4. Preparação da reação de clusterização de RNA in vitro

NOTA: Neste protocolo, a indução do agrupamento de RNA requer espertina e PEG 8000, com base em estudos^{anteriores 2,4,5}. Especificamente, uma solução de estoque de tetrahidrocloreto de espermina de 100 mM preparada em água livre de nuclease foi alicotada em múltiplos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e armazenada a −20 °C.

1. Descongele um tubo de solução de espermina de 100 mM e 50% de PEG 8000 no gelo.
   NOTA: Após a abertura, o PEG 8000 de 50% deve ser usado por no máximo dois meses devido a possível degradação.
2. Para preparar 500 μL de tampão recém-fabricado de 10× RNA refolding, combine 50 μL de 2M KCl, 50 μL 1M_{MgCl 2}, 50 μL 1M Tris (pH 7,0) e 350 μL água livre de nuclease. Misture bem pipetando para cima e para baixo. Centrífuga a 2.000 × g por 2 s em uma minicentrífuga de bancada.
   NOTA: O buffer de redobragem deve ser preparado no dia do experimento de agrupamento de RNA.
   NOTA: Os passos 4.3-4.4 dependem das condições experimentais e podem ser ajustados conforme necessário. Duas condições exemplos para agrupamento de RNA usadas neste estudo são descritas abaixo. A condição de co-dobramento é adaptada de um método usado para recozer oligonucleotídeos antissenso ao^{RNA 2}. Neste método, os RNAs são misturados em um tampão de sal e aquecidos juntos para promover o pareamento intermolecular de bases entre RNAs que carregam sequências complementares. Em contraste, para a condição de dobramento separado, cada RNA é dobrado individualmente antes da mistura. Essa condição tem como objetivo aproximar um cenário celular em que os RNAs são dobrados antes de interagir.
3. Co-dobragem
   NOTA: Essa condição promove o pareamento de bases intermoleculares entre RNAs que contêm as sequências superior e inferior . Ele serve como um controle positivo para o pareamento de bases intermoleculares impulsionado por repórteres sob a condição de agrupamento de RNA.
   1. Em um tubo de PCR de 200 μL, combine 16 pmol de cada RNA transcrito in vitro contendo sequência superior ou inferior , 2 μL de 10× tampão de RNA refolding e água sem nuclease para um volume final de 14 μL. Misture cuidadosamente pipetando para cima e para baixo. Centrifuge a 2.000 × g por 2 s em uma minicentrífuga de bancada.
      NOTA: Para calcular a massa de RNA correspondente a 16 pmol.
   2. Aqueça a amostra de RNA a 90 °C por 2 minutos.
   3. Transfira imediatamente a amostra para a RT e proteja-a da luz. Incube a reação em RT por 1 hora.
4. Dobragem separada
   1. Aqueça a amostra de RNA a 90 °C por 2 minutos e depois imediatamente coloque no gelo por pelo menos 15 minutos.
   2. Em um tubo de PCR de 200 μL, combine 16 pmol de RNA transcrito in vitro transportando sequência superior ou inferior , 1 μL de 10× tampão de RNA redobrável e água sem nuclease para um volume final de 7 μL.
      NOTA: Para calcular a massa de RNA correspondente a 16 pmol.
   3. Incube a reação em RT por 30 minutos, protegido da luz.
   4. Combine as amostras de RNA contendo as sequências superior e inferior em um único tubo de PCR. Misture bem pipetando para cima e para baixo. Centrifuge a 2.000 × g por 2 s em uma minicentrífuga de bancada. Incubar em tempo de descanso por 30 minutos.
5. Adicione 6 μL de uma pré-mistura 1:2 (v/v) de 100 mM de espermina e 50% de PEG 8000. Misture bem pipetando para cima e para baixo. Centrífuga a 2.000 × g por 2 s em uma minicentrífuga de bancada.
   NOTA: PEG 8000 com 50% é altamente viscoso. Pipete devagar e com cuidado.
6. Adicione 2 μL de 1 mM de DFHBI-1T à reação. Misture bem pipetando para cima e para baixo. Centrífuga a 2.000 × g por 2 s em uma minicentrífuga de bancada. A reação deve parecer amarelo-esverdeada.
   NOTA: Para preparar uma solução estocada de DFHBI-1T de 20 mM a partir de 1 mg de corante liofilizado DFHBI-1T (MW: 320,21), adicione 156 μL de DMSO anidro de grau em biologia molecular. Aliquota o estoque em pequenas quantidades em múltiplos tubos microcentrífugas e armazene em -20 °C. Evite ciclos repetitivos de congelamento-descongelamento para o corante. Prepare uma solução de trabalho DFHBI-1T recém-diluída de 1 mM, diluindo o estoque de 20 mM em água sem nuclease e armazenando-o no gelo.
7. Carregue a reação em um vidro cobertor com câmara de vidro.
8. Incube a câmara em RT por 4 horas no escuro, com a tampa para minimizar a evaporação.

5. Preparação para imagem

1. Adquira imagens tridimensionais usando um microscópio de iluminação estruturada ou confocal equipado com lasers e objetivos apropriados.
   NOTA: A microscopia confocal é necessária para minimizar a luz fora de foco.
2. Configure o microscópio para imagear cada região de interesse (ROI) com o canal Cy5 primeiro em cada plano z, seguido de obter a imagem do mesmo ROI usando o canal GFP.
3. Ajuste o tempo de exposição para 500 ms para todos os canais. Ajuste a potência do laser para 80% para GFP e 40% para Cy5.
4. Imagine uma região de cobertura fora da gota de reação em RT usando um passo z de 150 nm.

6. Quantificação do pareamento de bases intermoleculares

1. Importar imagens para o software de análise^{de imagens 21}. Identifique os canais de GFP (DFHBI-1T) e Cy5 (RNA).
2. Desenhe um ROI de 5 × 5 pixels dentro de um cluster de RNA e meça a densidade integrada para ambos os canais no mesmo plano z. Selecione de 5 a 8 ROIs de diferentes clusters de RNA em cada imagem.
   NOTA: Ajuste o tamanho do ROI dependendo da configuração da câmera, mas mantenha a consistência entre os experimentos.
3. Selecione 5–8 ROIs fora da gota de reação para medição de fundo e calcule a densidade integrada média para ambos os canais.
4. Calcule a intensidade normalizada do DFHBI-1T para cada ROI usando:
   

7. Problemas comuns e solução de problemas

1. Se nenhum pellet de RNA for observado após a centrifugação, considere degradação do RNA, tempo de transcrição insuficiente, polimerase inativa, sais residuais ou baixa concentração de RNA. Use reagentes livres de RNase, estenda o tempo de transcrição, utilize enzimas frescas e purifique os modelos.
2. Se não forem observados clusters de RNA marcados com Cy5, considere degradação de RNA ou PEG 8000 ou UTP-Cy5 degradados. Use reagentes frescos e condições livres de RNase.
3. Se nenhum sinal DFHBI-1T for observado sob condições de co-dobramento, considere baixa qualidade do corante, ausência de formação de estrutura de brócolis ou transcritos truncados. Use corante fresco, garanta a composição adequada do tampão e verifique o tamanho do traço por meio de análise em gel.
4. Se o sinal de fluorescência desbotar, reduza a potência do laser e o tempo de exposição, minimize as etapas de imagem e proteja as amostras da luz durante a incubação.

Results

Neste experimento de demonstração, a capacidade dos repórteres de RNA superior e inferior sozinhos de formar par de bases e formar a estrutura de brócolis foi avaliada inicialmente usando o protocolo de clustering de RNA in vitro ^{anteriormente descrito 4}. O pareamento de bases entre o topo e o inferior gera dois braços de brócolis, cada um capaz de intercalar uma molécula de DFHBI-1T (Figuras 1A–C)^18,22.

Após a indução do agrupamento de RNA com espermina e PEG 8000, ambos os RNAs formaram agrupamentos individualmente ou juntos (Figuras 1D–Eii). Quando RNAs superiores ou inferiores foram examinados isoladamente, a fluorescência do DFHBI-1T dentro dos aglomerados de RNA foi substancialmente menor do que na condição de co-dobramento, na qual os dois RNAs foram combinados antes da desnaturação térmica e do redobramento (Figura 1F). Na condição de co-dobramento, a razão molar do DFHBI-1T (0,1 mM) para o topo (0,8 μM) e o fundo (0,8 μM) foi estimada em 125:1:1. Isso corresponde a um excesso de aproximadamente 62,5 vezes de DFHBI-1T em relação ao número máximo de estruturas potenciais de Brócolis.

O sinal DFHBI-1T baixo, mas não nulo, observado apenas para o topo e para o fundo é consistente com relatos anteriores que mostraram fluorescência mínima do DFHBI-1T quando cada repórter é expresso individualmente¹⁸. O DFHBI-1T também apresentou fluorescência de fundo muito baixa, mas detectável, na ausência de RNA (Figura 1F). Juntos, esses resultados demonstram que o DFHBI-1T é compatível com o ensaio in vitro de agrupamento de RNA e que o co-folding potencializa o pareamento de bases intermoleculares entre os RNAs superior e inferior .

Após a normalização para intensidade de RNA, a intensidade normalizada de fluorescência DFHBI-1T na condição de co-dobramento atingiu 1,03, o que foi significativamente maior do que a de cima e de baixo sozinhos (0,054 e 0,023, respectivamente) (Figura 1D, Figura 1Ei e Figura 1F). Clusters de RNA formados pela mistura de RNAs superior e inferior que foram dobrados separadamente antes do agrupamento foram então examinados (Figura 1D, Figura 1Eii e Figura 1F). Nessa condição de dobramento separada, o sinal normalizado do DFHBI-1T foi 0,031, comparável aos níveis de referência observados nos controles negativos (apenas em cima ou em baixo ) (Figura 1F). Esses resultados indicam que o co-folding promove o pareamento intermolecular de bases entre os RNAs superior e inferior , enquanto o dobramento separado restringe tais interações.

As sequências superior e inferior foram então inseridas na região não traduzida 3′ (UTR) do shutdown (shu) de Drosophila melanogaster, um grâul germinativo^{mRNA 4,23,24} e seu equivalente antissenso (shu^anti). O shu 3′ UTR foi selecionado porque trabalhos anteriores demonstraram que esse RNA existe predominantemente como monômero em Drosophila melanogaster e não se dimeriza, mesmo em altas concentrações molares em ensaios^{de gel de RNA 4,24}. Além disso, shu-top e shu-bottom não formam homodímeros nos géis^{de RNA 4}, permitindo uma avaliação mais direta das interações intermoleculares entre top e bottom e da influência das sequências flanqueantes derivadas do shu.
Os modelos de DNA para shu-top, shu-bottom, shu^anti-top e shu^anti-bottom estão listados na Tabela 2. As sequências superior e inferior foram inseridas no centro do shu ou ^{shu anti} 3′ UTR, exigindo remodelação estrutural para facilitar a interação e imitar melhor as interações fisiológicas RNA–RNA, nas quais regiões interagentes tipicamente estão embutidas dentro dos^{transcritos 4}.

Após a indução do agrupamento de RNA, shu-top, shu-bottom, shu^anti-top e ^{shu anti-bottom} apresentaram individualmente fluorescência mínima de DFHBI-1T, semelhante apenas à de cima e de baixo (Figuras 2A e 2B). Consistentemente, a co-dobragem do shu-top com o shu-bottom ou do^{shu anti-top} com o shu^anti-bottom produzia um sinal DFHBI-1T maior do que o dobramento separado (Figuras 2Ci e Cii). Após a normalização para controles de intensidade e negativo de RNA (definidos como o sinal médio normalizado de DFHBI-1T de cada RNA isoladamente), a co-dobragem de shu-top e shu-bottom resultou em um aumento de 5,63 vezes na fluorescência normalizada de DFHBI-1T (Figuras 2Di e 2Dii). Em contraste, o dobramento separado mostrou apenas um aumento de 1,04 vezes, comparável aos níveis de base observados individualmente para shu-top e shu-bottom. Tendências semelhantes foram observadas para ^{shu anti-top} e ^{shu anti-bottom} sob condições de co-folding e dobramento separado (Figuras 2Di e 2Dii). Esses resultados indicam que o dobramento separado não promove o pareamento intermolecular de bases entre shu-top e shu-bottom, ou shu^anti-top e ^{shu anti-bottom}, enquanto o co-folding intensifica essas interações, provavelmente devido às sequências repórteres inseridas.

Para testar se shu e ^{shu anti-can} base combinam, shu-top foi misturado com shu^anti-bottom, e shu^anti-top foi misturado com shu-bottom. Ambas as combinações apresentaram maior fluorescência de DFHBI-1T tanto sob co-dobramento quanto em condições de dobragem separada, em comparação com shu-top com shu-bottom ou ^{shu anti-top} com ^{shu anti-bottom} (Figuras 2Ci e 2Cii). Após a normalização, o co-dobramento do shu-top com shu^anti-bottom e shu^anti-top com shu-bottom resultou em aumentos de 61,86 e 82,60 vezes na fluorescência do DFHBI-1T, respectivamente (Figuras 2Di e 2Dii). Em contraste, o dobramento separado gerou aumentos de apenas 2,69 e 4,94 vezes, respectivamente (Figuras 2Di e 2Dii). Embora substancialmente menores do que sob condições de co-dobração, esses valores foram maiores do que os observados para shu-top com shu-bottom ou shu^anti-top com shu^anti-bottom (1,04 e 1,16, respectivamente).

Em conjunto, esses resultados indicam que repórteres que carregam sequências complementares adicionais têm maior capacidade de pares de bases do que aqueles sem tais sequências. Esse efeito é ainda mais potencializado sob a condição de co-dobramento, que promove interações intermoleculares.

Figura 1: Estruturas secundárias previstas de RNAs superior e inferior e quantificação de seu pareamento de bases intermoleculares em clusters de RNA in vitro. (A–B) Exemplos de estruturas secundárias de topo (A) e bottom (B) dobradas individualmente, conforme previsto pelo^{RNAfold 25}. Quando dobrados separadamente, o topo e a parte inferior não reconstituem o aptamero do brócolis, e DFHBI-1T (estrela cinza) produz fluorescência mínima. (C) Exemplo da estrutura secundária de RNAs superior e inferior pareados com bases, conforme previsto pelo RNAcofold²⁵. O pareamento de bases intermoleculares entre os dois RNAs reconstitui dois braços de^{brócolis 18}, permitindo a ligação do DFHBI-1T e resultando em forte fluorescência verde (estrelas verdes). (D) Imagens de DFHBI-1T sozinho (controle apenas com contraste) e clusters de RNA in vitro (magenta) formados por RNAs superior e inferior na presença de DFHBI-1T (verde). (Ei, ii) Agrupamentos de RNA in vitro (magenta) formados por RNAs superior e inferior sob condições de co-dobragem (i) e dobragem separada (ii) na presença de DFHBI-1T (verde). Nos painéis D e E, os RNAs foram marcados com Cy5 de modo que, em média, aproximadamente um terço dos RNAs contém um único uracilo marcado com Cy5, enquanto os dois terços restantes não estão marcados. As imagens representam projeções médias de Z de 27 fatias adquiridas com um passo de 150 nm, usando a mesma exposição e potência do laser para cada canal em todas as condições. A fluorescência do DFHBI-1T foi normalizada para a mesma faixa de intensidade em diferentes condições. Barras de escala: 2 μm. (F) A intensidade do DFHBI-1T foi normalizada para a abundância de RNA, medida pela fluorescência Cy5. Os dados são apresentados como média ± SEM. Valores p para teste t de duas caudas (**** vs. co-dobramento): 1,0 × 10⁻²² (apenas corante), 2,3 × 10⁻²² (topo), 4,9 × 10⁻²³ (embaixo) e 7,0 × 10⁻²³ (dobramento separado). n = 30 regiões para a condição apenas de corante e 30–31 clusters de RNA para todas as outras condições. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Imagens representativas e quantificação do pareamento de bases intermoleculares para repórteres topo e inferior de shu ^{e shu anti-portadores}. (A) Imagens do DFHBI-1T sozinho (controle apenas com corante) e clusters de RNA in vitro (magenta) formados por RNAs shu-top, shu-bottom, ^{shu anti-top} e shu^anti-bottom na presença de DFHBI-1T (verde). Os RNAs foram marcados com Cy5 de modo que, em média, três uracilos UTP-Cy5 foram incorporados durante a transcrição in vitro. As imagens representam projeções médias de Z de 27 fatias adquiridas com um passo de 150 nm, usando a mesma exposição e potência do laser para cada canal em todas as condições. A fluorescência do DFHBI-1T foi normalizada para a mesma faixa de intensidade em diferentes condições. Barras de escala: 2 μm. (B) A intensidade do DFHBI-1T foi normalizada para a abundância de RNA, medida pela fluorescência Cy5. Os dados são apresentados como média ± SEM. n.s., não significativo. Valores p para teste t bicaudal (vs. apenas corante): 3,1 × 10⁻³ (**; shu-top), 1,7 × 10⁻¹ (n.s.; shu-bottom), 2,9 × 10⁻³⁵ (***; Shu anti-top), e 2,2 × 10⁻² (; Shu^anti-bottom). n = 30 regiões para a condição apenas de corante e 30–32 clusters de RNA para todas as outras condições. (Ci, ii) Imagens de clusters de RNA in vitro (magenta) formados pela mistura de shu-top com shu-bottom, ^{shu anti-top} com shu^anti-bottom, shu-top com shu^anti-bottom, e shu^anti-top com shu-bottom na presença de DFHBI-1T (verde) sob co-dobragem (i) e dobramento separado ( ii) condições. As imagens representam projeções médias de Z de 27 fatias adquiridas com um passo de 150 nm, usando a mesma exposição e potência do laser para cada canal em todas as condições. Para a faixa baixa, a fluorescência do DFHBI-1T foi normalizada para a mesma faixa de intensidade da Figura 1D–Eii e da Figura 2A. Para a faixa alta, a fluorescência do DFHBI-1T foi normalizada para uma faixa de intensidade maior, porém consistente, em todas as condições nos painéis Ci e Cii. Barras de escala: 2 μm. (Di, ii) A intensidade do DFHBI-1T foi normalizada primeiro para a intensidade do RNA e depois para controles negativos, definidos como o sinal médio normalizado do DFHBI-1T de cada RNA isoladamente. Os dados são apresentados como média ± SEM. n.s., não significativo. (i) Valores p para teste t de duas caudas (**** vs. shu-top + shu-bottom): 1,1 × 10⁻³¹ (^{shu anti-top} + ^{shu anti-bottom}), 1,1 × 10⁻²² (shu-top + ^{shu anti-bottom}) e 4,3 × 10⁻²⁷ (^{shu anti-top} + shu-bottom). (ii) Valores p para teste t de duas caudas (vs. shu-topo + shu-bottom): 2,2 × 10⁻¹ (n.s.; shu anti-topo + shu anti-baixo), 1,9 × 10⁻9 (; shu-top + ^{shu anti-bottom}), e 1,3 × 10⁻¹⁵ (; shu anti-top + shu-bottom). n = 29–32 agrupamentos de RNA para todas as condições. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Nome	Sequências (5′-3′)
Promotor T7	TAATACGACTCACTATAG
topo	GGATGATGGAGACGGTCGGGTC CAGGATCATTCATGGCAAGAGAC GGTCGGGTCCAGATGATGCGGAT
Base	GGATCCCCCATCATCTGTCGAGTAG AGTGTGGGCTCTTGCCATGTGTAT GTGGGTCAACCCACATACTCTGAT GATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGC TCCATCATCC
Atacante top-T7	TAATACGACTCACTATAG GGATGGAGACGGTCG
top-reverso	ATCCGCATCATCTGGACCC
Atacante de baixo T7	TAATACGACTCACTATAGG GATCCGCATCATCTGTCGA
Reverso inferior	GGATGATGGAGCCCACACT
Os primers dianteiros contêm um avanço de sequência de promotores T7 (em negrito), seguido por sequências que visam a extremidade 5′ do RNA.

Tabela 1: Sequências de promotores T7, repórteres de brócolis divididos e primers usados para amplificar modelos de DNA para transcrição T7. Os primers listados foram usados para gerar moldes de DNA para transcrição in vitro dos RNAs superior e inferior , que foram posteriormente usados nos ensaios de agrupamento de RNA descritos neste estudo.

Nome	Sequências (5′-3′)
shu-top	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTTCATATTTCATTATCTTACTCAAAAAGGATGATGGAG ACGGTCGGGTCCAGGATCATTCATGGCAAGAGACGGTCGGGTCCAGATGATGCGGA TAAAAAACATACCAAACATGAAGGTAATTTAGTTCCAAGTTCTAGAAGAGCAGTATCATT AGTTATTTTTCGATATTAGCAACATGAATATCGGTAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTGT TATTTAGAGCAACGTAGACCTTAAGTTGTTAAAAAACCACAATAAAGTAATGCACGGCAGCTACAT
Shu-bottom	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTTCATATTTCATCATCATCATCTAAAAGGATCCCCGCATCATC TGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCTTGCCATGTGTGTGTGTCAACCCACATCTCTG ATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCATCATCATCCAAAAAAACATACCAAACATGAAGGTAAT TTAGTTCCAAGTTCTAGAAGAGCAGTATCATTATTATTTTTTGATATTAGCAACATGAATATCG TAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTTTTATTTAGAGCAACGTAGACGTAGACCTTAAGTTTTTAA AAACCACAATAAAAGTAATGCACGGCAGCTACAT
ShuAnti-Top	ATGTAGCTGCCCCGTGCATTATTATTGTGGTTTTTAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTAA ATAACAAAAAACGTTAACATTCGTCTCTGGGCTTACGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATAAC TAATGATACTGCTCTTCTAGAACTTGGAACTAATTTTTTCATGTTTGGTATGTTTTTTTTTGGA TGATGGAGACGGTCGGGTCCAGGATCATTCATGGCAAGAGACGGTCGGGTCCAGATGAT GCGGATTTTTTGAGTAAGATATGAAATATGAAATATGGGGCTTCTTAGTAAGC
ShuAnti-Bottom	ATGTAGCTGCCGTGTGTCATTATTATTGTGGTTTTTAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTA AATAACAAAAAACGTTAACATTCGTCTCTGGGCTTACGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATA ACTAATGATACTGCTCTTCTAGAACTTGGAACTAATTTTCATGTTTGGTATGTTTTTTTT GGATCCGCCATCATCTGTCGAGTAGTGTGTGGGCTCTTGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTCAAC CCACATACTCTGATGATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCATCATCCTTTTTTTGAGTAA GATATGAAAATATGAAATACTGGGGCTTCTTAGTAAGC
shu-top ou shu-bottom-T7 atacante	TAATACGACTCACTATAGGGCTTACTAAGAAGCCCCAGT
shu-top ou shu-bottom-Reverso	ATGTAGCTGCGTGCATTAC
shuanti-top ou shu anti-bottom-T7 forward	TAATACGACTCACTATAGGGATGTAGCTGCCGTGCATTA
Shuanti-topo ou shuanti-bottom-Reverso	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTA
Os primers dianteiros contêm um avanço de sequência de promotores T7 (em negrito), seguido por sequências que visam a extremidade 5′ do RNA. Um ou dois Gs adicionais foram incluídos entre o promotor T7 e shu-top e shu-bottom oushu anti-top e shuanti-bottom, respectivamente. Isso porque ter Gs nas posições +2 e +3 pode aumentar significativamente o rendimento detranscrição 19. No entanto, esses G adicionais podem potencialmente afetar a interpretação do pareamento de bases nas construções projetadas. Veja a nota no passo 1.1.

Tabela 2: Sequências de shu-top, shu-bottom, ^shu anti-top, ^{shu anti-bottom} e primers usados para amplificar moldes de DNA para transcrição T7. Os primers listados foram usados para gerar moldes de DNA para transcrição in vitro de anti-RNAs shu e shu portando os repórteres superior e inferior, que foram posteriormente usados nos ensaios de agrupamento de RNA descritos neste estudo.

Discussion

Neste estudo, o sistema de aptamers de brócolis^{dividido 18} foi adaptado para visualização direta e quantificação do pareamento intermolecular de bases sob condições in vitro de clustering de RNA. Essa abordagem permite a avaliação do pareamento intermolecular de bases em diferentes condições in vitro e complementa ensaios bioquímicos posteriores, como experimentos de RNA pull-down usando pareadores cruzados de^{bases 15,16,17} e eletroforese^{em gel 4,6,7}. Diferentemente desses métodos bioquímicos, que não possuem resolução espacial para distinguir o pareamento de bases dentro dos aglomerados de RNA daquele que ocorre fora deles, essa abordagem permite a visualização espacial direta dessas interações dentro dos aglomerados. Especificamente, permite o monitoramento do pareamento de bases entre RNAs superiores e inferiores, ou RNAs que carregam esses repórteres, sob condições definidas de agrupamento de RNA. Além disso, fornece uma leitura quantitativa em tempo real do pareamento de bases entre RNAs repórteres sem exigir reticulação ou extração de RNA, minimizando assim a perda de amostras e a incompatibilidade do buffer.

Usando microscopia de fluorescência, o pareamento de bases intermoleculares entre as sequências de aptámeros de Brócolis divididos foi medido quantitativamente por meio do sinal DFHBI-1T, demonstrando compatibilidade do DFHBI-1T com o protocolo de clustering de RNA in vitro . A extensão do pareamento de bases intermoleculares variou dependendo das condições de dobramento do RNA, conforme observado sob condições de co-dobragem e dobramento separado (Figura 1F e Figura 2Di–2Dii). Esses achados indicam que as condições de dobramento do RNA influenciam criticamente as interações intermoleculares do RNA e devem ser cuidadosamente consideradas ao interpretar os resultados experimentais.

Esse ensaio também oferece uma plataforma para avaliar se sequências que flanqueiam os repórteres superior e inferior aprimoram o pareamento de bases intermoleculares, como demonstrado usando shu. A fluorescência do DFHBI-1T foi maior para shu-top com ^{shu anti-bottom} e shu^anti-top com shu-bottom do que para shu-top com shu-bottom ou ^{shu anti-top} com shu^anti-bottom, indicando interações intermoleculares envolvendo shu e ^{shu anti} aprimorar ainda mais o sinal Brócolis. Essas observações sugerem que o sinal de fluorescência DFHBI-1T obtido apenas pelo co-dobramento dos repórteres superior e inferior não representa o limite superior do ensaio.

A fluorescência DFHBI-1T medida nesses experimentos abrangeu uma ampla faixa dinâmica, de um aumento de 1,04 vezes (shu-top com shu-bottom sob dobramento separado) até um aumento de 82,60 vezes (^{shu anti-top} com shu-bottom sob condições de co-dobramento). Essa faixa dinâmica permite a detecção de diferenças nas interações intermoleculares de RNA entre RNAs que carregam esses repórteres.

Várias etapas desse protocolo são críticas para a detecção bem-sucedida do pareamento de bases de RNA intermolecular entre RNAs superiores e inferiores divididos de Brócolis em clusters de RNA. Alíquotas frescas de PEG 8000 devem ser usadas para induzir o agrupamento de RNA de forma confiável, e ciclos repetidos de congelamento-descongelamento devem ser minimizados devido à instabilidade do reagente. O DFHBI-1T deve ser aliquotado e armazenado a −20 °C para preservar as propriedades de fluorescência. Os produtos de transcrição in vitro devem ser analisados em um gel de RNA desnaturante antes do agrupamento para confirmar o tamanho correto do transcrito. Além disso, manter condições livres de RNase, incluindo um ambiente de trabalho limpo e uma câmara de imagem, é essencial porque as gotículas de RNA são incubadas em temperatura ambiente por longos períodos antes da imagem.

Uma limitação deste ensaio é que o DFHBI-1T relata especificamente o pareamento de bases intermoleculares mediado pelas sequências superior e inferior . Outros eventos de pareamento de bases intermoleculares que ocorrem em diferentes regiões de RNA não podem ser detectados. Além disso, a estrutura de brócolis formada pelo pareamento de bases entre as fitas superior e inferior é termodinamicamente^{estável 26} e pode não refletir totalmente interações mais fracas ou transitórias, como aquelas formadas por bases espalhadas expostas à superfície, como observado nos clusters de mRNA germinativo de Drosophila ⁴.

Além disso, as interações intermoleculares RNA–RNA podem ser promíscuas e inespecíficas, e sequências que flanqueiam os repórteres superior e inferior podem influenciar a fluorescência do DFHBI-1T. Essas regiões laterais podem interagir diretamente com as sequências repórteres, inibindo a formação de brócolis ou alterando a estrutura do RNA, afetando assim as interações entre os RNAs que transportam os repórteres. Assim, o ensaio reflete os efeitos combinados da estrutura do RNA, do pareamento de bases top–bottom , das interações entre sequências flanqueadoras e das interações entre as sequências flanqueadoras e os repórteres.

Esse ensaio oferece oportunidades para investigações futuras. Por exemplo, alterar sequências de RNA ao lado dos repórteres, introduzir helicases de RNA ou chaperonas, ou modificar as condições do sal pode influenciar o pareamento de bases intermoleculares em clusters de RNA. Tais efeitos podem ser avaliados medindo o sinal DFHBI-1T sob condições de co-folding e separação. Considerando que aptâmeros de RNA semelhantes foram usados em células, bactérias e^leveduras 26,27,28,29,30, essa abordagem pode ser estendida para sistemas celulológicos ou organismos modelo para examinar o pareamento intermolecular de bases em clusters de mRNA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1M MgCl2	Millipore Sigma	M1028	Usado para preparação de 10 vezes; Buffer de refolding de RNA.
2M KCl	Thermo Fisher Scientific	AM9640G	Usado para preparação de 10 vezes; Buffer de refolding de RNA.
50% PEG 8000	NEB	M0204S	Componente do kit de ligase de RNA T4; usado como reagente de aglomeração molecular para induzir clusterização de RNA.
Etanol absoluto, 200 proof	Thermo Fisher Scientific	T038181000CS	Usado para preparação do tampão de lavagem de RNA.
Ácido fenol:clorofórmio, pH 4,5 (com IAA, 125:24:1)	Thermo Fisher Scientific	AM9722	Usado para purificação de RNA.
Aminoalil-UTP-Cy5	Jena Biociência	NU-821-CY5	Usado para marcação de RNA durante transcrição in vitro.
Vidro coberto com câmara	Thermo Fisher Scientific	155409PK	Câmara de imagem para reações de clustering de RNA.
Clorofórmio	Thermo Fisher Scientific	C298-500	Usado para purificação de RNA.
DFHBI-1T	Lucerna	410	Usado como fluoróforo para detecção de aptamers de RNA de brócolis.
DMSO	Thermo Fisher Scientific	D12345	anidro; grau em biologia molecular; usado para preparação do DFHBI-1T.
DNA Limpo & Kit de Concentrador	Zymo	D4014	Usado para limpeza de produtos de DNA antes da transcrição do T7.
Kit de Extração de Gel de DNA	NEB	T1020L	Usado para extração de gel.
Banho seco	Benchmark Scientific	BSH1001	Usado para aquecer amostras de RNA em tubos de microcentrífuga.
FIJI/ImageJ	NIH (Institutos Nacionais de Saúde)	N/A	software de análise de imagens de código aberto; usado para quantificação da intensidade de fluorescência e análise de ROI.
Sistema de eletroforese em gel	Thermo Fisher Scientific	B2-BP	Usado para eletroforese em gel de DNA.
Corante de carga em gel, roxo (6 vezes)	NEB	B7024S	Usado como corante de carga para eletroforese em gel de DNA.
Microscópio de iluminação estruturada instantânea	VisiTech internacional	VT-iSIM	Um microscópio confocal capaz de obter imagens de fluorescência GFP e Cy5.
Isopropanol	Thermo Fisher Scientific	327272500	Usado para purificação de RNA.
Kit de Transcrição MEGAscript T7	Thermo Fisher Scientific	AM1334	Usado para transcrição in vitro de T7. O kit inclui soluções de nucleotídeos (ATP, CTP, GTP, UTP) e DNase.
Tubos microcentrífugas	Genesee Scientific	22-284	Tubo de 1,5mL; usado para armazenar moldes de DNA para transcrição in vitro, produtos de RNA e alíquotas de espertina e DFHBI-1T.
Mini centrífuga	Benchmark Scientific	Z763845	Usado para centrifugação breve.
Espectrofotômetro Nanodrop One	Thermo Fisher Scientific	13-400-518	Espectrofotômetro de microvolume para medir a concentração e qualidade de DNA e RNA.
Água livre de nucleases	Thermo Fisher Scientific	AM9937	Usado para ressistência de pellets de RNA, preparação de lavagem de RNA e tampões de redobramento, e diluição de espertina e DFHBI-1T.
Calculadora online de massa molar	Biolaboratórios da Nova Inglaterra (NEB)	N/A	Ferramenta online usada para calcular a massa de RNA a partir da quantidade molar (por exemplo, pmol).
Tubos de PCR de polipropileno	Corning	3745	200 & mu; Tubos L PCR usados para PCR, transcrição in vitro e reações de clustering de RNA
Fonte de Alimentação Básica PowerPac	Bio-rad	1645050	Usado para eletroforese em gel de DNA.
Ciclador térmico Proflex PCR	Thermo Fisher Scientific	44-840-73	Usado para PCR, transcrição in vitro e aquecimento de amostras de RNA em tubos de PCR.
Q5 Alta Fidelidade 2 vezes; Master Mix	NEB	M0492S	Usado como 2 vezes; Mix Master de alta fidelidade.
Centrífuga refrigerada	Eppendorf	5424R	Usado para purificação e pelletagem de RNA.
Solução de Descontaminação de RNase	Thermo Fisher Scientific	AM9782	Usado para limpar bancadas e superfícies de laboratório para minimizar a contaminação por RNase.
Espermina  tetrahidrocloreto	Sigma-Aldrich	S1141-1G	Usado para induzir clustering de RNA.
Tris Base	Millipore Sigma	T1503-1KG	Usado para preparação do tampão Tris (pH 7,0).
Agarose ultrapura	Thermo Fisher Scientific	16500500	Usado para eletroforese em gel de DNA.