Emulsão lipídica à base de azeite de oliva melhora a miocardite induzida por inibidor de checkpoint imunológico por meio da inibição da via NF-κB/NLRP3/IL-1β

Resumo

Emulsões lipídicas à base de azeite mitigam a miocardite induzida por inibidores de checkpoint imunológicos ao direcionar a via NF-κB/NLRP3/IL-1β, demonstrando seu potencial para suprimir cascatas inflamatórias. Esses achados destacam seu potencial como terapia complementar para lesão cardíaca relacionada ao sistema imunológico.

Resumo

O presente estudo teve como objetivo investigar a eficácia terapêutica e o mecanismo subjacente das emulsões lipídicas à base de azeite de oliva (OOLE) na mitigação da miocardite induzida por inibidores de checkpoint imunológico (ICI) desencadeadas pelo ipilimumabe (IPI) e pelo nivolumabe (NIVO). Um modelo in vitro de cardiomiócitos inflamatórios foi estabelecido ao co-cultivar células HL-1 com células T CD4⁺/CD8⁺ isoladas de camundongos tratados com ICI. As células foram tratadas com 10% de OOLE, seguidas por citometria de fluxo para apoptose, ELISA para perfil de citocinas (TNF-α, IL-1β, IL-6) e Western blot/qPCR para análise de vias (NF-κB, NLRP3, IL-1β). In vivo, a miocardite foi induzida em camundongos por administração de IPI/NIVO (IPI/NIVO ). A função cardíaca foi avaliada por meio de ecocardiografia, e marcadores inflamatórios foram avaliados no tecido sérico e miocárdico. Os resultados mostraram que a OOLE reduziu significativamente a apoptose induzida por células T e suprimiu a produção de citocinas inflamatórias nas células HL-1, enquanto a expressão de NF-κB, NLRP3 e IL-1β foi regulada para baixo. In vivo, a OOLE melhorou os parâmetros funcionais do ventrículo esquerdo e atenuou a inflamação sistêmica. Análises moleculares confirmaram que esses efeitos protetores foram mediados pela inibição do eixo de sinalização NF-κB/NLRP3/IL-1β. Em conclusão, a OOLE mitiga a miocardite aguda induzida por ICI ao direcionar a via NF-κB/NLRP3/IL-1β, demonstrando seu potencial para suprimir cascatas inflamatórias precoces e fornecer rápida cardioproteção. Esses achados destacam seu potencial como terapia complementar para lesão cardíaca relacionada ao sistema imunológico.

Introdução

Inibidores de checkpoint imunológico (ICIs), como aqueles que visam a morte celular programada 1 (PD-1) e a proteína citotóxica associada a linfócitos T 4 (CTLA-4), revolucionaram o cenário do tratamento para várias malignidades. No entanto, a ampla aplicação clínica das ICI é frequentemente complicada por eventos adversos relacionados ao sistema imunológico (IRAEs). Entre elas, a miocardite induzida por ICI é uma complicação rara, porém potencialmente fatal, caracterizada por um curso clínico rápido e altas taxas de mortalidade variando de 25% a 50%^1,2. Apesar da gravidade, as opções terapêuticas atuais para miocardite induzida por ICI permanecem em grande parte limitadas a corticosteroides em alta dose e imunossupressores^{não específicos 3,4}. Essas intervenções tradicionais frequentemente produzem respostas subótimas e podem comprometer a eficácia antitumoral das^{ICI 1}, criando uma lacuna crítica de conhecimento na busca por estratégias cardioprotetoras mais seguras e direcionadas que possam mitigar a inflamação cardíaca sem imunossupressão sistêmica.

O inflamassoma da proteína receptor semelhante ao NOD 3 (NLRP3), ativado pela via de sinalização NF-κB, emergiu como um dos principais impulsionadores da tempestade de citocinas observada na miocardite^{induzida por ICI 5,6}. A produção excessiva de citocinas pró-inflamatórias, particularmente IL-1β e IL-6, leva a lesão cardíaca profunda e insuficiência cardíaca⁷. Embora várias intervenções à base de lipídios tenham sido exploradas em doenças cardiovasculares, o potencial das emulsões lipídicas à base de azeite de oliva (OOLE) nesse contexto específico permanece inexplorado. O OOLE é rico em ácido oleico, um ácido graxo monoinsaturado conhecido por sua capacidade única de modular a fluidez da membrana e suprimir cascatas^{inflamatórias 8,9}. No entanto, ainda não foi estabelecido se a OOLE pode melhorar especificamente o estado hiper-inflamatório característico da miocardite induzida por ICI.

Neste estudo, pretendemos preencher essa lacuna investigando o potencial terapêutico da OOLE. Hipotetizamos que a OOLE exerce um efeito cardioprotetor potente ao inibir o eixo de sinalização NF-κB/NLRP3/IL-1β, suprimindo assim o surto inflamatório e preservando a função cardíaca. Ao combinar um modelo de co-cultura in vitro de cardiomiócitos HL-1 e células T com um modelo murino in vivo . de miocardite induzida por ICI, demonstramos que a intervenção OOLE proporciona uma rápida recuperação funcional e mitiga a lesão do miocárdio. Este estudo fornece as primeiras evidências para a OOLE como uma abordagem farmacológica nutricional inovadora e direcionada para o manejo da cardiotoxicidade relacionada à ICI.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Guangzhou Miles Biotechnology Co., Ltd., com o número de aprovação IACUC-MIS2023076. A empresa mencionada é um centro de experimentação animal; Nossos experimentos com animais são realizados aqui e, portanto, estão sujeitos à revisão do Comitê de Ética do Centro.

Animais e desenho experimental
Trinta camundongos BALB/c (machos, 8 semanas, pesando 22 ± 2 g) foram comprados comercialmente. Critérios de indução e validação do modelo: Um modelo de miocardite induzida por inibidor de checkpoint imunológico (ICI) foi estabelecido por injeção intravenosa de ipilimumabe (5 mg/kg) e nivolumabe (10 mg/kg) por 2 semanas consecutivas. A dosagem ocorreu a cada 3 dias, totalizando uma duração de modelagem de 2 semanas. Esse protocolo já foi demonstrado induzir lesão cardíaca imunomediada significativa¹⁰. Às 24 horas após a injeção final, amostras de sangue foram coletadas pelo plexo retroorbital e centrifugadas a 300 x g por 15 minutos a 4 °C para isolar o soro; subsequentemente, os níveis séricos de cTnT foram quantificados usando um kit ELISA específico, envolvendo etapas sequenciais de carregamento de amostras, incubação de anticorpos conjugados com HRP, lavagem automática e reação do cromógeno TMB, com a densidade óptica medida em 450 nm para calcular concentrações com base em uma curva logística de quatro parâmetros, e uma concentração de cTnT ≥10 ng/mL foi considerada um estabelecimento bem-sucedido do modelo.

Seis camundongos modelo com peso corporal e concentração de cTnT mais próximos foram divididos aleatoriamente em dois grupos: um grupo controle e um grupo de tratamento (n=3 para ambos, replicação biológica). O grupo controle recebeu injeções intravenosas diárias de soro fisiológico normal na dose de 5 mL/kg. O grupo de tratamento recebeu injeções intravenosas diárias de emulsão lipídica à base de azeite de oliva (OOLE) a 5% em uma dose de 5 mL/kg pela veia caudal por 6 dias (essa representa a dosagem que utilizamos para tratamento clínico em nossa instituição; foi extrapolada para uso em camundongos com base nas razões de área de superfície corporal). Os seguintes exames foram realizados em uma janela de observação de 6 dias: a função cardíaca foi avaliada no início (dia 0) e após o tratamento (dia 6) utilizando um sistema de imagem fotoacústica por ultrassom. O sangue foi coletado pela veia retroorbital no dia 6, e as citocinas séricas foram quantificadas pelo ELISA. Após a eutanasia dos animais com uma overdose de anestesia, o tecido cardíaco foi congelado rapidamente para análise de proteínas.

Isolamento de células T
Os camundongos do grupo controle foram eutanasiados com uma overdose de anestesia. Os baços foram excisados assépticamente após uma esterilização superficial de 5 minutos com etanol de 75%, e todos os tecidos conjuntivos foram removidos. Os baços foram dissociados mecanicamente usando um filtro de células de 70 μm com PBS suplementado com 2% de FBS para criar uma suspensão de célula única. Essa suspensão foi então centrifugada a 300 x g ., 4 °C por 5 minutos, e os eritrócitos foram lisados com 1 mL de Buffer de Lisagem ACK por 2 minutos em temperatura ambiente. O processo de lise foi interrompido por lavagem com PBS. As células T foram enriquecidas negativamente para evitar a ativação usando um kit de isolamento de células T de camundongo. Para cada 10 milhões de células, 50 μL de coquetel de seleção foram adicionados e incubados em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, foi adicionada 75 μL de esferas magnéticas de estreptavidina por 10 milhões de células, com incubação de 5 minutos. Células ligadas à esfera foram retidas usando um ímã por 3 minutos, e as células T enriquecidas (com mais de 94% de pureza) foram coletadas do sobrenadante. Para separar os subconjuntos CD4⁺ e CD8⁺, as células enriquecidas foram coradas com anticorpos anti-CD3ε-PE, anti-CD4-APC e anti-CD8-FITC por 15 minutos no escuro, depois lavadas 3 vezes com PBS pré-resfriado. A separação foi realizada em um citômetro de fluxo usando a seguinte estratégia de gate: linfócitos (FSC/SSC), depois CD3⁺, depois CD4⁺ ou CD8⁺. As células foram separadas em modo Pureza em tubos de coleta pré-preenchidos com 200 μL de PBS, resultando em subconjuntos-alvo com pureza superior a 98%.

Construção e tratamento do modelo celular de miocardite
As células HL-1 foram cultivadas em meio DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina (PS) sob condições padrão (37 °C, 5% CO₂). As células foram divididas em três grupos: grupo controle (não tratado), grupo modelo (células HL-1 tratadas com células T CD4+/CD8+ por 24 horas) e grupo OOLE (grupo modelo co-tratado com 10% de OOLE por 24 horas).

ELISA para detecção sérica de proteínas relacionadas a lesão do miocárdio
Incube 50 μL da amostra de soro nos poços de microplacas ricos em anticorpos pré-revestidos do kit por 30 minutos, depois lave três vezes com PBST para remover os componentes não ligados. Adicione a solução preparada de avidina marcada com peroxidase de raiz-forte (HRP) para uma segunda incubação. Lave três vezes novamente com PBST, adicione 100 μL de substrato 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) para iniciar a reação colorimétrica e termine a reação com 100 μL de solução de parada dentro de 30–45 minutos após o início. Meça a absorvância (OD) a 450 nm usando um leitor de microplacas e quantifique a concentração do analito-alvo usando uma curva padrão plotada com padrões de referência conhecidos.

Western blot
Os tecidos cardíacos foram pulverizados usando um homogeneizador de tecidos com nitrogênio líquido. Posteriormente, amostras de tecido e celulares foram lisadas em 200 μL de tampão RIPA sobre gelo por 30 minutos. Os lisados foram centrifugados a 12.000 x g por 15 minutos a 4 °C para coletar supernadantes proteicos. As concentrações de proteína foram determinadas usando um kit de ensaio de proteínas BCA. Após ajustar a concentração de proteína para 5 μg/μL, as amostras foram misturadas com tampão de carga de 5× e desnaturadas por aquecimento a 95 °C por 10 minutos. As proteínas foram separadas em géis SDS-PAGE de 10% (administradas a 100 V por 90 minutos) e posteriormente transferidas para as membranas PVDF por meio de eletroblotting semi-seco a 15 V por 30 minutos. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% e depois sondadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários (incluindo IL-1β, NLRP3, MyD88, NF-κB p65 e Tubulina; diluição 1:1.000)². Após lavar as membranas três vezes por 10 minutos cada com soro salino tampado com Tris contendo 0,1% de Tween 20 (TBST), foram incubados com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de raiz-forte (HRP) (diluição 1:10.000) por 1 hora em temperatura ambiente. As bandas proteicas foram visualizadas aplicando um substrato de quimiluminescência (ECL) aprimorada, e os sinais foram capturados usando um sistema de imagem por quimiluminescência. Por fim, os níveis relativos de expressão foram analisados quantitativamente normalizando os valores densitométricos das bandas proteicas alvo para o controle interno da Tubulina usando o software ImageJ.

Ensaio de apoptose celular por citometria de fluxo
As células HL-1 foram lavadas 2x com soro salino tamponado com fosfato (PBS). Para dissociação celular, 1 mL de tripsina foi adicionado e incubado por 1 minuto, seguido imediatamente pela neutralização com 2 mL de meio de cultivo completo. A suspensão da célula era então centrifugada a 250 x g por 5 minutos a 4 °C, e o sobrenadante era descartado. A pastilha coletada foi lavada duas vezes com PBS gelado e ressuspensa em 1x tampão de ligação para alcançar uma densidade celular de 1x^{6 células} /mL. Uma alíquota de 100 μL dessa suspensão celular foi transferida para um tubo de citometria de fluxo, seguida pela adição de 5 μL de FITC-Anexina V e 5 μL de iodeto de prodídio (PI). Após um leve vórtice, a mistura foi incubada por 15 minutos em temperatura ambiente (25 °C) no escuro. Finalmente, 400 μL de 1 x binding buffer foram adicionados a cada tubo, e a apoptose celular foi posteriormente analisada usando um citometro de fluxo. Para a estratégia de gate, os eventos foram primeiro direcionados para dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC) para excluir detritos subcelulares e isolar a população intacta de células HL-1. Dentro desse portão primário, as células apoptóticas foram quantificadas por análise de quadrantes, com células apoptóticas iniciais definidas como FITC-Anexina V⁺/PI⁻ e células apoptóticas tardias definidas como FITC-Anexina V⁺/PI⁺.

Análise estatística
Cada experimento foi realizado em triplicado, e a análise estatística foi realizada usando software estatístico. As diferenças entre dois grupos foram analisadas usando o teste t de amostras independentes; as diferenças entre três ou mais grupos foram analisadas usando ANOVA unidirecional, seguida pelo teste pós-hoc de Bonferroni. Os dados são expressos como média ± erro padrão (SEM). p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

A combinação de ipilimumabe e Novolumab induz miocardite induzida por ICI em um modelo animal
Para estabelecer um modelo de miocardite induzida por ICI, camundongos BALB/c receberam injeções intravenosas de ipilimumabe (5 mg/kg) e nivolumabe (10 mg/kg) pela veia caudal. Os níveis séricos de troponina T cardíaca (cTnT) foram posteriormente medidos usando um ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA). Um nível de cTnT ≥ 10 ng/mL foi definido como o limiar para a ind...

Discussão

Neste estudo, demonstramos pela primeira vez que as emulsões lipídicas à base de azeite de oliva (OOLE) atenuam efetivamente a miocardite induzida por inibidores de checkpoint imunológico (ICI) ao suprimir a via de sinalização IL-1β/NLRP3/NF-κB. Nossos resultados fornecem evidências tanto mecanicistas quanto funcionais de que a OOLE não apenas melhora a função cardíaca, mas também alivia a inflamação do miocárdio tanto in vivo quanto in vitro. modelos de miocardite indu...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Membranas PVDF de 0,22	Millipore	ISEQ00010
4% de paraformaldeído	Guangzhou Jadeite Biotechnology Co., Ltd.	BL539A
Camundongos BALB/c	Guangdong Zhiyuan Biomedicine Technology Co., Ltd.
Kit de ensaio BCA	Dingguo Biotech	BCA02
Microscopia de campo claro	MSHOT	ml31
Kit cTnT elisa	lunchangshuobiotech	ED-28107
Aparelho de eletroforese	WIX	miniPro4
Sistema Totalmente Automatizado de Análise de Imagens por Quimioluminescência	FUJIFILM	LAS-3000
kit de hematoxilina-eosina & nbsp;	Guangzhou Jadeite Biotechnology Co., Ltd.	BL2236A
IFN-&gama; Kits ELISA	Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, China).	ED-10284
IL-1 e beta; anticorpo	Afinidade	BF8021
IL-1 e beta; Kits ELISA	Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, China).	ED-10351
Kits IL-6 ELISA	Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, China).	ED-10377
Software ImageJ 1.54	NIH
Ipilimumab	MCE	CAS: 477202-00-9
Anticorpo MyD88	Afinidade	AF5195
NF-κ Anticorpo B p65	Afinidade	BF8005
nivolumabe	MCE	CAS: 946414-94-4
Anticorpo NLRP3	Afinidade	BF8029
Emulsão lipídica à base de azeite de oliva	Departamento de Nutrição do Hospital de Câncer Fuda de Guangzhou
Aparelho de filme rotativo semi-seco rápido	Bio-Rad	788BR04132
Sistema quantitativo qPCR de fluorescência em tempo real	YARUI	MA-6000
Buffer de lise RIPA	Beyotime	P0013B
Microtomo rotativo	Leica	RM2235
Géis SDS-PAGE	Beyotime	P0052A, P0053A
Kit de Detecção de Apoptose Annexin V-FITC/PI	Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd.	MA0220-1
o Kit de Isolamento de Células T EasySep CD4>< Mouse CD4+	Stemcell	19765
A linha celular de cardiomiócitos de rato HL-1	Guangzhou All-perfect Biotechnology Co., Ltd.	TCM-C783
TNF-&alfa; Kits ELISA	Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, China).	ED-11776
Sistema de Imagem Fotoacústica por Ultrassom	Fujifilm VisualSonics	VEvo3100
Sistema de testes urodinâmicos	Techman	BL-420