Um Protocolo Simplificado para Microscopia de Localização de Molécula Única em Núcleos de Arabidopsis

Summary

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho eficiente para microscopia de localização de molécula única em núcleos isolados de Arabidopsis, utilizando isolamento, fixação e marcagem otimizados para alcançar visualização confiável em nanoescala da cromatina e da RNA Polimerase II. Essa abordagem pode ser facilmente adaptada a outras proteínas associadas à cromatina ou modificações de histonas para imagens de alta resolução.

Abstract

Embora a microscopia de fluorescência confocal tenha fornecido insights valiosos sobre a organização da cromatina em núcleos de plantas, sua resolução limitada por difração limita a investigação da arquitetura da cromatina, motivando o uso de técnicas de superresolução como a Microscopia de Localização de Molécula Única (SMLM). Entre essas abordagens, a microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM) fornece resolução em escala nanométrica em células individuais, permitindo visualização precisa de domínios de cromatina, modificações de histonas e organização nuclear. Embora tais métodos sejam cada vez mais aplicados em sistemas de mamíferos, seu uso na biologia vegetal permanece limitado, em grande parte devido a desafios técnicos na preparação da amostra.

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho simplificado e reprodutível para a imagem SMLM de núcleos isolados de Arabidopsis thaliana. Esse protocolo começa com a fixação das mudas para preservar a morfologia nuclear, seguida por corte suave de tecido e centrifugação para enriquecer núcleos intactos. Núcleos isolados são então marcados por fluoróforos em meio líquido e imobilizados em almofadas de agarose de baixa fusão, uma estratégia que aumenta a estabilidade durante sessões prolongadas de imagem com molécula única. Essas etapas minimizam coletivamente a fluorescência de fundo, melhoram a consistência da marcagem e aumentam a reprodutibilidade entre réplicas biológicas.

As preparações resultantes proporcionam maior clareza para visualizar modificações da cromatina e arquitetura nuclear em plantas. Ao reduzir as barreiras técnicas para implementar a imagem SMLM em Arabidopsis, esse protocolo oferece um meio versátil para investigar regulação epigenética, organização da cromatina e variações topológicas nucleares em escala nanométrica. Este trabalho estabelece uma base metodológica para aplicar o SMLM às plantas, aproximando a biologia celular dos mamíferos e abrindo novas oportunidades para estudar como a arquitetura nuclear contribui para a regulação do genoma em resposta a pistas de desenvolvimento e ambientais em sistemas vegetais.

Introduction

A microscopia há muito tempo é uma pedra angular para o estudo da organização da cromatina e da arquitetura nuclear, revelando como o DNA e as proteínas associadas à histona se organizam no espaço nuclear 3D e influenciam a regulação^{gênica 1,2}. A microscopia de fluorescência convencional forneceu insights valiosos sobre domínios de cromatina em grande escala, como territórios cromossômicos, cromocentros e corpos^{nucleares 3,4}, viáveis in situ, em particular em tecidos radiculares de^plantas

Protocol

NOTA: As informações detalhadas sobre os materiais e instrumentos utilizados neste protocolo estão disponíveis na Tabela de Materiais. A menos que especificado de outra forma, os tampões são liberados em filtros apirogênicos de 0,2 μm. O H₂O ultra-puro duplamente destilado (_{ddH 2}O) é utilizado durante todo esse protocolo. As etapas de centrifugação são realizadas em microtubos de 1,5 mL usando um rotor de ângulo fixo.

1. Fixação das mudas e liberação dos núcleos

1. Coloque uma placa de cultura de 6 poços sobre gelo sob a exaustor, depois adici....

Results

O protocolo descrito acima permite a preparação de núcleos de alta qualidade de Arabidopsis thaliana adequados para SMLM. Foram realizadas várias rodadas de otimização para melhorar a integridade nuclear e reduzir detritos citoplasmáticos e celulares que comprometem a qualidade da imagem. Após cada etapa de otimização, a qualidade das preparações nucleares era avaliada por imagem confocal usando um microscópio Olympus IX81 de disco giratório antes de prosseguir para a aquisição .......

Discussion

A preparação dos núcleos de Arabidopsis thaliana para microscopia de localização de molécula única (SMLM) requer várias etapas críticas que influenciam fortemente a qualidade final da amostra. Como descrito anteriormente^{, 19,35}, um corte de tecido completo e consistente é essencial para maximizar a recuperação dos núcleos intactos. O uso de lâminas de micrótomo em vez de lâminas padrão produz uma fragmentação de tecido m.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorpo anti-RNA polimerase II CTD repetido YSPTSPS (fosfo S2)	Abcam	AB5095	Anticorpo primário usado com diluição 1/200 em tampão imunocolorante para visualizar a forma ativa da polimerase (anticorpo policlonal elevado em coelho)
Software de aquisição	Abbelight	NEO LiveImaging v2.18
Albumina Sérica Bovina	Sigma-Aldrich	A7906
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
Agarose de Baixa Fusão Certificada	Bio-Rad	1613111
Cobertura de espessura de 1,5H de redondo	Marienfeld	117640	Ø: 24 mm
D-(+)-glicose, anidro, 99%	Termo Científica	A16828-36
Espelho dicróico	Semrock	Di03-R405/488/561/635-t1	Espelho dicróico para separação excitação/emissão
Dulbecco' s Soro Tamponado com Fosfato 10 & agudo;	BioWest	X0515 - 500	Trabalho em condições estéreis
Lâminas Epredia Ultra Descartáveis para Microtomos	FisherScientific	12191830	Perfil baixo, uso único
Placa de Cultura Celular Multipoço Transparente de 6 Poços Transparente e Fundo Plano TC, com tampa	Falcon	353046
Solução de formaldeído 37%	Carl Roth	7398	Trabalho sob a exaustão
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Glicerol	VWR	24388.295
Anti-IgG Anti-Coelho de Cabra (H+L) Anticorpo Secundário Altamente Adsorvido Cruzado, Alexa Fluor Plus 647	Termo Científica	A32733TR	Usado em 1/200 como anticorpo secundário acoplado ao AF647
Solução Hoechst 33258	Sigma-Aldrich	94403	Usado a 1/500 para contra-tingir o DNA, adicionado ao pad de agarose
Solução de ácido clorídrico	Laboratório de Química	CL05.0311.1000
JF549-Hoechst	Laboratório Lavis e equipe de Química Aberta (Janelia)	JF549-Hoechst	Usado para contra-colorir DNA, adicionado ao pad de agarose em concentração final de 1,5 nM
Conjunto de moedor de tecido KIMBLE Dounce	Sigma-Aldrich	D8938	Tubo de 2 mL com pilões de folga tanto grandes (0,0030-0,0050 polegadas) quanto pequenos (0,0005-0,0025 polegadas)
Unidade de lasers	Oxxius	L6Cc	Equipado com seis lasers: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW e 730 nm - 30 mW
Cloreto de magnésio hexahidratado	Carl Roth	HN03
Mercaptoetilamina (MEA)	Sigma-Aldrich	30070
MOPS sal de sódio 98%	Fisher Scientific SAS	352590010
Filtro de emissão multibanda	Semrock	FF01-446/523/600/677	Filtragem por emissão multibanda para bloquear luz de dispersão a laser
Nanodiamantes	Adamas Nanotecnologias	NDNV100nmHiWGA2ml	Estoque 1 mg/mL
Câmera CMOS Digital ORCA-Fusion	Hamamatsu	C14440-20UP
Placa de Petri, 100/20 mm, PS, transparente, com ventilação, estéril	Greiner Bio-One	664161	Usado para cultivar plantas em meio MS
Placa de Petri, quadrada, PS, transparente, 120/120/17 mm, estéril	Greiner Bio-One	688161	Usado ao cortar as mudas das plantas
pluriStrainer Mini filtro de célula	pluriSelect	43-10030-50	Tamanho da malha 30 & micro; m, adequado para tubo Eppendorf de 1,5 mL
Cloreto de potássio	Sigma-Aldrich	P9333
Filtro de emissão de banda única	Semrock	FF01-698/70	Filtro de emissão específico para o canal AF647
Filtro de emissão de banda única	Chroma	ET600/50m	Filtro de emissão específico para o canal JF549
Cloreto de sódio (99,5%) & nbsp;	Euromedex	1112-A
Slides Star-Frost 76 x 26 mm	Knittel	VS112711FKB.01
Filtro de seringa estéril e oslash; Porosidade de 33 mm 0,2 & micro; m Cone de eclusa Luer	ClearLine	146560
Sistema de super-resolução	Abbelight	SAFe360	Olympus IX83 equipado com alvo de imersão em óleo 100x NA1.5
Biomole de Tri-Sódio Citrato de Sódio 2H2O Gen-Apex	Prolabo	PRO-33615.268
Grau de Biologia Molecular Base Tris	Promega	H5135
Tris(2-carboxietil)fosfina cloridrato (TCEP)	Termo Científica	20491
Triton X-100	Euromedex	2000-B
Tween 20	Euromedex	2001-B
Twinsil Speed	Picodente	13001002	Selante de silicone
Sistema de limpeza por ozônio ultravioleta forno UVOCS	UVOCS Inc.	T10X10	20 min de exposição para limpeza do revestimento & nbsp;
Bomba de vácuo	Vacuubrand	VP 100C
Centrífuga Heraeus Megafuge 16R	Termo Científica		Rotor TX-400 75003629. Centrifugação realizada com tubos Eppendorf.