Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho eficiente para microscopia de localização de molécula única em núcleos isolados de Arabidopsis, utilizando isolamento, fixação e marcagem otimizados para alcançar visualização confiável em nanoescala da cromatina e da RNA Polimerase II. Essa abordagem pode ser facilmente adaptada a outras proteínas associadas à cromatina ou modificações de histonas para imagens de alta resolução.
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Artigo de método
Um Protocolo Simplificado para Microscopia de Localização de Molécula Única em Núcleos de Arabidopsis
Neste artigo
Resumo
Resumo
Embora a microscopia de fluorescência confocal tenha fornecido insights valiosos sobre a organização da cromatina em núcleos de plantas, sua resolução limitada por difração limita a investigação da arquitetura da cromatina, motivando o uso de técnicas de superresolução como a Microscopia de Localização de Molécula Única (SMLM). Entre essas abordagens, a microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM) fornece resolução em escala nanométrica em células individuais, permitindo visualização precisa de domínios de cromatina, modificações de histonas e organização nuclear. Embora tais métodos sejam cada vez mais aplicados em sistemas de mamíferos, seu uso na biologia vegetal permanece limitado, em grande parte devido a desafios técnicos na preparação da amostra.
Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho simplificado e reprodutível para a imagem SMLM de núcleos isolados de Arabidopsis thaliana. Esse protocolo começa com a fixação das mudas para preservar a morfologia nuclear, seguida por corte suave de tecido e centrifugação para enriquecer núcleos intactos. Núcleos isolados são então marcados por fluoróforos em meio líquido e imobilizados em almofadas de agarose de baixa fusão, uma estratégia que aumenta a estabilidade durante sessões prolongadas de imagem com molécula única. Essas etapas minimizam coletivamente a fluorescência de fundo, melhoram a consistência da marcagem e aumentam a reprodutibilidade entre réplicas biológicas.
As preparações resultantes proporcionam maior clareza para visualizar modificações da cromatina e arquitetura nuclear em plantas. Ao reduzir as barreiras técnicas para implementar a imagem SMLM em Arabidopsis, esse protocolo oferece um meio versátil para investigar regulação epigenética, organização da cromatina e variações topológicas nucleares em escala nanométrica. Este trabalho estabelece uma base metodológica para aplicar o SMLM às plantas, aproximando a biologia celular dos mamíferos e abrindo novas oportunidades para estudar como a arquitetura nuclear contribui para a regulação do genoma em resposta a pistas de desenvolvimento e ambientais em sistemas vegetais.
Introdução
A microscopia há muito tempo é uma pedra angular para o estudo da organização da cromatina e da arquitetura nuclear, revelando como o DNA e as proteínas associadas à histona se organizam no espaço nuclear 3D e influenciam a regulaçãogênica 1,2. A microscopia de fluorescência convencional forneceu insights valiosos sobre domínios de cromatina em grande escala, como territórios cromossômicos, cromocentros e corposnucleares 3,4, viáveis in situ, em particular em tecidos radiculares deplantas 3,5,6. No entanto, essas técnicas são fundamentalmente limitadas pela barreira de difração da luz, restringindo a resolução espacial a aproximadamente 200 nm lateralmente e 500 nmaxialmente 7. Essa limitação obscurece detalhes em escala nanométrica do dobramento da cromatina, padrões de modificação de histonas e compartimentalização transcricional que fundamentam a regulação epigenética. Para superar essa barreira, foram desenvolvidas abordagens de microscopia de superresolução (SRM), como microscopia de iluminação estruturada (SIM)8, depleção de emissão estimulada (STED)9,10 e microscopia de localização de molécula única (SMLM)11,12, para alcançar resoluções que variam de 100 nm até algunsnm 13.
Entre as técnicas de SRM, o SMLM — incluindo a Microscopia de Localização Fotoativada (PALM)13 e a Microscopia de Reconstrução Óptica Estocástica Direta (dSTORM) — oferece resolução espacial excepcional combinada com especificidademolecular 14. Ao detectar as posições de fluoróforos individuais ao longo do tempo, o SMLM reconstrói imagens em escala nanométrica de alta precisão de domínios de cromatina, marcas de histonas e estruturas nucleares em célulasindividuais 15,16. Essa capacidade transformou a pesquisa em cromatina em sistemas mamíferos, onde o SMLM foi aplicado para visualizar o agrupamento de nucleossomos, compactação da cromatina e padrões de modificação de histonas com detalhes semprecedentes 15,16,17. Em contraste, a aplicação do SMLM aos núcleos das plantas permanece limitada, principalmente devido a desafios técnicos associados às propriedades dos tecidos vegetais — como alta autofluorescência, rigidez da parede celular e presença de compostos dispersores de luz como amido eclorofila 18. Além disso, a natureza delicada dos núcleos durante o isolamento e a marcação exige fluxos de trabalho otimizados para manter a integridade estrutural e minimizar a fluorescência de fundo durante sessões prolongadas de imagem.
O protocolo descrito aqui foi originalmente desenvolvido por Elizabeth Kracik-Dyer e Célia Baroux para microscopia de depleção de emissão estimulada (STED) 19. Posteriormente, foi otimizado e adaptado para atender aos requisitos específicos da imagem STORM com a integração de conhecimentos provenientes de aplicações de microbiologiapublicadas 20,21,22. O objetivo geral é fornecer um fluxo de trabalho simplificado e reprodutível para a imagem SMLM de núcleos isolados de Arabidopsis thaliana. Ao integrar fixação otimizada, perturbação mecânica suave e marcagem de fluoróforos em suspensão, esse método preserva a morfologia nuclear enquanto remove eficientemente contaminantes citoplasmáticos que frequentemente comprometem a qualidade da imagem. A imobilização de núcleos marcados em pastilhas de agarose de baixa fusão garante estabilidade mecânica durante a aquisição, permitindo imagens de molécula única a longo prazo em precisão nanométrica. Comparado aos protocolos SRM descritos anteriormente para núcleos de plantas — especialmente aqueles baseados na microscopiaSTED 19,23 — esse fluxo de trabalho utiliza fluoróforos fotocomutáveis (por exemplo, AF647, JF549) e reduz a fluorescência de fundo graças a etapas de lavagem que descartam clorofila e detritos teciduais, e melhora a homogeneidade da marcação ao adicionar as moléculas de marcação diretamente aos núcleos fixos e permeabilizados. Consequentemente, ele permite a visualização consistente de modificações da cromatina, compartimentos nucleares e padrões epigenéticos em núcleos individuais. Ao reduzir as barreiras técnicas para a implementação do SMLM em plantas, esse método amplia o acesso à imagem em escala nanométrica e fornece uma base para estudar como a organização da cromatina e a arquitetura nuclear contribuem para a regulação gênica em resposta a sinais de desenvolvimento e ambientais.
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Protocolo
NOTA: As informações detalhadas sobre os materiais e instrumentos utilizados neste protocolo estão disponíveis na Tabela de Materiais. A menos que especificado de outra forma, os tampões são liberados em filtros apirogênicos de 0,2 μm. O H2O ultra-puro duplamente destilado (ddH 2O) é utilizado durante todo esse protocolo. As etapas de centrifugação são realizadas em microtubos de 1,5 mL usando um rotor de ângulo fixo.
1. Fixação das mudas e liberação dos núcleos
- Coloque uma placa de cultura de 6 poços sobre gelo sob a exaustor, depois adicione a cada poço aproximadamente 4 mL de solução de fixação gelada preparada improvisadamente sob uma coifa (formaldeído estabilizado com metanol a 4% (v/v), 0,1% Triton X-100 em 1× solução salina tamponada com fosfato [PBS]).
- Usando pinças limpas, remova as mudas (entre 8 e 15 dias após a germinação) que foram cultivadas em sais sólidos (0,8% ágar) de meia força Murashige e Skoog Medium 2,2 g/L MS, sais MS 1% (p/v), pH 5,7, conforme descrito para mudas de EM na referência24, e imediatamente submerga-as na solução de fixação. Use um poço para aproximadamente 20 mudas (3 poços foram necessários para obter material suficiente por amostra).
- Coloque a placa na câmara de vácuo cheia de gelo e aplique vácuo em pressões entre 0,2 bar e 0,8 bar por 15 minutos para remover o ar preso e permitir uma penetração profunda do fixador nos tecidos daplanta 25. Libere o vácuo lentamente, mexa a amostra e depois aplique o vácuo por mais 15 minutos.
- Sob a exaustor, remova a solução de fixação com uma pipeta e lave cada poço 3 vezes por 10 minutos sob agitação suave, usando 5 mL de PBS gelado.
- Remova PBS e use pinças para transferir o tecido fixo para uma placa de Petri de 120 mm × 120 mm. Adicione às mudas fixas 50 μL de Núcleo Isolante (NIB), preparado conforme descrito por Kracik-Dyer e Baroux (45 mM MgCl2, 20 mM MOPS, 30 mM citrato de sódio, 0,3% Triton X-100). Ajuste para pH 7 usando 1 N HCl)19. Lasca com uma lâmina.
NOTA: As lâminas de microtomo mostraram-se mais eficientes do que as lâminas convencionais para essa tarefa. - Raspe o tecido picado em uma das bordas da placa de Petri com a mesma lâmina e adicione 600 μL de nib, certificando-se de lavar qualquer tecido grudado na lâmina também.
- Transfira a pasta de tecido para o tubo homogeneizador Dounce de 2 mL e faça uma cariciada de 5 a 10 vezes com o pilão menor, e depois com o pilão maior até que ele esteja se movendo suavemente dentro do tubo (geralmente são necessários 5 a 10 movimentos).
- Filtre a amostra homogeneizada resultante através de um filtro de malha de 30 μm para um microtubo de 1,5 mL.
- Centrifuge a suspensão por 10 minutos a 800 × g usando a rampa mais baixa tanto para aceleração quanto para desaceleração. Um pequeno pellet branco é visível entre os detritos de tecido verde.
- Descarte o sobrenadante e resuspenda o pellet em 150 μL de NIB.
- Centrifuge novamente por 10 minutos a 800 × g e remova o sobrenadante. Se houver algum detrito verde visível, lave uma segunda vez. Resuspenda de 50 μL a 150 μL de NIB, dependendo do tamanho do pellet.
- Armazene a suspensão de núcleos isolados resultante a 4 °C por no máximo 1 semana antes de realizar a coloração. No entanto, recomenda-se proceder imediatamente.
2. (Imuno)coloração
NOTA: Nos passos seguintes, o protocolo é aplicado a um volume de 50 μL de suspensão de núcleos, correspondendo tipicamente a 20 mudas. A menos que especificado, os seguintes passos são realizados em temperatura ambiente.
- Centrifuge a solução por 10 minutos a 800 × g e descarte o sobrenadante. Cuidado para não tocar no pellet.
- Resuspenda os núcleos pipeteando suavemente 50 μL de tampão bloqueante (143 mM NaCl, 4% BSA em PBS, armazenado a 4 °C). Incube por 30 minutos sob agitação suave.
- Centrifuge a solução por 10 minutos a 800 × g e descarte o sobrenadante sem tocar na bola de núcleos.
- Resuspenda os núcleos pipeteando suavemente 50 μL de 1× PBS. Centrifuge novamente por 10 minutos a 800 × g. Descarte o sobrenadante como acima.
- Resuspenda os núcleos em 50 μL de solução primária de anticorpos preparada em tampão imunocolorante composto por 143 mM de NaCl, 1% de BSA e 0,05% Tween 20 em PBS (diluições de anticorpos e de trabalho estão detalhadas na Tabela de Materiais). Incube as amostras por 60 minutos sob agitação suave.
- Prossiga com 2 lavagens (repita os passos 2.3 e 2.4).
- Ressuspenda os núcleos em 50 μL de anticorpo secundário anti-coelho de cabra AF647 com diluição1/200 26. Envolva os tubos em papel alumínio para proteger o fluoróforo da luz. Incube os tubos por 60 minutos sob agitação suave.
- Prossiga com 2 lavagens (repita os passos 2.3 e 2.4).
- Ressuspenda o pellet em 50 μL de NIB. Armazene a suspensão em microtubos de 1,5 mL enrolados em papel alumínio. A marcação permanece estável por várias semanas a 4 °C.
3. Montagem
- Para a imagem STORM, prepare uma solução de agarose de baixa fusão (LMA 1,5% p/v) dissolvendo o pó em 1,25× tampão B composto por 50 mM de pH 8 Tris, 10 mM de NaCl, 10% de glicose. Prepare 1,25× solução de estoque e armazene a 4 °C.
- Aqueça a 90 °C por 1 minuto para dissolver o pó e obter uma solução clara. Resfrie e mantenha a solução LMA derretida a 37 °C antes de prosseguir para a próxima etapa para evitar a desnaturalização térmica do tampão da glicose oxidase (GLOX) (prepare 10x solução estocada armazenada a -20°C composta por 100 mM de pH Tris 7,5, 25 mM de KCl, 1 mM de pH TCEP 7,0, 5 mg/mL de glicose oxidase, 0,4 mg/mL de Catalase, 50% v/v Glicerol).
- Após a solução LMA atingir 37 °C, prepare o tampão STORM adicionando 100 mM de Mercaptoetilamina (MEA) e GLOX à solução LMA quente para alcançar 1× concentração final. Armazene a solução de estoque MEA 1 M por até 1 mês a 4 °C, mas recomenda-se o uso de uma solução recém-preparada. Misture suavemente.
NOTA: Para a marcação opcional de DNA, adicione 1,5 nM (concentração final, 1 mM de solução padrão em DMSO) do Hoechst conjugado JF549. Mantenha a suspensão a 37 °C até o uso. - Misture suavemente a suspensão dos núcleos com nanodiamantes a 1/1500 de diluição. Incube-as com a amostra por 5 minutos.
NOTA: Nanodiamantes servem como marcadores fiduciários para corrigir a deriva da amostra. - Deposite 10 μL da mistura em um coverslip de 1,5H tratado com ozônio (20 min no sistema de limpeza com ozônio ultravioleta) e espere 3 minutos para deixar os núcleos se depositarem no coverslip.
- Remova o excesso de líquido, espere 2 minutos. Adicione 10 μL do LMA preparado no passo 3.3 ao coversheet e cubra imediatamente com uma lâmina de microscópio.
- Sele a capa de cobertura usando selante de silicone. Misture quantidades iguais da solução A e B em uma pequena placa de Petri usando uma ponta de micropipeta. Aplique a mistura sobre as bordas do coverslip para selar a amostra. O selante de silicone endurece em 5 minutos.
- Uma vez montado, realizar imagens dos slides sem demora, no final das 4–5 horas seguintes, para evitar a perda das propriedades de absorção de oxigênio da base de fixação.
4. Imagem
NOTA: Os parâmetros de imagem devem ser cuidadosamente otimizados de acordo com a natureza da amostra, as propriedades fotofísicas dos fluoróforos e a configuração óptica do microscópio. É fundamental garantir uma alta relação sinal-ruído para cada fluoróforo, minimizando o vazamento espectral e a excitação cruzada entre canais fluorescentes. As amostras foram observadas com um microscópio de fluorescência invertida equipado com uma objetiva de imersão em óleo de alta NA 100x, uma unidade de manutenção de foco e um LED branco para imagens em campo claro. Os marcadores fluorescentes AlexaFluor647 (AF647) foram excitados a 640 nm e JF549-Hoechst a 561 nm. A luz emitida foi filtrada com um espelho dicróico compatível e filtro(s) passa-banda, e, finalmente, imagens foram coletadas com uma câmera científica Complementar Metal-Oxide-Semiconductor (sCMOS).
- Monte a lâmina de amostra e encontre o foco. Ative um módulo de manutenção de foco se o sistema tiver um (altamente recomendado para aquisições longas).
- Encontre e foque em um núcleo. É melhor ter um ou alguns nanodiamantes próximos ao núcleo de interesse para corrigir a deriva de forma mais eficiente durante a reconstrução.
- (Opcional) Capture instantâneos limitados por difração do campo brilhante e de cada canal fluorescente com baixa potência do laser.
- Ao realizar imagens de duas cores, comece com a aquisição do canal de comprimento de onda mais longo e depois mude para o canal de comprimento de onda mais curto (ou seja, adquira o canal AF647 antes do JF549).
NOTA: Exemplo de parâmetros de aquisição usados neste trabalho:
Canal A - rotulagem de epítopos - AF647
Tempo de exposição: 20 ms
Intensidade do laser: 640 nm – 2,2 kW/cm 2
Modo de excitação: HiLo27
Canal B - Marcagem de DNA - JF549-Hoechst
Tempo de exposição: 50 ms
Intensidade do laser: 561 nm - 1 kW/cm 2
Modo excitação: Epi
Número de imagens registradas: 10.000-30.000 por canal, garantindo que a densidade de fluoróforos por quadro permaneça suficientemente escassa para localização precisa de molécula única, enquanto o número acumulado de localizações foi determinado empiricamente usando o QUantitative Image Rating and Reporting of Error Locations (SQUIRREL)28 (Super-resolution), que também indica o número suficiente de quadros.
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Resultados
O protocolo descrito acima permite a preparação de núcleos de alta qualidade de Arabidopsis thaliana adequados para SMLM. Foram realizadas várias rodadas de otimização para melhorar a integridade nuclear e reduzir detritos citoplasmáticos e celulares que comprometem a qualidade da imagem. Após cada etapa de otimização, a qualidade das preparações nucleares era avaliada por imagem confocal usando um microscópio Olympus IX81 de disco giratório antes de prosseguir para a aquisição ...
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Discussão
A preparação dos núcleos de Arabidopsis thaliana para microscopia de localização de molécula única (SMLM) requer várias etapas críticas que influenciam fortemente a qualidade final da amostra. Como descrito anteriormente, 19,35, um corte de tecido completo e consistente é essencial para maximizar a recuperação dos núcleos intactos. O uso de lâminas de micrótomo em vez de lâminas padrão produz uma fragmentação de tecido m...
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Agradecemos ao Lavis Lab e à equipe de Open Chemistry da Janelia por fornecerem generosamente os corantes JF e JFX. Também agradecemos a Elizabeth Kracik-Dyer e Célia Baroux por compartilharem gentilmente seu protocolo, assim como a Aline Probst e Guillermo Orsi pelos conselhos perspicazes. A imagem óptica foi realizada na plataforma de imagem M4D do centro Grenoble Instruct-ERIC (ISBG; UAR 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) dentro da Parceria de Grenoble para Biologia Estrutural, apoiada pela Infraestrutura Francesa para Biologia Estrutural Integrada (ANR-10-INBS-0005-02) e pela Aliança de Grenoble para Biologia Estrutural Integrada e Celular, um projeto da escola de pós-graduação da Universidade de Grenoble Alpes (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). Agradecemos Dica ten Brink pelo pacote AnalyzeFRC Python desenvolvido no Departamento de Física de Imagem (ImPhys), Faculdade de Ciências Aplicadas, TU Delft.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S2) antibody | Abcam | ab5095 | Primary antibody used at 1/200 dilution in immunostaining buffer to visualize the active form of the polymerase (Polyclonal antibody raised in rabbit ) |
| Acquisition software | Abbelight | NEO LiveImaging v2.18 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| Certified Low Melting Agarose | Bio-Rad | 1613111 | |
| Coverslips thickness 1.5H round | Marienfeld | 117640 | Ø: 24 mm |
| D-(+)-Glucose, anhydrous, 99% | Thermo Scientific | A16828-36 | |
| Dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t1 | Dichroic mirror for excitation/emission separation |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 10´ | biowest | X0515 - 500 | Work in sterile conditions |
| Epredia Ultra Disposable Microtome Blades | FisherScientific | 12191830 | Low profile, single use |
| Falcon 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid | Falcon | 353046 | |
| Formaldehyde solution 37% | Carl Roth | 7398 | Work under the fume hood |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Glycerol | VWR | 24388.295 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647 | Thermo Scientific | A32733TR | Used at 1/200 as secondary antibody coupled to AF647 |
| Hoechst 33258 solution | Sigma-Aldrich | 94403 | Used at 1/500 to counterstain the DNA, added to the agarose pad |
| Hydrochloric Acid Solution | Chem-Lab | CL05.0311.1000 | |
| JF549-Hoechst | Lavis lab and Open Chemistry team (Janelia) | JF549-Hoechst | Used to counterstain DNA, added to the agarose pad at 1.5 nM final concentration |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | 2 mL tube with both large (0.0030-0.0050 inch) and small (0.0005-0.0025 inch) clearance pestles |
| Lasers unit | Oxxius | L6Cc | Equipped with six lasers: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW and 730 nm - 30 mW |
| Magnesium chloride hexahydrate | Carl Roth | HN03 | |
| Mercaptoethylamine (MEA) | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| MOPS sodium salt 98% | Fisher Scientific SAS | 352590010 | |
| Multiband emission filter | Semrock | FF01-446/523/600/677 | Multiband emission filtration to block laser scatter light |
| Nanodiamonds | Adamas Nanotechnologies | NDNV100nmHiWGA2ml | Stock 1 mg/mL |
| ORCA-Fusion Digital CMOS camera | Hamamatsu | C14440-20UP | |
| Petri dish, 100/20 mm, PS, clear, with vents, sterile | Greiner Bio-One | 664161 | Used to grow plants on 1/2 MS medium |
| Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile | Greiner Bio-One | 688161 | Used when chopping the plant seedlings |
| pluriStrainer Mini cell strainer | pluriSelect | 43-10030-50 | Mesh size 30 µm, suitable for 1.5 mL Eppendorf tube |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Single band emission filter | Semrock | FF01-698/70 | Specific emission filter for AF647 channel |
| Single band emission filter | Chroma | ET600/50m | Specific emission filter for JF549 channel |
| Sodium chloride (99,5%) | Euromedex | 1112-A | |
| Star-Frost slides 76 x 26 mm | Knittel | VS112711FKB.01 | |
| Sterile syringe filterø 33 mm porosity 0.2 µm Luer Lock cone | ClearLine | 146560 | |
| Super-resolution system | Abbelight | SAFe360 | Olympus IX83 equipped with 100x NA1.5 oil-immersion objective |
| Tri-Sodium Citrate 2H2O Gen-Apex Biomole | Prolabo | PRO-33615.268 | |
| Tris Base Molecular Biology Grade | Promega | H5135 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | 20491 | |
| Triton X-100 | Euromedex | 2000-B | |
| Tween 20 | Euromedex | 2001-B | |
| Twinsil Speed | Picodent | 13001002 | Silicone sealant |
| Ultraviolet Ozone cleaning system UVOCS oven | UVOCS Inc. | T10X10 | 20 min exposure for coverslip cleaning |
| Vacuum pump | Vacuubrand | VP 100C | |
| Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Scientific | Rotor TX-400 75003629. Centrifugation performed with Eppendorf tubes. |
Referências
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