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Artigo de método

Isolamento de Pequenas Vesículas Extracelulares do Músculo Esquelético Murino e Medula Óssea por Cromatografia de Exclusão de Tamanho

207 vistas

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DOI:

10.3791/70894

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23 de junho de 2026

 ,  ,  , 
1Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 2McGill Group for Suicide Studies, Douglas Mental Health University Institute, 3Center for Applied Nanomedicine, Research Institute of the McGill University Health Center, 4Department of Psychiatry, McGill University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o isolamento de pequenas vesículas extracelulares de músculos esqueléticos murinos e medula óssea usando digestão enzimática e cromatografia de exclusão de tamanho, permitindo a recuperação reprodutível de frações enriquecidas com vesículas de tecidos estruturalmente complexos e de baixo rendimento para análise molecular posterior.

Resumo

Pequenas vesículas extracelulares (sEVs) são partículas nanodimensionadas, ligadas a lipídios, que mediam a comunicação intercelular por meio da transferência de proteínas, lipídios e ácidos ribonucleicos (RNAs). O isolamento das sEVs de tecidos sólidos como músculo esquelético (SkM) e medula óssea (BM) continua sendo desafiadora devido ao baixo rendimento e à contaminação por componentes não vesiculares. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho reprodutível para isolar sEVs de SkM e BM de camundongos. SkM é digerido enzimaticamente, enquanto BM é processado diretamente e posteriormente submetido a centrifugação diferencial e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Para SkM, o volume vazio (~2,5 mL) é descartado, e os ~1,6 mL subsequentes são coletados como frações enriquecidas em EV, tipicamente subdivididas em frações sequenciais de 400 μL (F1–F4). Para BM, um volume vazio de 700 μL é descartado, seguido pela coleta de uma fração enriquecida com EV de ~850 μL, que pode ser subdividida em frações sequenciais de ~170 μL (F1–F5) e agrupada com base no enriquecimento do marcador EV. Usando essa abordagem, os sEVs podem ser isolados de pequenos volumes de tecido (aproximadamente 500 μL de um único quadríceps e 150 μL de concentração de fêmur e tíbia), resultando em ~108 partículas·mL−1·mg−1 de tecido com diâmetros predominantemente <200 nm. A integridade e pureza das vesículas são validadas usando microscopia eletrônica de transmissão, análise de rastreamento de nanopartículas e Western blot para marcadores canônicos de EV, com caracterização adicional por detecção interferométrica de partícula única para quantificar subpopulações de vesículas definidas por tetraspanina. Esse método permite o isolamento reprodutível de sEVs de alta pureza a partir de tecidos estruturalmente complexos usando material de entrada mínimo, apoiando análises moleculares e funcionais posteriores de vesículas derivadas de tecidos.

Introdução

Pequenas vesículas extracelulares (sEVs) são partículas nanodimensionadas, ligadas aos lipídios, que mediam a comunicação intercelular por meio da transferência de proteínas, lipídios e ácidosnucleicos. Eles são liberados por todos os tipos celulares e estão presentes em praticamente todos os fluidos biológicos, onde funcionam como transportadores-chave de cargas bioativas, incluindo peptídeos e microácidos ribonucleicos (RNAs)2. Sua carga é seletivamente separada, permitindo a entrega precisa de sinaisespecíficos 3, e sua estrutura vesicular permite que eles contornem as típicas restrições de gradiente e diluição de fatores livremente secretados ao entregar cargas moleculares concentradas por longasdistâncias 4. Embora os VEs de biofluidos (por exemplo, plasma, soro e saliva) forneçam um retrato conveniente da sinalização sistêmica, eles representam uma população altamente diversificada originária de muitos tecidos5. Isso dificulta determinar qual órgão está produzindo um sinal biológico específico ou como a comunicação dos VEs é regulada no nível tecidular. Como os EVs circulantes são agrupados, alterações específicas do tecido podem ser diluídas ou mascaradas, limitando a capacidade de identificar a verdadeira fonte dossinais 6.

O músculo esquelético (SkM) e a medula óssea (BM) são tecidos metabólicos e funcionalmente ativos principais, com composições celulares distintas e papéis de sinalização 7,8. Ambos os tecidos podem liberar populações de EV enriquecidas com carga única e específica para tecido; no entanto, esses sinais podem ser facilmente ofuscados no plasma por EVs provenientes de tecidos de alta rotatividade, comoas células imunes 8,9. Isolar diretamente os EVs do músculo ou da evacuação corporal aumenta a sensibilidade e permite a detecção de adaptações sutis específicas do tecido que podem não ser observadas na circulação. Portanto, os EVs derivados de tecidos fornecem informações complementares essenciais, revelando quando um órgão específico libera EVs, por quanto tempo esses sinais persistem e quais adaptações são agudas versus crônicas. Apesar do interesse crescente em EVs, a maioria dos métodos de isolamento estabelecidos foi desenvolvida para biofluidos (por exemplo, plasma e soro) ou sistemas de cultura celular. Nesses contextos, os VE podem ser obtidos com rendimento relativamente alto e perturbação estrutural mínima. No entanto, isolar EVs diretamente de tecidos sólidos como SkM e BM apresenta desafios técnicos notáveis. Esses tecidos são estruturalmente complexos e heterogêneos, exigindo etapas mecânicas ou enzimáticas de dissociação que podem introduzir artefatos, incluindo altos níveis de proteínas solúveis, fragmentos de organelos e nanopartículas não vesiculares, dificultando a obtenção de preparações de EV de alta pureza.

Outro grande desafio no isolamento de EV derivado de tecido é a falta de fluxos de trabalho padronizados para definição e separação de frações10. A centrifugação diferencial sozinha frequentemente resulta no co-isolamento de agregados proteicos e vesículas grandes, enquanto métodos baseados em ultracentrifugação, embora amplamente utilizados, podem levar à agregação de vesículas, deformação e recuperação variável dependendo do tipo de rotor e das condições experimentais. Abordagens de gradiente de densidade melhoram a pureza, mas são demoradas, de baixo rendimento e difíceis de padronizar emlaboratórios 11. Consequentemente, atualmente não existe um método amplamente adotado e reproduzível, otimizado para isolar pequenos EVs de tecidos sólidos com alta pureza e rendimentoconsistente 10.

A cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) surgiu como uma alternativa promissora para o isolamento de EV porque separa partículas com base no tamanho sem submeter as vesículas a altas forças centrífugas. A SEC permite a separação eficiente de pequenos EVs de proteínas solúveis e contaminantes de baixo peso molecular, preservando a integridade das vesículas e a função biológica. Importante, a SEC permite uma definição clara das frações de elução, possibilitando a identificação reprodutível de frações enriquecidas em EV e melhorando a consistência entre osexperimentos 12. No entanto, os fluxos de trabalho da SEC exigem otimização cuidadosa para amostras derivadas de tecidos, especialmente no que diz respeito ao processamento upstream de tecidos, remoção de detritos e coleta de frações. Para enfrentar essas limitações, desenvolvemos um protocolo reproduzível e padronizado para isolar sEVs de SkM e BM. Esse método integra digestão enzimática controlada para tecidos fibrosos, centrifugação diferencial para remoção de detritos e purificação baseada em SEC para isolar vesículas de alta pureza. O fluxo de trabalho é especificamente otimizado para minimizar a contaminação por componentes intracelulares, preservando a integridade das vesículas e permitindo a recuperação consistente de tecidos de baixo rendimento.

Este protocolo preenche uma lacuna metodológica crítica ao fornecer uma abordagem prática e escalável para isolar sEVs derivados de tecidos com fracionamento definido e pureza validada, alcançada por meio de análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), Western blotting de marcadores canônicos de EV, microscopia eletrônica para avaliação morfológica e análise de EV de partícula única usando captura de anticorpos, dimensionamento interferométrico e imagem de fluorescência multicanal. É particularmente adequado para estudos que exigem análise de EV específica em tecido, onde vesículas derivadas de biofluidos são insuficientes para resolver a origem celular dos sinais. Os pesquisadores devem usar esse método quando o objetivo é obter sEVs de alta pureza a partir de tecidos sólidos com contaminação mínima e integridade preservada das vesículas. Em contraste, métodos baseados em ultracentrifugação podem ser preferidos para aplicações de alto rendimento, onde a pureza é menos crítica, e abordagens com gradiente de densidade podem ser selecionadas ao isolar subpopulações específicas de EV apesar de menor rendimento. Juntos, esse protocolo fornece uma estrutura padronizada para o isolamento e caracterização de sEVs derivados de tecidos, permitindo análises moleculares, bioquímicas e funcionais reprodutíveis a jusante.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animais da Universidade McGill (DOUG10029) e conduzidos de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados Animais.

1. Protocolo de Isolamento SEV (SkM-sEV) derivado de SkM (SkM-sEV)

  1. Coleta de Amostras e Dissociação de Tecidos
    1. Colheita e preservação de tecidos
      1. Congele rapidamente o tecido SkM imediatamente após a excisão, mergulhando-o em metilbutano pré-resfriado.
        NOTA: Para preparar metilbutano pré-resfriado, coloque um recipiente de metilbutano em um banho de gelo seco e adicione gradualmente pequenos pedaços de gelo seco diretamente ao líquido. Deixe a solução esfriar, a temperatura normalmente fica na faixa de −70°C a −80°C. Mantenha o metilbutano no banho de gelo seco durante o uso para preservar a temperatura. Imerga o tecido por aproximadamente 3–4 segundos até que esteja totalmente congelado, conforme indicado por endurecimento total e perda de flexibilidade.
      2. Transfira o tecido para crioviais.
      3. Coloque as amostras sobre gelo seco.
        NOTA: Armazene as amostras a −80°C até processamento adicional. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento. O congelamento rápido preserva efetivamente os veículos elétricos quando as amostras são devidamente seladas. Desidratação ou danos nas vesículas podem ocorrer se os tecidos ficarem expostos ou passarem por múltiplos ciclos decongelamento-descongelamento 13.
    2. Dissociação de tecidos
      NOTA: Realize todas as etapas em um gabinete de biossegurança usando instrumentos estéreis e luvas para evitar contaminação, que poderia comprometer a pureza dos veículos elétricos.
      1. Peso de tecido
        1. Esterilize pinças com etanol 70% e deixe secar ao ar.
        2. Transfira o tecido congelado para uma placa de cultura em suspensão pré-pesada.
        3. Pese o tecido usando uma balança de miligramas (tipicamente ~80–120 mg por amostra, dependendo da idade e do sexo do camundongo).
          NOTA: O protocolo é validado para massas de tecido de entrada de ~80–120 mg. Para amostras dentro desse intervalo, use os volumes de reagentes especificados nos Passos 1.2.3.1, 1.3.1.3 e 1.3.2.1 sem modificações. Para amostras fora dessa faixa, escale todos os volumes dos reagentes proporcionalmente à massa do tecido, mantendo a razão validada de RPMI-1640, colagênase D e DNase I (1000:40:4 μL por 100 mg de tecido). Isso corresponde a aproximadamente 10 μL de RPMI-1640, 0,4 μL de colagênase D (estoque de 100 mg/mL) e 0,04 μL de DNase I (estoque de 20.000 U/mL) por mg de tecido. Mantenha essas proporções para preservar as concentrações finais de enzimas durante a reação. A eficiência digestiva e o rendimento do EV devem ser validados empiricamente quando trabalhando substancialmente fora da faixa de 80–120 mg.
        4. Coloque a amostra em um tubo pré-resfriado e mantenha-a no gelo.
      2. Prepare enzimas
        1. Descongelar aliquotas de colagênase D (estoque de 100 mg/mL) e DNase I (estoque de 20.000 U/mL) em gelo (veja Arquivo Suplementar 1, Passo 1.4 para preparação de estoque enzimático). Essas enzimas são adicionadas no Passo 1.3.2.1 para alcançar concentrações finais durante a reação de 3,8 mg/mL de colagênase D e 77 U/mL de DNase I. O volume final de digestão é de 1,044 mL.
        2. Misture DNase I suavemente por inversão. Não faça vórtice.
      3. Preparação de tecidos para digestão
        1. Adicione 800 μL de RPMI-1640 a um prato de cultura de suspensão estéril colocado no gelo.
        2. Transfira o papel para o prato.
        3. Corte o tecido em 6 a 8 pedaços de tamanho aproximadamente uniforme (2 a 3 mm de cada lado) usando um bisturi descartável e estéril. Estabilize o tecido com pinças estéreis durante o corte para garantir uma fragmentação uniforme. Complete essa etapa em 1 minuto por amostra para manter a consistência entre as amostras.
        4. Mantenha a placa no gelo durante todo o procedimento para minimizar a degradação.
    3. Transferência de tecidos e digestão enzimática
      1. Transferência de tecido
        1. Apare a ponta de uma ponta de pipeta P1000 estéril usando uma lâmina estéril para produzir uma abertura de 2–3 mm de diâmetro, suficiente para permitir a livre passagem dos fragmentos de tecido gerados no Passo 1.2.3.3.
          NOTA: Alternativamente, utilize pontas de pipeta de 1 mL de grande diâmetro (orifício largo) comercialmente disponíveis, que fornecem uma abertura padronizada (tipicamente ~2–3 mm de diâmetro interno) e eliminam a variabilidade associada ao corte manual.
        2. Transfira os fragmentos de tecido e o meio RPMI-1640 para tubos pré-marcados de 1,5 mL usando uma pipeta P1000 equipada com a ponta modificada. Realize 2–3 aspirações sucessivas para recuperar fragmentos e meio residuais. Inspecione visualmente a placa e a ponta da pipeta após a transferência e use pinças estéreis para transferir quaisquer fragmentos restantes, garantindo que não restem tecidos visíveis.
        3. Adicione 200 μL de RPMI-1640 a cada tubo.
      2. Digestão enzimática
        1. Adicione 40 μL de colagênase D stock (100 mg/mL) e 4 μL de DNase I stock (20.000 U/mL) a cada tubo a partir de alíquotas descongeladas no gelo. Isso resulta em concentrações finais durante a reação de 3,8 mg/mL de colagênase D e 77 U/mL de DNase I. Para amostras fora da faixa de tecido de 80–120 mg, ajuste proporcionalmente os volumes enzimáticos conforme descrito na NOTA seguinte Passo 1.2.1.3.
          NOTA: Esses volumes são calibrados para massas teciduais dentro da faixa típica de 80–120 mg. Para massas teciduais fora dessa faixa, escale todos os volumes dos reagentes proporcionalmente, conforme descrito na NOTA seguinte Passo 1.2.1.3 (0,4 μL estoque de colagênase D e 0,04 μL estoque de DNase I por mg de tecido), o que preserva as mesmas concentrações finais de enzimas durante a reação independentemente da massa do tecido.
        2. Adicione as enzimas a todas as amostras simultaneamente ao processar múltiplas amostras.
        3. Mantenha os tubos no gelo durante a adição de enzimas.
        4. Inverta suavemente os tubos para misturar. Não faça vórtice.
        5. Incube os tubos a 37°C por 30 minutos em um batedeiro nutador (24 rpm, ângulo de inclinação de 20°; veja Tabela de Materiais). Certifique-se de misturar de forma uniforme durante a incubação.
          NOTA: Digere cada amostra em um volume total de 1,044 mL (1000 μL RPMI-1640, 40 μL de colagênase D e 4 μL de DNase I por amostra; equivalente a ~25:1 de relação tampão-colagênase).
    4. Remoção de detritos
      NOTA: Inicie o equilíbrio da coluna SEC no início da primeira centrifugação (Passo 1.4.1.1). A coluna SEC requer 20–25 minutos para lavagem e equilíbrio. Iniciar o equilíbrio neste ponto garante que a coluna esteja pronta para carregamento da amostra imediatamente após a conclusão da etapa de filtração (Passo 1.4.3).
      1. Primeira centrifugação
        1. Centrifuge as amostras a 300 × g por 10 minutos a 4°C para pelletar detritos não digeridos, células intactas e fragmentos de tecido restantes.
        2. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para novos tubos estéreis de microcentrífuga de 1,5 mL sem perturbar o pellet.
      2. Segunda centrifugação
        1. Centrifuge as amostras a 2.000 × g por 15 minutos a 4°C para pelletar detritos grandes, células mortas, corpos apoptóticos e vesículas grandes.
        2. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para novos tubos estéreis de microcentrífuga de 1,5 mL sem perturbar o pellet.
          NOTA: A segunda centrifugação é opcional e deve ser incluída quando for necessária remoção adicional de detritos. Realize essa etapa se o sobrenadante parecer visivelmente turvo ou contiver material particulado residual após a primeira centrifugação. Essa etapa também é recomendada se preparações anteriores mostrarem contaminação por marcadores intracelulares (por exemplo, Calnexina ou BiP) em frações de SEC enriquecidas com EV ou a presença de partículas não vesiculares por microscopia eletrônica de transmissão. A necessidade dessa etapa deve ser validada durante a otimização inicial do protocolo para cada tipo de tecido.
      3. Filtração
        1. Pré-úmido os peneiros estéreis de células de 30 μm enxaguando-os com RPMI-1640 para equilibrar a membrana e minimizar a perda da amostra. Descarte o enxágue.
        2. Filtre cada amostra através do peneiro celular pré-umido de 30 μm para tubos de microcentrífuga estéreis de baixa ligação a proteínas de 1,5 mL para remover detritos celulares remanescentes e partículas grandes antes da SEC.
        3. Deixe as amostras passarem pelo filtro pela gravidade.
        4. Deixe de 10 a 15 minutos por amostra para filtração.
          NOTA: A filtração está completa quando não resta líquido visível acima da membrana do filtro e o volume do filtrado no tubo de coleta se estabilizou. Se a filtração for mais lenta ou ficar em estol (stagnação), isso pode indicar entupimento devido a detritos residuais; Nesses casos, considere repetir a etapa de esclarecimento ou reduzir a carga da amostra.
        5. Colete 550–600 μL de sobrenadante filtrado para carregamento subsequente na coluna SEC. Para consistência entre amostras, normalize o volume de carga para 500 μL por coluna (veja Passo 2.2.1), independentemente do volume total recuperado.
  2. Cromatografia por exclusão de tamanho (SEC)
    1. Coluna SEC equilibrada
      NOTA: Realize esta etapa durante a centrifugação, se possível.
      1. Lave a coluna SEC com 17 mL de 1× PBS (0,22 μm filtrado).
      2. Permita que todo o volume passe pela coluna por gravidade a uma vazão esperada de 0,75 mL/min (20–25 min no total para o volume de lavagem de 17 mL). Vazões mais rápidas ou mais lentas podem indicar desequilíbrio inadequado da coluna ou bloqueio.
      3. Mantenha a coluna e o PBS à temperatura ambiente (RT, 21°C ± 2°C) durante o equilíbrio para garantir uma vazão consistente e desempenho ideal na coluna.
      4. Prepare tubos microcentrífugas de baixa ligação a proteínas de 1,5 mL para coleta de todas as frações.
      5. Prepare um tubo adicional para coleta do volume vazio, se necessário.
    2. Carregamento de amostras e elução
      1. Carregue 500 μL de sobrenadante filtrado na coluna SEC.
      2. Deixe a amostra entrar completamente na resina. O ponto final é alcançado quando o menisco líquido atinge a superfície do leito de resina, sem que reste líquido visível acima da resina enquanto a resina permanece visivelmente úmida.
      3. Não permita que o menisco desça abaixo da superfície de resina nem que a coluna seque, pois isso introduz ar na cama de resina e interrompe a elução. Quando o menisco líquido atingir a superfície da resina (conforme definido no Passo 2.2.2), prossiga imediatamente para o Passo 2.2.4 sem demora.
      4. Adicione imediatamente 2 mL de PBS para iniciar a elução.
      5. Colete o volume do vazio (~2,5 mL).
      6. Descarte o volume vazio ou mantenha-o como uma fração não EV.
      7. Comece a coletar a fração enriquecida com EV imediatamente após o volume vazio de 2,5 mL ter eludido.
      8. Colete um total de 1,6 mL de eluato enriquecido com EV após o volume vazio, seja como uma fração contínua única em um tubo ou como frações sequenciais que são posteriormente agrupadas.
      9. Alternativamente, colete frações sequenciais de 0,4 mL para otimizar pureza versus rendimento. Volumes de fração menores são recomendados quando é necessária maior pureza (por exemplo, para análises proteômicas ou aplicações sensíveis a jusante), enquanto frações maiores podem ser usadas para maximizar o rendimento total do EV.
      10. Avalie frações para enriquecimento de EV usando métodos de caracterização (por exemplo, Western blot para marcadores e contaminantes de EV, e NTA), e agrupe frações enriquecidas em EV conforme definido na seção de caracterização.
        NOTA: Mantenha a coluna fluindo continuamente. À medida que uma fração está terminando, adicione PBS para manter um líquido constante acima da cama de resina e evitar que a coluna seque. Use tubos de baixa ligação a proteínas e sem nuclease para coleta.
    3. Concentração
      1. Concentre amostras de EV usando filtros centrífugos (corte de peso molecular de 100 kDa [MWCO]) para aplicações posteriores (por exemplo, sequenciamento de RNA, proteômica ou Western blot).
      2. Enxágue os filtros com PBS antes de usar.
      3. Centrifuge as amostras a 4.000 × g a 4°C, verificando a cada 2–3 minutos até atingir o volume final desejado (tipicamente 50–100 μL). Use volumes finais menores (por exemplo, ~50 μL) para aplicações que exigem concentração e volumes mais altos (por exemplo, ~100 μL) quando se prefere maximizar a recuperação.
        ATENÇÃO: Evite a superconcentração interrompendo a centrifugação assim que o volume alvo for atingido.
      4. Recupere a retenção pipetando suavemente.
      5. Registre volumes de amostras pré e pós concentração para estimar a recuperação, se necessário. O NTA pode ser usado para avaliar a concentração de partículas antes e depois da concentração, se disponível.
    4. Armazenamento
      1. Mantenha frações enriquecidas com EV no gelo ou a 4°C para ensaios imediatos (por exemplo, NTA e microscopia eletrônica de transmissão [TEM]) e processe em 24 horas para TEM e em 48 h para NTA.
      2. Amostras de EV aliquotas em tubos de baixa ligação a proteínas para armazenamento.
      3. Armazene as amostras a −80°C para uso prolongado.
      4. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.

2. Protocolo de Isolamento SEV (BM-sEV) derivado de BM

  1. Coleta de amostras e dissociação de tecidos
    1. Colheita e preservação de tecidos
      1. Não congele os ossos imediatamente após a excisão, pois isso endurece a medula e complica a extração usando o método do tubo espetado. Em vez disso, mantenha os ossos no gelo ou a 4°C durante curtos períodos de manuseio antes do processamento ou congelamento, conforme descrito no Passo 3.1.1.4 (colocação sobre gelo seco antes do armazenamento a −80°C).
      2. Remova os músculos e tecidos conjuntivos ao redor dos ossos dissecados.
      3. Transfira os ossos para crioviais.
      4. Coloque as amostras sobre gelo seco.
        NOTA: Armazene as amostras a −80°C até processamento adicional.
    2. Processamento BM
      NOTA: Realize todas as etapas em um gabinete de biossegurança usando instrumentos estéreis e luvas para evitar contaminação, que poderia comprometer a pureza dos veículos elétricos.
      1. Pré-pesar e rotular tubos de centrífuga de 1,5 mL antes de adicionar qualquer material. Calcule a massa do BM comparando os pesos dos tubos antes e depois da extração.
      2. Prepare o sistema de tubo cuked inserindo um tubo PCR de 0,2 mL (tampa intacta) em um tubo centrífuga de 1,5 mL com um encaixe justo. Perfure a parte inferior do tubo de 0,2 mL uma vez com uma agulha estéril de 16 G mantida perpendicular à base, produzindo uma única perfuração uniforme de ~1,6 mm de diâmetro. Prepare uma configuração por perna por mouse.
      3. Coloque a perna, limpa de todos os músculos e tecidos ao redor, em uma placa de Petri estéril.
      4. Separe o fêmur e a tíbia cortando o espaço articular.
      5. Corte ambas as extremidades do fêmur e da tíbia para expor a medula vermelha. Coloque os ossos no tubo PCR perfurado posicionado dentro do tubo de 1,5 mL e sele o conjunto com parafilme para garantir uma montagem segura durante a centrifugação.
      6. Centrifuge as amostras por 10 s em uma microcentrífuga de bancada a aproximadamente 8.000 × g, ou a configuração mais próxima possível do instrumento utilizado, em temperatura ambiente.
      7. Verifique a extração bem-sucedida da medula por três critérios: (i) os ossos aparecem visivelmente brancos, sem resíduos de medula vermelha, (ii) o pellet no tubo inferior aparece vermelho escuro e compacto, tipicamente preenchendo a ponta cônica do tubo de 1,5 mL, e (iii) a massa medulosa medida (Passo 3.1.2.9) está dentro da faixa esperada de ~15–30 mg por camundongo.
      8. Reposicione ou recorte os ossos e repita a breve rotação se a medula vermelha visível permanecer dentro do osso.
      9. Pese novamente os tubos para determinar a massa da medula extraída (tipicamente ~15–30 mg por amostra, dependendo da idade, sexo e eficiência da extração do camundongo).
        NOTA: O protocolo é validado para rendimentos de medula de ~15–30 mg por amostra. Como o volume de ressuspension do RPMI-1640 é mantido constante em 250 μL independentemente da massa da medula (Passo 3.1.2.10), o rendimento de EV é normalizado para a massa inicial medida durante a análise a jusante (partículas em massa de moléculas (partículas em massa de moléculas (tecido de partículas em massa de moléculas (partículas em massa de 1 mg −1 em matéria de morte). Para amostras substancialmente abaixo de 15 mg, medula de piscina de camundongos pareados (mesma idade, sexo e osso) antes da ressuspensão para manter entrada suficiente para caracterização a jusante. Para amostras substancialmente acima de 30 mg, divida-se a medula em duas ressuspensões separadas de 250 μL cada ou escala o volume do RPMI-1640 proporcionalmente (~12,5 μL por mg de medula) para evitar ressaltos incompletos; Em ambos os casos, aplique a mesma normalização por massa durante a análise.
      10. Adicione 250 μL de RPMI-1640 a cada tubo. Mantenha um volume constante entre as amostras, independentemente da massa da medula, para permitir a normalização do rendimento EV à massa inicial da medula. Mantenha as amostras no gelo.
      11. Resuspenda a medula pipetando suavemente para cima e para baixo de 10 a 15 vezes usando uma pipeta P1000 até que a suspensão pareça visualmente homogênea, sem aglomerados visíveis ou fragmentos de tecido intactos restantes. Evite pipetear com força ou formar bolhas, que podem prejudicar a integridade das vesículas.
  2. Remoção de detritos
    1. Primeira centrifugação
      1. Centrifuge as amostras a 300 × g por 10 minutos a 4°C para pelletar detritos não digeridos, células intactas e fragmentos de tecido restantes.
      2. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para novos tubos estéreis de microcentrífuga de 1,5 mL sem perturbar o pellet.
    2. Segunda centrifugação
      1. Centrifuge as amostras a 2.000 × g por 15 minutos a 4°C para remover detritos grandes.
      2. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para novos tubos estéreis de microcentrífuga de 1,5 mL sem perturbar o pellet.
    3. Terceira centrifugação
      1. Centrifuge as amostras a 10.000 × g por 30 minutos a 4°C para remover corpos apoptóticos e vesículas grandes.
      2. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para novos tubos estéreis de microcentrífuga de 1,5 mL sem perturbar o pellet.
      3. Certifique-se de obter um volume final de sobrenadante de 200 μL.
  3. Cromatografia por exclusão de tamanho (SEC)
    1. Preparação da coluna
      1. Equilibre a coluna SEC lavando com 6 mL de 1× PBS (0,22 μm-filtrado).
        NOTA: O volume de equilíbrio é específico de cada coluna e deve corresponder ao tipo de coluna listado na Tabela de Materiais. Essa coluna requer um volume de equilíbrio de 6 mL, que difere da coluna usada para amostras SkM.
      2. Deixe todo o volume passar pela gravidade.
      3. Mantenha a coluna e o PBS em RT durante o equilíbrio para garantir a taxa de fluxo e desempenho da coluna ideais.
    2. Carregamento de amostras e elução
      1. Carregue 150 μL de sobrenadante filtrado na coluna SEC.
      2. Deixe a amostra entrar completamente na resina. O ponto final é alcançado quando o menisco líquido atinge a superfície da cama de resina, sem que reste líquido visível acima da resina enquanto a resina permanece úmida (conforme descrito no Passo 2.2.2).
      3. Não permita que o menisco desça abaixo da superfície de resina nem que a coluna seque (veja o ponto final definido no Passo 3.3.2.2), pois isso introduz ar na camada de resina e interrompe a elução. Quando o menisco líquido atingir a superfície da resina, prossiga imediatamente para o Passo 3.3.2.4 sem demora.
      4. Adicione imediatamente 550 μL de PBS para iniciar a elução.
      5. Colete o volume vazio (700 μL).
      6. Descarte o volume vazio ou mantenha-o como uma fração não EV.
      7. Comece a coletar a fração enriquecida com EV imediatamente após o volume vazio de 700 μL ter eluído.
      8. Colete 850 μL de eluato enriquecido com EV seguindo o volume vazio de 700 μL.
      9. Alternativamente, colete frações sequenciais de aproximadamente 170 μL para otimizar pureza versus rendimento.
        NOTA: Volumes de fração menores são recomendados quando é necessária maior pureza (por exemplo, para análises proteômicas ou aplicações sensíveis a jusante), enquanto frações maiores podem ser usadas para maximizar o rendimento total do EV.
      10. Avalie frações para marcadores de EV e agrupe frações enriquecidas com EV conforme necessário.
        NOTA: Mantenha a coluna fluindo continuamente. À medida que uma fração está terminando, adicione PBS para manter um líquido constante acima da cama de resina e evitar que a coluna seque.

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Resultados

Para avaliar a eficácia desse protocolo para isolar sEVs derivados de tecidos, são apresentados resultados representativos de amostras de SkM e BM. O isolamento bem-sucedido foi definido por (i) enriquecimento de marcadores canônicos de EV (TSG101, CD63, CD81 e CD9) em frações iniciais de SEC, (ii) detecção mínima de contaminantes intracelulares (por exemplo, Calnexina e BiP), (iii) distribuição unimodal do tamanho das partículas com a maioria das partículas <200 nm), (iv) visualização d...

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Discussão

Este protocolo descreve uma abordagem robusta e reprodutível para isolar preparações enriquecidas com sEV diretamente de SkM e BM, dois tecidos de baixo rendimento e altamente heterogêneos. Embora o isolamento de EVs seja bem estabelecido para biofluidos e sistemas de cultura celular, métodos padronizados para EVs derivados de tecidos continuam limitados devido a desafios associados à dissociação tecidual, contaminação por material intracelular e variabilidade no rendimento. Aqui, deline...

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Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos a Jennie Yang, Dariusz Żurawek e Volodymyr Yerko pela assistência técnica e discussões úteis. Agradecemos à plataforma Center for Applied Nanomedicine, especialmente a Nadim Tawil e Laura Montermini, pelo apoio na caracterização de vesículas extracelulares e aquisição de dados. Também agradecemos à equipe da unidade animais, Guylaine Gadoury e Tara Thomson, pela ajuda no manuseio dos ratos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1.5 mL centrifuge tubeSarstedt72.690.300Microcentrifúga geral usada em todo o protocolo
1.5 mL low-protein-binding tubeSarstedt72.706.600Usado para manuseio de EV, coleta de frações SEC e armazenamento
0.2 mL PCR tubeFisher Scientific14-222-262Usado para configuração de extração de medula óssea com tubo perfurado
16 G needleBD305197Usado para perfurar o tubo PCR de 0,2 mL
30 µm cell strainerMiltenyi Biotec 130-098-458Usado para filtragem de amostra de músculo esquelético
70% ethanolSigma-Aldrich1.11727Usado para esterilizar pinças
Biosafety cabinetNANAUsado para manuseio estéril de tecido
Bone cutting instrumentFisher Scientific10-001-976Usado para separar fêmur e tíbia e expor a medula
Bovine serum albumin (BSA)BioShopALB001Usado para bloqueio e diluição de anticorpos em Western blot
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)BioShopCCL302Usado para preparação do tampão HEPES
Carbon-coated copper grid, 200-meshSigma-Aldrich930342Usado para preparação da amostra TEM
Centrifugal filter, 100 kDa MWCOMilliporeSigmaUFC810096Usado para concentração de EV
Collagenase DRoche11088858001Usado para digestão enzimática do músculo esquelético
CryovialSarstedt72.690.300Usado para armazenamento de tecido e osso
Deionized water (ultrapure)NANAUsado para preparação de tampão e etapas de lavagem TEM
DNase IRoche11284932001Usado para digestão enzimática do músculo esquelético
Dry iceNANAUsado para resfriamento e transporte da amostra
Enhanced chemiluminescence substrateBiorad1705061Usado para detecção de Western blot
Filter unit, 0.22 µmSarstedt83.3941.501Usado para filtrar PBS quando aplicável
Forceps / tweezersMilliporeSigmaF3892Usado para manuseio de tecido
GlutaraldehydeNANAUsado para fixação TEM
GlycineNANAUsado nas etapas de lavagem da grade TEM
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14175-095Usado para preparação do estoque de DNase I
HEPESBioShopHEP001.500Usado para preparação do tampão HEPES-NaOH
Horseradish peroxidase-conjugated streptavidinThermo FisherS911Usado para detecção de Western blot
Imaging system for chemiluminescenceBiorad12003153Usado para imagem das membranas de Western blot
KClBioShopPOC308Usado para preparação do tampão HEPES
Magnesium chloride (MgCl2)BioShopMAG510.500Usado para preparação do tampão HEPES
2-MethylbutaneThermo Fisher78-78-4Usado para congelamento rápido do músculo esquelético
Milligram balanceMilliporeSigmaZ741359Usado para pesagem de tecido e medula
NaClBioShopSOD004.1Usado para preparação do tampão HEPES
Nano-particle tracking analysis instrumentMalvern PanalyticalNanoSight NS300NanoSight NS300 usado para dimensionamento e contagem de partículas
NaOHBioShopSHY500.500Usado para ajuste de pH
Nitrocellulose membraneBioRad1704271Usado para transferência de Western blot
Nutating mixerLabnet S0500Usado durante a digestão enzimática
P1000 pipetteMilliporeSigmaFA10006M-1EAUsado para transferência de tecido
Pipette tip, 1 mLSarstedt70.3050.275A ponta é aparada para ampliar a abertura para transferência de fragmentos de tecido
Phosphate-buffered saline (PBS)WisentINC 811.012-FLUsado em todo o protocolo; também usado para equilíbrio e eluição SEC
Phosphatase inhibitorMilliporeSigma4906845001Usado para preparação de lisado para Western blot
Petri dishMilliporeSigmaCLS351146Usado para preparação da medula óssea
Polyacrylamide gel, 4–20% gradient stain-freeBioRad4561094Usado para separação de Western blot
Protease inhibitorMilliporeSigma11697498001Usado para preparação de lisado para Western blot
RPMI-1640 mediumSigma-AldrichR7388-500MLNão suplementado; sem FBS ou antibióticos
RIPA buffer, 10×Merck20-188Usado para extração de proteína para Western blotting
Scalpel, sterile disposableUltident Paragon02-90000-10Usado para cortar o tecido do músculo esquelético
SEC column, original 70 nmIZONICO70PUsado para SEC do músculo esquelético
SEC column, single 70 nmIZONICS70PUsado para SEC da medula óssea
Sodium azideSigma-AldrichS2002Adicionada ao PBS para lavar a coluna
Sodium cacodylate bufferNANAUsado para tampão de fixação TEM
Luer Slip Single Use Syringe without Needle MedlineSYR101020Usado durante a aquisição NTA, se aplicável
Transmission electron microscopeFEINATecnai G2 Spirit Twin 120 kV Cryo-TEM usado para imagem TEM
Tween-20BioShopTWN508.1Usado em PBS-T para Western blotting
Uranyl acetateNANAUsado para coloração negativa TEM
Whatman filter paperMilliporeSigmaWHA10030

Referências

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