$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Geral de Hebei (Aprovação nº: 2025-LW-0265). Devido à natureza retrospectiva do estudo, a aprovação ética foi obtida após o período de coleta de dados, o que foi permitido pelo comitê para estudos não intervencionistas usando dados clínicos anonimizados. A exigência de consentimento informado por escrito foi dispensada.
Seleção de participantes
Participantes potenciais foram recrutados do Departamento de Nefrologia do Hospital Geral de Hebei entre julho de 2022 e maio de 2024. Todos os pacientes foram avaliados de acordo com critérios pré-definidos de inclusão e exclusão.
Os critérios de inclusão foram os seguintes: diagnóstico de nefropatia diabética (DN) noestágio III 23 de Mogensen, definida como albuminúria persistente com razão albumina-creatinina urinária (UAlb/UCR) de 30–300 mg/g em pelo menos duas das três amostras pontuais coletadas ao longo de 3 a 6 meses, sem hematúria ou rápida diminuição da função renal sugestiva de doença renal não diabética; taxa de filtração glomerular (eGFR) estimada ≥45 mL/min/1,73m2 calculada usando a equação CKD-EPI; diagnóstico inicial de DN sem terapia prévia com vitamina D, probucol ou imunossupressor para DN; idade <75 anos; e condição clinicamente estável sem complicações agudas do diabetes, como cetoacidose diabética ou estado hiperglicêmico hiperosmolar, ou infecções graves ativas dentro de 4 semanas antes do ingressamento. Biópsia renal não era necessária para o alistamento; No entanto, pacientes com suspeita de doença renal não diabética, incluindo sedimento urinário ativo, glomerulonefrite progressiva rapidamente ou doença autoimune sistêmica, foram excluídos.
Os critérios de exclusão incluíam doenças sistêmicas graves, como malignidades, doenças cardiovasculares graves ou doenças autoimunes; alergia conhecida à vitamina D, probucol, valsartano, atorvastatina ou insulina; gravidez ou lactação; e uso recente de medicamentos em até 4 semanas que podem interferir nos resultados do estudo, incluindo imunossupressores ou corticosteroides.
Alocação de grupos
O médico de triagem permaneceu cego quanto à alocação final do grupo até a confirmação da elegibilidade.
Características demográficas e clínicas de base, incluindo idade, sexo, duração do diabetes e DN, e histórico de hipertensão ou hiperlipidemia, foram registradas.
Este estudo utilizou um desenho retrospectivo, não randomizado, controlado. Para minimizar o viés de seleção e abordar possíveis fatores de confusão, incluindo alterações temporais e variabilidade relacionada ao médico, a alocação de grupos foi baseada na ordem cronológica de admissão, em vez da preferência do médico ou do paciente.
Pacientes internados entre julho de 2022 e dezembro de 2023 receberam terapia tripla padrão composta por valsartano, atorvastatina e probucol e foram designados para o grupo controle (n = 56). Pacientes internados entre janeiro de 2024 e maio de 2024 que receberam terapia quádrupla (valsartano, atorvastatina, probucol e vitamina D) foram designados para o grupo de observação (n = 94).
O maior número de pacientes no grupo de observação refletiu o aumento da aplicação clínica da terapia com vitamina D adjunta no centro de estudo a partir do início de 2024, seguindo evidências emergentes. As características demográficas e clínicas de base foram comparáveis entre os grupos (Tabela 1; P>0,05), e nenhuma mudança significativa nos critérios diagnósticos, métodos laboratoriais ou composição da equipe médica ocorreram durante o período do estudo.
Administração do regime de tratamento
Todos os participantes receberam um regime diário padronizado de infusão de insulina subcutânea para controle glicêmico durante o período de 8 meses do estudo. A dosagem de insulina foi ajustada individualmente de acordo com o monitoramento diário da glicose capilar. Os pacientes do grupo controle receberam valsartan (80 mg uma vez ao dia no estômago vazio), atorvastatina (20 mg uma vez ao dia) e probucol (250 mg duas vezes ao dia) por 8 meses. Os pacientes do grupo de observação receberam o mesmo regime de valsartano, atorvastatina e probucol com dosagens e esquemas idênticos, juntamente com suplementação oral diária de vitamina D.
A dosagem de vitamina D foi determinada de acordo com os níveis séricos iniciais de 25-hidroxivitamina D [25(OH)D] medidos no momento do recrutamento usando imunoensaio eletroquimioluminescente (ECLIA). A seficiência de vitamina D foi definida como 25(OH)D ≥30 ng/mL, insuficiência como 20 ng/mL ≤25(OH)D <30 ng/mL e deficiência como 25(OH)D <20 ng/mL. Pacientes que receberam suplementação para prevenir deficiência receberam 600–800 UI/dia, enquanto pacientes com insuficiência ou deficiência estabelecida de vitamina D receberam 2000 UI/dia.
Monitoramento de segurança e critérios de parada
Para garantir a segurança dos participantes durante o período de tratamento de 8 meses, os níveis séricos de cálcio, fósforo e hormônio paratireoidiano (PTH) foram medidos no início do jogo e a cada 4 semanas para monitorar a hipercalcemia induzida pela vitamina D e o desequilíbrio cálcio-fósforo. Um eletrocardiograma (ECG) com 12 derivações foi realizado no início da linha de partida e após 8 meses para avaliar o prolongamento do intervalo QTc associado ao probucol. Em pacientes com QTc basal ≥450 ms em homens ou ≥460 ms em mulheres, o ECG foi repetido no primeiro mês.
Parâmetros da função renal, incluindo creatinina sérica e eGFR, juntamente com eletrólitos séricos, foram monitorados quinzenalmente durante o primeiro mês e mensalmente depois. Os participantes foram instruídos a relatar novos sintomas imediatamente. Os critérios de descontinuação do tratamento incluíram cálcio sérico corrigido >10,5 mg/dL (2,62 mmol/L) confirmado por testes repetidos em até 48 horas; Intervalo QTc >500 ms ou aumento de >60 ms em relação ao valor inicial em dois ECGs consecutivos; dobrar a creatinina sérica a partir do início ou desenvolvimento de lesão renal aguda segundo os critérios Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO); e qualquer evento adverso grau ≥3 de acordo com os Critérios Comuns de Terminologia para Eventos Adversos (CTCAE) considerado possivelmente, provavelmente ou definitivamente relacionado à vitamina D ou probucol. Eventos adversos graves foram reportados ao comitê de ética do hospital em até 24 horas.
Coleta e processamento de amostras biológicas
Amostras de sangue e urina foram coletadas antes do início do tratamento e após a conclusão do período de 8 meses. Todas as amostras foram coletadas pela manhã após um jejum noturno de 8 a 12 horas. Aproximadamente 20 mL de sangue venoso foram coletados usando técnicas padrão de flebotomia em tubos separadoros de soro e EDTA. As amostras de sangue foram deixadas coagular em temperatura ambiente por 30 minutos e centrifugadas a 1000 × g por 15 minutos a 4 °C. Os supernadantes séricos transparentes foram cuidadosamente aspirados sem perturbar o coágulo ou a camada buffy, alicotados em crioviais para diferentes ensaios, rotulados com identificação do participante, data e tipo de amostra, e armazenados a −80 °C até análise. Amostras de soro podiam ser armazenadas a −80 °C por até 12 meses.
Para a excreção urinária de proteínas de 24 horas (UPE de 24 horas), os participantes descartaram a primeira amostra de urina matinal às 7h do dia 1 e, em seguida, coletaram toda a urina, incluindo a primeira amostra matinal às 7h do segundo dia, em um recipiente de coleta fornecido. Os participantes foram instruídos a refrigerar o recipiente de coleta durante o período de coleta. O volume total de urina foi registrado, cuidadosamente misturado e alicotado para análise laboratorial. As amostras foram armazenadas a 4 °C quando analisadas dentro de 24 horas ou a −20 °C para análise posterior.
Para a razão albumina-creatinina urinária (UAlb/UCR), amostras de urina no meio da manhã foram coletadas em recipientes estéreis e processadas de forma semelhante. Os mesmos procedimentos foram repetidos após a conclusão do período de tratamento de 8 meses.
Análise de parâmetros bioquímicos e clínicos
Amostras de soro congelado foram descongeladas no gelo ou a 4 °C antes da análise da creatinina sérica (SCr). O SCr foi medido usando um ensaio colorimétrico enzimático em um analisador bioquímico automático, conforme as instruções do fabricante. A calibração diária era realizada usando calibradores multinível, e dois níveis de materiais comerciais de controle de qualidade eram incluídos em cada lote. As amostras foram analisadas em duplicado, e ensaios com coeficiente de variação >5% foram repetidos. O limite inferior de detecção para SCr era de 2,0 μmol/L.
A concentração de proteína em alíquotas de urina de 24 horas foi medida usando o método de pirogalol-vermelho-molibdato. Amostras foram analisadas em duplicado, e materiais de controle de qualidade foram incluídos em cada rodagem. Amostras acima da faixa de calibração (>3,0 g/L) foram diluídas com soro fisiológico normal e reavaliadas. A UPE de 24 horas foi calculada usando a concentração de proteína urinária e o volume total de urina.
As concentrações de albumina urinária e creatinina em amostras de urina da primeira manhã foram medidas usando o analisador bioquímico, e a razão UAlb/UCR foi posteriormente calculada.
Glicose plasmática em jejum (FPG) e glicose pós-prandial de 2 horas (2h-PPG) foram medidas usando um medidor de glicose validado e amostras de sangue por picadas capilares no dedo, conforme as instruções do fabricante.
A hemoglobina glicada (HbA1c) foi analisada usando cromatografia líquida de alta performance com um sistema dedicado de análise de HbA1c. Os participantes foram orientados a evitar medicamentos que reduzem lipídios por 7 dias e refeições ricas em gordura ou álcool por 24 horas antes da coleta de sangue pós-tratamento. Colesterol total sérico (TC), triglicerídeos (TG), colesterol lipoproteico de alta densidade (HDL-C) e colesterol lipoproteico de baixa densidade (LDL-C) foram medidos por meio de ensaios enzimáticos. Materiais de controle de qualidade em dois níveis foram analisados diariamente. Os parâmetros lipídicos foram inicialmente medidos em silicato, e amostras com coeficiente de variação >10% foram reavaliadas em duplicidade. Os limites de detecção eram 0,1 mmol/L para TC, 0,05 mmol/L para TG, 0,08 mmol/L para HDL-C e 0,10 mmol/L para LDL-C. Os valores de LDL-C foram determinados por ensaio direto ou pela equação de Friedewald quando os níveis de triglicerídeos estavam <400 mg/dL.
Função imunológica e análise de marcadores inflamatórios
As concentrações séricas de imunoglobulina G (IgG) foram medidas usando um kit comercial de IgG ELISA em humanos. A faixa de detecção do ensaio foi de 1,37–1000 ng/mL, a sensibilidade foi de 0,52 ng/mL, o coeficiente de variação intra-ensaio foi de <6% e o coeficiente de variação entre ensaios foi de <9%. Todas as amostras foram analisadas em duplicidade, e materiais de controle de alta e baixa qualidade fornecidos com o kit foram incluídos em cada placa. Placas com valores de QC fora de 2 desvios padrão dos valores-alvo foram rejeitadas e repetidas. Amostras acima do limite superior do padrão foram diluídas 1:2 e reavaliadas.
Todos os reagentes e amostras de soro foram equilibrados à temperatura ambiente antes da análise. As amostras de soro foram diluídas conforme as instruções do kit, tipicamente com diluição 1:100.000. Padrontas, amostras diluídas e blanks (100 μL) foram adicionados a poços apropriados de microplacas pré-revestidas e incubados a 37 °C por 90 min. Os poços foram lavados três vezes antes da incubação com anticorpo biotinilado de detecção por 60 minutos a 37 °C. Após lavagens adicionais, foi adicionado conjugado de peroxidase de raiz-forte e incubado por 30 minutos no escuro. Após a lavagem, a solução de substrato era adicionada e a mistura era incubada no escuro por 15 minutos antes de adicionar a solução de parada. A densidade óptica foi medida em 450 nm com comprimentos de onda de referência de 570 nm ou 630 nm. Curvas padrão foram geradas para calcular as concentrações de IgG.
Subconjuntos de linfócitos foram analisados por citometria de fluxo em um BD FACSCanto II equipado com lasers de 488 nm e 640 nm. A tensão de espalhamento direto foi ajustada para 300 V, a dispersão lateral para 350 V, e as tensões do tubo fotomultiplicador para canais FITC, APC e PE para 400 V, 550 V e 480 V, respectivamente. Os doublets foram excluídos usando o filtro FSC-A versus FSC-H.
A coloração de viabilidade foi realizada usando 7-aminoactinomicina D (7-AAD), e apenas eventos 7-AAD-negativos foram analisados. Amostras de sangue total foram distribuídas em tubos de ensaio sem coração, controle isotípico e ensaio. Anticorpos anti-humanos CD3-FITC, CD4-APC e CD8-PE foram adicionados aos tubos de ensaio, enquanto anticorpos isotipo-controle correspondentes foram adicionados aos tubos controle. As amostras foram incubadas no escuro em temperatura ambiente por 30 minutos. Os controles de compensação foram preparados com BD CompBeads, e a compensação automática foi realizada no software FACSDiva. Os glóbulos vermelhos foram lisados com tampão de lise para glóbulos vermelhos, depois lavados e ressuspensos em tampão de coloração contendo 7-AAD.
A configuração diária do citômetro e as contas de rastreamento eram usadas para controle de qualidade. A hierarquia de gating incluiu exclusão de duplos, seleção de linfócitos, gating de viabilidade, gating CD3+ e identificação de subconjuntos CD4/CD8. Pelo menos 50.000 eventos vivos de linfócitos foram adquiridos por amostra, com eventos totais adquiridos variando de 100.000 a 150.000. Os dados foram analisados usando o software FlowJo, e as porcentagens das células CD3+, CD4+ e CD8+, juntamente com as razões CD4+/CD8+, foram calculadas.
As concentrações séricas de hs-CRP, IL-6, TNF-α e MCP-1 foram medidas usando kits ELISA comerciais obtidos. As faixas e sensibilidades de detecção foram as seguintes: hs-CRP (0,07–12,5 ng/mL; sensibilidade 0,022 ng/mL), IL-6 (0,7–300 pg/mL; sensibilidade 0,35 pg/mL), TNF-α (1,6–100 pg/mL; sensibilidade 0,8 pg/mL) e MCP-1 (5–1000 pg/mL; sensibilidade 2,5 pg/mL). Todos os ensaios eram realizados em duplicado. Materiais de controle de baixa e alta qualidade estavam incluídos em cada placa. Os coeficientes de variação intra-ensaio foram <8%, e os coeficientes de variação entre ensaios foram <10%. Valores abaixo dos limites de detecção foram registrados como metade do limite inferior de quantificação, enquanto valores acima do padrão mais alto foram diluídos e reavaliados. As amostras passaram por apenas um ciclo de congelamento-descongelamento antes da análise. Os procedimentos ELISA de citocinas seguiram protocolos idênticos aos descritos para ELISA de IgG, de acordo com as instruções do fabricante sobre fatores de diluição, condições de incubação e temperaturas.
Avaliação de desfechos clínicos e gestão de dados
Ao final do período de tratamento de 8 meses, os médicos tratantes, cegos para a alocação de grupos, avaliaram o status clínico dos participantes. Os pacientes foram classificados como liberados quando todos os critérios pré-definidos de melhora clínica para nefropatia diabética foram atendidos por pelo menos duas semanas consecutivas: redução de ≥30% em UPE de 24 horas em comparação com o início inicial, estabilização ou melhora na eGFR definida como declínio <5 mL/min/1,73m² em relação ao income, e ausência de complicações agudas do diabetes ou outras condições que exigissem continuidade do cuidado hospitalar. Participantes que não atenderam a todos os critérios foram classificados como não tendo alta. As taxas de resposta clínica foram posteriormente calculadas para cada grupo.
Todos os dados demográficos, laboratoriais e clínicos coletados foram inseridos em um banco de dados eletrônico usando entrada dupla de dados por dois pesquisadores independentes. Verificações de alcance e de consistência foram realizadas para garantir a precisão dos dados. Os desfechos primários incluíram mudanças do basal a 8 meses nos parâmetros da função renal, incluindo UPE de 24 horas e UAlb/UCR, e parâmetros da função imunológica, incluindo percentual de células T CD3+ e razão CD4+/CD8+. Os desfechos secundários incluíram alterações do início ao período de 8 meses nos parâmetros glicêmicos (FPG, 2h-PPG, HbA1c), perfil lipídico (TC, TG, LDL-C, HDL-C), marcadores inflamatórios (HS-CRP, IL-6, TNF-α, MCP-1) e taxa de resposta clínica. Todas as medidas de desfecho foram avaliadas no início do tratamento, dentro de 48 horas antes do início do tratamento, e após o tratamento, dentro de 1 semana após a conclusão do período de tratamento de 8 meses.
Análise estatística
Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o software SPSS. Variáveis contínuas com distribuição normal foram expressas como média ± desvio padrão, enquanto variáveis categóricas foram expressas como frequência e porcentagem. Testes t com amostras independentes foram usados para comparações entre grupos, e testes qui-quadrado foram usados para variáveis categóricas. A significância estatística foi definida como P<0,05. Dada a natureza exploratória do estudo e o grande número de desfechos avaliados, os desfechos secundários não foram ajustados para multiplicidade. Portanto, os valores P foram considerados descritivos, e não confirmatórios. Devido ao desenho retrospectivo do estudo não randomizado, todas as comparações entre os grupos controle e observação não foram ajustadas para potenciais fatores de confusão, e a confusão residual pode ter permanecido. Todos os 150 pacientes inscritos (56 no grupo controle e 94 no grupo de observação) completaram o período completo de tratamento e acompanhamento de 8 meses. Nenhum paciente foi perdido para acompanhamento, retirado ou excluído após o alistamento. Nenhum dado ausente foi identificado para características iniciais ou medidas de desfecho, incluindo função renal, perfis de glicose e lipídios, marcadores imunes e fatores inflamatórios. Portanto, não eram necessários procedimentos de imputação.