Artigo de investigação

Nanopartículas Verdes de CuO/ZnO: Redução da Translocação e Acúmulo de AFB1 no milho

DOI:

10.3791/70906

⸱

5 de junho de 2026

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1Department of Agricultural Research and Specialist Services, Ministry of Agriculture, 2Faculty of Natural and Agricultural Science, Crop Science Department, North-West University, 3Food Security and Safety Niche Area, Faculty of Natural and Agricultural Sciences, North-West University, 4Department of Animal Science, School of Agricultural Sciences, Faculty of Natural and Agricultural Sciences, North-West University, 5Center for Animal Health Studies, Faculty of Natural and Agricultural Sciences, North-West University, 6Material Science Innovation and Modeling (MaSIM) Research Focus Area, Faculty of Natural and Agricultural Science, North-West University, 7Department of Chemistry, School of Physical and Chemical Sciences, Faculty of Natural and Agricultural Science, North-West University

Neste artigo

Resumo

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Este estudo investigou a eficácia de nanopartículas híbridas de CuO/ZnO sintetizadas em verde na redução do acúmulo e translocação de aflatoxina B1 (AFB 1) no milho, demonstrando que um tratamento de 125 mg/kg reduziu significativamente os níveis deAFB 1 e minimizou os riscos de exposição dietética em humanos e animais.

Resumo

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A aflatoxina B1 (AFB1) é um potente carcinógeno produzido pelas espécies de Aspergillus que contamina culturas de milho, representando graves riscos à saúde de humanos e animais devido à exposição alimentar. O manejo tradicional pós-colheita e as intervenções químicas são frequentemente custosos ou ineficazes para prevenir a translocação de toxinas transportadas pelo solo para a planta durante o crescimento. O objetivo principal deste protocolo foi avaliar nanopartículas híbridas de óxido de cobre/óxido de zinco (CuO/ZnO) sintetizadas em verde como uma emenda sustentável do solo pré-colheita. O estudo teve como objetivo determinar se esses NPs poderiam inibir efetivamente a translocação e o acúmulo deAFB 1 nos tecidos do milho, reduzindo assim o acúmulo de toxinas em grãos comestíveis. Utilizando um desenho randomizado em blocos completos em dois locais de campo distintos, o milho foi cultivado em solo inoculado com esporosAFB 1 ou Aspergillus flavus e tratado com concentrações variadas de NPs (0–125 mg/kg). O protocolo utilizou síntese verde com substrato de Pleurotus ostreatus para garantir a sustentabilidade ecológica. Tecidos vegetais foram analisados em diferentes estágios fisiológicos usando Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) para medir os níveis deAFB 1 e calcular avaliações de risco para humanos e pecuários. O tratamento com 125 mg/kg de NPs híbridos verdes diminuiu significativamente (p < 0,05) as concentrações deAFB 1 em todos os estágios de crescimento. No local do campus, aAFB 1 foi reduzida em 68% na fase vegetativa, 82% na floração e 76% na maturidade em comparação com o controle positivo. Crucialmente, os níveis de AFB 1 do grão caíram para 6,91 ppb, reduzindo significativamente a ingestão diária estimada para humanos. No entanto, pesquisas adicionais são necessárias para avaliar possíveis resíduos de nanopartículas e toxicidade de longo prazo. Esse método demonstra que os NPs híbridos verdes de CuO/ZnO atuam como um agente biorremediador eficaz, impedindo o transporte de toxinas para as partes comestíveis da planta. Essa abordagem oferece uma estratégia escalável e ambientalmente segura para aumentar a segurança alimentar e mitigar a exposição àAFB 1 em regiões propensas a aflatoxinas.

Introdução

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As aflatoxinas, especialmente a Aflatoxina B1 (AFB1), estão entre as micotoxinas mais significativas devido à sua prevalência, toxicidade e impacto nos humanos. Eles são produzidos por certos fungos, principalmente aqueles pertencentes à espécie Aspergillus 1,2,3. AFB 1 está ligada ao câncer hepatocelular e é a mais perigosa de todas asaflatoxinas 4. Esses potentes carcinógenos infectam uma variedade de culturas agrícolas, incluindo milho (Zea mays L.), causando sérias preocupações com a segurançaalimentar 5,6. A presença deAFB 1 no milho não afeta apenas a produtividade e a qualidade das culturas, mas também representa uma séria ameaça tanto à saúde humana quanto animal devido à exposiçãoalimentar 7,8.

Atualmente, o manejo da aflatoxina depende predominantemente de estratégias pós-colheita, como secagem adequada, triagem dos grãos danificados, tratamentos químicos (por exemplo, amônia ou ozônio), irradiação e armazenamento hermético para prevenir o crescimento fúngico duranteo armazenamento 9. As estratégias incluem bom manejo das culturas, agentes de biocontrole (como a cal) e melhorias nas instalações de armazenamento10. Tratamentos físicos e químicos, como micro-ondas, ultravioleta (UV), luz pulsada, água eletrolisada, plasma frio, ozônio, feixe de elétrons e irradiação gama, também foramtestados 11. No entanto, esses métodos pós-colheita costumam ser caros, consomem muita energia ou são impraticáveis para uso generalizado, e não impedem a translocação de aflatoxina dentro da planta durante o crescimento.

As abordagens pré-colheita utilizadas incluem práticas agronômicas como cultivares resistentes, plantio oportuno, irrigação para reduzir o estresse causado pela seca e biocontrole com cepas aflatoxigênicas de A. flavus (por exemplo, Aflasafe), que excluem competitivamente cepas toxigênicas, mas exigem aplicações repetidas e podem não abordar totalmente a translocação do solo 11,12,13. Esses métodos frequentemente enfrentam limitações: intervenções pós-colheita não conseguem reverter contaminação pré-existente, incorrem em altos custos para infraestrutura de triagem/armazenamento em ambientes com recursos limitados, correm risco de perda de nutrientes ou resíduos provenientes de produtos químicos, e a eficácia do biocontrole varia conforme as condiçõesambientais 14.

Em contraste, nanopartículas híbridas de CuO-ZnO sintetizadas em verde oferecem uma nova estratégia de correção do solo pré-colheita. Ao contrário dos NPs químicos convencionais, a síntese verde usando extratos vegetais (por exemplo, substrato de cogumelos) evita solventes tóxicos, reduz custos e aumenta a biocompatibilidade, tornando-os ambientalmentesustentáveis 15,16. A hibridização CuO-ZnO aumenta sinergisticamente a atividade antifúngica ao gerar espécies reativas de oxigênio (ROS), perturbando membranas fúngicas e fornecendo uma grande área superficial para a adsorção daAFB 1, prevenindo assim a absorção e translocação para partes comestíveis da planta, como grãos. Isso difere das estratégias existentes ao permitir intervenção precoce na interface solo-planta, alcançando até 80-99% de reduçãoAFB 1 em doses baixas (por exemplo, 125 mg/kg), sem comprometer a produtividade da cultura ou deixar resíduosnocivos 17. Principais vantagens incluem a sustentabilidade em comparação com fungicidas químicos, eficácia superior em comparação a NPs de metal único ou biocontrole sob condições variáveis de campo, e potencial para integração escalável em práticas agrícolas em regiões propensas a aflatoxinas, como a África Subsaariana.

Os NPs de óxido metálico, especificamente óxido de zinco (ZnO) e óxido de cobre (CuO), têm atraído atenção entre esses materiais devido às suas características antifúngicas e capacidade de absorvertoxinas 18,19. Por exemplo, foi relatado que os NPs de têm a capacidade de criar ROS, que podem prejudicar macromoléculas biológicas bacterianas efúngicas. Além disso, em outro experimento, foi demonstrado que cepas fúngicas apresentam uma mudança notável com uma clara tendência ao aumento da ordem quando F. solani foi tratada com NPs CuO baseados em quitosana, resultando no maior efeito deordenação 21. A síntese verde de NPs ganhou destaque como uma alternativa mais segura e sustentável aos métodos químicos convencionais, minimizando assim subprodutos tóxicos e o impacto ambiental15,22.

A hibridização de NPs de CuO e ZnO combina as propriedades benéficas de ambos os metais, potencialmente aumentando sua eficácia na degradação ou adsorção deAFB 123,24. Atualmente, esses NPs sintetizados em verde são usados principalmente para controlar a produção de FA em cepas fúngicas em experimentos in vitro; por exemplo, Sheik e Awad estudaram o impacto de AgNPs, AuNPs e sua mistura no crescimento e acúmulo de aflatoxinaB1 da cepa aflatoxigênica A. flavus 25. No entanto, a concentração necessária para controlar o crescimento de A. flavus é desconhecida. Assim, há uma necessidade crítica de avaliar híbridos verdes CuO-ZnO sob condições relevantes para o campo devido ao seu impacto na translocação daAFB 1 de fontes alteradas no solo para tecidos de milho, em comparação com NPs convencionais. Portanto, os objetivos deste estudo foram determinar o efeito de diferentes concentrações de NPs híbridos verdes de CuO/ZnO na concentração deAFB 1/A. flavus nos tecidos da planta de milho e avaliar o risco daAFB 1 no milho após tratar o milho com NPs híbridos verdes CuO/ZnO. Hipóteses de pesquisa deveriam fornecer uma base mecanicista para a eficácia observada dos NPs híbridos CuO-ZnO sintetizados em verde. Este estudo testa as seguintes hipóteses mensuráveis: 1) A hipótese da inibição antifúngica, na qual os NPs híbridos reduziriam significativamente a esporulação de A. flavus e a subsequente produção de novo AFB1 no solo em comparação com NPs de metal único, identificados por menor carga fúngica e níveis de toxina no local de Molelwane. 2) A hipótese de adsorção-translocação: na qual a presença de toxinas pré-existentes (local do campus), os NPs demonstraram alta afinidade de ligação paraAFB 1, diminuindo significativamente a taxa de translocação de toxinas do solo para o sistema radicular do milho. 3) A hipótese da biocompatibilidade (fitotoxicidade): na qual NPs híbridos sintetizados em plantas verdes resultariam em menor acúmulo residual de metais e redução dos marcadores de estresse oxidativo nos tecidos do milho em comparação com os parâmetros químicos convencionais, aumentando assim a biossegurança das culturas.

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Protocolo

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Locais experimentais
Os testes foram realizados em dois locais localizados a 7 km de distância; Os locais foram inoculados com diferentes tratamentos. No primeiro teste, uma instalação de rede com 40% de sombra foi instalada na Fazenda de Pesquisa Molelwane, Universidade do Noroeste (NWU) (25,810°S, 25,630°E, 1276 m) na Província do Noroeste da África do Sul. O solo de terra arenosa vermelha foi categorizado como forma Hutton e continha 75% de areia, 4% de lodo e 21% deargila (25). O segundo experimento foi realizado na instalação de rede do campus NWU Mafikeng (25. 8278 °S, 25. 6079 °E, 1276 m). Os solos do segundo sítio tinham terra arenosa com 82% de areia, 3% de silte, 15% de argila, e anteriormente eram classificados como Arcadia form25. Os NPs híbridos verdes CuO/ZnO foram sintetizados no laboratório do Departamento de Química, Escola de Ciências Físicas e Químicas, Faculdade de Ciências Naturais e Agrícolas, NWU, na África do Sul.

Síntese de NPs híbridos verdes CuO/ZnO
Dez (10) g de substrato seco de cogumelos usados (SMS) foram adicionados a 100 mL de água desionizada, aquecidos a 70 °C e mexidos por 2 h26. A mistura foi então resfriada até a temperatura ambiente, filtrada, e 30 mL do filtrado foram adicionados a uma solução contendo 2,5 g de acetato de cobre e 2 g de acetato de zinco em 30 mL de água destilada. O pH dessa solução foi ajustado para 8 usando hidróxido de sódio (NaOH), aquecido a 80 °C por 2 horas, centrifugado após a reação, secado durante a noite no forno e calcinado a 650 °C por 2 horase 26 horas. Os NPs sintetizados foram caracterizados e confirmados como NPs híbridos verdes CuO/ZnO.

Amostragem e análise do solo
Amostras de solo foram coletadas na University Farm em Molelwane e no local de testes do campus, em profundidades de 0–15 cm e 15–30 cm. Posteriormente, eles foram categorizados e examinados quanto às suas propriedades físicas e químicas, conforme descrito por27.

Desenho experimental
O estudo utilizou um experimento fatorial organizado em um desenho randomizado de blocos completos (RCBD) com três réplicas. Para avaliar a eficácia dos NPs híbridos CuO-ZnO sintetizados em verde sob diversos cenários de contaminação, dois modos de exposição independentes foram estabelecidos em locais distintos: o Site 1 (North-West University Campus) representou um modelo de contaminação exógena onde o solo foi adulterado com AFB1 extraído a uma taxa de 160 ppb/kg para avaliar as capacidades diretas de adsorção e proteção de translocação dos NPs. Local 2 (Molelwane Research Farm): Representou um modelo de infecção biológica onde o solo foi inoculado com esporos de A. flavus a 160 esporos/kg para investigar o impacto antifúngico dos NPs na produção de micotoxinas de novo e subsequente absorção da planta. Os NPs em pó foram pesados e misturados uniformemente com 1 kg de terra em um saco plástico de plantio após a inoculação (esporosAFB 1 ou A. flavus ). Cada tratamento era realizado separadamente, e as mãos eram higienizadas entre os tratamentos. Em seguida, quatro sementes de milho foram inicialmente plantadas em cada vaso (9 cm de diâmetro superior, 6,5 cm de diâmetro inferior). Para manter três mudas saudáveis por vaso, as mudas foram podadas uma semana após a emergência. De acordo com as recomendações para a produção ótima de milho derivadas da análise do solo, o solo foi fertilizado. Os vasos foram colocados em espaçamentos entre fileiras e entre fileiras de 0,75 m × 0,3 m, totalizando 216 vasos. O solo em vasos era regado até 60% da capacidade do campo após a semeadura. Amostras de solo e plantas foram coletadas em três estágios de desenvolvimento: V10 (desenvolvimento), R1 (floração) e R6 (maturidade). As amostras eram então levadas ao laboratório em uma caixa térmica cheia de gelo e mantidas a -20 °C para exames adicionais. Sacos de papel pardo eram usados para armazenar e congelar as amostras restantes das plantas para concentrações deAFB 1 e outros ensaios. As amostras restantes de plantas para concentrações deAFB 1 e outras análises foram guardadas em sacos de papel pardo e congeladas profundamente até a análise.

Análise das aflatoxinas do milho
Os componentes de desenvolvimento do milho (raiz, caule, folha e grão) em várias fases de crescimento eram reunidos em sacos plásticos estéreis, rotulados com cuidado e transportados para o laboratório. Para manter a integridade dos dados de crescimento e garantir observações independentes para cada estágio do desenvolvimento, foi implementado um protocolo de amostragem destrutiva. Para eliminar a contaminação cruzada entre concentrações de nanopartículas e tipos de inoculação, ferramentas de colheita e luvas foram limpas com etanol a 70% e enxaguadas com água desionizada entre cada grupo de tratamento. Usando um pilão, 10 g do material vegetal e 1 g de cloreto de sódio (NaCl) foram pulverizados por 10 minutos em 25 mL de metanol 80% e 20% de água destilada. Para grãos de milho e núcleo de milho, 25 g de amostra moída e 2,5 g de NaCl foram misturados com 100 mL de 80% de metanol:20 água destilada em alta velocidade por 10 minutos. Em seguida, o extrato homogeneizado foi filtrado por um filtro de microfibra de vidro, seguido por lavagem com 20 mL de 20% Tween-2 em soro salino tamponado com fosfato (PBS). Aflatoxinas foram extraídas da coluna de afinidade imune após a elução a uma vazão de uma gota por segundo, e o sobrenadante (citoplasma) foi coletado em um frasco âmbar. Em seguida,AFB 1 e outras aflatoxinas foram medidas seguindo o método de cromatografialíquida 28 , que envolveu derivatizar aflatoxinas com solução de o-ftaldialdeído e injetar os compostos derivatizados em um sistema de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). O sistema HPLC estava equipado com um detector de fluorescência Jasco FP-920 ajustado para excitação de 362 nm e emissão de 425 nm. AAFB 1 era inerentemente estruturada fisiologicamente para ser detectada em um comprimento de onda de excitação de 362 nm. Uma coluna Hichrom (4,6 mm × 150 mm) com partículas de 5 μm foi usada, e o reator de derivatização foi um programa KOBRA Cell a 100 μA. Separações dos picos cromatográficos foram feitas em uma coluna Hichrom à qual uma pré-coluna de fase estacionária semelhante foi instalada. O Inertsil ODS-3 e o ODS-3 V eram usados como cartuchos de proteção e analítico, respectivamente, enquanto o injetor consistia em um autoamostrador com uma válvula reodyne. A fase móvel era composta por água: metanol (65:35, v/v), brometo de potássio (119 mg) e 4 M de ácido nítrico (350 μL) por litro, e era bombeada a uma vazão de 1,0 mL/min em um programa isocrático. A detecção de aflatoxina foi considerada positiva para cada pico em um tempo de retenção semelhante a cada padrão e em uma altura cinco vezes maior que o ruído de base29.

Limites de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ) e porcentagem (%) de recuperação foram calculados para confirmar a abordagem analítica do HPLC, usando as equações 1, 2 e 3, respectivamente. A LOD é a menor concentração de aflatoxina que pode ser distinguida de forma confiável do ruído de fundo, enquanto a LOQ é a menor concentração de aflatoxina que pode ser medida quantitativamente com precisão e exatidãoaceitáveis: 30. AFB 1 e seus metabólitos foram recuperados adicionando 10 μL de padrões totais de aflatoxina (AFB 1,AFB 2, AFG1 e AFG2) às amostras controle negativas de milho em triplicado. As amostras foram então extraídas usando HPLC, utilizando os procedimentos mencionados anteriormente.

LOD = X + 3s 1

LOQ = X + 10s 2

figure-protocol-13

Onde: "X" é a concentração média dos valores em branco da amostra fortificada, e "s" é o desvio padrão da amostra.

Estimativa de exposição AFB1
Os níveis médios de aflatoxina na dieta do milho, a ingestão diária de milho e o peso corporal médio (crianças, adultos, gado de carne, vacas leiteiras e pintinhos) foram usados para calcular a ingestão diária estimada (EDI). A EDI média para aflatoxinas foi calculada de acordo com a equação 2 e expressa em (ng/kg peso corporal/dia); para o cálculo do índice de risco (HI), os valores de EDI foram convertidos em ng/kg peso corporal/dia (1 ppb/kg/dia = 1.000 ng/kg peso corporal/dia) para corresponder às unidades do TD503231.

figure-protocol-24

Avaliação de riscos e caracterização
O índice de perigo (HI) foi calculado dividindo o EDI pelo TD50 e multiplicando por um fator de segurança de 50.000. A dose tóxica mediana (TD) 50 é a dose necessária (ng/kg/peso corporal/dia) para causar tumores em 50% dos animais de teste que não teriam desenvolvido tumores na dosezero 31,32.

Análise de dados
A análise da variância foi realizada nos dados coletados de crescimento e rendimento utilizando o procedimento RCBD no SAS 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA). Múltiplas comparações das médias dos mínimos quadrados foram realizadas usando o teste de diferença honestamente significativa (HSD)33 de Tukey.

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Resultados

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Concentração de aflatoxina nos componentes do crescimento
Os resultados mostraram que concentrações de aflatoxina nos componentes de crescimento e em grãos de milho tratados com NPs de CuO/ZnO sintetizados em verde foram detectadas, indicando a presença de todos os principais tipos de aflatoxina (AFG2, AFG1, AFB2 e AFB1). As curvas de calibração usadas para calcular as concentrações de aflat...

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Discussão

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O sucesso deste protocolo na redução da translocação e acúmulo daAFB 1 no milho depende de várias etapas críticas que garantem tanto a eficácia biológica quanto a confiabilidadeanalítica 16,27. Os resultados demonstram que 125 mg/kg de NPs híbridos CuO-ZnO sintetizados em verde reduziram significativamente as concentrações deAFB 1 em ambos os modelos experimentais, embora por meio de mecanismos potencialment...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

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Esse trabalho foi apoiado por uma bolsa de doutorado da Northwest University e uma bolsa para a Faculdade de Ciências Naturais e Agricultura.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Acetato de cobre(II) [(CO2CH3)2]Sigma-Aldrich Pty, St Louis, MO, EUA10,53,753Sólido cristalino azul-esverdeado escuro (98% de pureza)
Filtro de microfibra de vidro Sigma-Aldrich Pty, St Louis, MO, EUA1703965Vidro borosilicato  
Sistema de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)Shimadzu20H2Para separação e quantificação de analitos  
Etanol de grau HPLCSigma-Aldrich Pty, St Louis, MO, EUA34923Solvente incolor de alta pureza ( ≥ 99 %)
Metanol de grau HPLCMerck KGaA, Darmstadt, Alemanha322415Solvente incolor de alta pureza ( ≥ 99 %)
Coluna de afinidade imuneShimadzuKJ524Para purificação seletiva de analitos-alvo
Sementes de milho da PAN 5R-590RNWKN/APequenos grãos duros com coluor branco
Soro salino tamponado com fosfato (PBS)Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha3526580Uma solução tampão isotônica  
Sacolas plásticasEco-Agro Enterprise (Pty) LtdN/APerfurado
AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 e AFs purificados - total in situLaboratório Analítico Trilogia, Inc (Vossbrink Drive, WA, EUA)TAS-M12DA1-10Branco a sólido cristalino branco sujo
Cloreto de sódio (NaCl)Sigma-Aldrich Pty, St Louis, MO, EUAN/ASólido cristalino branco
Acetato de zinco [Zn(CH3COO2)2H2O]Produtos químicos VWR2331 210 2Sólido cristalino branco (99% de pureza)

Referências

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