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Artigo de método

Isolamento e Cultura de Células Microvasculares Endoteliais do Cérebro de Camundongo

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DOI:

10.3791/70909

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17 de julho de 2026

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1Department of Basic Sciences, Vascular Physiology Laboratory, 2Biomedical Sciences Doctorate Program, Universidad de Talca, 3Faculty of Health Sciences, University of Talca, 4Group of Research and Innovation in Vascular Health, GRIVAS Health, 5Consortium for Research and Innovation Neurovascular (NEUROVAS)

Neste artigo

Resumo

Um protocolo é apresentado para o isolamento e cultura primária de células endoteliais microvasculares cerebrais (BMECs) a partir de tecido cerebral murino neonatal, a fim de gerar um modelo robusto in vitro para estudar a função da barreira hematoencefálica sob condições fisiológicas e patológicas.

Resumo

As células endoteliais microvasculares do cérebro (BMECs) são o principal componente celular da barreira hematoencefálica (BBB) e desempenham um papel fundamental na regulação do transporte molecular e na manutenção da homeostase do sistema nervoso central. Modelos in vitro confiáveis do endotélio cerebral são essenciais para estudar a fisiologia e disfunção da BBB em doenças neurológicas e sistêmicas. Um protocolo reproduzível para o isolamento e cultura primária de BMECs a partir do córtex cerebral murino neonatal é descrito. O método inclui dissecção de tecido cortical, dissociação mecânica e enzimática, remoção de detritos de mielina usando gradiente de densidade de albumina sérica bovina (BSA) e enriquecimento de células endoteliais usando imunoseleção baseada em CD31. Células isoladas são posteriormente cultivadas em placas revestidas de colágeno e caracterizadas por avaliação morfológica, detecção por imunofluorescência de marcadores endoteliais, ensaios de formação de tubos angiogênicos e medições de resistência elétrica transendotelial (TEER) para avaliar propriedades de barreira. Esse protocolo oferece uma abordagem confiável para obter culturas primárias de BMEC adequadas para investigar a biologia da BBB, sinalização endotelial e interações neurovasculares sob condições fisiológicas e patológicas.

Introdução

A barreira hematoencefálica (BBB) é uma estrutura altamente especializada que regula estritamente a troca de substâncias entre o sistema nervoso central (SNC) e a circulaçãosistêmica 1. A BBB é formada principalmente por células endoteliais microvasculares do cérebro conectadas por junções apertadas. Essas células endoteliais funcionam dentro de um sistema multicelular conhecido como unidade neurovascular (NVU), que também inclui astrócitos, perícitos, neurônios, células gliais e a membranabasal 2. Entre esses componentes, as células endoteliais microvasculares cerebrais (BMECs) desempenham um papel central ao formar uma camada contínua com junções apertadas, milhares de sistemas seletivos de transporte, tráfego vesicular limitado e ao restringir a infiltração de células imunes por meio da baixa expressão de moléculas de adesão que limitam a passagem de solutos e células para o parênquimacerebral 3,4.

Além de seu papel como barreira física e seletiva, os BMECs estão ativamente envolvidos em processos essenciais, incluindo sinalização neurovascular, regulação do fluxo sanguíneo cerebral, respostas imunes locais e, especialmente, angiogênesecerebral 5. Este último processo é fundamental durante o desenvolvimento embrionário, mas também é reativado em condições patológicas como AVC, isquemia ou inflamação. Os BMECs respondem a sinais proangiogênicos, como fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e fator de crescimento placentário (PLGF), coordenando a formação e maturação de novosvasos 6,7. Assim, uma disfunção endotelial cerebral comprometeria severamente a integridade da BBB e a homeostase cerebral.

Estudar os BMECs in vitro nos permite modelar tanto a fisiologia da BBB quanto os mecanismos que regulam a angiogênese cerebral. No entanto, isolar essas células do tecido cerebral apresenta desafios técnicos significativos devido à complexidade do tecido neural, à abundância de mielina e à necessidade de obter culturas com alta pureza endotelial. Embora existam linhagens celulares imortalizadas, elas apresentam limitações significativas em termos de seu fenotipo e representatividadefuncional 8.

Nesse contexto, os protocolos para cultivo primário de BMECs a partir de modelos murinos neonatais constituem uma poderosa ferramenta experimental, pois preservam muitas das características morfológicas, moleculares e funcionais do endotélio cerebral in vivo. No entanto, vários protocolos estabelecidos para isolamento murino de BMEC dependem da dissociação mecânica combinada com gradientes de densidade (dextrano ou Percoll), frequentemente resultando em enriquecimento endotelial variável e contaminação residual por perícitos, astrócitos e detritos demielina 9. A purificação baseada em antibióticos usando puromicina melhora a pureza endotelial (até ~95%), mas pode introduzir estresse celular devido à inibição da síntese proteica e aos potenciais efeitos no fenótipoendotelial 10. Alternativamente, abordagens baseadas em Filtragem Celular Ativada por Fluorescência (FACS) fornecem populações altamente purificadas, mas requerem equipamentos especializados e processamento extensivo, o que pode reduzir viabilidade eescalabilidade 11. Protocolos neonatais mais recentes evitam gradientes de densidade e reduzem o número de etapas de centrifugação, melhorando o rendimento e limitando acontaminação 12.

Com base nesse contexto, este trabalho descreve um protocolo otimizado para isolar e cultivar células endoteliais a partir da microvasculatura cerebral neonatal de camundongos. Esse método combina dissecação anatômica precisa, digestão enzimática eficiente, remoção de mielina usando gradiente de Albumina Sérica Bovina (BSA) e enriquecimento por imunoseleção com microesferas magnéticas conjugadas ao marcador CD31. O protocolo permite a obtenção de culturas primárias viáveis, reprodutíveis e enriquecidas, adequadas para estudos de angiogênese cerebral, interação neurovascular, sinalização endotelial e disfunção da BBB sob condições fisiológicas e patológicas.

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Protocolo

O Comitê de Bioética e Biossegurança da Universidade de Bío-Bío aprovou este projeto (bolsa Fondecyt 1240925). O trabalho com animais foi realizado de acordo com os princípios fundamentais dos três R's no uso de animaisexperimentais 13 e de acordo com as recomendações das Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicadas pelos National Institutes of Health dosEstados Unidos 14. Os animais eram mantidos em ambientes adequados no Bioterium da Universidade de Bío-Bío sob condições padrão de habitação (ciclo de 12 horas luz/escuro, temperatura controlada de 22 ± 2 °C, com acesso ad libitum a ração e água).

Para obter as células, foram usadas camundongos grávidas do tipo selvagem (WT) (C57BL/6), com idades entre 4 e 6 meses. Após o parto, os filhotes permaneceram com a mãe até o dia pós-natal 5 (P5). Nesse ponto, os filhotes eram profundamente anestesiados com isoflurano até a perda dos reflexos antes da eutanásia. A hipotermia era usada apenas como complemento para minimizar o movimento e era imediatamente seguida pela decapitação. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as Diretrizes da American Veterinary Medical Association (AVMA) para a Eutanásia de Animais (2020)15 e regulamentos internacionais para o cuidado e uso de animais de laboratório (NIH)14. O córtex cerebral foi isolado e utilizado para desenvolver esse protocolo experimental (ver Passo 3 do Protocolo). A Tabela de Materiais lista os materiais e anticorpos usados neste protocolo.

1. Preparação do meio de cultura endotelial

  1. Para preparar 500 mL de meio de cultivo para células endoteliais cerebrais murinas, em um recipiente estéril, misture 250 mL de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 250 mL de meio de cultura endotelial de células suplementado com 10% de FBS.
    NOTA: O meio de cultivo fornece fatores essenciais de crescimento endoteliais e apoia a proliferação celular. Se o produto referenciado (veja a Tabela de Materiais) não estiver disponível, suplementos equivalentes de células endoteliais (por exemplo, ECGS, hidrocortisona e L-glutamina) podem ser adicionados ao DMEM + FBS para alcançar condições de crescimentosemelhantes 16.
  2. Filtre todo o meio estéril (10% FBS) através de um filtro de 0,22 μm para garantir a esterilidade.
  3. Armazene o meio preparado a 4 °C até o uso. Prepare um médio fresco a cada 2 a 4 semanas para manter a atividade do fator de crescimento.

2. Revestir as placas de cultura

NOTA: Para promover a adesão celular e manter o fenótipo endotelial, as placas de cultura devem ser previamente revestidas com colágeno tipo I. Os passos desse processo são os seguintes:

  1. Prepare a solução de pré-revestimento misturando colágeno Tipo I (0,1 mg/mL), M de ácido acético para solubilizar o colágeno e meio basal estéril para atingir um volume total de 15 mL. Misture delicadamente até que o colágeno esteja totalmente dissolvido e ajuste a solução para pH 4,0 , se necessário. Filtre a solução por um filtro de 0,22 μm e deixe no gelo até o uso para preservar a estabilidade do colágeno.
    NOTA: O colágeno tipo I imita a membrana basal, apoia a fixação das células endoteliais e ajuda a manter o fenótipo celular.
  2. Homogeneize a solução sob condições estéreis. Aplique a solução de forma uniforme para cobrir toda a superfície das placas de cultura.
    NOTA: Apenas o volume necessário para cobrir a superfície é utilizado.
  3. Incube as placas a 37 °C durante a noite (12–16 horas) para permitir que o colágeno se adsorva corretamente. Antes de semear as células, remova o excesso de solução de revestimento e lave as placas duas vezes com solução fisiológica estéril 1x tamponada com fosfato (1x PBS, pH 7,4) para remover o ácido residual e o colágeno não ligado.

3. Isolamento de cultura de células mistas cerebrais

NOTA: Este protocolo se baseia em relatosanteriores 9,17 que buscavam isolar BMECs do córtex cerebral de camundongos P5.

  1. Sacrifique cinco filhotes de P5 usando anestesia profunda com isoflurano; Use a hipotermia apenas como complemento, seguida da decapitação cervical.
    NOTA: A partir desta etapa, todos os procedimentos devem ser realizados em um gabinete de segurança biológica de fluxo laminar.
  2. Colete os cérebros (Figura 1A) e coloque-os em PBS frio estéril (1x) em um tubo cônico de 50 mL até que todos os cérebros sejam processados.
  3. Separe as meninges rolando cuidadosamente cada cérebro sobre uma membrana de nitrocelulose esterilizada. Transfira os cérebros para uma placa de 100 mm contendo PBS frio (1x). Usando um bisturi estéril, remova o tronco encefálico, cerebelo, tálamo e bulbo olfatório (Figura 1B,C).
  4. Colete os córtices cerebrais livres de meninges resultantes e armazene-os em PBS frio (1x). Transfira imediatamente todo o córtex cerebral para um tubo cônico de 50 mL contendo 5 mL de PBS 1x no gelo (Figura 1D).
  5. Dissocie mecanicamente o tecido usando tesoura estéril, seguida de uma pipeta de 1 mL até que nenhuma parte seja observada e a suspensão seja homogênea (Figura 1E).
    NOTA: A ponta da pipeta pode ser cortada para reduzir o estresse mecânico durante a trituração. A dissociação do tecido é alcançada por sucção controlada e pipeteamento suave, enquanto uma abertura mais larga na ponta minimiza as forças de cisalhamento e a lise mecânica celular, preservando assim a viabilidade celular.
  6. Recolha todos os tecidos e coloque-os em tubos de 15 mL.
  7. Para digerir o tecido, transfira a amostra para um tubo cônico estéril de 15 mL contendo 2 mL de solução de colagênase (2 mg/mL em DMEM) e incube por 2 horas a 37 °C em um agitador orbital a 180 rpm.
  8. Após a digestão, adicione 5 mL de DMEM suplementado com 10% de FBS à suspensão e centrifuge a 3.000 × g . por 10 minutos (veja a Figura 1F). Descarte o supernadante.
  9. Para remover a mielina, ressuspenda o pellet em 4 mL de 20% de BSA em PBS (w/v) e centrifuge a 3.000 × g . por 20 minutos (Figura 1G). Após a centrifugação, remova cuidadosamente a camada superior leitosa contendo mielina usando uma pipeta Pasteur e descarte qualquer sobrenadante restante (Figura 1H).
  10. Ressuspenda o pellet em 2 mL de DMEM contendo 10% de FBS, depois centrifuge novamente a 3.000 × g. por 10 minutos. Descarte o sobrenadante e depois ressuspenda suavemente o último pellet em 1 mL de DMEM contendo 10% de FBS.
    NOTA: Neste estágio, a ressuspensão final contém uma população heterogênea de células derivadas do cérebro resultantes da dissociação tecidual. Essa mistura pode incluir células endoteliais microvasculares cerebrais, astrócitos, perícitos e outras células neurais. São necessárias etapas subsequentes de purificação e cultivo para enriquecer seletivamente os BMECs.
  11. Antes de colocar as células isoladas, remova a solução de revestimento das placas de cultura preparadas (veja Passo 2.3) e enxágue cada poço duas vezes com PBS estéril (1x).
  12. Seme as células ressuspensas (passo 3.10) nas placas revestidas (recomendado: placas de 60 mm).
    NOTA: Normalmente, toda a suspensão celular obtida de um isolamento é distribuída em um ou dois pratos revestidos, cada um contendo 5 mL de meio endotelial de crescimento.
  13. Mantenha as culturas em meio celular endotelial a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂. Substitua o médio a cada 2–3 dias. Quando as culturas atingem 90–100% de confluência, prossiga com a imunoseleção usando esferas revestidas com CD31 para enriquecer células endoteliais.
    NOTA: Após o isolamento e o estabelecimento inicial da cultura, o procedimento normalmente gera aproximadamente 5 × 106 células por preparação, que aderem às placas revestidas de colágeno e desenvolvem a morfologia característica de paralelepípedo das monocamadas endoteliais.

4. Isolamento de células endoteliais microvasculares cerebrais (BMECs) usando esferas magnéticas CD31

  1. Preparação e descolamento de células
    1. Quando as culturas atingirem 90–100% de confluência, lave as células 3 vezes com PBS (1x) para remover o meio residual.
    2. Adicione 1 mL de tripsina (0,5% 1x) à placa e incube por 3–5 minutos a 37 °C para destacar as células.
    3. Neutralize a tripsina adicionando 1 mL de meio de cultura endotelial com 10% de FBS. Transfira a suspensão da célula (~2 mL) para um tubo estéril de microcentrífuga e centrifuge a 220 × g. por 10 minutos a 4 °C. Descarte o supernadante.
  2. Preparação de esferas magnéticas CD31
    1. Coloque 8 μL de esferas magnéticas CD31 em um novo tubo de 15 mL. Lave as esferas com 1 mL de solução Hanks a 1%, ressuspendendo-as suavemente movendo o tubo.
    2. Coloque o tubo em um ímã por 2 minutos para precipitar as contas. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem mexer nas contas. Repita o passo de lavagem 3 vezes.
      NOTA: Sempre trabalhe próximo ao ímã para evitar perder as esferas e realize essa etapa em condições estéreis para evitar a contaminação da cultura celular primária.
  3. Incubação de células com esferas
    1. Resuspenda o pellet celular em 1 mL de solução de Hank a 1% contendo FBS (para reduzir a ligação inespecífica).
    2. Transfira as células para o tubo contendo as esferas pré-lavadas usando uma pipeta de 1.000 μL. Incube a mistura no gelo com uma sacudida suave por 20 minutos.
  4. Separação magnética de células endoteliais
    1. Coloque o tubo sobre um ímã por 3 minutos para precipitar células endoteliais ligadas a esferas.
    2. Remova o sobrenadante com cuidado.
      NOTA: Neste estágio, dois tipos celulares isolados podem ser purificados — uma célula endotelial (veja passo 4.5) e uma mistura de diferentes tipos de células cerebrais. Neste momento, duas opções estão disponíveis.
      1. Remova e descarte o sobrenadante (ou seja, a mistura de células cerebrais) mantendo o tubo no ímã. Lave as células ligadas às esferas (ou seja, células CD31+ ) com 2 mL de solução de Hank e repita 3 vezes.
      2. Usar o sobrenadante contendo detritos celulares para gerar uma nova cultura contendo células não selecionadas (por exemplo, fibroblastos, astrócitos, micróglias, neurônios, perícitos, entre outros).
  5. Cultivo de BMECs purificados
    1. Resuspenda as células endoteliais ligadas à esferas em 7 mL de meio endotelial completo (10% FBS).
    2. Semeie as células em uma placa de 60 mm previamente revestida com colágeno durante a noite (ver seção 2). Incubar em condições padrão (37 °C, 5% CO₂).
      NOTA: O fenótipo endotelial é preservado até a passagem (p) 3 sob as condições descritas da cultura. Para manter as propriedades relacionadas à barreira hematoencefálica, recomenda-se a realização de ensaios experimentais usando passagens iniciais (p0–p3).

5. Caracterização celular

  1. Observação microscópica de células capturadas em esferas
    NOTA: Sob as condições de cultura descritas neste protocolo, os BMECs primários podem ser mantidos por até três passagens (p3), preservando sua morfologia endotelial característica e fenótipo. Dependendo da densidade de semeadura e da taxa de crescimento, as culturas geralmente podem ser mantidas por aproximadamente 2 a 3 semanas in vitro antes que mudanças fenotípicas significativas possam ocorrer.
    1. Após a imunoseleção com esferas magnéticas CD31, observe as células acopladas sob um microscópio de contraste de fase (Figura 2A).
      1. Procure por células endoteliais CD31-positivas apresentando uma morfologia típica de paralelepípedo e formando monocamadas homogêneas em 5 a 7 dias.
        NOTA: Durante a imunseleção, esferas magnéticas revestidas com CD31 se ligam especificamente às células endoteliais, enriquecendo assim a população endotelial. Após o processo de seleção, as esferas (aproximadamente 4,5 μm de diâmetro) ainda podem ser observadas associadas ou internalizadas pelas células endoteliais durante as passagens iniciais. Esses casos normalmente diminuem com lavagens subsequentes e manutenção da cultura, e não interferem na viabilidade do BMEC ou no crescimento celular (Figura 2B).
      2. Use a morfologia uniforme e a ausência de células alongadas ou semelhantes a astrócitos para estimar a pureza da população endotelial.
  2. Imunofluorescência para CD31 e GLUT1
    1. Semente 2 × 10,3 BMECs em vestes cobertas de colágeno e cultura até atingir 80–90% de confluência.
    2. Fixe as células com paraformaldeído a 4% por 10 minutos em temperatura ambiente (22–25 °C) e lave com PBS.
    3. Permeabilize com 0,1% de Triton X-100 por 5 minutos e bloqueie a ligação não específica com 5% de BSA por 30 minutos.
    4. Incube durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra CD31 e GLUT1 (transportador de glicose específico para endotélio cerebral).
    5. Lave com PBS e incube por 1 h com os anticorpos secundários fluorescentes apropriados.
    6. Contra-colorir núcleos com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e montar os coverskirts com meio de montagem antifade.
    7. Visualize sob um microscópio de fluorescência ou confocal. Procure CD31 localizado nas bordas celulares (Figura 3A), enquanto GLUT1 mostra a distribuição citoplasmática e membrana, confirmando identidade endotelial e fenótipo do endotélio cerebral (Figura 3B).
      NOTA: Imagens representativas de isolamentos independentes de BMEC demonstram a morfologia típica e a expressão de marcadores de BMECs cultivados. A presença de proteínas de junção apertada, como a claudina-5, também pode ser usada para caracterizar o endotélio cerebral. Para avaliar melhor a pureza das culturas endoteliais, pode ser realizada coloração adicional por imunofluorescência usando marcadores negativos para outros tipos de células neurais. Por exemplo, a proteína ácida glial fibrilar (GFAP) pode ser usada para detectar astrócitos, e a molécula adaptadora ionizada de ligação ao cálcio 1 (Iba1) para identificar células microgliais. A ausência de coloração para esses marcadores confirma a ausência de contaminação por essas populações celulares não endoteliais (Figura 3C,D).
  3. Ensaio de formação de tubos
    NOTA: As células endoteliais exibem capacidade proangiogênica nos ensaiosMatrigel 18, e a identidade endotelial pode ser confirmada usando este ensaio.
    1. Pré-recubra uma placa de 96 poços com Matrigel e deixe polimerizar por 30 minutos a 37 °C.
    2. Semente 1 × 104 BMECs por poço em 100 μL de meio endotelial completo (FBS de 10%). Incube a 37 °C e monitore a formação do tubo ao longo de 4–8 horas usando um microscópio de contraste de fase (Figura 4A).
    3. Quantifique o comprimento total do tubo, número de junções e malhas usando o ImageJ (plugin Angiogenesis Analyzer)19. (Figura 4B).
      NOTA: A capacidade dos BMECs de formar estruturas tubulares interconectadas confirma seu potencial angiogênico e funcionalidade endotelial.
  4. Medição da resistência elétrica transendotelial (TEER)
    NOTA: As células endoteliais cerebrais devem formar uma barreira rígida, pois são um componente crítico daBBB 20. A capacidade endotelial de gerar uma barreira elétrica precisa ser confirmada.
    1. Semeie 20.000 BMECs em inserções Transwell revestidas de colágeno (tamanho de poro 0,4 μm) no compartimento superior e cultive até atingirem a confluência.
    2. Meça o TEER usando um voltômetro epitelial para avaliar a integridade da monocamada. Registrar os valores do TEER diariamente até a estabilização; um aumento da resistência indica a formação de junções intercelulares apertadas, características das barreiras endoteliais funcionais (Figura 4C).
      NOTA: Remanescentes da mistura celular não selecionada, incluindo astrócitos, podem ser usados para gerar um sistema de cocultura. Essa configuração requer uma otimização cuidadosa da razão celular entre os compartimentos superior (BMECs) e inferior (mistura celular não selecionada), o que deve ser padronizado em cada laboratório. Essa configuração de cocultura foi adaptada dos modelosBBB 21 descritos anteriormente.
    3. Semeie a mistura celular não selecionada (passo 4.4.2.2) no poço inferior da placa de cultivo e os BMECs no lado superior da membrana de inserção Transwell.
      NOTA: Um experimento representativo comparando condições de monocultura e cocultura foi incluído para avaliar a estanqueidade da barreira por meio de medições TEER (Figura 4C).

6. Expansão e manutenção de BMECs purificados

  1. Condições culturais
    1. Mantenha os BMECs purificados em meio de cultura endotelial completa (10% FBS) a 37 °C em uma incubadora umidificada (95% de umidade) com 5% de CO₂. Troque o meio de cultivo a cada 2–3 dias para fornecer nutrientes frescos e manter a viabilidade celular.
  2. Monitoramento do crescimento e morfologia celular
    1. Observe as culturas diariamente sob um microscópio de contraste de fase para monitorar a ligação celular, o crescimento e a morfologia. Procure pela morfologia característica de paralelepípedos dos BMECs, que formam uma monocamada confluente em 5–7 dias.
  3. Subcultura e passagem
    1. Quando as culturas atingem 80–90% de confluência, separe as células usando 0,05–0,1% de tripsina por 3–5 minutos a 37 °C.
    2. Neutralize a tripsina com volume igual de meio completo, centrifuge a 220 × g por 10 minutos a 4 °C e resuspenda a pastilha em meio endotelial fresco.
    3. Semeie as células em placas revestidas de colágeno na densidade desejada para expansão contínua.
      NOTA: Limite as passagens do BMEC a 3–5 para manter o fenótipo endotelial e a integridade funcional.
  4. Criopreservação opcional
    1. Para armazenamento a longo prazo, resuspenda os BMECs em meio congelante (10% de DMSO em meio endotelial completo). Congele gradualmente até –80 °C em um freezer de taxa controlada, depois transfira para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.

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Resultados

O protocolo descrito aqui permite o isolamento e a cultura de BMECs primários de camundongos neonatais (P5). Essas células são o principal componente celular da BBB e, portanto, são uma ferramenta experimental valiosa para o estudo da fisiologia e fisiopatologia cerebrovascular. O isolamento e cultura bem-sucedidos de células endoteliais microvasculares cerebrais (BMECs) foram demonstrados por meio de avaliações morfológicas, fenotípicas e funcionais.

O fluxo ...

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Discussão

O isolamento dos BMECs é uma ferramenta fundamental para estudar os mecanismos que regulam a fisiologia da BBB e sua disfunção em várias patologias do sistema nervoso central (SNC) 4,9, incluindo AVC. Ao contrário das linhagens celulares imortalizadas, as culturas primárias de BMEC preservam características fenotípicas e funcionais chave do endotélio cerebral, incluindo a expressão de proteínas fortemente ligadas e uma capacidade...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Partes deste manuscrito foram escritas com o ChatGPT da OpenAI (GPT-4, versão de julho de 2025) para melhorar a clareza, a linguagem e a coerência. Os autores revisaram criticamente, editaram e aprovaram todo o conteúdo assistido por IA. Nenhuma ferramenta de IA foi usada para análise de dados, interpretação de resultados ou geração de conclusões científicas.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer aos pesquisadores pertencentes à GRIVAS Health e ao NEUROVAS por suas valiosas contribuições. Este estudo foi financiado pela Fondecyt Regular 1240295.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas de cultura de 60 mmCorning430166
Placas de cultura de 96 poçosCorning41122107
Ácido acéticoSigma-AldrichA6283
Antibiótico-antimótico (opcional)Gibco15240062
Anti-CD31Santa Cruz sc-466941:100
Anti-GFAPThermo Fisher Scientific13-03001:500
Anti-GLUT1Abcamab1157301:200
Anti-Iba1Santa Cruzsc-327251:500
Anti-mouse IgG Alexa Fluor (corante 594)Thermo Fisher ScientificA-110051:500
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor  (corante 488)Thermo Fisher ScientificA-110081:500
Pipetas automáticas e serológicas Oxford LP  OXL.OXL.OSP-5C
Meio basal (para solução de colágeno)Gibco (DMEM)11965092
Álbumina sérica bovina (BSA)Sigma-AldrichA9647
Colagenase tipo IISigma-AldrichC6885
DAPIThermo Fisher Scientific622481 µg/mL
DMEM (glicose alta)Thermo Fisher Scientific11965092
Meio Completo EndoGRO-MVMerck MilliporeSCME004Meio de crescimento de células endoteliais
Tubos Falcon (15 & 50 mL)Corning®352096 / 352070
Soro Fetal Bovino (FBS)Gibco (Thermo Fisher)16000044
Microscópio de FluorescênciaMoticBA410
Luvas, máscaras, materiais de laboratórioVários fornecedores—
Heparina (100 U/mL)Sigma-AldrichH3393
Microscópio InvertidoOlympus CKX41
Ímã de separação magnéticaEasySep  NC9284020
Agitador Orbital (37 °C)Thermo Fisher ScientificSK-0180-S
ParafilmBemisPM996
PBS (1×)Thermo Fisher Scientific10010023
Centrífuga RefrigeradaHITACHICT5RE
BisturiFine Science ToolsVários
Tesouras e pinças finasFine Science ToolsVários
Membrana de nitrocelulose estérilBIO-RAD1620094
Colágeno Tipo ICorning 30394

Referências

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