Geração e Diferenciação de Organoides Epiteliais Olfativos Humanos a partir de Células-Tronco Adultas

Resumo

Este protocolo descreve uma abordagem estabelecida para isolar células progenitoras olfativas de tecido adulto superior de cornetos humanos para gerar organoides epiteliais olfativos. Também detalha uma estratégia de indução química para conduzir a diferenciação desses organoides em neurônios sensoriais olfativos maduros, permitindo assim a modelagem da neurogênese olfativa humana.

Resumo

O epitélio olfativo humano possui notável capacidade neurogênica, sustentada por uma população residente de células-tronco basais; No entanto, estabelecer um modelo dinâmico in vitro que recapitule fielmente esse processo regenerativo tem se mostrado desafiador. Aqui, apresentamos um protocolo estabelecido para gerar organoides olfativos a partir de células progenitoras isoladas de tecido de cornetos superiores humanos adultos. Esses organoides mantêm a caule, como evidenciado pela expressão de SOX2, e exibem um padrão de diferenciação espacialmente organizado, caracterizado pela expressão uniforme do marcador neuronal imaturo GAP43 e localização periférica do marcador sensorial olfativo maduro OMP. A diferenciação direcionada subsequente com o inibidor de Notch LY411575, o ativador de Wnt CHIR-99021 e ácido retinoico gerou células sensoriais sensoriais olfativas semelhantes a marcadores positivos que coexpressavam OMP e o marcador neuronal Tuj1 (classe III β-tubulina). Esse modelo derivado do ser humano contorna as limitações dos sistemas murinos e oferece uma plataforma robusta in vitro para estudar neurogênese olfativa, anosmia associada à COVID-19 e outros distúrbios neurodegenerativos relacionados ao olfato.

Introdução

O sistema olfativo humano suporta neurogênese ^contínua,1 um processo principalmente impulsionado por células-tronco basais no epitélio olfativo, especificamente nas células basais horizontais (HBCs) e nas células basais globosas (GBCs). ^2,3 GBCs diferenciam-se constitutivamente em neurônios sensoriais olfativos (OSNs), enquanto os HBCs permanecem quietos até serem ativados por lesão. ^4,5 A percepção olfativa começa quando moléculas odorantes se ligam aos receptores nos cílios dos OSNs, desencadeando uma cascata de transdução de sinal que retransmite informações para o bulbo olfativo e o córtex. ⁶ O desenvolvimento e a manutenção dessa função sensorial são regidos pelo epitélio olfativo.

A disfunção olfativa causada por insultos físicos, químicos ou biológicos frequentemente se resolve espontaneamente. ⁷ No entanto, afeta de 1,5% a 25% da população^{global 8} e pode resultar de diversas etiologias, incluindo trauma,9 infecções,10 e distúrbios neurodegenerativos como Alzheimer e doença de Parkinson¹¹; Nesses casos, a recuperação espontânea é frequentemente incompleta ou ausente. Abordagens terapêuticas atuais, como treinamento olfatório e administração de corticosteroides, mostram eficácia limitada. ^12,13 Essa lacuna terapêutica decorre de uma compreensão incompleta dos mecanismos que governam a sobrevivência e regeneração do neuroepitélio olfativo após lesão, uma lacuna de conhecimento agravada ainda mais pela inadequação dos modelos in vitro existentes para estudar a biologia olfativa humana.

Nos últimos anos, o desenvolvimento de diversos modelos de organoides humanos criou novas plataformas tecnológicas para o estudo de doenças humanas. ¹⁴ organoides derivados de células-tronco adultas (AdSCs), também chamadas de células-tronco residentes em tecidos, foram gerados com sucesso para uma variedade de tecidos derivados de endoderme, incluindo estômago, fígado, pâncreas, pulmões e bexiga. 15,16,17,18,19 Em contraste, estabelecer organoides epiteliais olfativos humanos a partir da placode olfativa derivada do ectoderma continua sendo tecnicamente desafiador. Um grande desafio prático é a dificuldade de obter consistentemente tecido epitelial olfatório viável do cornetado superior humano. A localização e a extensão da região olfatória variam consideravelmente entre indivíduos e apresentam degeneração acentuada relacionada à idade. A coleta inadvertida de epitélio respiratório em vez de olfatório compromete os resultados da cultura. Para resolver isso, refinamos o protocolo de 2021 de Ren et al., que cultivaram com sucesso aglomerados celulares a partir da mucosa olfativa ^humana,20 para gerar de forma confiável organoides epiteliais olfativos humanos. Nossa abordagem gera organoides epiteliais olfativos humanos com uma arquitetura tridimensional e hierarquicamente organizada e apoia sua diferenciação em neurônios sensoriais olfativos. Esse modelo oferece uma plataforma experimental valiosa para investigar os mecanismos que determinam o destino das células-tronco epiteliais olfativas e para a triagem de potenciais agentes terapêuticos para distúrbios olfativos.

Para resumir explicitamente, o objetivo principal desse método é estabelecer um fluxo de trabalho padronizado para gerar e diferenciar organoides epiteliais olfativos humanos a partir de células progenitoras adultas. A justificativa dessa abordagem é abordar a lacuna crítica criada pela ausência de modelos in vitro fisiologicamente relevantes do sistema olfatório humano. Comparado com culturas tradicionais de monocamada bidimensional (2D) ou modelos murinos, esse sistema tridimensional (3D), derivado do ser humano, oferece a vantagem distinta de recapitular fielmente a complexa organização espacial e o contexto genético específico do ser humano da mucosa olfativa. Para que os pesquisadores considerem esse protocolo, é essencial reconhecer que o isolamento preciso do epitélio olfatório viável do cornetado superior humano, evitando a contaminação com epitélio respiratório, é extremamente desafiador e altamente influenciado pela idade do paciente e pela variação anatômica individual. Consequentemente, esse protocolo é particularmente adequado para pesquisadores que têm acesso consistente a amostras clínicas humanas e buscam modelar neurogênese olfativa humana, anosmia induzida por vírus ou déficits olfativos associados a distúrbios neurodegenerativos.

Protocolo

Este estudo foi conduzido com aprovação do Conselho de Revisão Institucional (IRB) do Hospital da China Ocidental da Universidade de Sichuan (Aprovação nº 2024 (31)). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes participantes antes da coleta de tecidos e publicação dos dados. Amostras de tecido de cornetado superior foram obtidas de pacientes submetidos a cirurgia endoscópica da base do crânio ou cirurgia do seio etmoide para rinorreia do líquido cefalorraquidiano.

1. Processamento e transporte de amostras de tecido

1. Imediatamente após a coleta, coloque as amostras de tecido em um meio de transporte pré-frio e estéril, composto por meio basal DMEM/F12/HEPES suplementado com 10% de soro fetal bovino e 5% de solução de penicilina–estreptomicina, e transporte-as para o laboratório a 4 °C.
   NOTA: O soro ajuda a manter a viabilidade celular, enquanto a mistura antibiótica previne a possível contaminação microbiana durante o trânsito. Mantenha o tempo de transporte abaixo de 2 horas para preservar a viabilidade celular.

2. Pré-processamento de tecidos (realizado no gelo)

1. Transfira a amostra para uma placa de cultura pré-fria e estéril, remova o meio de transporte e lave o tecido com um tampão PBS modificado contendo 5% de solução de penicilina–estreptomicina. Faça a lavagem da seguinte forma: adicione 5 mL de solução pré-refrigerada à panela, toque suavemente o papel 5–7 vezes e depois aspire completamente o líquido. Repita esse ciclo de lavagem 3 vezes para remover células sanguíneas e detritos de tecido.
2. Usando microtesouras estériles, triture o tecido em fragmentos de aproximadamente 1–2^mm3.
   NOTA: Durante essa etapa, mantenha a hidratação dos tecidos, fixe-a com pinças de ponta romba e minimize o tempo de aparagem para preservar a viabilidade celular.

3. Digestão enzimática

1. Transfira o tecido mecanicamente dissociado para um tubo centrífugo de 15 mL e adicione 3 mL de tampão composto de digestão pré-aquecido (37 °C) (contendo 0,125% de tripsina e 10 U/mL de DNase I), mantendo uma relação enzima-volume de tecido de 3:1. Incube o tubo em um banho-maria a 37 °C com agitação suave por 20 minutos. Inspecione a amostra a cada 5 minutos para monitorar o progresso da digestão e evitar aglomeração de tecido.
2. Interrompa a digestão adicionando um volume igual de solução de terminação, DMEM/F12/meio basal HEPES suplementado com 10% de soro bovino fetal. Pipete suavemente a mistura para cima e para baixo 10 vezes para garantir a mistura completa e o contato eficaz entre as enzimas e os componentes inibitórios.
   NOTA: A α1-antitripsina presente no soro neutraliza eficientemente a atividade da tripsina.

4. Preparação da suspensão de célula única

1. Coloque um penador de célula de 40 μm sobre um tubo centrífugo de 50 mL. Usando uma ponta de pipeta de 1 mL aparada, transfira o tecido e o líquido digeridos do tubo de 15 mL para o peneirador. Enrole suavemente o material no filtro com a ponta da pipeta para facilitar a passagem, depois enxágue o penador com 1–2 mL adicionais de solução de terminação. Depois que todo o líquido passar pelo peneirador, transfira o filtrado do tubo de 50 mL para um novo tubo de centrífuga de 15 mL.
2. Centrifuge a suspensão a 300 × g por 5 minutos a 4 °C. Observe a granulação celular distinta no fundo do tubo e aspire cuidadosamente o sobrenadante, deixando aproximadamente 100 μL para evitar perturbar ou perder a célula.

5. Estabelecimento de um sistema cultural tridimensional

1. Sem ressuspender a célula em meio de cultura, combine-a diretamente com Matrigel usando uma ponta de pipeta pré-fria e de baixa ligação para alcançar uma densidade precisa de 10.000 células/μL. Dispense 40 μL dessa mistura célula–Matrigel em cada poço de uma placa de 24 poços e 20 μL em cada placa confocal de fundo de vidro. Incube as placas a 37 °C por 30 minutos para permitir que o Matrigel polimerize e forme um andaime tridimensional.
2. Após a solidificação do Matrigel, adicione suavemente 500 μL de meio de cultura de células-tronco neurais olfativos sem soro ao longo da parede do poço para evitar perturbar o gel. Mantenha as culturas em um incubador umidificado a 37 °C com 5% de CO₂, substituindo o meio a cada 3 dias por meio fresco pré-aquecido.
   NOTA: O meio olfativo de cultura de células-tronco neurais consiste em DMEM/F12/HEPES suplementado com os seguintes componentes: R-spondin 1 (200 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Wnt3a (50 ng/mL), EGF (50 ng/mL), Y-27632 (10 μM), um agente antimicrobiano primário (100 μg/mL), suplemento de N2 (1%), suplemento de B27 (2%) e L-glutamina (1%).

6. Passagens e diferenciação

1. Pré-resfrie a solução de recuperação de organoides no gelo por 10 minutos antes do uso; aspire o meio de cultivo dos poços e depois adicione 1 mL de solução de recuperação gelada em cada poço. Incline a placa em um ângulo de 45° e aspire suavemente e dispense a solução 5–7 vezes para desalojar organoides da matriz de membrana basal e transferir a suspensão resultante para um tubo centrífugo de 15 mL. Incube o tubo no gelo por 3–5 minutos, depois centrifuge a 300 × g por 5 minutos a 4 °C, e remova cuidadosamente o sobrenadante, deixando aproximadamente 100 μL de líquido para evitar a perda do pellet.
2. Adicione 1 mL de reagente de dissociação organoide diretamente ao pellet celular e incube o tubo a 37 °C com um leve sacudir a 220 rpm por 5 minutos. Termine imediatamente a digestão adicionando um volume igual de Solução Stop e pipete suavemente a mistura para cima e para baixo 5 vezes para garantir homogeneidade. Centrifuge a 300 × g por 5 minutos a 4 °C para coletar as células dissociadas.
3. Resuspenda o pellet celular em Matrigel a um volume de 40 μL por poço para placas de 24 poços ou 20 μL por poço para placas de cultura confocal com fundo de vidro; Misture cuidadosamente usando uma ponta de pipeta pré-fria e de baixo binding para garantir uma suspensão uniforme. Após semear nas placas ou pratos apropriados, incubar as construções a 37 °C por 30 minutos para permitir a polimerização com Matrigel e a formação tridimensional do andaime. Depois, adicione suavemente 500 μL de meio especializado de cultura esferoide sem soro para células-tronco neurais olfativas ao longo das paredes do poço, para evitar perturbar o gel. Mantenha culturas em incubadora a 37 °C com 5% de CO₂ e 95% de umidade relativa.
4. Aproximadamente 7 dias após a passagem, uma vez que a nova geração de organoides epiteliais olfativos tenha se reformado em esferoides, aspire o meio de expansão das placas confocais de fundo de vidro e o substitua por meio diferenciador. Substitua o meio de diferenciação por meio fresco, pré-aquecido, a cada 3 dias. Neurônios olfativos morfologicamente distintos tipicamente tornam-se aparentes sob microscopia após aproximadamente 7 dias de diferenciação.
   NOTA: O meio de diferenciação consiste em DMEM/F12/HEPES suplementado com R-Spondin 1 (200 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Wnt3a (50 ng/mL), EGF (50 ng/mL), Y-27632 (10 μM), LY411575 (5 μM), CHIR99021 (3 μM), ácido retinoico (AR, 1 μM), um agente antimicrobiano primário (100 μg/mL), suplemento de N2 (1%), suplemento de B27 (2%) e L-glutamina (1%).

7. Imunofluorescência

1. Aspire o meio de cultura e lave suavemente as amostras uma vez com 500 μL de PBS. Remova o PBS, depois adicione 500 μL de paraformaldeído a 4% e fixe as amostras em temperatura ambiente por 15 minutos. Aspire e descarte o fixador; depois, lave as amostras fixas com PBS (3 x 500 μL) e armazene-as a 4 °C por até 48 horas.
2. Aspire o PBS e adicione 500 μL de solução de permeabilização (0,2% Triton X-100 em PBS), incube por 15 minutos em temperatura ambiente, depois aspire e descarte a solução. Lave as amostras com PBST 0,02% (0,02% Triton X-100 em PBS; 3 x 500 μL).
3. Adicione 500 μL de solução bloqueante (3% de BSA em PBS) e incube por 1 hora em temperatura ambiente.
4. Aspire a solução bloqueante e substitua-a por 500 μL de solução primária de anticorpos, preparada diluindo o anticorpo primário apropriado (por exemplo, anti-GAP43 em 1:160, anti-OMP em 1:50 ou anti-SOX2 em 1:50) em solução bloqueante, e incube durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, aspire a solução primária de anticorpos e lave as amostras com PBST 0,02% (3 x 500 μL).
5. Adicione 500 μL de solução secundária de anticorpos, contendo um anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 488 ou Alexa Fluor 555 diluído 1:500 em solução bloqueante, e incube em temperatura ambiente no escuro por 1 hora. Aspire a solução secundária de anticorpos e realize lavagens adicionais com PBST 0,02% (3 x 500 μL).
6. Adicione 500 μL de solução de trabalho DAPI (DAPI diluído em PBS) e incube no escuro por 10 minutos para colorir os núcleos. Aspire a solução DAPI e lave as amostras com PBST a 0,02% (3 x 500 μL). Armazene as amostras coradas a 4 °C por até 48 horas antes da imagem.

8. Imagem por microscopia confocal

1. Realize microscopia confocal usando um tamanho no eixo Z de 1 μm para organoides com diâmetro de ≤100 μm e 0,5 μm para organoides maiores que 100 μm. Adquira imagens em modo sequencial multicanal, escaneando na seguinte ordem: DAPI, FITC, TRITC e Cy5. Importe os arquivos adquiridos da sequência de imagens da pilha Z para o software de renderização 3D (por exemplo, Imaris). Utilize a função de renderização de volume 3D para gerar um modelo tridimensional completo do organoide. Observe este modelo reconstruído para visualizar a distribuição espacial de marcadores celulares específicos (por exemplo, SOX2, GAP43 e OMP) e para confirmar qualitativamente a arquitetura hierárquica e o status de diferenciação neuronal dos organoides epiteliais olfativos como o ponto final final.

Resultados

Isolamento do tecido epitelial olfatório e cultura de organoides epiteliais olfativos primários
Para estabelecer um sistema de cultura para organoides epiteliais olfativos, isolamos o epitélio olfatório do tecido superior dos cornetados humanos e o incorporamos em uma matriz tridimensional de Matrigel (Figura 1). Com base nas condições definidas de cultura relatadas por Ren et al., validamos e ajustamos as concentrações dos principais fat...

Discussão

Organoides representam um modelo in vitro único porque sua arquitetura tridimensional auto-organizada recapitula de perto a dos tecidos humanos nativos e, em alguns casos, pode ser histologicamente indistinguível de órgãos reais. ¹⁴ Estabelecer modelos organoides humanos é, portanto, fundamental para estudar doenças humanas. Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um sistema de cultura organoide a partir de células epiteliais olfativas humanas primária...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ALEXA FLUOR 488 DONKEY	Thermo	A11055	1:500
ALEXA FLUOR 555 DONKEY	Thermo	A31572	1:500
Anti-GAP43 antibody	Abcam	ab75810	1:160
Anti-OMP antibody	SANTA CRUZ	sc-365818	1:50
Anti-Sox-2 antibody	SANTA CRUZ	sc-365823	1:50
B-27 Supplement	Gibco	17504044	2%
CHIR99021	Novoprotein	HY-10182	3 μM
DMEM/F12/HEPES	Procell	PM150310	/
Glutamax (L-glutamine supplement)	Gibco	35050061	1%
LY411575	Novoprotein	HY-50752	5 μM
Matrigel (basement membrane matrix)	Corning	356231	4% (Vol/Vol)
N-2 Supplement	Gibco	17502048	1%
Organoid Dissociation Reagent	Precedo	PRS-ODR	/
Organoid Recovery Solution	Thewellbio	MS04-100	/
Primocin (primary antimicrobial agent)	Invivogen	ant-pm-05	100 μg/mL
Recombinant Human EGF	Novoprotein	C029	50 ng/mL
Recombinant Human Noggin	Novoprotein	CB89	100 ng/mL
Recombinant Human RSPO1	Novoprotein	CX83	200 ng/mL
Recombinant Human Wnt3a	Novoprotein	C18K	50 ng/mL
Retinoic acid	MCE	HY-14649	1 μM
Y27632	MCE	HY-10071	10 μM