Esse método estuda como fibroblastos cutâneos senescentes afetam os saudáveis. A senescência é induzida por exposição à UVB, e o meio condicionado é aplicado aos fibroblastos normais. Ele ajuda a avaliar compostos bioativos que visam a comunicação celular alterada no envelhecimento da pele.
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Artigo de método
Nova combinação de antioxidantes para restaurar a comunicação intercelular saudável em um modelo in vitro usando meio condicionado de células senescentes
Neste artigo
Resumo
Resumo
O envelhecimento da pele é um processo multifatorial impulsionado por alterações nos níveis molecular e celular, também conhecidas como marcas do envelhecimento. Uma dessas alterações consiste na comunicação intercelular alterada, que contribui para disfunção do tecido cutâneo e danos estruturais. Aqui, é apresentado um modelo in vitro para imitar essas características do envelhecimento da pele incubando fibroblastos saudáveis com meio condicionado a partir de fibroblastos senescentes. Primeiro, fibroblastos irradiados por UVB podem ser analisados para detectar alterações na expressão gênica associadas ao fotoenvelhecimento. Segundo, um meio condicionado a partir de fibroblastos senescentes induzidos por UVB pode ser colhido e transferido para fibroblastos saudáveis, levando à regulação para baixo das proteínas da matriz extracelular e à alta da expressão gênica das citocinas pro-inflamatórias. Essas mudanças são neutralizadas pelo uso de uma nova combinação de antioxidantes (vitamina C + idebenona). Esses resultados demonstram que o modelo in vitro pode ser usado para avaliar a eficácia de novos compostos nas características do envelhecimento das células dérmicas da pele e, assim, para selecionar compostos que possam modular processos celulares regenerativos e de rejuvenescimento da pele.
Introdução
O envelhecimento da pele é o processo natural de diminuição das funções e propriedades da pele, incluindo perda de firmeza e elasticidade e aumento da flacidez. Isso é acelerado por fatores externos, como exposição ao ultravioleta (UV) e poluição, que danificam as células e causam alterações nonível molecular 1. Essas mudanças foram bem caracterizadas por pesquisas recentes e identificadas como marcas do envelhecimento, incluindo instabilidade genômica, atrito de telômeros, alterações epigenéticas, perda de proteostase, macroautofagia defeituosa, detecção de nutrientes, disfunção mitocondrial, senescência celular, exaustão de células-tronco, alteração da comunicação intercelular, inflamação crônica e disbiose2. Essas características explicam como o dano subcelular se traduz em disfunção tecidual, favorecendo assim o processo de envelhecimento. Curiosamente, essas alterações não agem de forma independente, mas formam uma assinatura de rede interdependente. Danos primários, como danos genômicos ou alterações epigenéticas, acumulam-se e eventualmente causam senescência celular. No caso da pele, isso é causado principalmente por danos causados pelos raios UV, sendo o fotoenvelhecimento o principal contribuinte para as características do envelhecimentoda pele 3. Células senescentes apresentam aumento na produção de citocinas pro-inflamatórias, metaloproteinases da matriz e fatores de crescimento, também conhecidos como fenótipo secretor associado à senescência (SASP) e que incluem IL6, IL8, MMP1, MMP3, TNFA ou IL1A, entre outros 4,5,6. Esses fatores secretados não afetam apenas as propriedades estruturais da pele, como a matriz extracelular dérmica, mas também prejudicam a função das células ao redor. Isso inclui a liberação de citocinas que estimulam a ativação dos melanócitos para provocar hiperpigmentação cutânea associada à idade (como o Fator de Células-Tronco ou IL18) ou outras proteínas prejudiciais que alteram a função dos fibroblastos saudáveis ao redor, comprometendo sua função e contribuindo para a amplificação aprimorada do fenótiposenescente 7,8,9,10,11. Como resultado, inflamação crônica e comunicação intercelular alterada são promotores-chave do estado prejudicial que traduz essas alterações moleculares em sinais visuais de envelhecimento da pele, como rugas, flacidez, manchas de idade ou perda de firmeza.
Os contribuintes proteicos específicos para os efeitos prejudiciais do SASP podem ser estudados por meio de técnicas bem conhecidas, como o ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA), Luminex, reação em cadeia quantitativa em tempo real da polimerase (qRT-PCR) ou Western Blot, entreoutros 5,12. No entanto, essa abordagem é útil para identificar proteínas específicas sob uma perspectiva individual e caracterizar um mecanismo de ação específico, mas não considera os efeitos do SASP completo nas células vizinhas. Aqui, um protocolo in vitro é proposto para estudar o efeito do SASP produzido por fibroblastos dérmicos senescentes induzidos por UVB em fibroblastos vizinhos saudáveis, imitando a característica alterada da comunicação intercelular do envelhecimento. Como mencionado anteriormente, o UV é o principal motor da senescência celular na pele. Assim, o dano UV é selecionado como fonte de dano em vez da senescência replicativa ou induzida por oncogênio para construir o modelo3 atual. Para isso, o meio contendo os fatores secretados pelos fibroblastos senescentes (meio condicionado) é utilizado, e marcadores de função celular são quantificados em fibroblastos saudáveis incubados com esse meio. Sob esse protocolo, uma vez que o meio condicionado foi transferido das células senescentes para as células saudáveis, fibroblastos senescentes induzidos por UVB são colhidos para quantificar características moleculares, como genes envolvidos na sinalização proinflamatória e paracrina. Em segundo lugar, fibroblastos saudáveis tratados com meio condicionado de fibroblastos senescentes são colhidos para caracterizar o efeito do SASP sobre células vizinhas, quantificando genes envolvidos na matriz extracelular, fatores de crescimento e ativação de fibroblastos. Assim, o efeito dos compostos de interesse (COI) é analisado tanto inicialmente em fibroblastos senescentes quanto posteriormente em fibroblastos saudáveis tratados com o meio condicionado. Sobre esses compostos, pesquisas anteriores mostraram que os antioxidantes são eficazes na proteção contra e na correção dos sinais do envelhecimento da pele induzido pela fotoenvelhecimento. Consequentemente, a combinação de dois antioxidantes (vitamina C e idebenona) é usada para reverter algumas das alterações induzidas pela UVB, tanto em células senescentes quanto em células saudáveis incubadas com meio condicionado a partir de célulassenescentes 13,14,15
No geral, este protocolo foi projetado para estudar os efeitos do SASP nas células da pele e identificar novas moléculas/intervenções que restaurem a comunicação intercelular alterada, sendo assim adequado para produtos regenerativos e bioestimulantes em medicina estética e dermatologia regenerativa.
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Protocolo
Fibroblastos dérmicos humanos usados neste estudo foram obtidos de um provedor comercial de linhagem celular. Como não houve amostras humanas primárias, dados de pacientes ou experimentos in vivo , não foram necessárias aprovações do Conselho de Revisão Institucional (IRB) nem consentimento informado para este estudo.
1. Indução de senescência em fibroblastos dérmicos usando UVB
- Placar fibroblastos dérmicos humanos com uma densidade de 6 × 104 células por poço em uma placa de 6 poços usando o Meio Eagle Modificado (DMEM) da Dulbecco, suplementado com Soro Bovino Fetal (FBS) a 10%.
- Após 24 horas, remova o meio de cultura celular e substitua-o por 1 mL de soro salino tamponado com fosfato (PBS) por poço.
- Irradie as células com luz UVB a 25 mJ/cm2.
NOTA: Essa energia foi otimizada para o dispositivo de irradiação UVB usado neste protocolo (veja Tabela de Materiais) para induzir danos suficientes para desencadear a senescência, evitando danos excessivos que possam levar à apoptose. Ao usar outros dispositivos, ajuste a energia de irradiação de acordo.
ATENÇÃO: A radiação UVB é perigosa. Use equipamentos de proteção e blindagem adequados para evitar a exposição. - Remova PBS e adicione 2 mL de meio de cultura celular fresca por poço.
- Após 72 horas, remova o meio de cultura celular, adicione 1 mL de PBS por poço e repita a irradiação UVB conforme descrito no passo 1.3.
- Após 72 horas, remova o meio de cultura celular e adicione 0,5 mL de 0,05% de tripsina-EDTA por poço. Incube por 1–2 minutos a 37 °C, depois colhe as células usando 1,5 mL de meio de cultivo celular fresco.
- Placar as células com uma densidade de 8 × 104 células por poço em uma placa de 6 poços usando meio de cultivo celular (DMEM suplementado com 10% de FBS). A senescência celular é induzida após essa etapa.
2. Tratamento de células senescentes com compostos de interesse
- Após 24 horas, remova o meio de cultura celular e adicione 2 mL de meio de cultura celular contendo compostos de interesse.
- Após mais 24 horas, placar um lote separado de fibroblastos dérmicos humanos (conforme descrito no passo 1.1) em placas de 6 poços. Essas células servirão como fibroblastos dérmicos saudáveis para a transferência do meio condicionado.
3. Transferência condicionada de meio de células senescentes para células saudáveis
- Às 48 horas após o tratamento composto das células senescentes e 24 horas após a colocação dos fibroblastos saudáveis, colete 2 mL de meio condicionado por poço das células senescentes e transfira-o para os fibroblastos saudáveis.
NOTA: Remova o meio de cultura dos fibroblastos saudáveis imediatamente antes de adicionar o meio condicionado para garantir uma transferência eficiente. - Adicione 1 mL de PBS às células senescentes e colha-as usando tripsina, conforme descrito no passo 1.6. Use essas células para análise de marcadores de senescência ou inflamação usando um kit ELISA ou qPCR.
NOTA: Pellets celulares podem ser armazenados a −80 °C se ensaios a jusante não forem realizados imediatamente. - Incubar fibroblastos saudáveis que recebam meio condicionado a 37 °C com 5% de CO₂ por 24 horas.
4. Células saudáveis coletam para análise de ativação de fibroblastos por análise de expressão gênica
- Após 24 horas de incubação com meio condicionado, colhe fibroblastos saudáveis usando tripsina conforme descrito no passo 1.6. Analise a expressão gênica da matriz extracelular por qPCR.
- Realize análise qPCR.
- Extraia RNA de pellets celulares conforme as instruções do fabricante (kit de extração de RNA).
- Realize a transcrição reversa de 200 ng de RNA conforme as instruções do fabricante (kit de transcrição reversa).
- Amplifique o cDNA conforme as instruções do fabricante (mistura master qPCR). Realize a qPCR sob as seguintes condições: 95 °C por 30 s, seguido por 40 ciclos de 95 °C por 5 s e 60 °C por 30 s. Os primers usados estão listados na Tabela 1.
| Gene | Sequência direta | Sequência reversa |
| CDKN2A | 5'-GGCATTGTGAGCAACCACTG-3' | 5'-CCTGTAGGACCTTCGGTGAC-3' |
| CDKN1A | 5'-CTGGAGACTCTCAGGGTCGAA-3' | 5'-CCAGGACTGCAGGCTTCCT-3' |
| SCF | 5'-AATCCTCTCTCGTCAAACTGAAGG-3' | 5'-CCATCTCGCTTATCCAAATGA-3' |
| IL-18 | 5'-TGCAGTCTACACAGCTTGG-3' | 5'-GTTTGTTGCGAGAGGAAGGG-3' |
| ELN | 5'-GCAGGAGTTAAGCCCAAGG-3' | 5'-TGTAGGGCAGTCCATAGCCA-3' |
| FBN1 | 5'-GGTGAATGTACAAACACAGTCAGCAG-3' | 5'-ATAGGAACAGAGCAGCTTGTTGA-3' |
| IL-6 | 5'-AGCCCTGAAAGGAGACATGTA-3' | 5'-TCTGCCAGTCTCTCTTTGC-3' |
| IL-8 | 5'-ATTTCTGCGCCTGTGTGTGTGAAGGT-3' | 5'-TTTTTTATGAATTCTCAGCCCTCT-3' |
| CTGF | 5'-GGAAATGCTGTGAGGAGTGGGT-3' | 5'-TGTCTTCCAGTCGGTAGGCAGCTA-3 |
| IGF1 | 5'-CAGAGCAGATAGAGCCTGCG-3' | 5'-CAGGTAACTCGTGCAGAGCA-3' |
Tabela 1: Lista de primers usados para ensaios qPCR. Sequências diretas e reversas são fornecidas para cada primer correspondentes aos genes estudados e quantificados neste modelo.
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Resultados
O protocolo atual descreve um método para simular a alteração da comunicação intercelular característica do envelhecimento in vitro. A Figura 1 apresenta um esquema gráfico ilustrando as principais etapas do protocolo, incluindo indução de senescência, quantificação de marcadores e análise da alteração da comunicação intercelular em células da pele in vitro.
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Discussão
Compreender o processo de envelhecimento em nível molecular é fundamental para projetar novas abordagens e intervenções que retardem características relacionadas ao envelhecimento e prolongem a longevidade e funcionalidade das células e tecidos. A definição e identificação das marcas do envelhecimento foram essenciais para estabelecer um arcabouço científico para o desenvolvimento dessasintervenções 2,16. Entre as marcas reconhec...
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Divulgações
Todos os autores foram empregados pelo Mesoaesthetic Pharma Group, S.L.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer aos colaboradores pela ajuda e conselhos neste projeto.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 6-well plates | Fisher Scientific | 10578911 | Placas multipoço para cultura celular a serem usadas durante o ensaio (indução de senescência e tratamento com compostos) |
| Bio-LINK Crosslinker BLX-312/36 (dispositivo de irradiação UVB) | Vilber Lourmat | VL-6111-1090-1 | Dispositivo usado para produzir danos por irradiação UVB e, consequentemente, induzir senescência |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Merck Life science | D6046-500ML | Meio de cultura celular padrão para fibroblastos dérmicos |
| Soro fetal bovino (FBS) | Fisher Scientific | 17593595 | Suplemento nutritivo usado como fonte de fatores de crescimento, hormônios, proteínas e micronutrientes essenciais para o crescimento celular |
| Kit ELISA H3K27me3 | Epigentek | P-3014T-096 | Uma imunoensaio específico para detectar a modificação epigenética de H3K27me3 em amostras biológicas |
| Fibroblastos dérmicos humanos | Promocell | C-12302 | Principal célula da pele na derme e regulador do fotoenvelhecimento da pele |
| Soro tamponado de fosfato (PBS) | Merck Life science | D8537-500ML | Solução tampão que imita o ambiente fisiológico. Usado para lavar células sem induzir estresse ou reduzir a viabilidade celular |
| PrimeScript RT reagent kit (kit de transcrição reversa) | Takara Bio | RR037A | O kit para obter cDNA do RNA isolado das células. 2ª etapa para ensaio qPCR após purificação de RNA. |
| TB Green Premix Ex Taq (mix master qPCR) | Takara Bio | RR420A | O kit para produzir a reação em cadeia da polimerase a partir de cDNA para quantificar os níveis de expressão gênica. 3ª etapa para ensaio qPCR após transcrição reversa. |
| Kit de purificação de RNA total (kit de extração de RNA) | Norgen | 17200 | O kit para obter RNA das células colhidas. 1ª etapa para ensaio qPCR após colheita das células. |
| Trypsin/EDTA 0,05% | Merck Life science | T2601-100ML | Solução enzimática usada nas etapas de colheita/passagem para dissociação das células das placas de cultura celular |
Referências
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Reimpressões e permissões
