A Propentofilina Alivia a Hiperalgesia Incisional ao Regular a Fosforilação de ERK1/2 em Astrócitos e Microglia Espinhais

Xu Jin; Na Zhou; Lixiong Tuo; Yisa Shi

doi:10.3791/70927

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Artigo de investigação

A Propentofilina Alivia a Hiperalgesia Incisional ao Regular a Fosforilação de ERK1/2 em Astrócitos e Microglia Espinhais

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DOI:

10.3791/70927

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14 de agosto de 2026

Xu Jin¹ , Na Zhou² , Lixiong Tuo¹ , Yisa Shi³

¹Department of Anesthesiology, Zhang Ye People's Hospital Affiliated To Hexi University, ²Department of Stomatology, Zhangye Hospital of Traditional Chinese Medicine, ³Department of Anesthesiology, The Second Hospital & Clinical Medical School, Lanzhou University

Neste artigo

Resumo

Este estudo investiga o efeito da propentofilina administrada intratecalmente na atenuação da hiperalgesia pós-incisão e se esse efeito está associado a alterações nos marcadores gliais espinhais e na fosforilação da quinase regulada por sinal extracelular 1 e 2 em ratos.

Resumo

Astrocytos espinhais, micróglias e a quinase regulada por sinal extracelular 1 e 2 (ERK1/2) estão implicados no processamento da dor. Este estudo investigou se a propentofilina (PPF) intratecal pré-operatória atenua a hiperalgesia aguda pós-incisão em ratos e se esse efeito está associado a marcadores gliais espinhais e à fosforilação de ERK1/2. Sessenta e seis ratos machos Sprague–Dawley foram aleatoriamente distribuídos em grupos branco, dor incisional, solução salina normal, dimetil sulfóxido, PPF e U0126. A hiperalgesia mecânica e térmica foi avaliada no momento basal e 2, 4, 8, 24 e 72 h após a incisão. Marcadores neuronais e gliais espinhais, p-ERK1/2 e mediadores inflamatórios foram avaliados por Western blot e imunofluorescência. Experimentos com astrócitos espinhais primários foram adicionalmente utilizados para examinar a liberação de mediadores inflamatórios dependente de ERK1/2. A PPF intratecal pré-operatória atenuou a hiperalgesia mecânica e térmica durante todo o período de observação de 72 h, enquanto o U0126 atenuou a hiperalgesia principalmente no período inicial pós-incisão. Aos 4 h após a incisão, ambos os tratamentos foram associados à redução da expressão espinhal de GFAP, Iba-1 e p-ERK1/2 e à diminuição da imunorreatividade de TNF-α e COX-2. Em astrócitos cultivados, a PPF reduziu a liberação de mediadores inflamatórios induzida por LPS, enquanto a ERK1/2 constitutivamente ativa atenuou esse efeito. Esses achados sustentam uma associação entre o efeito antipalpável da PPF e a modulação das respostas gliais espinhais, relacionadas a ERK1/2 e inflamatórias após a incisão.

Introdução

A dor incisional, um tipo comum de dor aguda após procedimentos cirúrgicos, geralmente não persiste por mais de 7 dias, mas possui mecanismos patológicos complexos que diferem dos mecanismos da dor inflamatória e neuropática¹^,². Se a dor incisional não for bem controlada durante seu desenvolvimento, pode evoluir para síndrome de dor crônica, e sua natureza pode mudar de dor aguda por lesão tecidual para dor neuropática ou mista³. Em geral, a administração de analgésicos, como opioides e drogas anti-inflamatórias não esteroides, é a forma mais comum de analgesia após incisão. No entanto, muitos efeitos colaterais podem ocorrer com o uso contínuo ou em altas doses dessas substâncias, uma situação que ressalta a necessidade de estratégias analgésicas mais seguras e eficazes.

Evidências confiáveis indicam que a propentofilina (PPF) alivia a hiperalgesia em diferentes processos dolorosos⁴^,⁵. Além disso, o efeito analgésico da PPF pode ser parcialmente obtido pela inibição da expressão medular das proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs), como p38 e as quinases N-terminais de c-Jun (JNKs)⁶. Embora os efeitos da PPF sobre as vias p38 e JNK já tenham sido estabelecidos, sua possível modulação da via da quinase regulada por sinal extracelular 1 e 2 (ERK1/2), outra subfamília crítica de MAPKs implicada na sinalização da dor, permanece inexplorada na dor incisional aguda. Esta lacuna no conhecimento é particularmente importante, dado que a ativação da ERK1/2 apresenta padrões temporais e celulares distintos em comparação com p38 e JNK, sugerindo potenciais oportunidades terapêuticas únicas.

As células gliais, incluindo astrócitos, micróglias e oligodendrócitos, foram inicialmente consideradas a estrutura de conexão e suporte do tecido nervoso. No entanto, estudos recentes demonstraram que astrócitos e micróglias desempenham um papel importante na regulação da plasticidade sináptica e na transmissão de informações sobre dor⁷. Como macrófagos residentes do cérebro e da medula espinhal, as micróglias podem ser ativadas por diversos sinais extracelulares no estágio inicial do processo doloroso e, em seguida, proliferam e liberam grandes quantidades de citocinas inflamatórias, o que aumenta a condução dos sinais de dor da medula espinhal para o cérebro⁸^,⁹. Concomitantemente, astrócitos ativados podem aumentar a liberação do neurotransmissor excitatório glutamato e enviar informações diretamente para neurônios sensoriais, potencializando a comunicação intercelular¹⁰.

Estudos demonstraram que a ativação de astrócitos ocorre no estágio inicial (nas primeiras 24 h) da dor induzida por incisão, enquanto a ativação de micróglias aparece muito mais tarde¹¹^,¹². Além disso, um estudo indicou que micróglias ativadas têm um efeito limitado na hiperalgesia mecânica na dor induzida por incisão¹³. Esses achados destacam questões contínuas sobre os papéis distintos de astrócitos e micróglias na dor aguda. A propentofilina, um agente modulador da glia, tem sido relatada como capaz de aliviar a hiperalgesia ao regular a ativação de astrócitos e micróglias após lesão nervosa constritiva crônica, lesão nervosa aguda e lesão aguda de tecido⁴^,⁵. No entanto, até onde se sabe atualmente, nenhum estudo examinou os efeitos da PPF sobre a ativação de astrócitos ou micróglias na dor aguda induzida por incisão.

A quinase regulada por sinal extracelular 1 e 2, uma importante subfamília de MAPK ativada a jusante da proteína quinase ativada por mitógeno 1 e 2 (MEK1/2), tem sido amplamente implicada no processamento nociceptivo e na plasticidade neuronal¹⁴^,¹⁵. Estudos anteriores demonstraram que a ERK1/2 fosforilada (p-ERK1/2) pode ser induzida em neurônios espinais por estímulo nociceptivo e também pode ser detectada em astrócitos e micróglia em estados de dor inflamatória ou neuropática¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Além disso, relatou-se que a inibição farmacológica da sinalização MEK1/2–ERK1/2 atenua a hiperalgesia mecânica e térmica em diversos modelos de dor²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵.

No entanto, a distribuição celular da ERK1/2 medular, particularmente em astrócitos e micróglias, ativada por uma incisão aguda, e seu papel na dor induzida por incisão permanecem insuficientemente definidos. Estudos anteriores do grupo de pesquisa indicam que o PPF alivia a hiperalgesia aguda pós-incisão em ratos por meio da redução da sinalização medular JNK e p38, mas permanece incerto se o PPF também modula a sinalização relacionada à ERK1/2 em células gliais medulares durante a dor induzida por incisão. Assim, o presente estudo deve ser considerado uma extensão das bases atuais sobre glias e MAPK na pesquisa da dor, e não um paradigma mecanicista completamente independente. Sua principal distinção em relação aos trabalhos anteriores reside no foco específico na dor pós-incisão aguda, na análise da ERK1/2 em vez da p38/JNK como componente de MAPK de interesse, e na avaliação da distribuição celular medular precoce da p-ERK1/2 em relação ao tratamento com PPF.

Este estudo foi planejado para investigar se a administração intratecal pré-operatória de PPF atenua a hiperalgia incisional em um modelo de incisão plantar em ratos e se esse efeito está associado à fosforilação de ERK1/2 ou a alterações na expressão de marcadores neurais e gliais espinhais e mediadores inflamatórios, fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e ciclo-oxigenase-2 (COX-2). Mais especificamente, este estudo difere dos relatos anteriores por combinar avaliação comportamental com análise temporal por Western blot; por sua comparação farmacológica com o inibidor MEK1/2 U0126; e por sua localização qualitativa por imunofluorescência de p-ERK1/2 em neurônios espinhais, astrócitos e micróglias dentro de um modelo de dor incisional aguda. Embora seu arcabouço mecanicista se baseie em literatura prévia que associa modulação glial e sinalização MAPK à dor, o presente trabalho tem como objetivo fornecer evidências adicionais sobre o possível envolvimento de respostas gliais relacionadas ao ERK1/2 espinhal na fase inicial da hiperalgia incisional.

Em comparação com analgésicos pós-operatórios convencionais, abordagens direcionadas a vias específicas podem testar um componente definido de sinalização, mas podem oferecer benefícios apenas por tempo limitado e exigir administração invasiva; a inibição de MEK1/2–ERK1/2 demonstrou efeitos antialodinicos em diversos modelos experimentais de dor²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵. O PPF difere de um inibidor de via única porque modula as respostas gliais e está associado a mais de um processo relacionado à MAPK⁴^,⁵^,⁶. A aplicação prática permanece limitada pelo delineamento pré-clínico, administração intratecal pré-operatória, uso exclusivo de ratos machos e ausência de estudos de faixa de dose e segurança em modelos cirúrgicos maiores.

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Protocolo

Os experimentos realizados foram aprovados pelo Comitê de Ética do Segundo Hospital Afiliado da Universidade de Lanzhou, Província de Gansu, China (número de aprovação ética 2017-070). Todos os procedimentos seguiram as diretrizes da Associação Internacional para o Estudo da Dor²⁶. Foram utilizados um total de 66 ratos machos adultos Sprague–Dawley, obtidos de um centro credenciado de animais de laboratório, pesando entre 200–250 g. Apenas ratos machos foram incluídos neste estudo para reduzir a variabilidade potencial relacionada a influências hormonais dependentes do sexo. Todos os protocolos foram realizados de acordo com as diretrizes da Associação Internacional para o Estudo da Dor²⁶, e foram tomados todos os esforços necessários para minimizar o sofrimento. Informações detalhadas sobre os reagentes, consumíveis, instrumentos e softwares utilizados neste estudo são fornecidas na Tabela de Materiais.

Animais

Os ratos foram mantidos aos pares antes da operação e individualmente após a incisão, com alimento e água ad libitum. A sala foi mantida em um ciclo de 12 h de luz e 12 h de escuro, com temperatura controlada em 24 °C ± 2 °C.

Injeção intratecal e modelo de dor incisional

Para a administração intratecal de soluções, os ratos foram anestesiados com 1,5%–3% de sevoflurano (administrado por meio de cone nasal) e posicionados em decúbito ventral com a coluna vertebral flexionada. Os pelos da região lombar foram raspados e a pele sobre o espaço intervertebral L5–L6 foi desinfetada. Uma microseringa foi inserida percutaneamente no espaço intervertebral L5–L6. A entrada bem-sucedida no espaço subaracnóideo foi indicada por um movimento súbito da cauda ou tremor da cauda durante a progressão da agulha e foi confirmada adicionalmente pela presença de líquido cefalorraquidiano ao realizar uma leve aspiração. Caso esses sinais não fossem observados, a posição da agulha era ajustada antes da injeção. A injeção foi realizada somente após o cumprimento dos dois critérios de confirmação, e os animais que apresentaram sinais neurológicos anormais após a injeção foram excluídos. A solução respectiva foi então injetada lentamente, e a pele foi limpa novamente após a injeção. O procedimento cirúrgico durou aproximadamente 3 min, e os ratos geralmente se recuperaram da anestesia em 5–10 min.

O modelo de dor incisional em ratos foi estabelecido conforme descrito anteriormente²⁷. Após a anestesia, a superfície plantar da pata traseira foi desinfetada com iodopovidona a 10%. Foi feita uma incisão longitudinal de 1 cm na pele plantar, iniciando aproximadamente a 0,5 cm do calcanhar e estendendo-se em direção aos dedos. A incisão penetrou a pele e a fáscia. O músculo plantar foi suavemente elevado com pinça oftálmica e incisado longitudinalmente, preservando a continuidade tecidual geral. Em seguida, o músculo foi reposicionado, aplicou-se leve pressão para obter hemostasia e a ferida foi fechada com dois pontos em matelassê usando náilon 3-0. O local da incisão foi novamente desinfetado após o fechamento da ferida. Após a cirurgia, os ratos foram mantidos individualmente e tiveram permissão para se recuperar em um ambiente tranquilo e aquecido, protegidos da luz intensa e com livre acesso a alimento e água. Os animais foram monitorados no pós-operatório, e aqueles que não atendiam aos critérios pré-definidos foram excluídos prontamente. A infecção da ferida foi determinada com base em vermelhidão, inchaço e aumento da temperatura local ao redor da ferida, exsudato purulento amarelo-esverdeado anormal com mau cheiro, cicatrização retardada com abertura persistente da ferida, necrose e aumento de tamanho, além de sinais sistêmicos como temperatura corporal elevada, letargia e recusa em se alimentar. Critérios adicionais de exclusão incluíram falha na recuperação da anestesia dentro de 30 minutos, transecção muscular intraoperatória ou lesão neurovascular, automutilação no pós-operatório, falha no estabelecimento do modelo e déficits neurológicos, como paralisia da pata traseira ou incapacidade de suportar peso não relacionada à dor incisional. Ratos com infecção ou deiscência da ferida foram excluídos do estudo.

Medição comportamental

O limiar mecânico de retirada da pata (PWMT) e a latência térmica de retirada da pata (PWTL) foram medidos por um investigador cego quanto à alocação dos grupos. Os testes foram realizados em um ambiente silencioso, sempre no mesmo horário do dia, após pelo menos 10 minutos de aclimatação; a caixa, o piso de malha ou de vidro, a luminosidade ambiente e a intensidade da fonte de calor foram mantidas constantes entre os grupos. Para o teste do PWMT, filamentos von Frey calibrados (0,4 g, 0,6 g, 1,0 g, 1,4 g, 2,0 g, 4,0 g, 6,0 g, 8,0 g, 10,0 g e 15,0 g) foram aplicados perpendicularmente à superfície plantar adjacente à ferida até que o filamento se curvasse aproximadamente 1–2 mm. Estimulações consecutivas foram separadas por 2 minutos, e o PWMT de 50% foi determinado pelo método ascendente-descendente²⁸. Para o teste do PWTL, os ratos foram colocados em caixas transparentes individuais sobre um piso de vidro, e a fonte de calor radiante foi alinhada com a superfície plantar ao lado da ferida. Um limite de corte de 30 s evitou lesão tecidual, exposições consecutivas foram separadas por 2 minutos, e a média de três medições foi registrada²⁹. A elevação da pata, agitação ou lambida foram consideradas resposta positiva de retirada; ensaios afetados por comportamento de higiene, locomoção ou perda de alinhamento da fonte de calor foram repetidos após reaclimatação.

Análise de Western blot

Nos momentos predeterminados, os ratos foram eutanasiados por dislocação cervical, e a medula espinhal lombar L4–L6 foi rapidamente coletada em tampão de lise para ensaio de radioimunoprecipitação suplementado com inibidor de protease na proporção de 100:1. Os tecidos foram homogeneizados, mantidos no gelo por 20 min e centrifugados a 15.000 × g durante 20 min a 4 °C. O sobrenadante foi misturado com tampão de carregamento 4× na proporção de 3:1, aquecido em água fervente por 5 min e armazenado a −80 °C. Amostras de proteína (30 µg por poço) foram separadas em géis de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio a 10% e transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno de 0,45 ou 0,22 µm. A transferência bem-sucedida foi verificada pela confirmação da migração esperada do marcador de peso molecular pré-colorido e pela ausência de regiões de transferência desiguais ou interrompidas. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% e albumina sérica bovina a 3% por 2 h à temperatura ambiente e incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra NeuN (1:8.000), GFAP (1:4.000), Iba-1 (1:3.000), p-ERK1/2 (1:1.000), t-ERK1/2 (1:3.000) ou GAPDH (1:2.000). Após lavagem em solução salina tamponada com Tris contendo Tween 20 a 0,05% (pH 7,4), as membranas foram incubadas com o anticorpo secundário conjugado à peroxidase do rábano silvestre correspondente (1:5.000) por 1 h à temperatura ambiente. Os sinais foram revelados por quimioluminescência aumentada e registrados em filme usando o mesmo intervalo de exposição dentro de cada alvo. Um pesquisador cegado quanto à alocação dos grupos analisou a densidade das bandas com software de análise de imagens. As imagens foram convertidas para escala de cinzas de 8 bits, uma região retangular idêntica de interesse foi aplicada a cada banda, o fundo local de uma região adjacente em branco foi subtraído e a densidade integrada foi registrada. O mesmo tamanho de região e procedimento de fundo foram utilizados para todas as amostras em um mesmo blot. NeuN, GFAP, Iba-1 e t-ERK1/2 foram normalizados em relação a GAPDH; p-ERK1/2 foi normalizado em relação a t-ERK1/2; e os valores foram então expressos em relação ao grupo controle.

Imunofluorescência

Nos momentos predeterminados, os ratos foram anestesiados com pentobarbital sódico a 3% (1,5 mL/kg) e perfundidos pelo coração com 300 mL de solução salina tamponada com fosfato 0,01 mol/L pré-resfriada (PBS; pH 7,4), seguida por 250 mL de paraformaldeído a 4% pré-resfriado. A medula espinhal L4–L6 foi pós-fixada em paraformaldeído a 4% por 6 h, crioprotegida durante a noite em sacarose 20%–30% em PBS a 4 °C e cortada em seções de 10 µm a −22 °C. As seções foram lavadas em PBS 0,01 mol/L, bloqueadas em soro de cabra a 10% por 1 h à temperatura ambiente e incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra NeuN (1:100), GFAP (1:1.000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) ou COX-2 (1:50). Após três lavagens com PBS, as seções foram incubadas com o anticorpo secundário conjugado a fluoróforo verde ou vermelho correspondente (1:400) por 1 h à temperatura ambiente, lavadas mais três vezes em PBS e montadas com meio antidesvanecimento e lamínula. Seções de controle negativo processadas sem o anticorpo primário foram incluídas em cada lote de coloração. As imagens foram adquiridas por um investigador cego com um microscópio de fluorescência. Imagens gerais de baixa ampliação foram adquiridas usando uma objetiva de 10×, enquanto imagens de imunorreatividade celular e de co-localização foram adquiridas usando objetivas de 20× ou 40×, conforme o painel da figura correspondente. Para comparações dentro da mesma figura e lote de coloração, a ampliação da objetiva, intensidade de iluminação, tempo de exposição, ganho do detector, configurações da câmera e parâmetros de processamento de imagem foram fixados após otimização abaixo da saturação. Canais de fluorescência separados foram adquiridos sequencialmente para minimizar a sobreposição de canais. Três campos não sobrepostos no corno dorsal ipsilateral foram capturados por animal. A intensidade de fluorescência foi quantificada com software de análise de imagem após conversão para 8 bits, subtração de fundo usando uma região livre de células e aplicação de uma região de interesse e limiar idênticos dentro de cada lote de coloração; os valores dos campos foram médios para obter um valor por animal. Campos com superexposição, dobramento tecidual, rasgo, foco ruim ou fundo irregular foram excluídos e readquiridos nas mesmas condições não saturantes. A coloração foi aceita quando a arquitetura tecidual estava intacta, o sinal-alvo excedia o controle sem anticorpo primário e nenhuma dobra, rasgo ou região saturada significativa afetava a análise.

In vitro experimentos primários com astrócitos espinhais

Astrocytes primários de medula espinhal de rato foram cultivados em condições estéreis padrão, em meio de cultura completo, a 37 °C em incubadora umidificada com 5% de CO₂. As células foram utilizadas quando atingiram cerca de 70%–80% de confluência e foram alocadas nos grupos controle, estimulado com LPS, LPS + PPF, LPS + U0126 e resgate de ERK1/2. PPF e U0126 foram adicionados na concentração de 10 µM. A estimulação com LPS, o tratamento com fármacos e as condições de coleta foram mantidas idênticas entre poços paralelos em cada experimento. Para análise de seletividade da via, os lisados celulares foram coletados para Western blot de p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, p38 total, p-JNK, JNK total e o controle de carregamento correspondente. Os sobrenadantes da cultura de poços paralelos foram coletados, clarificados por centrifugação e analisados quanto a TNF-α, PGE2 e IL-6 por ensaio imunoenzimático ligado a anticorpos (ELISA), conforme instruções do fabricante. A densitometria de Western blot seguiu os mesmos princípios de análise de imagem descritos anteriormente. Para os experimentos de resgate, a ERK1/2 endógena foi suprimida por transfeção com siRNA, e um construto de expressão de ERK1/2 constitutivamente ativa (CA-ERK1/2) foi introduzido antes do tratamento. A eficiência do silenciamento e superexpressão foi confirmada por Western blot antes da interpretação dos dados de citocinas. Células expostas ao reagente de transfeção sem siRNA ativo ou construto serviram como controles procedimentais quando aplicável.

Planejamento experimental

Subdivisão dos animais experimentais

Os ratos foram distribuídos em seis grupos utilizando um método de tabela de números aleatórios, e a alocação dos grupos foi concluída antes dos testes comportamentais e da coleta de tecidos. Os seis grupos compreendiam um grupo branco (n = 6), um grupo com dor incisional (IP) (n = 18), um grupo com solução salina normal (NS) (NS a 0,9%, 10 µL; n = 9), um grupo PPF (10 µg em 10 µL; n = 12), um grupo de dimetilsulfóxido (DMSO) (DMSO a 10%, 10 µL; n = 9) e um grupo U0126 (10 µg em 10 µL; n = 12). Os ratos do grupo branco não receberam nem incisão plantar nem injeção intratecal e serviram como controles não tratados. Os ratos do grupo IP foram submetidos à incisão plantar sem pré-tratamento por injeção intratecal. Os ratos dos grupos NS, PPF, DMSO e U0126 receberam administração intratecal dos respectivos agentes 30 minutos antes da incisão plantar. O grupo NS serviu como controle veicular para o PPF, enquanto o grupo DMSO serviu como controle veicular para o U0126.

Doses de propentofilina e U0126

A propentofilina é um modulador glial, e uma dose de 10 µg foi selecionada porque aliviou a hiperalgesia aguda em estudos anteriores realizados pelo grupo de pesquisa. O U0126 é um inibidor não competitivo com relação ao trifosfato de adenosina da MEK1/2, utilizado para bloquear a fosforilação da ERK1/2. Doses intratecais eficazes de 1–10 µg foram relatadas em diversos modelos de dor³⁰^,³¹^,³²; a dose de 10 µg foi utilizada no presente estudo. O U0126 foi dissolvido em 10% de dimetilsulfóxido, enquanto o PPF foi dissolvido em solução salina normal a 0,9%. As concentrações finais foram de 1 µg/µL. Fármacos e veículos foram preparados antes da cirurgia, mantidos a 4 °C e utilizados dentro de 12 h.

Efeito da administração intratecal pré-operatória de propentofilina ou U0126 na hiperalgesia

Seis ratos de cada grupo foram aleatoriamente selecionados para a avaliação comportamental 24 h antes da operação, e os valores resultantes de TPMA e TPLP foram designados como basais. As injeções intratecais foram administradas 30 min antes da operação. Para avaliar os efeitos da administração intratecal pré-operatória de PPF e U0126 na hiperalgesia mecânica e térmica, o TPMA e o TPLP foram avaliados em 2 h, 4 h, 8 h, 24 h e 72 h após a incisão.

Desenho experimental para avaliar os efeitos da administração intratecal pré-operatória de propentofilina ou U0126 sobre a expressão de marcadores neuronais e gliais na medula espinhal após incisão

Para determinar o ponto temporal pós-incisão apropriado para a avaliação do efeito do tratamento, uma análise preliminar de curso temporal foi inicialmente realizada no grupo IP. Especificamente, ratos do grupo IP foram eutanasiados 2 h, 4 h, 24 h e 72 h após a incisão, e os níveis de expressão dos marcadores celulares NeuN, GFAP e Iba-1 na medula espinhal foram medidos por Western blot (n = 3 por ponto temporal). Com base nesta análise preliminar, as primeiras 4 h pós-incisão foram selecionadas como uma janela de observação precoce, pois a expressão de NeuN atingiu seu nível mais alto no ponto temporal de 4 h e porque considerou-se que as alterações moleculares precoces são as mais relevantes para o desenvolvimento inicial da hiperalgesia pós-incisão. No entanto, o ponto temporal de 4 h não teve a intenção de representar todas as alterações moleculares temporais após a incisão.

Neste ponto de tempo selecionado, ratos que haviam recebido uma injeção intratecal foram eutanasiados para análise por Western blot de diferentes marcadores celulares (n = 3 por grupo) e avaliação por imunofluorescência da morfologia de diferentes tipos celulares (n = 3 por grupo). No grupo controle, os ratos foram aleatoriamente sacrificados para determinar os níveis basais de expressão de diferentes marcadores celulares (NeuN, GFAP e Iba-1) na medula espinhal por Western blot (n = 3) e a morfologia de diferentes células (neurônios, astrócitos e micróglias) por imunofluorescência (n = 3). Assim, o grupo controle serviu como controle basal não incisado e não tratado.

Efeitos do tratamento na p-ERK1/2 medular e nos mediadores inflamatórios

Para determinar o ponto temporal pós-incisão apropriado para avaliar os efeitos do tratamento na expressão de p-ERK1/2 e nos níveis de citocinas inflamatórias, uma análise preliminar de curso temporal foi inicialmente realizada no grupo IP. Especificamente, ratos do grupo IP foram eutanasiados 2 h, 4 h, 24 h e 72 h após a incisão, e a expressão de p-ERK1/2 na medula espinhal foi medida por Western blot (n = 3 por ponto temporal). Com base neste experimento de curso temporal, juntamente com o ponto temporal em que a expressão de NeuN foi mais alta após a incisão, 4 h após a incisão foi selecionado como o ponto temporal fixo para a avaliação subsequente dos efeitos da administração intratecal pré-operatória de PPF ou U0126 na expressão de p-ERK1/2 e citocinas inflamatórias na medula espinhal. Esse ponto temporal foi escolhido como uma janela de observação mecanicista precoce, e não como uma representação abrangente de todas as alterações temporais após a incisão.

Neste ponto temporal selecionado, ratos que tinham recebido uma injeção intratecal foram eutanasiados para análise por Western blot da expressão de p-ERK1/2 (n = 3 por grupo) e avaliação por imunofluorescência de citocinas inflamatórias (n = 3 por grupo). No grupo controle, os ratos foram sacrificados aleatoriamente para determinar os níveis basais de expressão de p-ERK1/2 na medula espinhal por Western blot (n = 3) e de citocinas inflamatórias (TNF-α e COX-2) por imunofluorescência (n = 3). Assim, o grupo controle serviu como controle basal sem incisão e sem tratamento.

Localização celular de p-ERK1/2 medular em neurônios, astrócitos e micróglias

Para avaliar mais a distribuição celular da p-ERK1/2 espinhal após a incisão, foi realizada coloração por imunofluorescência nos grupos Controle e IP em 4 h após a incisão (n = 3).

Análise estatística

Os dados são expressos como média ± desvio padrão. O tamanho da amostra foi determinado com base em estudos anteriores do grupo de pesquisa e em experimentos preliminares. Os dados comportamentais foram analisados por análise de variância (ANOVA) de duas vias com medidas repetidas, utilizando o grupo como fator entre sujeitos e o tempo como fator dentro dos sujeitos. Os dados de western blot ao longo do tempo foram avaliados por ANOVA de um fator, seguida de comparações pareadas ajustadas pelo método de Bonferroni. Os dados de western blot e imunofluorescência em tempo fixo foram avaliados por ANOVA de um fator com comparações planejadas ajustadas pelo método de Bonferroni; comparações entre dois grupos foram avaliadas pelo teste t de Student. A normalidade e a homogeneidade da variância foram verificadas pelos testes de Shapiro–Wilk e de Levene, respectivamente. Um valor de p bicaudal < 0,05 foi considerado significativo. As análises estatísticas foram realizadas com o software de análise estatística listado na Tabela de Materiais. Para os experimentos in vitro com astrócitos, experimentos independentes de cultura foram tratados como unidade de análise; a densitometria de western blot e as concentrações de citocinas foram comparadas utilizando ANOVA de um fator seguida de comparações planejadas ajustadas pelo método de Bonferroni ou teste t de Student para comparações prescritas entre dois grupos, conforme apropriado.

DISPONIBILIDADE DE DADOS:

Os dados que apoiam as descobertas deste estudo estão fornecidos no Arquivo Suplementar 1.

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Resultados

Os efeitos da incisão e da administração intratecal pré-operatória de propentofilina ou U0126 na hiperalgesia após a incisão

Hiperalgesia mecânica

Não houve diferenças significativas nos limiares mecânicos de dor de retirada (PWMT) entre os seis grupos em 24 h antes da operação (p > 0,05; Figura 1A,B). No grupo IP, o PWMT diminuiu após a incisão e permaneceu significativamente mais ...

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Discussão

A maioria dos pacientes sofre com dor aguda após cirurgia, não apenas fisicamente, mas às vezes também mentalmente³³, embora ainda muito permaneça desconhecido sobre os mecanismos detalhados da dor aguda pós-operatória. Juntamente com os poderosos efeitos dos medicamentos analgésicos vêm seus efeitos colaterais inevitáveis, tornando essencial a exploração de analgésicos mais seguros e eficazes. Este estudo baseou-se em um modelo ratino de incisão previamente validado para simular dor aguda pós-ope...

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Divulgações

Os autores declaram que não possuem conflitos de interesses pessoais, financeiros, comerciais ou acadêmicos.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Haijiao Zhou e Ming Wang pelo apoio técnico.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo
Tampão PBS 0,01 M	Solarbio	P1020
Tampão Tris-HCl 1,0 M (pH 6,8)	Solarbio	T1020
Tampão Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8)	Solarbio	T1010
Laureato de sódio a 10% (SDS)	Solarbio	S1010
Solução estoque TBST 10×	Solarbio	T1081
Acrilamida a 30%	Solarbio	A1010
Tampão de carregamento de proteína 4×	Solarbio	P1041
Adobe Photoshop	Adobe	—
Persulfato de amônio	Solarbio	A1030
Máquina automática de gelo em flocos	Changshu Xueke	IMS-40
Albumina sérica bovina (BSA)	Solarbio	A8020
Criostato CM150	Leica	CM150
Peagâmetro digital	—	PHS-3C
Dissulfóxido de dimetila (DMSO)	Solarbio	D8371
Balança analítica eletrônica	Cany	—
Reagente de quimioluminescência aumentada (ECL)	Solarbio	PE0010
Filme	Kodak	—
Microscópio de fluorescência DP71	Olympus	DP71
Meio de inclusão para cortes congelados	Sakura	4583
Aparelho de eletroforese em gel	BIO-RAD	—
Glicerol	Solarbio	IG0910
Glicina	Solarbio	G8200
Anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 594 de cabra anti-murino	Proteintech	SA00013-3
Anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano silvestre de cabra anti-murino	ZSGB-BIO	ZB2305
Anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 488 de cabra anti-coelho	Proteintech	SA00013-2
Anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano silvestre de cabra anti-coelho	ZSGB-BIO	ZB2301
Soro de cabra	Solarbio	SL038
GraphPad Prism	GraphPad Software	5
Centrífuga refrigerada de alta velocidade 3K15	Sigma	3K15
Agitador orbital horizontal TS-1000	Haimen Qilinbeier	TS-1000
ImageJ	National Institutes of Health	1.51j8
Metanol	Tianjin Guangfu	—
Anticorpo primário anti-rato GAPDH de camundongo	Proteintech	60004-1-Ig
Anticorpo primário anti-rato p-ERK1/2 de camundongo	CST	9101S
Na2HPO3	Tianjin Beichen Fangzheng	—
NaH2PO3	Tianjin Damao	—
Paraformaldeído	Biosharp	BL539A
Lâminas de microscopia de grau patológico	Shitai	—
Fluoreto de fenilmetanosulfonila (PMSF)	Beyotime	ST506
Teste plantar 37370	UGO BASILE	37370
Membrana de fluoreto de polivinilideno	Solarbio	—
Propentofilina (PPF)	Taosu	T19812
Anticorpo primário anti-rato COX-2 de coelho	Abcam	Ab179800
Anticorpo primário anti-rato GFAP de coelho	Proteintech	16825-1-AP
Anticorpo primário anti-rato Iba-1 de coelho	Proteintech	10904-1-AP
Anticorpo primário anti-rato NeuN de coelho	Abcam	Ab279297
Anticorpo primário anti-rato t-ERK1/2 de coelho	Proteintech	11257-1-AP
Anticorpo primário anti-rato TNF-α de coelho	Proteintech	29652-1-AP
Tampão de lise RIPA	Solarbio	R0010
SDS	Solarbio	S8010
Pó de leite desnatado	Solarbio	D8340
SPSS	IBM	22
Tetrametiletilenodiamina (TEMED)	Solarbio	T8090
Tris	Solarbio	T8060
Triton X-100	Solarbio	T8200
U0126-EtOH	Selleck	S1102
Freezer de temperatura ultra-baixa	Haier	—
Freezer de temperatura ultra-baixa	Sanyo	—
Sistema de purificação de água ultrapura	Heal Force	—
Filamentos von Frey	North Coast Medical	—

Referências

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