A Propentofilina Alivia a Hiperalgesia Incisional ao Regular a Fosforilação de ERK1/2 em Astrócitos e Microglia Espinhais

Resumo

Este estudo investiga o efeito da propentofilina administrada intratecalmente na atenuação da hiperalgesia pós-incisão e se esse efeito está associado a alterações nos marcadores gliais espinhais e na fosforilação da quinase regulada por sinal extracelular 1 e 2 em ratos.

Resumo

Astrocytos espinhais, micróglias e a quinase regulada por sinal extracelular 1 e 2 (ERK1/2) estão implicados no processamento da dor. Este estudo investigou se a propentofilina (PPF) intratecal pré-operatória atenua a hiperalgesia aguda pós-incisão em ratos e se esse efeito está associado a marcadores gliais espinhais e à fosforilação de ERK1/2. Sessenta e seis ratos machos Sprague–Dawley foram aleatoriamente distribuídos em grupos branco, dor incisional, solução salina normal, dimetil sulfóxido, PPF e U0126. A hiperalgesia mecânica e térmica foi avaliada no momento basal e 2, 4, 8, 24 e 72 h após a incisão. Marcadores neuronais e gliais espinhais, p-ERK1/2 e mediadores inflamatórios foram avaliados por Western blot e imunofluorescência. Experimentos com astrócitos espinhais primários foram adicionalmente utilizados para examinar a liberação de mediadores inflamatórios dependente de ERK1/2. A PPF intratecal pré-operatória atenuou a hiperalgesia mecânica e térmica durante todo o período de observação de 72 h, enquanto o U0126 atenuou a hiperalgesia principalmente no período inicial pós-incisão. Aos 4 h após a incisão, ambos os tratamentos foram associados à redução da expressão espinhal de GFAP, Iba-1 e p-ERK1/2 e à diminuição da imunorreatividade de TNF-α e COX-2. Em astrócitos cultivados, a PPF reduziu a liberação de mediadores inflamatórios induzida por LPS, enquanto a ERK1/2 constitutivamente ativa atenuou esse efeito. Esses achados sustentam uma associação entre o efeito antipalpável da PPF e a modulação das respostas gliais espinhais, relacionadas a ERK1/2 e inflamatórias após a incisão.

Introdução

A dor incisional, um tipo comum de dor aguda após procedimentos cirúrgicos, geralmente não persiste por mais de 7 dias, mas possui mecanismos patológicos complexos que diferem dos mecanismos da dor inflamatória e neuropática^1,2. Se a dor incisional não for bem controlada durante seu desenvolvimento, pode evoluir para síndrome de dor crônica, e sua natureza pode mudar de dor aguda por lesão tecidual para dor neuropática ou mista³. Em geral, a administração de analgésicos, como opioides e drogas anti-inflamatórias não esteroides, é a forma mais comum de analgesia após incisão. No entanto, muitos efeitos colaterais podem ocorrer com o uso contínuo ou em altas doses dessas substâncias, uma situação que ressalta a necessidade de estratégias analgésicas mais seguras e eficazes.

Evidências confiáveis indicam que a propentofilina (PPF) alivia a hiperalgesia em diferentes processos dolorosos^4,5. Além disso, o efeito analgésico da PPF pode ser parcialmente obtido pela inibição da expressão medular das proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs), como p38 e as quinases N-terminais de c-Jun (JNKs)⁶. Embora os efeitos da PPF sobre as vias p38 e JNK já tenham sido estabelecidos, sua possível modulação da via da quinase regulada por sinal extracelular 1 e 2 (ERK1/2), outra subfamília crítica de MAPKs implicada na sinalização da dor, permanece inexplorada na dor incisional aguda. Esta lacuna no conhecimento é particularmente importante, dado que a ativação da ERK1/2 apresenta padrões temporais e celulares distintos em comparação com p38 e JNK, sugerindo potenciais oportunidades terapêuticas únicas.

As células gliais, incluindo astrócitos, micróglias e oligodendrócitos, foram inicialmente consideradas a estrutura de conexão e suporte do tecido nervoso. No entanto, estudos recentes demonstraram que astrócitos e micróglias desempenham um papel importante na regulação da plasticidade sináptica e na transmissão de informações sobre dor⁷. Como macrófagos residentes do cérebro e da medula espinhal, as micróglias podem ser ativadas por diversos sinais extracelulares no estágio inicial do processo doloroso e, em seguida, proliferam e liberam grandes quantidades de citocinas inflamatórias, o que aumenta a condução dos sinais de dor da medula espinhal para o cérebro^8,9. Concomitantemente, astrócitos ativados podem aumentar a liberação do neurotransmissor excitatório glutamato e enviar informações diretamente para neurônios sensoriais, potencializando a comunicação intercelular¹⁰.

Estudos demonstraram que a ativação de astrócitos ocorre no estágio inicial (nas primeiras 24 h) da dor induzida por incisão, enquanto a ativação de micróglias aparece muito mais tarde^11,12. Além disso, um estudo indicou que micróglias ativadas têm um efeito limitado na hiperalgesia mecânica na dor induzida por incisão¹³. Esses achados destacam questões contínuas sobre os papéis distintos de astrócitos e micróglias na dor aguda. A propentofilina, um agente modulador da glia, tem sido relatada como capaz de aliviar a hiperalgesia ao regular a ativação de astrócitos e micróglias após lesão nervosa constritiva crônica, lesão nervosa aguda e lesão aguda de tecido^4,5. No entanto, até onde se sabe atualmente, nenhum estudo examinou os efeitos da PPF sobre a ativação de astrócitos ou micróglias na dor aguda induzida por incisão.

A quinase regulada por sinal extracelular 1 e 2, uma importante subfamília de MAPK ativada a jusante da proteína quinase ativada por mitógeno 1 e 2 (MEK1/2), tem sido amplamente implicada no processamento nociceptivo e na plasticidade neuronal^14,15. Estudos anteriores demonstraram que a ERK1/2 fosforilada (p-ERK1/2) pode ser induzida em neurônios espinais por estímulo nociceptivo e também pode ser detectada em astrócitos e micróglia em estados de dor inflamatória ou neuropática^16,17,18,19. Além disso, relatou-se que a inibição farmacológica da sinalização MEK1/2–ERK1/2 atenua a hiperalgesia mecânica e térmica em diversos modelos de dor^{20,21,22,23,24,25}.

No entanto, a distribuição celular da ERK1/2 medular, particularmente em astrócitos e micróglias, ativada por uma incisão aguda, e seu papel na dor induzida por incisão permanecem insuficientemente definidos. Estudos anteriores do grupo de pesquisa indicam que o PPF alivia a hiperalgesia aguda pós-incisão em ratos por meio da redução da sinalização medular JNK e p38, mas permanece incerto se o PPF também modula a sinalização relacionada à ERK1/2 em células gliais medulares durante a dor induzida por incisão. Assim, o presente estudo deve ser considerado uma extensão das bases atuais sobre glias e MAPK na pesquisa da dor, e não um paradigma mecanicista completamente independente. Sua principal distinção em relação aos trabalhos anteriores reside no foco específico na dor pós-incisão aguda, na análise da ERK1/2 em vez da p38/JNK como componente de MAPK de interesse, e na avaliação da distribuição celular medular precoce da p-ERK1/2 em relação ao tratamento com PPF.

Este estudo foi planejado para investigar se a administração intratecal pré-operatória de PPF atenua a hiperalgia incisional em um modelo de incisão plantar em ratos e se esse efeito está associado à fosforilação de ERK1/2 ou a alterações na expressão de marcadores neurais e gliais espinhais e mediadores inflamatórios, fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e ciclo-oxigenase-2 (COX-2). Mais especificamente, este estudo difere dos relatos anteriores por combinar avaliação comportamental com análise temporal por Western blot; por sua comparação farmacológica com o inibidor MEK1/2 U0126; e por sua localização qualitativa por imunofluorescência de p-ERK1/2 em neurônios espinhais, astrócitos e micróglias dentro de um modelo de dor incisional aguda. Embora seu arcabouço mecanicista se baseie em literatura prévia que associa modulação glial e sinalização MAPK à dor, o presente trabalho tem como objetivo fornecer evidências adicionais sobre o possível envolvimento de respostas gliais relacionadas ao ERK1/2 espinhal na fase inicial da hiperalgia incisional.

Em comparação com analgésicos pós-operatórios convencionais, abordagens direcionadas a vias específicas podem testar um componente definido de sinalização, mas podem oferecer benefícios apenas por tempo limitado e exigir administração invasiva; a inibição de MEK1/2–ERK1/2 demonstrou efeitos antialodinicos em diversos modelos experimentais de dor^{20,21,22,23,24,25}. O PPF difere de um inibidor de via única porque modula as respostas gliais e está associado a mais de um processo relacionado à MAPK^4,5,6. A aplicação prática permanece limitada pelo delineamento pré-clínico, administração intratecal pré-operatória, uso exclusivo de ratos machos e ausência de estudos de faixa de dose e segurança em modelos cirúrgicos maiores.

Protocolo

Os experimentos realizados foram aprovados pelo Comitê de Ética do Segundo Hospital Afiliado da Universidade de Lanzhou, Província de Gansu, China (número de aprovação ética 2017-070). Todos os procedimentos seguiram as diretrizes da Associação Internacional para o Estudo da Dor²⁶. Foram utilizados um total de 66 ratos machos adultos Sprague–Dawley, obtidos de um centro credenciado de animais de laboratório, pesando entre 200–250 g. Apenas ratos machos foram incluídos neste estudo para reduzir a variabilidade potencial relacionada a influências hormonais dependentes do sexo. Todos os protocolos foram realizados de acordo com as diretrizes da Associação Internacional para o Estudo da Dor²⁶, e foram tomados todos os esforços necessários para minimizar o sofrimento. Informações detalhadas sobre os reagentes, consumíveis, instrumentos e softwares utilizados neste estudo são fornecidas na Tabela de Materiais.

Animais

Os ratos foram mantidos aos pares antes da operação e individualmente após a incisão, com alimento e água ad libitum. A sala foi mantida em um ciclo de 12 h de luz e 12 h de escuro, com temperatura controlada em 24 °C ± 2 °C.

Injeção intratecal e modelo de dor incisional

Para a administração intratecal de soluções, os ratos foram anestesiados com 1,5%–3% de sevoflurano (administrado por meio de cone nasal) e posicionados em decúbito ventral com a coluna vertebral flexionada. Os pelos da região lombar foram raspados e a pele sobre o espaço intervertebral L5–L6 foi desinfetada. Uma microseringa foi inserida percutaneamente no espaço intervertebral L5–L6. A entrada bem-sucedida no espaço subaracnóideo foi indicada por um movimento súbito da cauda ou tremor da cauda durante a progressão da agulha e foi confirmada adicionalmente pela presença de líquido cefalorraquidiano ao realizar uma leve aspiração. Caso esses sinais não fossem observados, a posição da agulha era ajustada antes da injeção. A injeção foi realizada somente após o cumprimento dos dois critérios de confirmação, e os animais que apresentaram sinais neurológicos anormais após a injeção foram excluídos. A solução respectiva foi então injetada lentamente, e a pele foi limpa novamente após a injeção. O procedimento cirúrgico durou aproximadamente 3 min, e os ratos geralmente se recuperaram da anestesia em 5–10 min.

O modelo de dor incisional em ratos foi estabelecido conforme descrito anteriormente²⁷. Após a anestesia, a superfície plantar da pata traseira foi desinfetada com iodopovidona a 10%. Foi feita uma incisão longitudinal de 1 cm na pele plantar, iniciando aproximadamente a 0,5 cm do calcanhar e estendendo-se em direção aos dedos. A incisão penetrou a pele e a fáscia. O músculo plantar foi suavemente elevado com pinça oftálmica e incisado longitudinalmente, preservando a continuidade tecidual geral. Em seguida, o músculo foi reposicionado, aplicou-se leve pressão para obter hemostasia e a ferida foi fechada com dois pontos em matelassê usando náilon 3-0. O local da incisão foi novamente desinfetado após o fechamento da ferida. Após a cirurgia, os ratos foram mantidos individualmente e tiveram permissão para se recuperar em um ambiente tranquilo e aquecido, protegidos da luz intensa e com livre acesso a alimento e água. Os animais foram monitorados no pós-operatório, e aqueles que não atendiam aos critérios pré-definidos foram excluídos prontamente. A infecção da ferida foi determinada com base em vermelhidão, inchaço e aumento da temperatura local ao redor da ferida, exsudato purulento amarelo-esverdeado anormal com mau cheiro, cicatrização retardada com abertura persistente da ferida, necrose e aumento de tamanho, além de sinais sistêmicos como temperatura corporal elevada, letargia e recusa em se alimentar. Critérios adicionais de exclusão incluíram falha na recuperação da anestesia dentro de 30 minutos, transecção muscular intraoperatória ou lesão neurovascular, automutilação no pós-operatório, falha no estabelecimento do modelo e déficits neurológicos, como paralisia da pata traseira ou incapacidade de suportar peso não relacionada à dor incisional. Ratos com infecção ou deiscência da ferida foram excluídos do estudo.

Medição comportamental

O limiar mecânico de retirada da pata (PWMT) e a latência térmica de retirada da pata (PWTL) foram medidos por um investigador cego quanto à alocação dos grupos. Os testes foram realizados em um ambiente silencioso, sempre no mesmo horário do dia, após pelo menos 10 minutos de aclimatação; a caixa, o piso de malha ou de vidro, a luminosidade ambiente e a intensidade da fonte de calor foram mantidas constantes entre os grupos. Para o teste do PWMT, filamentos von Frey calibrados (0,4 g, 0,6 g, 1,0 g, 1,4 g, 2,0 g, 4,0 g, 6,0 g, 8,0 g, 10,0 g e 15,0 g) foram aplicados perpendicularmente à superfície plantar adjacente à ferida até que o filamento se curvasse aproximadamente 1–2 mm. Estimulações consecutivas foram separadas por 2 minutos, e o PWMT de 50% foi determinado pelo método ascendente-descendente²⁸. Para o teste do PWTL, os ratos foram colocados em caixas transparentes individuais sobre um piso de vidro, e a fonte de calor radiante foi alinhada com a superfície plantar ao lado da ferida. Um limite de corte de 30 s evitou lesão tecidual, exposições consecutivas foram separadas por 2 minutos, e a média de três medições foi registrada²⁹. A elevação da pata, agitação ou lambida foram consideradas resposta positiva de retirada; ensaios afetados por comportamento de higiene, locomoção ou perda de alinhamento da fonte de calor foram repetidos após reaclimatação.

Análise de Western blot

Nos momentos predeterminados, os ratos foram eutanasiados por dislocação cervical, e a medula espinhal lombar L4–L6 foi rapidamente coletada em tampão de lise para ensaio de radioimunoprecipitação suplementado com inibidor de protease na proporção de 100:1. Os tecidos foram homogeneizados, mantidos no gelo por 20 min e centrifugados a 15.000 × g durante 20 min a 4 °C. O sobrenadante foi misturado com tampão de carregamento 4× na proporção de 3:1, aquecido em água fervente por 5 min e armazenado a −80 °C. Amostras de proteína (30 µg por poço) foram separadas em géis de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio a 10% e transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno de 0,45 ou 0,22 µm. A transferência bem-sucedida foi verificada pela confirmação da migração esperada do marcador de peso molecular pré-colorido e pela ausência de regiões de transferência desiguais ou interrompidas. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% e albumina sérica bovina a 3% por 2 h à temperatura ambiente e incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra NeuN (1:8.000), GFAP (1:4.000), Iba-1 (1:3.000), p-ERK1/2 (1:1.000), t-ERK1/2 (1:3.000) ou GAPDH (1:2.000). Após lavagem em solução salina tamponada com Tris contendo Tween 20 a 0,05% (pH 7,4), as membranas foram incubadas com o anticorpo secundário conjugado à peroxidase do rábano silvestre correspondente (1:5.000) por 1 h à temperatura ambiente. Os sinais foram revelados por quimioluminescência aumentada e registrados em filme usando o mesmo intervalo de exposição dentro de cada alvo. Um pesquisador cegado quanto à alocação dos grupos analisou a densidade das bandas com software de análise de imagens. As imagens foram convertidas para escala de cinzas de 8 bits, uma região retangular idêntica de interesse foi aplicada a cada banda, o fundo local de uma região adjacente em branco foi subtraído e a densidade integrada foi registrada. O mesmo tamanho de região e procedimento de fundo foram utilizados para todas as amostras em um mesmo blot. NeuN, GFAP, Iba-1 e t-ERK1/2 foram normalizados em relação a GAPDH; p-ERK1/2 foi normalizado em relação a t-ERK1/2; e os valores foram então expressos em relação ao grupo controle.

Imunofluorescência

Nos momentos predeterminados, os ratos foram anestesiados com pentobarbital sódico a 3% (1,5 mL/kg) e perfundidos pelo coração com 300 mL de solução salina tamponada com fosfato 0,01 mol/L pré-resfriada (PBS; pH 7,4), seguida por 250 mL de paraformaldeído a 4% pré-resfriado. A medula espinhal L4–L6 foi pós-fixada em paraformaldeído a 4% por 6 h, crioprotegida durante a noite em sacarose 20%–30% em PBS a 4 °C e cortada em seções de 10 µm a −22 °C. As seções foram lavadas em PBS 0,01 mol/L, bloqueadas em soro de cabra a 10% por 1 h à temperatura ambiente e incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra NeuN (1:100), GFAP (1:1.000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) ou COX-2 (1:50). Após três lavagens com PBS, as seções foram incubadas com o anticorpo secundário conjugado a fluoróforo verde ou vermelho correspondente (1:400) por 1 h à temperatura ambiente, lavadas mais três vezes em PBS e montadas com meio antidesvanecimento e lamínula. Seções de controle negativo processadas sem o anticorpo primário foram incluídas em cada lote de coloração. As imagens foram adquiridas por um investigador cego com um microscópio de fluorescência. Imagens gerais de baixa ampliação foram adquiridas usando uma objetiva de 10×, enquanto imagens de imunorreatividade celular e de co-localização foram adquiridas usando objetivas de 20× ou 40×, conforme o painel da figura correspondente. Para comparações dentro da mesma figura e lote de coloração, a ampliação da objetiva, intensidade de iluminação, tempo de exposição, ganho do detector, configurações da câmera e parâmetros de processamento de imagem foram fixados após otimização abaixo da saturação. Canais de fluorescência separados foram adquiridos sequencialmente para minimizar a sobreposição de canais. Três campos não sobrepostos no corno dorsal ipsilateral foram capturados por animal. A intensidade de fluorescência foi quantificada com software de análise de imagem após conversão para 8 bits, subtração de fundo usando uma região livre de células e aplicação de uma região de interesse e limiar idênticos dentro de cada lote de coloração; os valores dos campos foram médios para obter um valor por animal. Campos com superexposição, dobramento tecidual, rasgo, foco ruim ou fundo irregular foram excluídos e readquiridos nas mesmas condições não saturantes. A coloração foi aceita quando a arquitetura tecidual estava intacta, o sinal-alvo excedia o controle sem anticorpo primário e nenhuma dobra, rasgo ou região saturada significativa afetava a análise.

In vitro experimentos primários com astrócitos espinhais

Astrocytes primários de medula espinhal de rato foram cultivados em condições estéreis padrão, em meio de cultura completo, a 37 °C em incubadora umidificada com 5% de CO₂. As células foram utilizadas quando atingiram cerca de 70%–80% de confluência e foram alocadas nos grupos controle, estimulado com LPS, LPS + PPF, LPS + U0126 e resgate de ERK1/2. PPF e U0126 foram adicionados na concentração de 10 µM. A estimulação com LPS, o tratamento com fármacos e as condições de coleta foram mantidas idênticas entre poços paralelos em cada experimento. Para análise de seletividade da via, os lisados celulares foram coletados para Western blot de p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, p38 total, p-JNK, JNK total e o controle de carregamento correspondente. Os sobrenadantes da cultura de poços paralelos foram coletados, clarificados por centrifugação e analisados quanto a TNF-α, PGE2 e IL-6 por ensaio imunoenzimático ligado a anticorpos (ELISA), conforme instruções do fabricante. A densitometria de Western blot seguiu os mesmos princípios de análise de imagem descritos anteriormente. Para os experimentos de resgate, a ERK1/2 endógena foi suprimida por transfeção com siRNA, e um construto de expressão de ERK1/2 constitutivamente ativa (CA-ERK1/2) foi introduzido antes do tratamento. A eficiência do silenciamento e superexpressão foi confirmada por Western blot antes da interpretação dos dados de citocinas. Células expostas ao reagente de transfeção sem siRNA ativo ou construto serviram como controles procedimentais quando aplicável.

Planejamento experimental

Subdivisão dos animais experimentais

Os ratos foram distribuídos em seis grupos utilizando um método de tabela de números aleatórios, e a alocação dos grupos foi concluída antes dos testes comportamentais e da coleta de tecidos. Os seis grupos compreendiam um grupo branco (n = 6), um grupo com dor incisional (IP) (n = 18), um grupo com solução salina normal (NS) (NS a 0,9%, 10 µL; n = 9), um grupo PPF (10 µg em 10 µL; n = 12), um grupo de dimetilsulfóxido (DMSO) (DMSO a 10%, 10 µL; n = 9) e um grupo U0126 (10 µg em 10 µL; n = 12). Os ratos do grupo branco não receberam nem incisão plantar nem injeção intratecal e serviram como controles não tratados. Os ratos do grupo IP foram submetidos à incisão plantar sem pré-tratamento por injeção intratecal. Os ratos dos grupos NS, PPF, DMSO e U0126 receberam administração intratecal dos respectivos agentes 30 minutos antes da incisão plantar. O grupo NS serviu como controle veicular para o PPF, enquanto o grupo DMSO serviu como controle veicular para o U0126.

Doses de propentofilina e U0126

A propentofilina é um modulador glial, e uma dose de 10 µg foi selecionada porque aliviou a hiperalgesia aguda em estudos anteriores realizados pelo grupo de pesquisa. O U0126 é um inibidor não competitivo com relação ao trifosfato de adenosina da MEK1/2, utilizado para bloquear a fosforilação da ERK1/2. Doses intratecais eficazes de 1–10 µg foram relatadas em diversos modelos de dor^30,31,32; a dose de 10 µg foi utilizada no presente estudo. O U0126 foi dissolvido em 10% de dimetilsulfóxido, enquanto o PPF foi dissolvido em solução salina normal a 0,9%. As concentrações finais foram de 1 µg/µL. Fármacos e veículos foram preparados antes da cirurgia, mantidos a 4 °C e utilizados dentro de 12 h.

Efeito da administração intratecal pré-operatória de propentofilina ou U0126 na hiperalgesia

Seis ratos de cada grupo foram aleatoriamente selecionados para a avaliação comportamental 24 h antes da operação, e os valores resultantes de TPMA e TPLP foram designados como basais. As injeções intratecais foram administradas 30 min antes da operação. Para avaliar os efeitos da administração intratecal pré-operatória de PPF e U0126 na hiperalgesia mecânica e térmica, o TPMA e o TPLP foram avaliados em 2 h, 4 h, 8 h, 24 h e 72 h após a incisão.

Desenho experimental para avaliar os efeitos da administração intratecal pré-operatória de propentofilina ou U0126 sobre a expressão de marcadores neuronais e gliais na medula espinhal após incisão

Para determinar o ponto temporal pós-incisão apropriado para a avaliação do efeito do tratamento, uma análise preliminar de curso temporal foi inicialmente realizada no grupo IP. Especificamente, ratos do grupo IP foram eutanasiados 2 h, 4 h, 24 h e 72 h após a incisão, e os níveis de expressão dos marcadores celulares NeuN, GFAP e Iba-1 na medula espinhal foram medidos por Western blot (n = 3 por ponto temporal). Com base nesta análise preliminar, as primeiras 4 h pós-incisão foram selecionadas como uma janela de observação precoce, pois a expressão de NeuN atingiu seu nível mais alto no ponto temporal de 4 h e porque considerou-se que as alterações moleculares precoces são as mais relevantes para o desenvolvimento inicial da hiperalgesia pós-incisão. No entanto, o ponto temporal de 4 h não teve a intenção de representar todas as alterações moleculares temporais após a incisão.

Neste ponto de tempo selecionado, ratos que haviam recebido uma injeção intratecal foram eutanasiados para análise por Western blot de diferentes marcadores celulares (n = 3 por grupo) e avaliação por imunofluorescência da morfologia de diferentes tipos celulares (n = 3 por grupo). No grupo controle, os ratos foram aleatoriamente sacrificados para determinar os níveis basais de expressão de diferentes marcadores celulares (NeuN, GFAP e Iba-1) na medula espinhal por Western blot (n = 3) e a morfologia de diferentes células (neurônios, astrócitos e micróglias) por imunofluorescência (n = 3). Assim, o grupo controle serviu como controle basal não incisado e não tratado.

Efeitos do tratamento na p-ERK1/2 medular e nos mediadores inflamatórios

Para determinar o ponto temporal pós-incisão apropriado para avaliar os efeitos do tratamento na expressão de p-ERK1/2 e nos níveis de citocinas inflamatórias, uma análise preliminar de curso temporal foi inicialmente realizada no grupo IP. Especificamente, ratos do grupo IP foram eutanasiados 2 h, 4 h, 24 h e 72 h após a incisão, e a expressão de p-ERK1/2 na medula espinhal foi medida por Western blot (n = 3 por ponto temporal). Com base neste experimento de curso temporal, juntamente com o ponto temporal em que a expressão de NeuN foi mais alta após a incisão, 4 h após a incisão foi selecionado como o ponto temporal fixo para a avaliação subsequente dos efeitos da administração intratecal pré-operatória de PPF ou U0126 na expressão de p-ERK1/2 e citocinas inflamatórias na medula espinhal. Esse ponto temporal foi escolhido como uma janela de observação mecanicista precoce, e não como uma representação abrangente de todas as alterações temporais após a incisão.

Neste ponto temporal selecionado, ratos que tinham recebido uma injeção intratecal foram eutanasiados para análise por Western blot da expressão de p-ERK1/2 (n = 3 por grupo) e avaliação por imunofluorescência de citocinas inflamatórias (n = 3 por grupo). No grupo controle, os ratos foram sacrificados aleatoriamente para determinar os níveis basais de expressão de p-ERK1/2 na medula espinhal por Western blot (n = 3) e de citocinas inflamatórias (TNF-α e COX-2) por imunofluorescência (n = 3). Assim, o grupo controle serviu como controle basal sem incisão e sem tratamento.

Localização celular de p-ERK1/2 medular em neurônios, astrócitos e micróglias

Para avaliar mais a distribuição celular da p-ERK1/2 espinhal após a incisão, foi realizada coloração por imunofluorescência nos grupos Controle e IP em 4 h após a incisão (n = 3).

Análise estatística

Os dados são expressos como média ± desvio padrão. O tamanho da amostra foi determinado com base em estudos anteriores do grupo de pesquisa e em experimentos preliminares. Os dados comportamentais foram analisados por análise de variância (ANOVA) de duas vias com medidas repetidas, utilizando o grupo como fator entre sujeitos e o tempo como fator dentro dos sujeitos. Os dados de western blot ao longo do tempo foram avaliados por ANOVA de um fator, seguida de comparações pareadas ajustadas pelo método de Bonferroni. Os dados de western blot e imunofluorescência em tempo fixo foram avaliados por ANOVA de um fator com comparações planejadas ajustadas pelo método de Bonferroni; comparações entre dois grupos foram avaliadas pelo teste t de Student. A normalidade e a homogeneidade da variância foram verificadas pelos testes de Shapiro–Wilk e de Levene, respectivamente. Um valor de p bicaudal < 0,05 foi considerado significativo. As análises estatísticas foram realizadas com o software de análise estatística listado na Tabela de Materiais. Para os experimentos in vitro com astrócitos, experimentos independentes de cultura foram tratados como unidade de análise; a densitometria de western blot e as concentrações de citocinas foram comparadas utilizando ANOVA de um fator seguida de comparações planejadas ajustadas pelo método de Bonferroni ou teste t de Student para comparações prescritas entre dois grupos, conforme apropriado.

DISPONIBILIDADE DE DADOS:

Os dados que apoiam as descobertas deste estudo estão fornecidos no Arquivo Suplementar 1.

Resultados

Os efeitos da incisão e da administração intratecal pré-operatória de propentofilina ou U0126 na hiperalgesia após a incisão

Hiperalgesia mecânica

Não houve diferenças significativas nas TAMPs entre os seis grupos em 24 h antes da operação (p > 0,05; Figura 1A,B). No grupo IP, a TAMP diminuiu após a incisão e permaneceu significativamente mais baixa que a linha de base de 2 h a 72 h após a incisão (p < 0,05 versus linha de base; Figura 1A). Nos grupos NS e DMSO, não houve diferenças significativas nas TAMPs entre os diferentes momentos após a incisão (p > 0,05 versus grupo IP; Figura 1B). No grupo PPF, a TAMP foi significativamente maior do que no grupo IP de 2 h a 72 h após a incisão (p < 0,05 versus grupo IP; Figura 1A), e em 72 h após a incisão, já não foi significativamente diferente da linha de base (p > 0,05 versus linha de base; Figura 1A). No grupo U0126, as TAMPs foram significativamente maiores do que as do grupo IP durante as primeiras 24 h após a incisão (p < 0,05 versus grupo IP; Figura 1A), mas esse efeito não foi mantido em 72 h após a incisão, quando a TAMP permaneceu significativamente mais baixa que a linha de base e já não foi significativamente diferente daquela do grupo IP (p < 0,05 versus linha de base; p > 0,05 versus grupo IP; Figura 1A).

Hiperalgesia térmica

Não houve diferenças significativas nos limiares de dor de retirada da pata (PWTLs) entre os seis grupos em 24 h antes da operação (p > 0.05; Figura 1C, D). No grupo IP, o PWTL diminuiu de 24,85 s ± 1,06 s antes da operação até 4,38 s ± 1,02 s às 4 h após a incisão e, em seguida, aumentou parcialmente para 18,37 s ± 1,38 s às 72 h após a incisão, mas permaneceu significativamente inferior ao valor basal durante todo o período de observação (p < 0.05 versus linha de base Figura 1C). Nos grupos NS e DMSO, não houve diferenças significativas nos limiares de dor à pressão (PWTLs) entre os pontos de tempo após a incisãop > 0.05 versus o grupo IP; Figura 1D). No grupo PPF, o LPTP foi significativamente maior do que no grupo IP durante todo o período de observação de 72 h (p < 0,05 versus o grupo IP; Figura 1C) e, 72 h após a incisão, havia retornado a um nível que não diferia significativamente do valor basal (p > 0,05 versus linha de base; Figura 1C). No grupo U0126, o limiar de dor à pressão (PWTL) foi significativamente maior do que no grupo IP nas primeiras 24 horas após a incisão (p < 0,05 versus o grupo IP; Figura 1C); esse efeito não foi mantido 72 h após a incisão, quando o LTPD permaneceu significativamente inferior ao valor basal e já não diferiu significativamente do grupo IP (p < 0,05 versus linha de base; p > 0,05 versus o grupo IP; Figura 1C).

Análise por Western blot de alterações temporais na expressão de marcadores celulares da medula espinhal e na fosforilação da quinase regulada por sinal extracelular 1 e 2 após incisão

Várias bandas foram identificadas nos pesos moleculares exatos com um anticorpo específico nas membranas de PVDF, incluindo NeuN (48 e 50 kD), GFAP (50 kD), Iba-1 (17 kD), p-ERK1/2 (p-ERK1 = 44 kD; p-ERK2 = 42 kD), t-ERK1/2 (t-ERK1 = 44 kD; t-ERK2 = 42 kD) e GAPDH (36 kD). A banda de GAPDH foi utilizada como controle para NeuN, GFAP, Iba-1 e t-ERK1/2, e a banda de t-ERK1/2 foi utilizada como controle para p-ERK1/2.

Os dados de western blot da medula espinhal no grupo IP mostraram aumentos em graus variados após a incisão (Figura 2A). A expressão da proteína nuclear específica de neurônios atingiu seu valor mais alto 4 h após a incisão (p < 0,001 versus linha de base; Figura 2A) e permaneceu significativamente elevada 72 h após a incisão (p < 0,001 versus linha de base; Figura 2A). Os níveis da proteína ácida fibrilar glial aumentaram gradualmente ao longo do período de observação de 72 h (p < 0,001 versus linha de base; Figura 2A), com o nível mais alto observado em 72 h entre os pontos de tempo analisados. De forma semelhante, a Iba-1 também atingiu um nível significativamente aumentado 4 h após a incisão (p < 0,001 versus linha de base; Figura 2A) e oscilou dentro de uma faixa pequena. Notavelmente, os dados de western blot da medula espinhal no grupo IP mostraram que a ativação da ERK1/2 aumentou apenas nas primeiras 24 h após a incisão (p < 0,05 versus linha de base; Figura 2B), mas foi reduzida em 72 h após a incisão (p < 0,05 versus linha de base; Figura 2B), enquanto a expressão da t-ERK/2 não apresentou alteração significativa em nenhum ponto de tempo.

Análise por Western blot dos efeitos da administração intratecal pré-operatória de propentofilina ou U0126 na expressão de marcadores celulares e da proteína quinase regulada por sinal extracelular fosforilada 1 e 2 na medula espinhal

Os dados de western blot mostraram que a expressão de NeuN atingiu seu nível mais alto 4 h após a incisão, quando a medida comportamental estava em seu limiar mais baixo. Portanto, os efeitos sobre a expressão do marcador celular e a fosforilação de ERK1/2 por PPF e U0126 administrados intratecalmente 30 min antes da operação foram avaliados 4 h após a incisão.

Os dados de western blot mostraram que, em comparação com o grupo controle, a expressão medular de todos os marcadores celulares foi significativamente aumentada no grupo IP 4 h após a incisão (p < 0,05 vs linha de base; Figura 3). Em comparação com o grupo IP, a administração intratecal pré-operatória de PPF reduziu a expressão medular de NeuN (p < 0,05 vs grupo IP; Figura 3A), GFAP (p < 0,05 vs grupo IP; Figura 3B) e Iba-1 (p < 0,01 vs grupo IP; Figura 3C). Em comparação com o grupo IP, a administração intratecal pré-operatória de U0126 também reduziu a expressão medular de NeuN (p < 0,01 vs grupo IP; Figura 3D), GFAP (p < 0,05 vs grupo IP; Figura 3E) e Iba-1 (p < 0,01 vs grupo IP; Figura 3F). Quando comparado com o grupo controle, entretanto, a expressão de NeuN no grupo PPF permaneceu significativamente mais alta que a linha de base (p < 0,01 vs linha de base; Figura 3A), enquanto a expressão de NeuN no grupo U0126 foi significativamente menor do que no grupo controle (p < 0,01 vs linha de base; Figura 3D). Para GFAP e Iba-1, o texto agora enfatiza a comparação com o grupo IP, conforme mostrado na Figura 3. A administração intratecal pré-operatória de NS e DMSO não teve efeito significativo sobre a expressão de nenhum marcador celular.

Os dados de western blot mostraram que a expressão medular de t-ERK1/2 não diferiu significativamente entre os grupos Branco, IP, NS e PPF em 4 h após a incisão (Figura 4A). Em contraste, em comparação com o grupo branco, a expressão de p-ERK1/2 aumentou significativamente nos grupos IP e NS em 4 h após a incisão (p < 0,001 versus o grupo branco; Figura 4B). Em comparação com o grupo IP, a administração intratecal pré-operatória de PPF reduziu significativamente a expressão de p-ERK1/2 em 4 h após a incisão (p < 0,001 vs o grupo IP; Figura 4B). Em comparação com o grupo NS, a expressão de p-ERK1/2 no grupo PPF também foi significativamente menor (p < 0,01 vs o grupo NS; Figura 4B). No entanto, em comparação com o grupo branco, a expressão de p-ERK1/2 no grupo PPF permaneceu significativamente elevada em 4 h após a incisão. Da mesma forma, a expressão medular de t-ERK1/2 não diferiu significativamente entre os grupos Branco, IP, DMSO e U0126 em 4 h após a incisão (Figura 4C). Em comparação com o grupo branco, a expressão de p-ERK1/2 aumentou significativamente nos grupos IP e DMSO em 4 h após a incisão (p < 0,001 vs o grupo branco; Figura 4D). Em comparação com o grupo IP, a administração intratecal pré-operatória de U0126 reduziu significativamente a expressão de p-ERK1/2 (p < 0,001 vs o grupo IP; Figura 4D). Em comparação com o grupo DMSO, a expressão de p-ERK1/2 no grupo U0126 também foi significativamente menor (p < 0,001 versus o grupo DMSO; Figura 4D). Notavelmente, em comparação com o grupo branco, a expressão de p-ERK1/2 no grupo U0126 não diferiu significativamente daquela no grupo branco em 4 h após a incisão. O pré-tratamento com NS ou DMSO não teve efeito significativo sobre a expressão de p-ERK1/2 quando comparado ao grupo IP.

Observações de imunofluorescência de marcadores celulares da medula espinhal e mediadores inflamatórios

Os resultados da imunofluorescência mostraram qualitativamente uma imunorreatividade mais intensa de NeuN no corno dorsal ipsilateral 4 h após a incisão, em comparação com o lado contralateral (Figura 5). No grupo controle, imagens representativas mostraram imunorreatividade basal de NeuN, GFAP e Iba-1 no corno dorsal da medula espinhal ipsilateral (Figura 6A–C). No grupo IP, a imunorreatividade de NeuN foi qualitativamente mais intensa do que no grupo controle (Figura 6D vs Figura 6A), a imunorreatividade de GFAP também foi mais intensa (Figura 6E vs Figura 6B) e a imunorreatividade de Iba-1 também aumentou (Figura 6F vs Figura 6C). Concomitantemente, astócitos e micróglias no grupo IP apresentaram-se hipertrofiados, com corpos celulares aumentados e processos mais espessos e altamente ramificados (Figura 6E,F).

No grupo PPF, imagens representativas sugeriram imunorreatividade mais fraca de NeuN em comparação com o grupo IP (Figura 6G versus Figura 6D), imunorreatividade mais fraca de GFAP (Figura 6H versus Figura 6E) e imunorreatividade mais fraca de Iba-1 (Figura 6I versus Figura 6F). No grupo U0126, imagens representativas igualmente sugeriram imunorreatividade mais fraca de NeuN em comparação com o grupo IP (Figura 6J versus Figura 6D), imunorreatividade mais fraca de GFAP (Figura 6K versus Figura 6E) e imunorreatividade mais fraca de Iba-1 (Figura 6L versus Figura 6F). Em ambos os grupos PPF e U0126, astrócitos e micróglias pareciam menos hipertróficos, com corpos celulares menores e processos mais finos e escassos (Figura 6H,I,K,L). A análise correspondente da intensidade de fluorescência de NeuN, GFAP e Iba-1 foi consistente com as observações representativas de imunofluorescência (Figura 6M–O, respectivamente).

Quatro horas após a incisão, a imunorreatividade e a intensidade de fluorescência relativa de TNF-α e COX-2 estavam aumentadas no corno dorsal ipsilateral do grupo IP em comparação com o grupo controle. Ambas as medidas foram menores após o tratamento pré-operatório com PPF ou U0126 por via intratecal (Figura 7A–C).

Localização celular de p-ERK1/2 na medula espinhal por imunofluorescência

Os resultados da imunofluorescência mostraram que, no grupo controle, a imunorreatividade de p-ERK1/2 era fraca na medula espinhal e observada apenas em neurônios positivos para NeuN (Figura 8A–C). Em contraste, 4 h após a incisão, a imunorreatividade de p-ERK1/2 aumentou acentuadamente no corno dorsal ipsilateral da medula espinhal e co-localizou-se não somente com neurônios, mas também com astrócitos positivos para GFAP e micróglias positivas para Iba-1 (Figura 8D–I). Esse achado indica que a incisão induziu uma distribuição celular mais ampla de p-ERK1/2, passando de apenas neurônios em condições basais para neurônios, astrócitos e micróglias após a lesão.

Validação in vitro do mecanismo dependente de ERK1/2 em astrócitos espinhais

Para avaliar mais detalhadamente se o PPF poderia suprimir a liberação de mediadores inflamatórios por meio da sinalização relacionada à ERK1/2 no nível celular, astrócitos espinhais primários de rato foram estimulados com LPS e tratados com PPF ou U0126 (10 µM). A análise por Western blot mostrou que o PPF reduziu a expressão de p-ERK1/2 induzida pelo LPS, enquanto a fosforilação de p-p38 e p-JNK não foi significativamente alterada (Figura 9A), o que apoia a seletividade relativa da via ERK1/2 nessas condições. Paralelamente, o PPF reduziu os níveis de TNF-α, PGE2 (um produto downstream da atividade da COX-2) e IL-6 no sobrenadante da cultura em comparação com o grupo Estimulado; o U0126 produziu efeitos inibitórios semelhantes (Figura 9B).

Para testar se a ativação persistente de ERK1/2 poderia enfraquecer o efeito anti-inflamatório do PPF, foram realizados experimentos de resgate. O ERK1/2 endógeno foi silenciado usando siRNA, e posteriormente foi introduzida uma construção de ERK1/2 constitutivamente ativo (CA-ERK1/2) (Figura 9C). Em astrócitos que expressavam CA-ERK1/2, o PPF não reduziu mais os níveis de TNF-α, PGE2 ou IL-6 na mesma extensão (Figura 9D), indicando que a supressão da fosforilação de ERK1/2 contribui para o efeito anti-inflamatório do PPF neste sistema de astrócitos in vitro.

Coletivamente, esses achados in vitro fornecem suporte mecanicista ao nível celular de que PPF atenua a liberação de mediadores inflamatórios por meio de um mecanismo dependente de ERK1/2 em astrócitos da medula espinhal, complementando os dados observacionais in vivo.

Figura 1: Efeitos da PPF ou U0126 intratecal pré-operatória na hiperalgesia mecânica e térmica induzida por incisão. (A) Limiar de retirada mecânica ao toque (PWMT) nos grupos controle, IP, PPF e U0126. (B) Limiar de retirada mecânica ao toque (PWMT) nos grupos IP e controle com veículo. (C) Latência de retirada ao estímulo térmico (PWTL) nos grupos controle, IP, PPF e U0126. (D) Latência de retirada ao estímulo térmico (PWTL) nos grupos IP e controle com veículo. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 6 ratos por grupo) e foram analisados por ANOVA de medidas repetidas a dois fatores. ***p < 0,001 em relação à linha de base; #p < 0,05, ##p < 0,01 e ###p < 0,001 em relação ao grupo IP. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 2: Curso temporal da expressão dos marcadores celulares da medula espinhal e da fosforilação de ERK1/2 após incisão. (A) Quantificação e western blots representativos de NeuN, GFAP e Iba-1 no grupo IP desde o valor basal até 72 h após a incisão. (B) Quantificação e western blots representativos de t-ERK1/2 e p-ERK1/2 no mesmo período. Os valores foram normalizados ao grupo branco (100%) e são apresentados como média ± DP (n = 3 ratos por ponto temporal). As diferenças globais foram analisadas por ANOVA unifatorial com as comparações pareadas indicadas. *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 em relação ao valor basal. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 3: Efeitos da PPF ou U0126 intratecal pré-operatória sobre marcadores neuronais e gliais na medula espinhal 4 h após a incisão. (A–C) NeuN, GFAP e Iba-1 nos grupos controle, IP, solução salina normal e PPF. (D–F) NeuN, GFAP e Iba-1 nos grupos controle, IP, dimetil sulfóxido e U0126. São mostrados à direita exemplos representativos de Western blot. Os valores foram normalizados em relação ao grupo controle (100%) e são apresentados como média ± DP (n = 3 ratos por grupo). *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 em comparação com o grupo controle; #p < 0,05 e ##p < 0,01 em comparação com IP; Δp < 0,05, ΔΔp < 0,01 e ΔΔΔp < 0,001 em comparação com o grupo correspondente tratado com veículo. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Efeitos da PPF ou U0126 intratecal pré-operatória na fosforilação da ERK1/2 espinhal 4 h após a incisão. (A,B) ERK1/2 total e ERK1/2 fosforilada nos grupos branco, IP, salina normal e PPF. (C,D) ERK1/2 total e ERK1/2 fosforilada nos grupos branco, IP, dimetil-sulfóxido e U0126. São mostrados à direita exemplos representativos de Western blot. Os valores foram normalizados ao grupo branco (100%) e são apresentados como média ± DP (n = 3 ratos por grupo). **p < 0,01 e ***p < 0,001 versus grupo branco; ###p < 0,001 versus IP; ΔΔp < 0,01 e ΔΔΔp < 0,001 versus o grupo controle correspondente. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imunorreatividade espinal ipsilateral e contralateral para NeuN após incisão. Uma seção transversal representativa da medula espinhal lombar do grupo IP, obtida 4 h após a incisão, mostra marcação para NeuN nas cornos dorsais contralateral e ipsilateral. A imagem é representativa de n = 3 ratos e é fornecida para comparação anatômica qualitativa. Barra de escala = 500 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 6: Efeitos do PPF e do U0126 na imunorreatividade neuronal e glial da medula espinhal 4 h após a incisão. (A–C) NeuN, GFAP e Iba-1 no grupo controle. (D–F) Coloração correspondente no grupo IP. (G–I) Coloração correspondente após tratamento com PPF. (J–L) Coloração correspondente após tratamento com U0126. (M–O) Intensidades relativas de fluorescência de NeuN, GFAP e Iba-1, respectivamente. As barras representam média ± DP (n = 3 ratos por grupo); *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 para as comparações indicadas. Barras de escala = 200 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 7: Imunorreatividade medular de TNF-α e COX-2 após incisão e tratamento. (A) Imagens representativas de TNF-α e COX-2 dos grupos controle, IP, PPF e U0126 em 4 h após a incisão. (B) Intensidade relativa de fluorescência de TNF-α. (C) Intensidade relativa de fluorescência de COX-2. As barras indicam média ± DP (n = 3 ratos por grupo); ***p < 0,001 para as comparações indicadas. Barras de escala = 200 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 8: Localização celular da p-ERK1/2 medular aos 4 h após a incisão. (A–C) Coloração dupla de p-ERK1/2 com NeuN, GFAP e Iba-1, respectivamente, no grupo controle. (D–F) Coloração dupla correspondente no grupo IP; setas indicam células representativas com co-localização. A cor vermelha indica p-ERK1/2, a verde indica o marcador celular e a amarela indica co-localização. (G–I) Intensidades relativas de fluorescência associadas às regiões positivas para NeuN, GFAP e Iba-1, respectivamente. As barras mostram média ± DP (n = 3 ratos por grupo); **p < 0,01 e ***p < 0,001 para as comparações indicadas. Barras de escala = 100 µm. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Figura 9: Efeitos anti-inflamatórios dependentes de ERK1/2 da PPF em astrócitos espinhais primários de rato. (A) Blots Western representativos mostrando que a PPF reduziu a p-ERK1/2 induzida por LPS sem efeito evidente sobre p-p38 ou p-JNK. (B) Concentrações de TNF-α, PGE2 e IL-6 nos sobrenadantes de cultura após tratamento com LPS, PPF ou U0126. (C) Blots Western confirmando o silenciamento mediado por siRNA de ERK1/2 e a expressão de ERK1/2 constitutivamente ativo (CA-ERK1/2). (D) Concentrações de TNF-α, PGE2 e IL-6 após expressão de CA-ERK1/2 com ou sem PPF. As barras mostram a média ± DP de experimentos in vitro independentes; ***p < 0,001 para as comparações indicadas; ns, não significativo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Dados que apoiam os resultados deste estudo.Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A maioria dos pacientes sofre com dor aguda após cirurgia, não apenas fisicamente, mas às vezes também mentalmente³³, embora ainda muito permaneça desconhecido sobre os mecanismos detalhados da dor aguda pós-operatória. Juntamente com os poderosos efeitos dos medicamentos analgésicos vêm seus efeitos colaterais inevitáveis, tornando essencial a exploração de analgésicos mais seguros e eficazes. Este estudo baseou-se em um modelo ratino de incisão previamente validado para simular dor aguda pós-operatória, que era fácil e viável de preparar²⁷. O presente estudo avaliou alterações nos marcadores neuronais e gliais da medula espinhal, fosforilação de ERK1/2 e mediadores inflamatórios após a incisão e examinou se o efeito antialodínico da administração intratecal pré-operatória de PPF estava associado a alterações paralelas na fosforilação de ERK1/2 e na expressão de citocinas inflamatórias na medula espinhal.

Após a incisão, ratos do grupo IP desenvolveram hiperalgesia mecânica e térmica acentuada, enquanto o pré-tratamento com veículo não teve efeito detectável sobre os desfechos comportamentais ou moleculares. Esses achados sustentam a estabilidade do modelo e indicam que os efeitos observados nos grupos PPF e U0126 dificilmente podem ser atribuídos ao procedimento de injeção ou ao próprio veículo. Além disso, embora a expressão de NeuN tenha aumentado após a incisão, essa alteração deve ser interpretada com cautela como uma mudança na expressão do marcador neuronal, e não como evidência direta de ativação neuronal. Em conjunto, essas observações fornecem a base para examinar respostas relacionadas à glia e à ERK1/2 no desenvolvimento inicial da dor pós-incisão.

Demonstrou-se que as células gliais desempenham um papel importante na formação sináptica, na transmissão e integração da informação sináptica e na regulação da plasticidade sináptica. As funções imunológicas e pró-inflamatórias das células gliais no processamento da dor, especialmente das astrócitos e micróglias espinhais ativados, podem potencializar a sensibilização central envolvida na mediação da hiperalgesia e nas alterações comportamentais pós-operatórias^7,34. Alterações neurológicas maladaptativas na medula espinhal podem levar a um aumento da resposta a estímulos nocivos ou não nocivos. Evidências consideráveis indicam que a ativação dos astrócitos e micróglias espinhais está envolvida no desenvolvimento e manutenção da hiperalgesia em modelos de lesão do nervo espinhal³⁵, dor induzida pelo ativador tecidual do plasminogênio¹⁶, dor incisional^11,12 e dor por câncer ósseo^19,31. Portanto, a ativação glial espinhal parece ser uma característica comum em múltiplos estados dolorosos, e uma investigação mais aprofundada do seu papel na dor incisional pode ampliar o entendimento atual dos mecanismos da dor pós-operatória.

Os achados atuais apoiam a ideia de que astrócitos e micróglias espinhais participam da resposta neuroinflamatória inicial após incisão¹². Em vez de exibirem padrões temporais idênticos, GFAP, Iba-1 e p-ERK1/2 apresentaram cursos temporais parcialmente distintos, sugerindo que diferentes processos relacionados aos gliócitos podem contribuir para diferentes fases do desenvolvimento da dor pós-operatória^31,35. Os achados de imunofluorescência reforçaram essa interpretação ao mostrar alterações morfológicas hipertróficas em astrócitos e micróglias após a incisão. Juntamente com os aumentos na imunorreatividade de TNF-α e COX-2, essas observações são compatíveis com a noção de que a sinalização inflamatória associada aos gliócitos contribui para a hiperalgesia aguda pós-incisão^7,36.

A propentofilina, um derivado da metilxantina, foi inicialmente estudada como uma droga ativa no sistema cerebrovascular devido à sua atividade antiplaquetária e ao suporte na manutenção da memória de longo prazo³⁷. No entanto, o efeito regulador da PPF sobre as células gliais torna-a potencialmente valiosa também como agente analgésico. Estudos indicam que a PPF pode impedir a ativação da micróglia ao inibir a degradação do monofosfato de adenosina cíclico intracelular e reduzir a recaptação do adenosina extracelular^4,5. Em um estudo in vitro, a PPF inibiu a proliferação de astrócitos ao dificultar a via do alvo mamífero da rapamicina induzida por TNF-α⁶. Assim, é o efeito regulador da PPF sobre as células gliais que torna possível sua participação na modulação dos processos da dor.

O efeito anti-hiperalgésico sustentado do PPF no presente estudo, juntamente com as reduções na expressão de GFAP e Iba-1, apoia a interpretação de que a modulação glial é um componente importante da ação analgésica do PPF neste modelo. Estudos anteriores também sugeriram que o PPF pode suprimir a sinalização inflamatória relacionada às gliais em estados dolorosos^5,31. Além disso, a redução paralela de TNF-α e COX-2 sugere que o PPF pode atenuar a dor pós-cirúrgica em parte ao reduzir respostas inflamatórias associadas às gliais. No entanto, como os dados atuais são associativos e não mecanicistas, essas descobertas devem ser interpretadas como apoio ao envolvimento das gliais, e não como prova de uma via causal direta.

A participação da ERK1/2, um par de quinases intracelulares importantes reguladas por sinalização, no desenvolvimento e manutenção de diferentes processos dolorosos (mediando a excitabilidade neuronal e a plasticidade sináptica no cérebro e na medula espinhal) já foi comprovada²¹. Por exemplo, um estudo mostrou que a injeção de capsaicina ou formalina induziu um aumento rápido e breve da p-ERK1/2 na medula espinhal, mas a ativação da ERK1/2 espinhal persistiu por muito mais tempo após a injeção do adjuvante completo de Freund ou do veneno de abelha (após uma latência curta)^38,39. Por outro lado, em outro estudo, a ativação da ERK1/2 espinhal induzida por lesão nervosa atingiu um pico extremamente precoce e persistiu por algum tempo, com o desenvolvimento de hiperalgesia após o pico da p-ERK1/2³⁵. Portanto, a fosforilação da ERK1/2 pode ocorrer em diferentes estágios nos diversos processos dolorosos, e a p-ERK1/2 aumentada na medula espinhal pode ser importante tanto para a indução imediata quanto para a resposta gênica de longo prazo.

No presente estudo, a fosforilação induzida pelo corte em ERK1/2 aumentou significativamente nas primeiras 24 h após a incisão em comparação com o grupo controle, e a expressão de p-ERK1/2 atingiu seu pico 4 h após a incisão (como descrito anteriormente)²⁴, coincidindo com o momento em que a expressão de NeuN foi mais elevada. Concomitantemente, conforme revelado pelos resultados de imunofluorescência, a fosforilação induzida pelo corte em ERK1/2 foi simultaneamente distribuída em neurônios, astrócitos e micróglias no corno dorsal medular ipsilateral, apoiando a visão de que a sinalização relacionada ao ERK1/2 é particularmente relevante para a fase inicial da hiperalgesia pós-incisão. Além disso, a administração intratecal pré-operatória de U0126 reduziu a expressão de marcadores gliais medulares, NeuN e p-ERK1/2 4 h após a incisão e aliviou tanto a hiperalgesia mecânica quanto térmica durante o período pós-incisão inicial, sugerindo que o p-ERK1/2 medular pode estar envolvido na fase inicial da hiperalgesia aguda após a incisão. No entanto, como GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 e os desfechos comportamentais apresentaram perfis temporais diferentes, a presente interpretação mecanicista deve ser limitada ao estágio pós-incisão inicial representado pelo ponto temporal de 4 h, em vez de ser generalizada para todo o período pós-operatório.

Além disso, no presente estudo, a administração intratecal pré-operatória de PPF também reduziu a fosforilação de ERK1/2 em 4 h após a incisão, sugerindo que as alterações observadas na expressão espinal de NeuN, GFAP e Iba-1 podem estar associadas, ao menos em parte, à sinalização relacionada ao ERK1/2. A administração intratecal pré-operatória de U0126 também diminuiu a imunorreatividade de TNF-α e COX-2, apoiando uma possível associação entre a fosforilação de ERK1/2 e a expressão de mediadores inflamatórios após a incisão. Os experimentos adicionais in vitro com astrócitos mostrados na Figura 9 forneceram suporte em nível celular para um componente anti-inflamatório dependente de ERK1/2, pois a ativação persistente de ERK1/2 enfraqueceu a capacidade do PPF de reduzir a liberação de TNF-α, PGE2 e IL-6. No entanto, como esses experimentos de resgate foram realizados em astrócitos cultivados e não na medula espinhal intacta, e porque não foram realizados resgate in vivo ou manipulação seletiva por tipo celular, as conclusões in vivo ainda devem ser interpretadas como apoio, e não como prova definitiva, de um mecanismo causal dependente de ERK1/2.

Para discutir mais a fundo as possíveis relações entre a ativação de células gliais, a expressão de p-ERK1/2 e a liberação de citocinas inflamatórias, foram considerados os padrões de localização espacial observados por imunofluorescência. Após a incisão, a p-ERK1/2 foi coexpressa em astrócitos positivos para GFAP e em micróglias positivas para Iba-1 no corno dorsal da medula espinhal às 4 h após a incisão. Combinados aos achados de Western blot e imunofluorescência que mostraram que tanto o PPF quanto o U0126 estiveram associados à redução da expressão de p-ERK1/2, TNF-α e COX-2, esses dados sugerem que a fosforilação de ERK1/2 em células gliais espinhais pode estar envolvida na resposta inflamatória após a incisão. Os dados in vitro em astrócitos primários apoiam ainda mais uma ligação celular direta entre o tratamento com PPF, supressão de ERK1/2 e liberação de mediadores inflamatórios. No entanto, as evidências in vivo demonstram associação e mudanças paralelas relacionadas ao tratamento, enquanto os experimentos celulares complementam, mas não substituem, a validação causal específica por tipo celular in vivo. Como a análise de imunofluorescência foi baseada em um número limitado de animais e campos, essas observações devem ser interpretadas com cautela e em conjunto com os achados de Western blot e in vitro.

Várias etapas do procedimento têm um impacto desproporcional na reprodutibilidade. A injeção intratecal exige tanto uma resposta característica da cauda quanto a confirmação do líquido cefalorraquidiano; resistência durante a injeção, ausência de confirmação ou um novo déficit neurológico devem levar à exclusão, em vez de nova injeção no mesmo local. Os testes comportamentais são sensíveis à aclimatação, às condições do recinto, ao posicionamento do estímulo e às expectativas do pesquisador, portanto, a cegagem, intervalos fixos e condições ambientais consistentes são essenciais. O momento da coleta de tecidos, a transferência uniforme de proteínas, a incubação com anticorpos e as configurações idênticas de microscopia dentro de cada lote de coloração são igualmente importantes. Problemas comuns incluem limiares variáveis de retirada devido à aclimatação inadequada, bandas fracas ou irregulares em Western blot causadas por transferência incompleta ou superexposição, e fundo de fluorescência elevado devido a lavagem insuficiente, concentração excessiva de anticorpos ou configurações de aquisição saturadas.

O protocolo pode ser modificado de acordo com a questão científica. Um curso temporal mais amplo pode ser utilizado quando as respostas gliais tardias forem de interesse, e faixas de dose ou rotas alternativas de administração podem ser adicionadas quando a viabilidade translacional for priorizada. Em comparação com modelos de dor inflamatória ou neuropática, o modelo de incisão plantar é relativamente rápido e prático, e reproduz uma lesão pós-operatória bem definida²⁷. A combinação de testes comportamentais, Western blot e imunofluorescência associada a células fornece informações funcionais, moleculares e espaciais complementares; no entanto, é mais intensiva em recursos do que um ensaio com um único ponto final e, por si só, não estabelece causalidade específica por célula. A comparação farmacológica com U0126 reforça a interpretação da via, mas permanece menos específica do que a manipulação genética ou seletiva por tipo celular^{20,21,22,23,24,25}.

Aplicações futuras incluem testar ambos os sexos, lesões cirúrgicas maiores, vias de administração clinicamente viáveis, pontos temporais pós-operatórios adicionais e intervenções direcionadas a populações gliais específicas. O fluxo de trabalho é prático para triagem de tratamentos analgésicos ou moduladores gliais candidatos porque o modelo de incisão é breve, os desfechos comportamentais são repetíveis e os ensaios moleculares utilizam métodos laboratoriais padrão. A reprodutibilidade, contudo, depende de critérios de exclusão pré-especificados, avaliação cega dos desfechos, aquisição consistente de imagens e relato completo dos dados brutos e configurações de análise.

Limitações

Este estudo apresenta várias limitações. Primeiro, o modelo de incisão plantar na pata representa um dano cirúrgico relativamente leve e pode não refletir completamente procedimentos cirúrgicos maiores, como toracotomia ou laparotomia. Portanto, é necessária cautela ao extrapolar os achados atuais para outras formas de dor pós-operatória. Além disso, apenas ratos Sprague–Dawley machos foram incluídos, o que limita a generalização desses achados entre os sexos. Considerando as diferenças conhecidas entre os sexos nas respostas à dor, nos efeitos analgésicos e nos padrões de ativação glial, estudos adicionais que incluam animais fêmeas são necessários.

As principais observações moleculares e histológicas concentraram-se no ponto temporal de 4 h após a incisão. Como diferentes desfechos, incluindo GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 e resultados comportamentais, apresentaram perfis temporais distintos após a incisão, a interpretação mecanicista dos achados atuais deve ser limitada principalmente ao estágio inicial pós-incisão. Além disso, os experimentos moleculares aqui realizados foram conduzidos com um tamanho amostral relativamente limitado, o que pode reduzir a robustez estatística dessas observações.

A cinase regulada por sinal extracelular 1 e 2 foi avaliada em conjunto como p-ERK1/2; suas contribuições individuais não foram examinadas separadamente. Portanto, os papéis respectivos de ERK1 e ERK2 no processamento da dor induzida por incisão não puderam ser determinados no presente estudo. Além disso, a quantificação da intensidade de fluorescência baseou-se em um número limitado de animais e campos e não incluiu contagens estereológicas de células ou coeficientes formais de co-localização. Essas observações devem, portanto, ser interpretadas com cautela, juntamente com os achados do Western blot.

Finalmente, embora os experimentos in vitro de resgate de astrócitos tenham fornecido suporte mecanicista para a regulação de mediadores inflamatórios dependentes de ERK1/2, os eventos regulatórios upstream após a incisão e os eventos downstream no tecido medular intacto não foram investigados profundamente. O sistema de cultura in vitro também não pode reproduzir completamente as interações entre neurônios, astrócitos, micróglias e células imunes infiltrantes no corno dorsal medular. Assim, o presente estudo apoia um mecanismo relacionado ao ERK1/2, mas não estabelece causalidade celular específica completa in vivo.

Conclusão

O presente estudo demonstra que os aumentos induzidos pela incisão na expressão medular de NeuN, GFAP e Iba-1 foram atenuados pela administração intratecal pré-operatória de PPF. Esse efeito foi acompanhado pelo alívio da hiperalgesia mecânica e térmica aguda e por reduções na fosforilação de ERK1/2 e na expressão de TNF-α e COX-2 após a incisão. No entanto, esses achados apoiam (em vez de provar de forma definitiva o mecanismo) uma associação entre o efeito anti-hiperalgésico do PPF e a redução da fosforilação de ERK1/2 em células gliais medulares (em associação com a redução da expressão de mediadores inflamatórios). O efeito anti-hiperalgésico do PPF persistiu durante todo o período de observação após a incisão, enquanto o efeito do inibidor de MEK1/2 U0126 foi principalmente limitado ao período inicial pós-incisão. Esses achados sugerem que a sinalização ERK1/2 pode ser particularmente relevante durante o início do desenvolvimento da dor pós-incisão. O efeito mais duradouro do PPF indica que seu mecanismo de ação pode envolver vias adicionais além da simples inibição de ERK1/2. Assim, o PPF pode representar uma intervenção terapêutica potencial, e não um alvo biológico, para melhorar o manejo da dor aguda pós-operatória.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tampão PBS 0,01 M	Solarbio	P1020
Tampão Tris-HCl 1,0 M (pH 6,8)	Solarbio	T1020
Tampão Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8)	Solarbio	T1010
Laureato de sódio a 10% (SDS)	Solarbio	S1010
Solução estoque TBST 10×	Solarbio	T1081
Acrilamida a 30%	Solarbio	A1010
Tampão de carregamento de proteína 4×	Solarbio	P1041
Adobe Photoshop	Adobe	—
Persulfato de amônio	Solarbio	A1030
Máquina automática de gelo em flocos	Changshu Xueke	IMS-40
Albumina sérica bovina (BSA)	Solarbio	A8020
Criostato CM150	Leica	CM150
Peagâmetro digital	—	PHS-3C
Dissulfóxido de dimetila (DMSO)	Solarbio	D8371
Balança analítica eletrônica	Cany	—
Reagente de quimioluminescência aumentada (ECL)	Solarbio	PE0010
Filme	Kodak	—
Microscópio de fluorescência DP71	Olympus	DP71
Meio de inclusão para cortes congelados	Sakura	4583
Aparelho de eletroforese em gel	BIO-RAD	—
Glicerol	Solarbio	IG0910
Glicina	Solarbio	G8200
Anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 594 de cabra anti-murino	Proteintech	SA00013-3
Anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano silvestre de cabra anti-murino	ZSGB-BIO	ZB2305
Anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 488 de cabra anti-coelho	Proteintech	SA00013-2
Anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano silvestre de cabra anti-coelho	ZSGB-BIO	ZB2301
Soro de cabra	Solarbio	SL038
GraphPad Prism	GraphPad Software	5
Centrífuga refrigerada de alta velocidade 3K15	Sigma	3K15
Agitador orbital horizontal TS-1000	Haimen Qilinbeier	TS-1000
ImageJ	National Institutes of Health	1.51j8
Metanol	Tianjin Guangfu	—
Anticorpo primário anti-rato GAPDH de camundongo	Proteintech	60004-1-Ig
Anticorpo primário anti-rato p-ERK1/2 de camundongo	CST	9101S
Na2HPO3	Tianjin Beichen Fangzheng	—
NaH2PO3	Tianjin Damao	—
Paraformaldeído	Biosharp	BL539A
Lâminas de microscopia de grau patológico	Shitai	—
Fluoreto de fenilmetanosulfonila (PMSF)	Beyotime	ST506
Teste plantar 37370	UGO BASILE	37370
Membrana de fluoreto de polivinilideno	Solarbio	—
Propentofilina (PPF)	Taosu	T19812
Anticorpo primário anti-rato COX-2 de coelho	Abcam	Ab179800
Anticorpo primário anti-rato GFAP de coelho	Proteintech	16825-1-AP
Anticorpo primário anti-rato Iba-1 de coelho	Proteintech	10904-1-AP
Anticorpo primário anti-rato NeuN de coelho	Abcam	Ab279297
Anticorpo primário anti-rato t-ERK1/2 de coelho	Proteintech	11257-1-AP
Anticorpo primário anti-rato TNF-α de coelho	Proteintech	29652-1-AP
Tampão de lise RIPA	Solarbio	R0010
SDS	Solarbio	S8010
Pó de leite desnatado	Solarbio	D8340
SPSS	IBM	22
Tetrametiletilenodiamina (TEMED)	Solarbio	T8090
Tris	Solarbio	T8060
Triton X-100	Solarbio	T8200
U0126-EtOH	Selleck	S1102
Freezer de temperatura ultra-baixa	Haier	—
Freezer de temperatura ultra-baixa	Sanyo	—
Sistema de purificação de água ultrapura	Heal Force	—
Filamentos von Frey	North Coast Medical	—