Artigo de método

Identificação de histonas modificadas como substratos de ligação do membro humano da família spindlina 4 (SPIN4) por matrizes peptídicas e pulldown nativo de nucleossomos

DOI:

10.3791/70934

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27 de março de 2026

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1Division of Cellular and Molecular Pathogenesis, Department of Pathology, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 2Center for Precision Medicine and Genomics Research, Children's National Research Institute, 3Department of Endocrinology, Children's National Hospital, 4Department of Pediatrics, George Washington University School of Medicine and Health Sciences, 5Massey Comprehensive Cancer Center, Virginia Commonwealth University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Variantes genéticas no Membro da Família Spindlina 4 (SPIN4) humano foram recentemente identificadas em pacientes com crescimento ósseo, um novo distúrbio do desenvolvimento. Um protocolo e novos resultados descrevendo a identificação bioquímica de histonas modificadas no contexto de nucleossomos como substratos de ligação ao SPIN4 são apresentados.

Resumo

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O Membro da Família Spindlin Humana 4 (SPIN4) acaba de surgir como um regulador inovador do crescimento ósseo. Variantes de perda de função no SPIN4 foram identificadas em pacientes que apresentavam síndrome de crescimento excessivo pré e pós-natal, herdada de forma dominante ligada ao X. SPIN4 contém três repetições em tandem de domínios Tudor, cada uma formando uma gaiola aromática individual. Esses domínios Tudor são considerados domínios leitores epigenéticos para resíduos de arginina e lisina metilados de histonas, baseados na homologia de sequências. No entanto, os substratos exatos de ligação do SPIN4 permanecem incertos. O SPIN4 humano, tanto em sua forma selvagem quanto mutante causadora de doenças, foi gerado com sucesso por meio de um sistema de expressão celular de insetos. Por meio de um arranjo de peptídeos de modificação de histonas, foram determinadas as afinidades diferenciais de ligação entre o tipo selvagem e o mutante SPIN4. Validações funcionais também demonstraram que o SPIN4 é um leitor legítimo da metilação da histona H3 Lisina 4 (H3K4me), como evidenciado pela puxada bioquímica dos mononucleossomos nativos. Essa abordagem integrada facilita a identificação rápida de alvos de ligação das proteínas leitoras epigenéticas.

Introdução

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Spindlin Family Member 4 (SPIN4) é leitora epigenética e foi recentemente implicada na síndrome do crescimento excessivo, apresentando-se com uma constelação de crescimento pré e pós-natal e estaturaalta 1,2. Os camundongos knockout (KO) Spin4 recapitularam exatamente o fenótipo humano, apoiando a causalidade. Até o momento, o SPIN4 é o único leitor epigenético exclusivo identificado que regula negativamente o crescimento ósseo. No entanto, as propriedades bioquímicas do SPIN4, um leitor epigenético crítico para o crescimento, não foram caracterizadas, deixando uma lacuna crítica de conhecimento na compreensão dos mecanismos fundamentais causadores da doença nesse novo transtorno do desenvolvimento. O SPIN4 contém três repetições tandem de domínios Tudor, que geralmente são considerados domínios leitores de proteínas leitoras de histonasde arginina metilada ou lisina 3. Uma variante missense SPIN4D82H foi recentemente identificada em um paciente com síndrome de sobrecrescimento ósseo pré-natal e pós-natal. Essa mutação afeta o primeiro domínio Tudor de SPIN4; no entanto, os substratos de ligação relevantes desses domínios Tudor permanecem incertos, limitando a dissecação funcional da regulação dependente de SPIN4 da cromatina e da expressão gênica durante o desenvolvimento ósseo.

A identificação de novos substratos de ligação à histona dos domínios leitores de proteínas não depende de uma abordagem padronizada única. As modificações pós-traducionais (PTMs) das histonas ocorrem principalmente nas caudas das histonas que se projetam para fora das partículas nucleossomas centrais. O reconhecimento de PTMs nas caudas de histonas por domínios de proteínas leitoras é altamente variável e frequentemente requer interações multivalentes e eletrostáticas envolvendo DNA nucleossômico, DNA de ligação e/ou outros domínios histonas para estabilizar coletivamente a interaçãoleitor-alvo 4. Atualmente, PTMs de peptídeos da cauda de histonas foram construídos na forma de microarranjos e comercializados por vários fornecedores5. Embora a triagem PTM baseada em peptídeos da cauda de histonas para alvos de ligação dos domínios da proteína leitora seja de alta produção, frequentemente gera resultados falsos positivos na ausência de nucleossomos. Além disso, as condições experimentais para tais triagens são altamente empíricas e variam de uma proteína para outra, tornando-as tecnicamente difíceis de abordar. A triagem ou pulldown de PTM baseada em nucleossomos sintéticos fornece uma leitura muito mais robusta, mas é muito mais custosa e de baixo rendimento, já que reconstituir nucleossomos carregando combinações variáveis de PTMs é inerentemente desafiador.

Este protocolo descreve uma abordagem rápida para identificar PTMs de histonas em nucleossomos como alvos de ligação do SPIN4. O SPIN4 recombinante foi reconstituído e examinado contra um arranjo comercial de peptídeos PTM de histonas para identificar potenciais alvos de ligação. Monossomas nativos contendo diversos PTMs endógenos de histonas foram posteriormente gerados a partir de células vivas. O pulldown do SPIN4 dos mononucleossomos permitiu a validação direcionada baseada em anticorpos das PTMs histonas após a triagem inicial. Essa estratégia bioquímica integrada demonstra uma abordagem de prova de princípio para a descoberta de alvos eficiente em tempo e custo, e pode ser facilmente aplicada para identificar substratos de ligação de outras proteínas leitoras epigenéticas pouco caracterizadas.

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Protocolo

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Todos os procedimentos experimentais envolvendo células HEK293FT foram realizados em conformidade com as diretrizes do Comitê de Biossegurança Institucional (IBC) da Virginia Commonwealth University.

1. Purificação do SPIN4 humano recombinante

  1. Clone o SPIN4 ouSPIN4 D82H de comprimento completo e selvagem com uma etiqueta de epítopo N-terminal 1× FLAG em um vetor baculoviral 6,7.
  2. Prepare o baculovírus transfectando células Sf9 com vetores baculovirais, colha vírus quando as células estouram, aliquota e armazene o vírus a −80 °C 6,7.
  3. Em um frasco Erlenmeyer de 500 mL, adicione 100 mL de meio de crescimento, 1,5 × 108 células Sf9 e 1 mL de baculovírus P1.
  4. Incube a cultura a 27,5 °C em um incubador agitador orbital ajustado para 125 rpm por 72 horas no escuro.
  5. Purifique o FLAG-SPIN4 usando gel de afinidade FLAG em tampão de lise BC150 contendo inibidores de protease e eluva a proteína usando peptídeo FLAG 1× a 0,1 mg/mL.
  6. Para remover completamente o peptídeo 1× FLAG, dialise o FLAG-SPIN4 eluido contra o tampão de armazenamento de proteínas BC150 a 4 °C, na seguinte ordem:
    1. Primeira diálise: 1 L, 1 h.
    2. Segunda diálise: 2 L, durante a noite.
    3. Terceira diálise: 1 L, 1 h.
  7. Concentre a proteína dializada no volume desejado (para SPIN4, de 600 μL a 150 μL).
  8. Determine a concentração de proteínas usando um ensaio de Ácido Bicinhonínico (BCA) e calcule a concentração molar de acordo.
  9. A quantidade de proteína bruta recuperada em cada etapa de purificação e os rendimentos estimados correspondentes são resumidos na Tabela Suplementar 1. A purificação foi realizada a partir de 250 mL de cultura Sf9 usando 400 μL de gelada de afinidade anti-FLAG.
  10. Diluir o SPIN4 concentrado em 10× no tampão de armazenamento proteico BC150 (Tabela Suplementar 2). Coloque 1, 2, 5, 10 e 20 μL em um gel SDS–PAGE de 15% e visualize por coloração azul Coomassie (Figura 1A).
  11. Quantifique a intensidade de bandas usando um software de análise de imagem para determinar a intensidade relativa do sinal entre faixas carregadas com volumes iguais.
  12. Divida a razão de intensidade pelo peso molecular de cada proteína para obter a razão molar.
  13. Use essa razão molar para corrigir a concentração molar estimada no Passo 1.8.
  14. Aliquota purifica proteínas, congela rapidamente em nitrogênio líquido e armazena a −80 °C. Para uso de curto prazo, armazene a 4 °C durante a noite antes de seguir para o próximo experimento.

2. Matriz peptídica de histonas

  1. Prepare o tampão bloqueador de matriz peptídica dissolvendo 5 g de Albumina Sérica Bovina (BSA) no Tampão de Armazenamento de Proteína BC150 até um volume final de 100 mL.
  2. Opcionalmente, delinee a área da reação na matriz peptídica usando uma caneta marcadora hidrofóbica para minimizar o consumo de reagentes.
  3. Coloque várias folhas de papel filtro em uma placa de Petri de 15 cm e umede-as com água.
  4. Posicione as matrizes peptídicas sobre os papéis filtros umedecidos.
  5. Adicione cuidadosamente um buffer de bloqueio de 300 μL para cobrir completamente cada área do array.
  6. Cubra a placa de Petri e incube em temperatura ambiente por 1 a 3 horas.
  7. Prepare o FLAG-SPIN4 no buffer de bloqueio para uma concentração final de 1 μM.
  8. Prepare 1× peptídeo FLAG em tampão de bloqueio até uma concentração final de 1 μM.
  9. Para melhorar a relação sinal-ruído e reduzir o fundo indesejado, execute os seguintes passos em uma sala fria. Mova os arranjos bloqueados (com a placa de Petri) para a sala fria antes de adicionar proteínas.
  10. Remova o buffer de bloqueio excedente dos arrays.
  11. Adicione cuidadosamente a proteína FLAG-SPIN4 desejada ou o peptídeo FLAG como controle em cada bloco.
  12. Cubra a placa de Petri e incube durante a noite no quarto frio.
  13. Adicione aproximadamente 50 mL de tampão de lavagem de matriz peptídica a uma caixa de lavagem Western blot e leve para a sala fria.
  14. Descarte a solução proteica e transfira imediatamente os arranjos para o buffer de lavagem, lado da reação para cima.
  15. Lave os arranjos cinco vezes da seguinte forma: as duas primeiras lavagens por 1 min cada, e as outras três lavagens por 5 min cada.
  16. Enxágue as matrizes com um tampão bloqueador de matriz peptídica para remover detergente residual, depois devolva-as à placa de Petri.
  17. Prepare a solução de anticorpos anti-FLAG em diluição 1:2000 e adicione 300 μL por bloco.
  18. Incube em temperatura ambiente por 1 hora.
  19. Repita os passos 2.14 a 2.16 para lavar os arrays.
  20. Prepare a solução anti-camundongo (anticorpo secundário) conjugada com HRP em diluição 1:6000 e adicione 300 μL por bloco.
  21. Incube em temperatura ambiente por 1 hora.
  22. Repita os passos 2.14 a 2.16 para lavar os arrays.
  23. Coloque os arrays dentro de um protetor transparente.
  24. Adicione aproximadamente 1 mL de substrato de Quimioluminescência Aprimorada (ECL), garantindo uma cobertura uniforme da superfície da reação.
  25. Remova bolhas de ar e capture imagens quimioluminescentes e de campo claro usando um sistema de imagem apropriado (por exemplo, imagens digitais ou filmes autoradiográficos) (Figura 1B).
  26. Analisar a intensidade do sinal de acordo com o software de matriz peptídica e as ferramentas online associadas (Figura 2A–C).

3. Expressão em larga escala de FLAG-SPIN4 para ensaio de pulldown

  1. Em um frasco Erlenmeyer de 500 mL, adicione 125 mL de meio ESF921, 1,8 × 10células 8 Sf9 e 1,2 mL de baculovírus P1 expressando FLAG-SPIN4 ou FLAG-SPIN4D82H.
  2. Incubar a 27,5 °C em um incubador agitador orbital (125 rpm) por 72 horas.
  3. Aliquot a cultura é a seguinte:
    1. 4 mL de cultura em um tubo de 15 mL para titulação.
    2. 30 mL de cultura em quatro tubos de 50 mL.
  4. Centrifuge os tubos a 600 × g por 15 minutos e descarte o sobrenadante.
  5. Congele rapidamente os pellets em nitrogênio líquido e armazene a −80 °C até o uso.

4. Titulação da razão esfera-lisado para FLAG-SPIN4 e FLAG-SPIN4D82H

  1. Adicione 1 mL de tampão de lise BC150 a cada um dos pellets Sf9 a partir de 5 mL de cultura Sf9 descrita na Seção 3, Passo 3.1.
  2. Sonice os lisados para garantir uma perturbação completa: 30% de amplitude, 5 s ligados/5 s de desligamento, para um tempo total de sonicação de 15 s.
  3. Centrifuge a 20.000 × g, 4 °C, por 10 minutos e transfira o sobrenadante para tubos novos de 1,5 mL.
  4. Prepare uma polpa de gel de afinidade anti-FLAG de 20 μL para cada reação de puxão (60 μL para 3 titulações)
  5. Lave as esferas com o buffer de lise BC150:
    1. Adicione 1 mL de tampão de lise BC150 e vórtice brevemente.
    2. Centrifuge a 3.000 × g por 1 minuto.
    3. Aspire e descarte o sobrenadante.
  6. Resuspenda as esferas em um tampão de lise de 40 μL de BC150 para cada 1 reação de puxão (120 μL para 3 titulações).
  7. Combine o lisato em tubos de 1,5 mL contendo o buffer de lise BC150 e a suspensão de esferas (Tabela Suplementar 3)
  8. Incube os tubos em um rotador de tubo ajustado para 15 rpm a 4 °C por 1,5 h.
  9. Centrifuge a 3.000 × g por 1 minuto e aspire o sobrenadante.
  10. Lave as contas três vezes da seguinte forma:
    1. Resssuspendisse esferas em um tampão de lise e vórtice de 500 μL BC150 brevemente.
    2. Centrifuge a 3.000 × g por 1 minuto.
    3. Aspire o sobrenadante.
  11. Ressuspenda as esferas em 20 μL 1× tampão de Laemmli e incube a 95 °C por 5 minutos.
  12. Centrifuge a 3.000 × g por 1 minuto.
  13. Administre o sobrenadante em um gel SDS–PAGE de 15% e tinga com azul de Coomassie para estimar o rendimento proteico.
  14. Com base nos dados, selecione uma proporção lisato-esferas que sature os sítios de ligação de anticorpos nas esferas. Nos experimentos, ≥300 μL de lisado por 20 μL de contas foram suficientes para alcançar a capacidade total de ligação.
    NOTA: "Saturação dos sítios de ligação de anticorpos" é definida como o ponto em que aumentar o volume do lisado não resulta mais em maior recuperação da proteína alvo.
    NOTA: Na mesma molaridade, o SPIN4D82H apresenta uma afinidade de ligação menor ao gel de afinidade FLAG do que o equivalente do tipo selvagem.
    NOTA: Neste contexto experimental, 1 mL de lisado foi derivado de 6 milhões de células Sf9 (calculado como 1,5 × 106 células/mL × 4 mL), indicando que o SPIN4 expresso a partir de ~6 milhões de células Sf9 é suficiente para saturar 20 μL de polpa de gel de afinidade anti-FLAG.

5. Preparação em larga escala do gel de afinidade anti-FLAG FLAG-SPIN4 como isca

  1. Para cada proteína a ser testada, colete dois pellets de culturas de 30 mL. Resuspenda cada pellet em um buffer de lise BC150 de 6 mL, transfira para um tubo centrífugo de 15 mL e ajuste o volume total para 13 mL com buffer de lise BC150.
  2. Sonice cada amostra no gelo com 100% de amplitude, 15 s ligados/30 segundos de fora, para um tempo total de sonicação de 2 min.
  3. Transfira os lisados para tubos de centrífuga de alta velocidade pré-resfriados e centrifuge a 20.000 × g, 4 °C, por 15 minutos.
  4. Adicione 200 × (número de amostras + 1) × 1,1 μL de polpa de gel de afinidade anti-FLAG a um tubo de centrífuga de 1,5 mL.
  5. Lave as esferas com >5 volumes de coluna (CV) do tampão de lise BC150 uma vez.
  6. Resuspenda as esferas em 400 × (número de amostras + 1) × 1,1 μL de tampão de lise BC150.
  7. Transfira os supernadantes obtidos no Passo 4 para tubos centrífugos de 15 mL.
  8. Adicione 500 μL da suspensão com talonas Step 5.7 em cada tubo.
  9. Em um tubo, adicione 3 mL de tampão de lise BC150 e 60 μL de peptídeo 1× FLAG (100 mM) como controle negativo.
  10. Incube as amostras em um rotador tubular ajustado a 120 rpm a 4 °C por 1,5 h.
  11. Centrifuge a 2.000 × g por 5 minutos e descarte o sobrenadante.
  12. Resuspenda as esferas em uma quantidade apropriada de sobrenadante e transfira para tubos de 1,5 mL.
  13. Centrifuge a 3.000 × g por 1 minuto e aspire o sobrenadante.
  14. Lave as esferas cinco vezes com o tampão de lise BC150 da seguinte forma:
    1. Resuspenda as esferas em 1 mL de buffer de lise BC150.
    2. Para a 4ª e 5ª lavagens, coloque as amostras em um rotador tubular ajustado para 20 rpm a 4 °C por 10 minutos.
    3. Centrifuge a 3.000 × g por 1 minuto e aspire o sobrenadante.
  15. Resuspenda as esferas em um buffer de lise BC150 de 200 μL.
  16. Retire 9 μL da suspensão de contas/tampão e analise o conteúdo proteico por 15% de SDS–PAGE, seguido pela coloração azul Coomassie.
  17. Como a entrada de proteína excede a capacidade de ligação das contas, a quantidade de proteína ligada por volume de esferas deve ser semelhante entre as amostras. Semi-quantifique a intensidade da banda por meio de análise digital de imagem e ajuste a quantidade das esferas para reações subsequentes.

6. Preparação de mononucleossomos a partir de células HEK293FT

  1. Cultive células HEK293FT em placas de cultura de tecido de 15 cm até aproximadamente 90% de confluência usando 10% de Soro Bovino Fetal (FBS) em meio DMEM a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 .
  2. Células HEK293FT passagem precoce são obtidas comercialmente e autenticadas por perfilamento STR.
    NOTA: Um prato de 15 cm gera ~27 milhões de células, o que é suficiente para 1–2 reações de puxamento. Para seis reações (incluindo controles negativos), prepare pelo menos três pratos de 15 cm. Se a modificação pós-translacional (PTM) da histona alvo for rara ou instável, aumente o número de células de 2 a 10× de acordo.
  3. (Opcional) Dependendo da modificação da histona de interesse, adicione os inibidores de PTM apropriados (Tabela Suplementar 2) ao meio de cultivo e incube por 24 horas.
    NOTA: Esta etapa pode ser omitida se houver PTMs abundantes de histonas.
  4. Quando as células atingirem quase 100% de confluência, colete-as da seguinte forma:
    1. Aspire o meio de cultura.
    2. Enxágue as células suavemente com 10 mL de PBS gelado e depois aspire.
    3. Adicione 5 mL de pasta de manteila gelada.
    4. Raspe as células no gelo e transfira para um tubo de 50 mL (todos os pratos podem ser combinados).
    5. Centrifuge a 13.000 × g, 4 °C, por 10 minutos.
    6. Descarte o supernadante.
  5. (Opcional) Ou proceda imediatamente ou congele a célula para uso posterior:
    1. Estime o volume de pellets.
    2. Ressuspenda em 9× volume de pellet de Buffer G para atingir uma concentração final de glicerol de 20%.
    3. Congele rapidamente em nitrogênio líquido e armazene a −80 °C.
  6. Se for seguir com pellet congelado, descongele o pellet no gelo, centrifuge a 1.300 × g, 4 °C, por 5 minutos e descarte o sobrenadante.
  7. Resuspenda o pellet (fresco ou descongelado) em 10× volume de pellet de tampão TMSD (40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mMMgCl 2, 250 mM sacarose, 1 mM DTT) contendo inibidores de protease usando uma pipeta serológica.
  8. Prepare 10% de NP-40 no tampão TMSD de forma fresca e adicione 0,11× volume total de reação para alcançar uma concentração final de NP-40 de ~1%.
  9. Incube a suspensão em um rotador tubular ajustado para 120 rpm a 4 °C por 5 minutos.
  10. Misture 10 μL da suspensão com 10 μL de azul de tripân e observe ao microscópio para monitorar a coloração nuclear. Certifique-se de que os núcleos estejam completamente isolados do citosol (Figura 3A).
  11. Quando aproximadamente 95% dos núcleos são tripano-azul-positivos, prossiga para a próxima etapa. Para HEK293FT células, uma incubação de NP-40 por 5 minutos é tipicamente suficiente. Para outros tipos de células, verifique e ajuste o tempo de incubação.
  12. Centrifuge a 1.300 × g, 4 °C, por 5 minutos e descarte o sobrenadante.
  13. Resuspenda o pellet em 10× volume de pellet do buffer TMSD.
  14. Repita os passos 6.12 a 6.13 cinco vezes para remover completamente o NP-40 residual.
  15. Resuspenda o pellet em 5× volume de pellet do Buffer B.
  16. Adicione 1 unidade de nuclease microcócica (MNase) por 10.000 núcleos e incube em um banho-maria a 37 °C. Ocasionalmente, agite o tubo durante a incubação para manter os núcleos ressuspensos uniformemente
  17. Nos pontos de tempo indicados (0,5, 1 e 2,5 h), retire 50 μL da reação em tubos de 1,5 mL, adicione imediatamente 1 μL de 0,5 M EDTA-Na (pH 8,0) e o vórtice.
  18. Extraia o DNA de cada ponto temporal seguindo o procedimento abaixo:
    1. Adicione 80 μL de H₂O, 30 μL de 10% de SDS e 20 μL de 5 M NaCl; Vórtice.
    2. Adicione 200 μL de fenol/clorofórmio; Vórtice completamente.
    3. Centrífuga a 20.000 × g, RT, 3 min.
    4. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL.
    5. Adicione 1 mL de etanol 100% e 20 μL de acetato de sódio 3 M (pH 5,2); Vórtice.
    6. Centrífuga a 20.000 × g, RT, 5 min.
    7. Remova o sobrenadante, adicione 1 mL de etanol a 70%.
    8. Centrífuga a 20.000 × g, RT, 1 min.
    9. Remova o sobrenadante e seque o pellet a 55 °C com a tampa aberta por 10 minutos.
    10. Resuspenda o pelote em um buffer TE de 50 μL.
  19. Faça amostras em um gel de agarose TBE a 1% para confirmar o tamanho do DNA mononucleossomo (147 pb) (Figura 3B).
  20. (Opcional) As eficiências digestivas da Micronuclease Microcócica (MNase) variam entre os tipos celulares; MNase adicional pode ser adicionada no meio da reação, se necessário, para remover completamente os polinucleossomos. Por exemplo, se amostras de 1 h e 2 h parecerem semelhantes, adicione mais MNase em 3 h.
  21. Quando uma faixa predominante de ~147 pb for observada, ou quando uma incubação adicional de MNase/prolongada não altera mais o tamanho do fragmento, interrompa a reação adicionando 0,5 M EDTA-Na (pH8,0) a uma concentração final de 2 mM.
  22. Centrifuge a 1.300 × g, 4 °C, por 5 min. Colete o sobrenadante (S1).
  23. Ressuspenda o pellet em 10× volume de TE buffer + inibidores de protease e incube a amostra em um rotador de tubo ajustado a 20 rpm a 4 °C por pelo menos 30 minutos.
    NOTA: As eficiências na extração de mononucleossomos variam entre os tipos celulares. O NaCl de 0 a 300 mM pode ser usado para extrair nucleossomos de forma eficiente.
  24. Centrifuge a 1.300 × g, 4 °C, por 5 min. Colete o sobrenadante (S2).
  25. Transfira 50 μL de cada S1 e S2 para tubos separados de 1,5 mL.
  26. Analisar todas as frações por eletroforese em gel de agarosa (Etapas 6.17 a 6.18) para avaliar a distribuição do tamanho do DNA e a eficiência da extração. A maioria dos mononucleossomos é encontrada na fração S2 (Figura 3C).
  27. Transfira S2 para tubos de centrífuga de alta velocidade e centrifuge a 20.000 × g, 4 °C, por 10 minutos para remover material insolúvel.
  28. Colete o sobrenadante e faça diálisis contra o buffer de lise BC150 (sem inibidores):
    1. Primeira diálise: 1 L, 1 h.
    2. Segunda diálise: 2 L, durante a noite.
  29. Após a diálise, centrifuge novamente a 20.000 × g, 4 °C, por 10 minutos para remover quaisquer detritos insolúveis restantes.
  30. Colete o supernadante final.
  31. Misture 5 μL do sobrenadante com tampão de lise BC150 de 35 μL e tampão de Laemmli de 10 μL 5× aqueça, aqueça a 95 °C por 5 minutos e coloque 1, 2, 5, 10 e 20 μL em um gel SDS–PAGE de 15%.
  32. Carregue 1, 2 e 5 μL de 0,1 mg/mL de BSA no tampão de Laemmli como referência para estimativa de rendimento.
  33. Tinga com azul Coomassie e estima o rendimento dos nucleossomos de forma semi-quantitativa usando um software de análise de imagem (Figura 3D).

7. Pulldown modificado de nucleossomos

  1. Prepare o buffer bloqueador de esferas de 2× dissolvendo 1 g de BSA no buffer de lise BC150 até um volume final de 10 mL, depois o vórtice até dissolver completamente.
  2. Transfira as esferas FLAG-SPIN4-WT e FLAG-SPIN4D82H contendo quantidades molares equivalentes de proteína (da Seção 5, Passos 5.16 a 5.17) para tubos separados de 1,5 mL.
  3. Adicione um volume igual de esferas de controle negativo (da Seção 5, Passo 10) à amostra FLAG-SPIN4-WT.
  4. Ajuste o volume total de todas as amostras de esferas para serem idênticos usando o buffer de lise BC150.
  5. Adicione um volume igual de 2× de buffer bloqueador de esferas a cada tubo contendo esferas e ao buffer de lise BC150.
  6. Incube as amostras em um rotador de tubo ajustado a 20 rpm a 4 °C durante a noite (O/N).
  7. Descongele uma quantidade apropriada de 1× nucleossomo extraído de HEK293FT células sobre gelo. O volume necessário depende da razão desejada entre nucleossomo e molar SPIN4. Para otimização inicial, use uma razão molar de 1:1 entre nucleossomos e SPIN4.
  8. Misture 1× nucleossomo com um volume igual de 2× buffer bloqueador de esferas de forma completa.
  9. Combine a mistura do Passo 7.8 com as esferas pré-bloqueadas em um tubo de 15 mL.
  10. Incube a mistura em um rotador tubular ajustado a 20 rpm a 4 °C por 4 horas ou durante a noite.
  11. Centrifuge a 3.000 × g, 4 °C, por 3 minutos.
  12. Descarte cuidadosamente o sobrenadante.
  13. Ressuspenda as esferas em um buffer de lise BC150 de 1 mL e transfira para tubos de 1,5 mL.
  14. Lave as contas três vezes da seguinte forma:
    1. Centrifuge a 3.000 × g, 1 min, e aspire o sobrenadante.
    2. Resuspenda as esferas em 1 mL de buffer de lise BC150.
    3. Ocasionalmente, agite o tubo para manter as contas suspensas uniformemente durante a lavagem.
  15. Lave as contas mais duas vezes, conforme segue:
    1. Centrifuge a 3.000 × g, 1 min, e aspire o sobrenadante.
    2. Resuspenda as esferas em 1 mL de buffer de lise BC150.
    3. Gire a 20 rpm, 4 °C, por 10 minutos.
  16. Após a lavagem, ressuspenda as esferas em 9 volumes de coluna (CV) do tampão de lise BC150.
  17. Pegue 160 μL de cada amostra, misture com 40 μL de 5× tampão de Laemmli e aqueça a 95 °C por 5 minutos.
    NOTA: Recomenda-se uma elução peptídica flag do complexo proteína-nucleossomo, que gera resultados mais limpos e com menos contexto.
  18. Centrifuge a 3.000 × g, temperatura ambiente, por 5 minutos.
  19. Carregue 5 μL do sobrenadante em um gel SDS–PAGE a 15% e realize a coloração com prata (Figura 4A).
  20. Carregue mais 5 μL do sobrenadante em um gel SDS–PAGE de 15%, transfira para uma membrana PVDF e sonde com os anticorpos primários e secundários apropriados específicos para as PTMs de histona alvo (Figura 4B).

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Resultados

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Para investigar os substratos de ligação do SPIN4 humano, o SPIN4 do tipo selvagem e um mutante derivado do paciente associado à síndrome do supercrescimento foram reconstituídos usando um sistema de expressão celular de insetos Sf9. Especificamente, trata-se de uma mutação missense do ácido aspártico (D) em histidina (H) no resíduo 82 (D82H), que reside dentro do primeiro domínio Tudor do SPIN4, implicando seu papel na regulação da ligação ao substrato do SPIN4. Um vetor baculoviral cod...

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Discussão

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Foi apresentado um método eficiente em tempo e custo para identificar bioquimicamente PTMs específicos de histonas como alvos de uma proteína pouco caracterizada, e para avaliar como sua mutação associada à doença afeta a afinidade de ligação do alvo. A vantagem desse método é que não requer a reconstituição cara ou demorada dos nucleossomos sintéticos. Essa abordagem aproveitou a conveniência de arranjos comerciais de peptidos PTM de histonas, garantindo que o SPIN4 seja um leitor legít...

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Divulgações

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Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Os autores agradecem a todos os membros atuais e antigos do Yu and Jee Lab pelo apoio técnico. J.-R.Y. foi apoiado pelo NIH NIGMS Maximizing Investigators' Research Award (MIRA) R35GM160046. É. J contou com o apoio do Hospital Nacional Infantil e do Instituto de Pesquisa Infantil.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mLSarstedt72.690.001Experimentos gerais
Placa de Cultura de Tecidos de 15 cmSarstedt83.3903.300Experimentos gerais
Tubos Centrífugos Cônicos de 15 mLSarstedt62.554.101Experimentos gerais
Tubos Centrífugas Cônicas de 50 mLSarstedt62.548.004Experimentos gerais
Frasco Erlenmeyer de 500 mLStellar ScientificCT229809Cultura celular Sf9
Amersham ImageQuant 800 CCD ImagerCytivaIMQ800Sistema de imagem CCD
Gel de afinidade anti-FLAG M2Sigma-AldrichA2220Pulldown bioquímico
Anticorpo anti-FLAG M2Sigma-AldrichF1804Western blot
AprotininaMedChemExpressHY-P0017Inibidor de protease
Array Analyze SofrwareMotivo Ativohttps://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zipAnálise de dados de arrays de peptídeos MODificados
ASI Agarose LEAlkali ScientificA7700Gel de DNA
Sistema de Expressão de Baculovírus Bac-to-BacTermo Científica10359016Expressão baculoviral
Cloridrato de benzamidinaMedChemExpressHY-W018781Inibidor de protease
Albumina Sérica Bovina (BSA)Sigma-AldrichA9647Padrão de quantificação de proteínas
Azul de BromofenolTermo CientíficaA18469.08Amortecedor de Lammeli
Coomassie Brilliant Blue R-250Termo Científica20278Coloração em gel Protien
Ditiotreitol (DTT)Sigma-Aldrich D5545Buffer de lise
EDTAProdutos de pesquisa RPIE58100Buffer de lise
Substrato de Quimioluminescência Aprimorada (ECL)CytivaRPN2232Western blot
Meio de Cultura Celular de Insetos ESF 921Sistemas de Expressão96-001Cultura celular Sf9
Etanol (200 proof)Química do EspectroET107Precipitação de DNA
Sistema de Imagem EVOS M5000InvitrogenM5000Imagem geral
Peptídeo FLAGMedChemExpressHY-P7006Elução por pulldown
GlicerolSigma-Aldrich G77893Buffer de armazenamento
Anticorpo H3K4me1  Motivo Ativo39300Western blot
Anticorpo H3K4me2  Sinalização de Celular9725TWestern blot
Anticorpo H3K4me3 Sinalização de Celular9751TWestern blot
HEK293FT CélulasTermo CientíficaR70007Linha de fibroblastas renais embrionárias humanas
HEPESSigma-Aldrich H3375Buffer de lise
ImageJInstitutos Nacionais de Saúdehttps://imagej.net/ij/download.html  Programa de processamento de imagens baseado em Java
Hemissulfato de leupeptinaMedChemExpressHY-18234AInibidor de protease
Nuclease Microcócica (MNase)NEB M0247SEndonuclease para digestão de cromatina
Modelo 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB120110Sonicação
Matriz de Peptídeos de Histonas MODIFICADASMotivo Ativo13005Ensaio de ligação a proteínas
Pepstatina AMedChemExpressHY-P0018Inibidor de protease
Fração de IgG de Peroxidase Monoclonal de Cabra Anti-IgG, específica de cadeia leveJackson ImmunoResearch115-035-174Western blot
pFastBac1-Flag-SPIN4Termo Científica10360014Vetor de expressão baculoviral
pFastBac1-Flag-SPIN4-D82HTermo Científica10360014Vetor de expressão baculoviral
Fenol:Clorofórmio:Álcool isoamílico (25:24:1)Sigma-AldrichP2069Purificação de DNA
Kit de Ensaio de Proteína BCA Pierce Rapid GoldTermo CientíficaPIA53226Quantificaiton proteico
Pierce Silver Stain KitTermo Científica24612Detecção de proteínas
Inibidor de Protease PMSFTermo Científica36978Inibidor de protease
Gel de PoliacrilamidaFabricado internamenteN/AGel proteico
Células de insetos Sf9ATCCCRL-1711Linha celular de insetos para expressão de baculovírus
Dispositivo de Diálise Slide-A-Lyzer MINI, MWCO 10KTermo Científica69572Diálise de proteínas
Acetato de sódioSigma-AldrichS8750Precipitação de DNA
cloreto de sódio  Fischer BP358-1Amortecedores gerais
Dodecilsulfato de Sódio (SDS)Sigma-Aldrich L3771Amortecedores gerais
Solução Azul de Tripan (0,4%)Termo Científica15250061Coloração de núcleos

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lui, J. C., et al. Loss-of-function variant in SPIN4 causes an X-linked overgrowth syndrome. JCI Insight. 8 (9), e167074(2023).
  2. Chawla, N., Rajput, M., Shriyan, R., Bachani, S., Gupta, A. Clinical observation of a rare Binder phenotype with fetal overgrowth due to a SPIN4 mutation. Matern Fetal Med. 7 (1), e0030(2025).
  3. Lu, R., Wang, G. G. Tudor: a versatile family of histone methylation readers. Trends Biochem Sci. 38 (11), 546-555 (2013).
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  5. Mauser, R., Jeltsch, A. Application of modified histone peptide arrays in chromatin research. Arch. Biochem Biophys. 661, 31-38 (2019).
  6. Hsu, C. I., et al. Paraspeckle protein NONO regulates active chromatin by allosterically stimulating NSD1. Cell Rep. 44 (1), 116247(2025).
  7. Hsu, C. I., Yeh, E., Chen, C. C. L., Sahn, M., Yu, J. R. Protocol for reconstituting enzymatic activities for ultra-large histone methyltransferases NSD1 and SETD2 using a baculovirus expression system. STAR Protoc. 6 (1), 103963(2025).
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SPIN4 ProteinHistone ModificationPeptide ArrayNative Nucleosome PulldownTudor DomainHistone ReaderH3K4 MethylationWestern BlotBone Growth RegulationPost Translational Modification

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