Proteção das células beta das ilhotas contra lesão induzida por sobrecarga de ferro causada pelo gene 3 materno expresso pela mãe de RNA não codificante

Resumo

A sobrecarga de ferro reduziu a expressão de MEG3 no tecido pancreático. O MEG3 pode desempenhar um papel protetor contra a apoptose β-célula induzida por ferro, envolvendo potencialmente a modulação da via NF-ĸB. Esse mecanismo pode contribuir para a disfunção das ilhotas em pacientes com β-TM com sobrecarga de ferro.

Resumo

Pacientes com beta-talassemia maior (β-TM) frequentemente apresentam metabolismo anormal da glicose, e fatores como sobrecarga de ferro, anemia crônica, desequilíbrios hormonais, disfunção hepática e resistência à insulina associada à inflamação são considerados importantes contribuintes para a disfunção das ilhotas pancreáticas. Ácidos ribonucleicos longos e não codificantes (lncRNAs) são cada vez mais reconhecidos por seus papéis reguladores na apoptose celular e na homeostase da glicose. Este estudo explora a função do lncRNA, gene 3 expresso maternamente (MEG3), na lesão de ilhotas β células induzida por ferro. Um modelo murino com sobrecarga de ferro foi induzido por injeção intraperitoneal de dextron de ferro. A deposição de ferro e o dano tecidual no pâncreas foram avaliados usando azul da Prússia e coloração de hematoxilina e eosina, e a expressão de MEG3 foi quantificada por meio de reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa (RT-PCR). In vitro, células MIN6 foram transfectadas com pequenos RNAs interferentes MEG3 para examinar a apoptose por citometria de fluxo, e a atividade da via de sinalização NF-kappa (ĸ)B foi avaliada por Western bloting. A coloração histológica confirmou deposição significativa de ferro e danos estruturais no tecido pancreático de camundongos sobrecarregados de ferro. A análise RT-PCR revelou uma redução significativa da expressão de MEG3 no pâncreas (p<0,05). In vitro, o knockdown do MEG3 aumentou significativamente a apoptose das células MIN6 em comparação com os controles. A análise Western blot mostrou um nível elevado de NF-ĸB, indicando ativação da via de sinalização NF-ĸB em células silenciadas por MEG3. Esses achados sugerem que a regulação para baixo do MEG3 pode aumentar a apoptose β-célula das ilhotas por meio da sinalização NF-ĸB sob condições de sobrecarga de ferro. O gene MEG3 pode desempenhar um papel protetor contra a apoptose β-célula induzida por ilhéu por ferro, envolvendo potencialmente a modulação da via NF-ĸB. Esse mecanismo pode contribuir para a disfunção das ilhotas em pacientes com β-TM com sobrecarga de ferro.

Introdução

Beta β()-talassemias são um grupo de distúrbios hematológicos hereditários caracterizados pela redução ou ausência da produção da cadeia de β-globina, resultando em anemia crônica e eritropoiese^{ineficaz 1}. Em pacientes com talassemia maior (β-β TM) dependente de transfusão, transfusões repetidas de sangue e hemólise frequentemente levam à sobrecarga sistêmica de ferro, que pode danificar múltiplos órgãos e contribuir para uma série de complicações endócrinas, incluindo metabolismo anormal^{da glicose 2}. Além disso, a anemia crônica aumenta a carga sobre o pâncreas, desequilíbrios hormonais que afetam a regulação da glicose, disfunção hepática que prejudica o metabolismo da glicose e resistência à insulina induzida por processos inflamatórios podem contribuir para a hiperglicemia em pacientes com β-TM. Portanto, as perturbações metabólicas da glicose na β-TM são de natureza^{multifatorial 2,3}. Uma meta-análise recente relatou que a prevalência de glicose em jejum prejudicada, tolerância à glicose prejudicada (IGT) e diabetes mellitus (DM) em pacientes com β-TM foi de 17,21%, 12,46% e 6,54%, respectivamente, indicando um aumento da carga de distúrbios metabólicos da glicose^{nessa população 3}.

Apesar de sua crescente relevância clínica, os mecanismos subjacentes ao metabolismo anormal da glicose na β-TM continuam pouco compreendidos. Estudos anteriores demonstraram que a sobrecarga crônica de ferro, principalmente devido a transfusões repetidas e hemólise, pode levar à deposição excessiva de ferro no pâncreas, especialmente nas células β ilhotas. Esse acúmulo promove a geração de espécies reativas de oxigênio e agrava o estresse oxidativo, desencadeando disfunção mitocondrial, prejudicando a síntese e secreção de insulina e, por fim, induzindo apoptose β-celular e deficiência de^{insulina 4,6}. Além disso, a sobrecarga de ferro pode contribuir para a resistência periférica à insulina por meio de inflamação mediada pelo estresse oxidativo e interferência nas vias de sinalização da insulina. No entanto, as vias moleculares que ligam a sobrecarga de ferro à lesão das células β e à desregulação sistêmica da glicose são complexas e ainda não foram totalmente esclarecidas. Ácidos ribonucleicos longos e não codificantes (lncRNAs) – uma classe de transcritos com mais de 200 nucleotídeos que não codificam proteínas – emergiram como reguladores importantes em diversos processos biológicos, incluindo homeostase da glicose, secreção de insulina e respostas ao estresse^{oxidativo 7,8,9}. Sabe-se que células β ilhotas pancreáticas expressam mais de 1.000 lncRNAs, sugerindo seu possível papel regulador na manutenção da função^{endócrina 10}.

No entanto, pouco se sabe sobre os perfis de expressão dos lncRNAs e seus papéis funcionais no contexto de danos às β-células induzidas por sobrecarga de ferro, especialmente em β-TM. Avanços recentes revelaram que o LncRNA MEG3 (MEG3) promove a secreção de insulina e inibe a apoptose 11 das células β^{pancreáticas}. No entanto, seu efeito sobre as células β pancreáticas em condições de sobrecarga de ferro permanece difícil de alcançar. Em outros contextos patológicos, foi demonstrado que lncRNAs interagem com vias de sinalização chave como NF-kappa (ĸ)B, JNK e Nrf2, que também estão envolvidas no estresse oxidativo e na lesão celular relacionada à sobrecarga^{de ferro} 12,13,14. Especificamente, NF-ĸB é um fator de transcrição central ativado sob estresse oxidativo e tem sido implicado na apoptose de células β em condições de sobrecarga de^ferro 15,16,17. Portanto, este estudo investiga que a regulação descendente do MEG3 pode aumentar a apoptose das células β ilhotas por meio da sinalização NF-ĸB sob condições de sobrecarga de ferro. Esse trabalho pode fornecer novos insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes ao metabolismo anormal da glicose na β-TM.

Protocolo

Os protocolos experimentais empregados no presente estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital Geral de Hainan (protocolo nº 2021-239). O Guia dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e a Declaração de Helsinque foram rigorosamente seguidos em todos os procedimentos experimentais. Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Modelo Animal e Design Experimental

Trinta e seis camundongos machos C57BL/6J (4 semanas de idade, aproximadamente 20 g) foram usados neste estudo. Todos os camundongos foram alojados em condições laboratoriais padrão (20–25 °C, 50%–65% de umidade relativa, ciclo de 12 horas luz/escuridão) com acesso ad libitum a comida e água. Após um período de aclimatação de 7 dias, os camundongos foram divididos aleatoriamente em dois grupos (n=18 por grupo): o grupo de sobrecarga de ferro (grupo modelo), que recebeu injeções intraperitoneais de dextrano de ferro (0,2 g/kg) duas vezes por semana durante 4 semanas; e o grupo Controle recebendo volumes equivalentes de soro fisiológico normal por meio de injeção intraperitoneal. Após 4 semanas, os camundongos foram eutanasiados e os tecidos pancreáticos foram colhidos para análises subsequentes.

2. Medição de Ferro Sérico

Amostras de sangue foram coletadas do seio retroorbital sob anestesia pentobarbital de 1% durante o diestro. Após ser deixado em temperatura ambiente por 1 hora, o sangue foi centrifugado a 4 °C, 3.000 rpm por 15 minutos. O soro foi separado e armazenado a -80 °C. As concentrações séricas de ferro foram determinadas usando um kit de ensaio colorimétrico de ferro, seguindo o protocolo do fabricante.

3. Análise histológica

Amostras de tecido pancreático foram imersas em paraformaldeído a 4% para fixação, seguidas de imposição de parafina antes da preparação da secção. Cortes de tecido em série com espessura variando de 4–5 μm foram obtidas e processadas por meio de procedimentos padrão de deparafinização e reidratação. O exame histomorfológico foi posteriormente realizado usando coloração por hematoxilina e eosina, enquanto a deposição de ferro nos tecidos pancreáticos foi avaliada por coloração com azul da Prússia segundo protocolos convencionais de coloração histológica.

4. Cultura celular e transfecção de pequenos ácidos ribonucleicos interferentes

As células β pancreáticas MIN6 foram cultivadas no meio Eagle modificado de Dulbecco, com alta glicemia, suplementado com 15% de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 10 mM de HEPES, 50 mM de piruvato de sódio e 50 μmol/L β-mercaptoetanol. Todos os experimentos foram realizados em 80% de confluência celular. Cada vez durante a cultura celular, são retirados 6–8 ml de meio de cultura. As células foram mantidas a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO₂. Para estudos funcionais, células MIN6 na fase de crescimento logarítmico foram transfectadas com pequenos RNAs interferentes específicos de lncRNA (direcionando lncRNA selecionados com base em resultados de microarrays); Grupo inibidor) ou siRNA controle negativo (grupo inibidor NC) usando Lipofectamina 2000, conforme as instruções do fabricante. Após o cultivo por 24 horas, as células foram analisadas por reação em cadeia quantitativa da polimerase (qRT-PCR) ou western blot para determinar a eficiência do knockdown. As sequências-alvo deste siRNA foram as seguintes: siMEG3: GCGUCUUCCUGUGCCAUUUTTAAAUGGCACAGGAAGACGCTT; siNC: UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT. Cada experimento foi conduzido em triplicado e repetido três vezes.

5. Ensaio de Reação em Cadeia da Polimerase por Transcrição Reversa

O RNA total foi extraído de amostras de tecido pancreático e células MIN6 usando um reagente de isolamento de RNA à base de fenol comercialmente disponível, conforme as instruções do fabricante. O DNA complementar foi sintetizado usando um kit de transcrição reversa em um volume total de reação de 20 μL. Após a transcrição reversa, a concentração de cDNA da maioria das amostras foi de aproximadamente 1 μg/μL, com base na análise de quantificação da amostra. Posteriormente, 1 μL de molde de cDNA foi usado para amplificação quantitativa em tempo real por PCR. A qRT-PCR foi realizada usando um kit de detecção de PCR baseado em SYBR Green sob as seguintes condições de ciclo: 95 °C por 30 s, 90 °C por 15 s, 60 °C por 34 s e 68 °C por 30 s. Os níveis relativos de expressão gênica foram determinados usando o método do ciclo limiar comparativo (método ^2-ΔCT ). O GAPDH foi usado como gene de referência interno para a normalização de dados de PCR em tempo real. Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com os protocolos dos respectivos fabricantes, e cada experimento foi repetido independentemente pelo menos três vezes. As sequências de primers utilizadas neste estudo estão listadas na Tabela Suplementar 1 e na Tabela 2.

6. Kit de Contagem de Células-8 Ensaio

A capacidade de proliferação celular foi determinada usando um ensaio de contagem celular kit-8, de acordo com as diretrizes do fabricante. Brevemente, as células MIN6 foram placadas em placas de cultura de 96 poços com uma densidade de 5 x 10^{células de 3} por poço após transfecção com si-MEG3 ou si-NC e mantidas por 24 horas. Nos pontos de tempo designados, 10 μL de reagente de viabilidade celular foram introduzidos em cada poço, e as placas foram incubadas a 37 °C por 2 horas. Os valores de absorvância foram posteriormente medidos a 450 nm usando um leitor de microplacas. A viabilidade celular foi calculada como uma porcentagem em relação ao grupo controle.

7. Detecção de Apoptose por citometria de fluxo

Alterações apoptóticas em células MIN6 foram examinadas usando um kit de detecção de apoptose Annexin V-FITC/PI conforme as instruções do fabricante. Após 48 horas de transfecção de siRNA, as células foram colhidas, lavadas duas vezes com soro salino tamponado com fosfato frio e ressuspensas em tampão de ligação. Posteriormente, as células foram incubadas com 5 μL de Annexina V-FITC e 5 μL de iodeto propidiano por 15 minutos em temperatura ambiente em condições escuras. Imediatamente após a coloração, as amostras foram analisadas por citometria de fluxo. Populações celulares apoptóticas iniciais e tardias foram quantificadas usando software de análise citométrica de fluxo. A proporção de células apoptóticas foi posteriormente calculada para comparações entre grupos. Cada experimento foi conduzido de forma independente três vezes.

8. Análise da mancha ocidental

Experimentos com Western blot foram realizados de acordo com os protocolos¹⁸ previamente relatados. As células foram primeiro digeridas com tripsina, coletadas e lisadas em gelo usando o tampão de lise por radioimunoprecipitação. As concentrações de proteína foram quantificadas e quantidades equivalentes de proteína foram submetidas à separação em gels de eletroforese gel de dodecil sulfato de sódio e poliacrilamida a 10% antes da transferência para membranas de polivinilideno fluoreto. Após o bloqueio de membranas, amostras foram incubadas com anticorpos primários contra NF-κB (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000), caspase-3 (1:1000) e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) (1:2000) nas razões de diluição indicadas, seguidas pela incubação com anticorpos secundários ligados à peroxidase de raiz-forte. Os sinais proteicos foram detectados usando um sistema de quimioluminescência e quantificados com o software ImageJ. O GAPDH foi usado como controle de carga interna, e os níveis de expressão proteica foram expressos como mudanças de dobra em relação ao grupo controle.

9. Análise estatística

Os dados foram expressos como média ± desvio padrão (DS). Comparações entre grupos foram realizadas usando o teste Mann–Whitney^{U 19} usando análise estatística. Um valor-p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Avaliação do modelo camundongo com sobrecarga de ferro e medição da expressão materna do gene 3 em tecidos pancreáticos

Para investigar o papel do MEG3 in vivo, estabelecemos um modelo de sobrecarga de ferro em camundongos por meio da injeção intraperitoneal de dextron de ferro. Comparado ao grupo Contra, os níveis de ferro sérico no grupo Modelo foram significativamente aumentados (p<0,05) (Figura 1A). O exame histológico revelou deposição not...

Discussão

Metabolismo anormal da glicose é uma complicação comum e grave em pacientes com β-TM, frequentemente manifestando-se como IGT ou DM. Neste estudo, descobrimos que a sobrecarga de ferro levou a lesão pancreática e diminuiu significativamente a expressão de lncRNA MEG3 no tecido pancreático, acompanhada por aumento da apoptose das células β ilhéus. Além disso, a redução do MEG3 em células MIN6 promoveu a apoptose de células β e esteve associada à ativação do NF-ĸB, indicando uma possível l...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1M Tris-HCL (pH=6.8)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	T1020
50bp DNA Ladder	TIANGEN	MD108
50bp DNA Ladder	TIANGEN	MD108
6×DNA Loading Buffer	TIANGEN	GH101-01
6×DNA Loading Buffer	TRANS	GH101-01
-80ºC refrigerator	BIOBASE	BDF-86V348
ABI 7500 real-time PCR system	Applied Biosystems, USA
Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit	MULTI SCIENCES	AP101-100-kit
BCA Protein Assay Kit	Elabscience Biotechnology Co.,Ltd.	E-BC-K318-M
Biopulverizer	biospec
BSA	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	A8020
C57BL/6J male mice	Gempharmatech Co,Jiangsu,China
CCK-8 Cell Proliferation Assay Kit	KeyGEN BioTECH	KGA317
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
DMEM	KeyGEN BioTECH
Flow cytometry	ACEA Biosciences, USA	NovoCyte 2060R
Fluorescence PCR instrument	Bio-Rad Laboratories, Shanghai
Glycine	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	G8200
High-capacity cDNA reverse transcription kit	Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Servicebio	GB23301	1/2000
HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Servicebio	GB23303	1/2000
Human LncRNA Array V5.0	Arraystar,Rockville, Maryland, USA
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000015
Microarray scanner	Agilent Technologies,California, USA
MIN6 cell	procell	KGM12800N
Mini-Bead-Beater-16	biospec
Mouse Anti-GAPDH	TransGen Biotech	HC301	1/2000
NanoDrop spectrophotometer	NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA	ND-2000
PAGE Pre-Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	A1010
Primers	Generay Biotech,Anhui, China
PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser	CWBIO,Jiangsu, China
PVDF	Millipore	IPVH00010
Rabbit Anti Bax	proteintech	50599-2-ig	1/5000
Rabbit Anti Bcl-2	abcam	ab194583	1/1000
Rabbit Anti Caspase3	abcam	ab184787	1/2000
Rabbit Anti P65	abcam	ab32536	1/8000
Rabbit Anti p-P65	Affinity	af2006	1/1000
TB Green Premix Ex Taq II	TaKaRa, Japan
TRIzol	Invitrogen life technologies, Carlsbad, CA, USA
TRIzol reagent	CWBIO,Jiangsu, China
Ultra-sensitive chemiluminescence imaging system instrument	Bio-Rad Laboratories, Shanghai	Chemi DocTM XRS+
Ultraviolet spectrophotometer	NanoPhotometer	NP80