A aconitina induz danos ao miocárdio em ratos associados à ativação da via de sinalização JNK1/2

Resumo

Este estudo investigou o possível papel da sinalização JNK1/2 no dano miocárdico induzido por aconitina em ratos. O aumento da fosforilação do JNK1/2 esteve associado a danos no miocárdio, enquanto a inibição farmacológica da via JNK aliviou parcialmente o dano do miocárdio, sugerindo que a sinalização do JNK pode participar da cardiotoxicidade induzida pela aconitina.

Resumo

O envenenamento agudo por Aconitina (Acon) pode causar arritmia e danos no miocárdio; no entanto, os mecanismos subjacentes permanecem incertos. Este estudo investigou o mecanismo da lesão do miocárdio induzida por intoxicação aguda por Acon. Um modelo de rato (n = 51) de intoxicação aguda por Acon foi estabelecido por administração intragástrica. Rastreamentos eletrocardiográficos foram usados para registrar alterações no ritmo cardíaco. Foram realizadas colorações por hematoxilina e eosina (HE) e coloração de Masson para avaliar lesão patológica do miocárdio e deposição de colágeno. Os níveis de expressão de enzimas cardíacas e proteínas no sangue venoso foram detectados usando kits de ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA). A relação estrutura–atividade entre Acon e a via JNK foi investigada por meio de acoplamento molecular. Os níveis de expressão das proteínas fosforiladas da quinase C-Jun N-terminal 1/2 (JNK1/2) foram detectados por Western bloting. Neste estudo, foram observadas arritmias ventriculares em ratos após administração intragástrica de Acon. O tecido miocárdico apresentou uma disposição desordenada das fibras e células miocárdicas, acompanhada de deposição anormal de colágeno. Os resultados do acoplamento molecular indicaram possíveis interações entre Acon e JNK1/2. Enquanto isso, os níveis de expressão de enzimas cardíacas e proteínas, bem como de JNK1/2 fosforilado, foram significativamente aumentados. Estudos posteriores demonstraram que o tratamento com o inibidor do JNK SP600125 reverteu parcialmente a lesão miocárdica induzida por Acon em ratos. Esses resultados indicam que a fosforilação JNK1/2 está envolvida no desenvolvimento de lesão do miocárdio induzida por intoxicação aguda por aconitina. Os achados sugerem que a ativação da via de sinalização JNK1/2 contribui para o dano miocárdico induzido por aconitina, e que a inibição da via JNK1/2 pode aliviar a lesão do miocárdio causada pela intoxicação aguda por aconitina.

Introdução

Acon é um extrato natural de alcaloide diterpeno da planta Aconitum, da família Ranunculaceae. Possui efeitos^{anti-inflamatórios 1,2}, analgésicos, antitumorais, antirreumáticos, imuno-metabolismo e promoção da circulação^{sanguínea 3,4,5}. No entanto, o uso inadequado ou excessivo de preparações contendo Acon pode levar a eventos graves de intoxicação. Os sintomas causados pelo envenenamento por Aconitina incluem sintomas^{cardíacos 6}, sintomas neurológicos⁷ e sintomas^{gastrointestinais 8}. Nos últimos anos, houve relatos frequentes ao redor do mundo de casos envolvendo envenenamento por Acônito ou^{morte 9,10,11}. O envenenamento por aconis se manifesta principalmente no sistema cardiovascular, nervoso e digestivo. Entre elas, a principal causa de morte por envenenamento é a cardiotoxicidade. O dano cardíaco causado por Acon é muito sério; Em particular, o início curto da síndrome dificulta a realização do tratamento clínico de forma oportuna. Normalmente, a intoxicação aguda por Acon causa náusea, diarreia, tontura, dor no peito, dispneia e outros primeiros sintomas em poucas horas^. Atualmente, o mecanismo detalhado do dano ao miocárdio causado pelo envenenamento agudo por Acon ainda não está claro, e não existem medicamentos clinicamente eficazes que possam aliviar efetivamente os danos do miocárdio causados pelo envenenamento por Acon^12,13.

Danos em intoxicação aguda por Acon que possam permitir explorar o mecanismo do dano do miocárdio podem fornecer um meio significativo de investigação dependente do tempo. Tal modelo pode ter potencial para tratamento futuro de pacientes com condições agudas de intoxicação por Acon e pode prevenir o desenvolvimento precoce da síndrome. Estudos especularam sobre o papel da via de sinalização da quinase n-terminal c-Jun (JNK) na resposta imune a venenos. A via de sinalização JNK é uma das vias de sinalização da proteína quinase ativada pelo mitógeno (MAPK). A família JNK possui três genes (JNK1/MAPK8, JNK2/MAPK9 e JNK3/MAPK10). JNK1 e JNK2 podem ser expressos na maioria dos tecidos, incluindo o coração, enquanto JNK3 é encontrado principalmente no^{cérebro 14}, e está principalmente relacionado ao estresse oxidativo e à resposta inflamatória das células¹⁵. Estudos descobriram que a via de sinalização mediada pelo JNK desempenha um papel importante na isquemia/lesão de reperfusão cerebral e^{do miocárdio 16,17}. A administração de C66 alivia a inflamação do miocárdio induzida pela dieta rica em gordura ao inibir a ativação do JNK em corações de^{camundongos 18}. O ácido clorogênico alivia a lesão cardiomiócita induzida pelo TNF-α ao inibir a sinalização do JNK¹⁹. O Pinocembrin alivia danos do miocárdio induzidos por LPS e a resposta inflamatória ao inibir a via de sinalização p38/JNK MAPK, além de aliviar a disfunção cardíaca e a^{arritmia 20}. Esses estudos indicam que mudanças na sinalização JNK, principalmente JNK1/2, estão intimamente relacionadas ao dano miocárdico. Enquanto isso, a JNK também é um alvo posterior da Acon para uma série de atividades. Um estudo constatou que altas doses de exposição ao Acon podem mediar a via de ativação enzimática JNK, causando toxicidade no desenvolvimento em embriões de peixe-zebra (juvenis), como comprimento corporal encurtado, formato corporal curvado e defeitos no desenvolvimento^{cerebral 21}. Este estudo sugere que o Acon pode ativar a via de sinalização JNK. No entanto, o papel da via de sinalização JNK no dano do miocárdio causado por intoxicação aguda por aconitina é incerto.

Este estudo estabeleceu um modelo em ratos de intoxicação aguda por Acon em danos do miocárdio, definindo diferentes doses intragástricas e intervalos de tempo. Além disso, exploramos o efeito do Acon no nível de fosforilação do JNK1/2 no miocárdio e a ativação da via de sinalização do JNK neste modelo. Explorar o papel da fosforilação JNK1/2 na lesão miocárdica em ratos induzida por intoxicação aguda por Acon fornece uma base teórica para o estudo do dano miocárdico causado por intoxicação aguda por Acon.

Protocolo

O desenho experimental e o plano de implementação foram aprovados pelo Comitê de Experimentos com Animais da Universidade Médica de Kunming para aprovação (número de aprovação: Kmmu20220652) em 06/2022. Todos os planos experimentais foram realizados de acordo com as "Diretrizes para Experimentos com Animais da Universidade Médica de Kunming". A lista de todos os materiais utilizados neste estudo está listada na Tabela de Materiais.

ATENÇÃO: Devido à alta toxicidade do Acon, todos os procedimentos de preparação e administração foram realizados de acordo com as normas institucionais de segurança laboratorial. O pessoal que manuseava o Acon usava equipamentos de proteção individual adequados, incluindo luvas, jalecos e máscaras, e procedimentos envolvendo preparação para o Acon eram realizados com precauções adequadas para minimizar o risco de exposição. Os animais foram monitorados de perto durante e após a administração do Acon para sinais de toxicidade e sofrimento severos, e critérios humanos foram aplicados quando necessário para minimizar o sofrimento. Resíduos biológicos e materiais contaminados por Acon foram descartados de acordo com as regulamentações institucionais de biossegurança.

Tratamento animal

Ratos machos adultos Sprague-Dawley (SD) (2 meses de idade, 230 g) foram criados no prédio de experimentos com animais com SPF, centro experimental de animais da Universidade Médica de Kunming. As condições de alimentação de todos os ratos SD foram tratadas de acordo com as necessidades alimentares dos ratos SPF. Eles foram criados adaptativamente por 1 semana e jejuaram por 12 horas antes do experimento. Acon foi dissolvido em 0,05 M acetate buffer (Acet), e os ratos SD foram divididos em 4 grupos segundo o princípio do controle aleatório: Grupo 1 (Acon-1 mg) administrado 1mg/kg de Acon por gavage; Grupo 2 (Acon-2 mg) administrado 2mg/kg de Acon por via intragástrica; Grupo 3 (Acet), administrado 2 mL de acetato 0,05 M tamponado por intragástrico; e Grupo 4 (Controle sem tratamento). As amostras foram coletadas 1, 3 e 6 horas após a administração intragástrica. Um total de 36 ratos foi estudado, com 3 por grupo a 1h, 3h e 6h. Em cada momento designado, gravações de ECG eram realizadas pela primeira vez. Posteriormente, os ratos foram anestesiados e amostras de sangue foram coletadas para análise bioquímica sérica. Após a coleta de sangue, os ratos eram sacrificados e o tecido cardíaco era rapidamente extirpado. Porções do tecido miocárdico foram fixadas para análise histológica (coloração HE e Masson), enquanto os tecidos restantes foram armazenados para análise de expressão proteica por Western bloting. Em experimentos que testaram os ativadores e inibidores JNK1/2, ratos SD serão divididos em 5 grupos segundo o princípio do controle aleatório: o grupo modelo recebeu administração de 2 mg/kg de Acon intragástrico, e o grupo inibidor recebeu uma injeção intraperitoneal de 6 mg/kg SP600125²² inicialmente, seguida por 2 mg/kg de Acon por gavage 2 horas depois. O grupo agonista recebeu inicialmente uma injeção intraperitoneal de 0,1 mg/kg de anisomicina (Anis^)23,24, seguida de 2 mg/kg de Acon por gavage 2 horas depois. O grupo DMSO recebeu uma injeção intraperitoneal de 2 mL de solução mista com cosolvente DMSO a 0,8%. O grupo controle não recebeu tratamento. Um total de 15 ratos foi estudado. Todos os resultados da coloração foram analisados de forma cega para minimizar o viés observacional. Durante o período experimental, os ratos foram monitorados continuamente quanto ao status de sobrevivência e sinais de toxicidade severa após a administração de Aconitina. A mortalidade foi registrada em cada ponto de observação designado (1h, 3 h e 6h). A morte era definida como a cessação completa da respiração e do batimento cardíaco. Animais que apresentavam sofrimento severo, incluindo disneia persistente, perda do reflexo de endireitamento, incapacidade de andar ou condição moribunda, foram considerados como tendo atingido pontos humanos e foram eutanasiados imediatamente sob anestesia profunda para minimizar o sofrimento. O número de mortes para cada grupo de ratos (Tabela 1–4).

Rastreamento eletrocardiograma de rato (ECG)

Ratos de cada grupo foram submetidos a rastreamentos por ECG. O método específico foi o seguinte: após anestesia, por injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio em uma dose de 30 mg/kg. Os ratos estavam fixos em posição supina no console de experimentos com animais. O computador foi conectado ao sistema de aquisição e análise de sinais biológicos BL-420N, e o plugue de fio de chumbo ECG foi inserido na porta de entrada de 3 canais do sistema BL-420N. Os pinos eram inseridos subcutaneamente na parte interna do membro anterior direito, do membro posterior direito e do membro posterior esquerdo dos ratos. Os pinos foram embebidos e esterilizados em álcool a 75% antes da operação, e foi tomado cuidado para evitar a inserção dos pinos nos músculos. Os clipes de eletrodo do fio de chumbo do ECG foram então conectados aos pinos de cada membro. O interruptor de energia e o software do sistema de aquisição e análise de sinais biológicos BL-420N foram ativados. O canal 3 foi selecionado para aquisição de sinal, e o tipo de sinal foi definido como ECG de rato. Os parâmetros foram definidos da seguinte forma: taxa de amostragem, 1 kHz; alcance, 2,0 mV; constante de tempo (filtro passa-alta), 200 ms (0,80 Hz); filtragem passa-baixa, 100 Hz; velocidade de varredura, 200,0 ms/div; e o filtro de entalhe de 50 Hz foi desligado. O ECG com derivação II foi registrado e mudanças no ECG foram observadas. Após o ECG se estabilizar, monitoramento e registro foram realizados por 3 minutos, e os dados foram salvos em grupos para análise subsequente. Após a gravação do ECG, os clipes e pinos do eletrodo foram removidos, e os ratos foram devolvidos às suas gaiolas. Os ratos foram mantidos aquecidos e sua respiração monitorada até a recuperação total da anestesia para evitar a morte por sufocamento. Os registros de ECG no início do dia foram realizados no primeiro dia, antes de qualquer tratamento. No segundo dia, os ratos receberam Acon por gavage intragástrico, e os registros de ECG foram realizados posteriormente em 1h, 3 h e 6 h após a administração, utilizando o mesmo procedimento.

Coloração por Hematoxilina e Eosina (HE) e coloração de Masson

Corações foram cortados no plano horizontal do eixo curto, e o tecido cardíaco do ápice cardíaco dos ratos SD foi coletado e fixado em poliformaldeído a 4% em temperatura ambiente por 24 horas. Os tecidos fixos foram desidratados, eliminados em xileno e embutidos em cera de parafina. Depois, seções (4 μm de espessura) foram coradas com HE e Masson segundo o procedimento padrão. Na coloração com HE, a coloração por hematoxilina foi realizada por 2 minutos, depois as amostras foram deixadas de molho em água morna por 1 minuto, e a coloração com eosina foi realizada por 30 segundos. Na coloração Masson, tinga com solução de hematoxilina de ferro Weigert por 5 minutos, depois com solução azul Masson por 3–5 minutos e, finalmente, com solução azul anilina por 1–2 minutos. As lâminas foram observadas sob um microscópio óptico comum. Para cada seção, cinco campos microscópicos não sobrepostos foram selecionados aleatoriamente com a mesma ampliação, evitando grandes vasos e artefatos óbvios. A fração de volume de colágeno (CVF) foi calculada usando o ImageJ, de acordo com a Equação (1):

(1)

Ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA)

Após o registro do ECG, os ratos foram anestesiados com pentobarbital de sódio e, em seguida, foi realizada uma laparotomia na linha média para coletar sangue venoso. As amostras de sangue foram coletadas por perfuração da veia cava inferior usando uma agulha descartável de coleta venosa. O sangue foi incubado a 4 °C durante a noite, e o sobrenadante foi coletado após a centrifugação a 1000 × g por 20 minutos. As concentrações de CK-MB, AST, LDH, cTn-1 e h-FABP foram determinadas usando um kit de ensaio ELISA. O ELISA foi realizado conforme as instruções do fabricante. Os valores de densidade óptica (OD) de cada poço foram determinados a 450 nm, usando um leitor de microplacas.

Análise de Western blotting

A proteína total foi extraída dos tecidos cardíacos usando um kit de extração de proteínas. Um kit de ensaio proteico BCA foi utilizado para determinar a concentração de proteínas. A proteína total (o volume amostral da proteína a ser testada foi de 10 μL) foi separada com eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida a 10% e transferida para a membrana PVDF, bloqueando leite desnatado a 5% por 30 minutos. Posteriormente, a membrana foi incubada durante a noite com anticorpos primários JNK1/2(1:500), p-JNK1/2 (1:1000) e GAPDH (1:4000). No dia seguinte, todas as membranas foram lavadas com PBST três vezes e depois incubadas com o anticorpo secundário apropriado (1:5000) por 1 hora. Por fim, reagentes de quimioluminescência aprimorados foram usados para detecção de sinais; a solução reveladora foi aplicada uniformemente em gota a gota sobre as tiras de membrana PVDF e deixada incubar por 10 segundos, seguida por exposição, revelação e imagem. As intensidades das bandas Western blot foram medidas usando o software ImageJ.

Validação de acoplamento molecular

A estrutura molecular SDF 3D da Aconitine foi baixada do banco de dados PubChem, e a estrutura SDF foi convertida em uma estrutura mol2 usando o software OpenBabel. As estruturas proteicas PDB de maior resolução e maior duração do JNK1 e JNK2 foram baixadas dos bancos de dados Uniprot e Protein Data Bank. Hidrogenação, remoção de ligantes e adição total de hidrogênio foram realizadas em proteínas macromoleculares, enquanto adição total de hidrogênio e carga de elétrons foram realizadas em compostos de pequenas moléculas, e ligações de torção foram estabelecidas. Experimentos de acoplamento molecular foram realizados via AutoDock Vina, onde afinidades de ligação ≤ -7,0 kcal/mol foram definidas como indicativas de interações fortes ligando-proteína. O PyMol foi usado para visualizar a estrutura 3D do complexo de acoplamento, e o Discovery Studio foi usado para visualizar a estrutura 2D do complexo de acoplamento.

Análise estatística

Todos os experimentos foram repetidos três vezes de forma independente. O GraphPad Prism 8 foi usado para analisar e graficar todos os dados estatisticamente. Todos os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (DS). O teste t do aluno foi usado para comparações entre dois grupos. Para comparações entre múltiplos grupos no mesmo ponto temporal ou análises de curso temporal dentro do mesmo grupo, foi usada ANOVA unidirecional. P < 0,05 foi considerado indicativo de um^{estatisticamente significativo 25}.

Resultados

Resultados do ECG em ratos após o Acon gavage

Estudos anteriores demonstraram que os efeitos tóxicos da Aconitina ocorrem na fase inicial, tipicamente dentro de horas após a administração ^26,27. Portanto, para capturar a ocorrência e progressão precoces da cardiotoxicidade aguda dentro dessa janela de tempo, selecionamos três pontos de tempo: 1 h, 3 h e 6 h para os experimentos. Os resultados do eletrocardiograma mostraram que, após 1, 3 h e 6 h de ação do Acon, não ocorreram arritmias no grupo controle e no grupo Acet, e as mudanças no ECG não foram evidentes. Ratos do grupo Acon-1mg apresentaram contrações ventriculares prematuras e bigemina ventricular prematura, respectivamente, triplete ventricular prematura, taquicardia ventricular de explosão curta, taquicardia ventricular monomórfica, taquicardia ventricular bidirecional e uma ou mais arritmias ventriculares. Ratos do grupo Acon-2 mg desenvolveram contrações ventriculares prematuras, uma ou mais arritmias ventriculares, incluindo bigeminia ventricular prematura, taquicardia ventricular de curta explosão e taquicardia ventricular bidirecional (Figura 1, Figuras Suplementares 1–2). O Acon promove danos patológicos do miocárdio e aumenta a coloração de colágeno no tecido miocárdico de ratos.

O tecido miocárdico foi avaliado por coloração de HE. Os resultados mostraram que, comparado ao grupo controle e ao grupo Acet, após 1, 3 h e 6 h de tratamento com Acon, o tecido miocárdico de ratos SD no grupo Acon-1 mg apresentou ruptura parcial das fibras musculares do miocárdio, disposição desordenada das células miocárdicas, o interstício miocárdico está alargado e ocorre edema no interstício miocárdico, A maioria das células miocárdicas está inchada, os núcleos são profundamente corados e condensados, um grande número de células miocárdicas sofre degeneração e vacúolas redondas são formadas no citoplasma da fibra miocárdica (indicado por setas). As estrias das fibras musculares no tecido miocárdico dos ratos SD do grupo Acon-2 mg eram pouco claras ou desapareceram; A disposição dos feixes musculares era frouxa e desordenada, os espaços intermusculares eram alargados, um grande número de núcleos celulares estava profundamente corado, a picnose nuclear, edema intercelular e as células do miocárdio estavam inchadas e degeneradas. O citoplasma das fibras miocárdicas apresentou vacúolos arredondados (mostrados por setas) (Figura 2A, Figura Suplementar 3A, Figura Suplementar 4A).

A coloração de Masson foi realizada para avaliar a deposição de colágeno no tecido miocárdico. Nos grupos Controle e Acet, os cardiomiócitos apresentaram morfologia normal, com deposição mínima de colágeno observada no interstício miocárdico. No grupo Acon-1 mg, aumentos leves de colágeno tingido de azul foram observados em algumas áreas intersticiais. No grupo Acon-2 mg, regiões mais extensas e coloridas de azul estavam distribuídas difusamente por todo o tecido miocárdico, acompanhadas por arranjo desorganizado do miofilamento e perturbação da estrutura normal do miocárdio. A extensão da coloração por colágeno no grupo Acon-2 mg foi maior do que no grupo Acon-1 mg. A análise quantitativa mostrou que a fração volumétrica de colágeno (CVF) aumentou significativamente tanto nos grupos Acon-1 mg quanto Acon-2 mg em comparação com os grupos Controle e Acet (n = 3 ratos por grupo, ANOVA unidirecional, p < 0,05). Notavelmente, o valor de CVF atingiu seu nível mais alto no grupo Acon-2 mg às 6 horas após administração intragástrica (Figura 2B, Figura Suplementar 3B, Figura Suplementar 4B). Considerando o curto período de observação (1–6 h), esses achados têm maior probabilidade de refletir mudanças intersticiais agudas, como edema ou alterações nos padrões de coloração do colágeno, do que fibrose miocárdica estabelecida. Além disso, não houve diferença significativa no peso cardíaco entre os grupos em 1h, 3 h e 6 h após o tratamento com Acon-1 mg ou Acon-2 mg (Tabela 5).

O Acon promove enzimas cardíacas e níveis de proteínas cardíacas no sangue venoso de ratos

Para avaliar o dano miocárdico induzido por Acon, medimos os níveis séricos de marcadores de lesão cardíaca, incluindo CK-MB, AST, LDH, cTn-I e h-FABP. Comparados aos grupos Controle e Acet, os grupos Acon-1 mg e Acon-2 mg apresentaram níveis significativamente aumentados de CK-MB, AST, LDH, cTn-I e h-FABP em 1 hora, 3 h e 6 h (n = 3 ratos por grupo, ANOVA unidirecional, p < 0,05). Além disso, nos mesmos momentos, os aumentos nesses marcadores foram mais pronunciados no grupo Acon-2 mg do que no grupo Acon-1 mg (p < 0,05) (Figura 3).

Resultados do acoplamento molecular

Para examinar mais a fundo o efeito do Acon na via de sinalização do dano ao miocárdio em ratos, utilizamos o acoplamento molecular para identificar proteínas relacionadas à via Acon. Os resultados do acoplamento mostraram que o Acon podia se ligar estabilidade aos bolsões ativos tanto do JNK1 quanto do JNK2 por meio de múltiplas interações não covalentes. No JNK1, a Aconitina formou duas ligações de hidrogênio convencionais com ALA267 e SER299, com distâncias de ligação de 2,0 Å e 2,1 Å, respectivamente, indicando fortes interações direcionais que contribuem para a ancoragem dos ligantes. Além disso, extensas interações de van der Waals foram observadas entre a Aconitina e os resíduos ao redor, facilitando uma complementaridade espacial próxima dentro do bolsão de ligação. Interações hidrofóbicas, incluindo interações Alquilo/π-Alquilo com ILE304, estabilizaram ainda mais o ligante dentro do microambiente hidrofóbico. Ligações carbono-hidrogênio também foram identificadas, formando uma rede de interação cooperativa que suporta a ligação de ligantes (Figuras 4A–C). No JNK2, a Aconitina formou uma ligação de hidrogênio convencional com o LEU302 (2,1 Å), servindo como uma interação de ancoragem-chave. Semelhante ao JNK1, as interações de van der Waals, interações hidrofóbicas e ligações carbono-hidrogênio contribuíram coletivamente para a estabilização do complexo ligante–proteína (Figura 4D–F). Os resultados do acoplamento dos compostos testados são relatados como escores de ligação (kcal/mol) e apresentados na Tabela 6. No geral, a ligação de hidrogênio proporcionou especificidade e ancoragem, interações hidrofóbicas aumentaram a incorporação de ligantes e a afinidade de ligando, e as interações de van der Waals contribuíram para a estabilidade complexa geral. Esses achados indicam que a aconitina pode formar complexos estáveis tanto com JNK1 quanto com JNK2, apoiando seu potencial como agente de alvo.

Acon aumenta o nível de fosforilação do JNK

Para investigar mais a fundo o efeito do Acon na via de sinalização JNK no tecido miocárdico, a expressão da fosforilação de JNK1/2 foi avaliada por Western bloting. Comparados aos grupos Controle e Acet, os grupos Acon-1 mg e Acon-2 mg apresentaram níveis significativamente aumentados de p-JNK1/2 (n = 3 ratos por grupo, ANOVA unidirecional, p < 0,05). Além disso, o nível de fosforilação de JNK1/2 foi significativamente maior no grupo Acon-2 mg do que no grupo Acon-1 mg (p < 0,05) (Figura 5A). Dentro do grupo Acon-2 mg, comparações entre diferentes períodos mostraram que os níveis de p-JNK1/2 aumentaram significativamente em 1 hora, 3 h e 6 h, com o nível mais alto observado às 6 h (n = 3 ratos por grupo, ANOVA unidirecional, p < 0,05) (Figura 5B). Com base nesses resultados, o grupo Acon-2 mg às 6 h foi selecionado para experimentos subsequentes.

Inibidor do JNK alivia danos patológicos do miocárdio e coloração de colágeno no tecido miocárdico de rato

Para avaliar melhor o papel regulador da via de sinalização JNK, os níveis de expressão de p-JNK1 e p-JNK2 no tecido miocárdico foram avaliados por Western blotting. Comparado aos grupos Controle e DMSO, o grupo Acon apresentou níveis de expressão significativamente aumentados de p-JNK1 e p-JNK2 (n = 3 ratos por grupo, ANOVA unidirecional, p < 0,05). Comparado ao grupo Acon, o grupo Acon+SP600125 apresentou níveis significativamente reduzidos de p-JNK1 e p-JNK2 (n = 3 ratos por grupo, ANOVA unidirecional, p < 0,05). Em contraste, comparado ao grupo Acon+SP600125, o grupo Acon + Anis apresentou níveis de expressão significativamente aumentados de p-JNK1 e p-JNK2 (n = 3 ratos por grupo, ANOVA unidirecional, p < 0,05) (Figura 6).

Os efeitos de Anis e SP600125 sobre danos ao miocárdio foram investigados mais a fundo. Os resultados da coloração com HE mostraram que, comparado ao grupo Acon, o edema intersticial do tecido miocárdico no grupo Acon+SP600125 foi reduzido, o inchaço de alguns cardiomiócitos desapareceu e o citoplasma celular foi uniforme. O espaço muscular está cheio, o espaço intermuscular fica mais fino, algumas fibras do miocárdio estão organizadas de forma firme e ordenada, um pequeno número de núcleos celulares está profundamente corado, e o citoplasma das fibras do miocárdio apresenta pequenos vacúolos arredondados, e o dano patológico do miocárdio é aliviado. Comparado ao grupo Acon+SP600125, o grupo Acon + Anis teve fibras do miocárdio quebradas, lacunas musculares alargadas, fibras do miocárdio dispostas de forma frouxa e desordenada, células do miocárdio inchadas e degeneradas, cromatina nuclear profundamente corada e edema intercelular ocorrido (Figura 7A).

A coloração de Masson foi realizada para avaliar a coloração por colágeno no tecido miocárdico. No grupo Acon+SP600125, áreas moderadas com coloração azul foram observadas no interstício do miocárdio. Comparado ao grupo Acon, a fração de volume de colágeno (CVF) no grupo Acon+SP600125 foi significativamente reduzida, indicando atenuação das alterações intersticiais induzidas por Aconitina. Em contraste, no grupo Acon + Anis, áreas de colágeno com coloração azul mais extensas foram observadas no interstício miocárdico em comparação com o grupo Acon+SP600125, acompanhadas por um aumento significativo no FVC (n = 3 ratos por grupo, ANOVA unidirecional, p < 0,05) (Figura 7B). Além disso, não houve diferença significativa no peso cardíaco entre os grupos (Tabela 5). Considerando o curto período de observação (1–6 h), essas mudanças têm maior probabilidade de refletir alterações intersticiais agudas, como edema ou alterações nos padrões de coloração de colágeno, do que fibrose miocárdica estabelecida. Esses achados sugerem que SP600125 alivia a lesão miocárdica induzida por aconitina, enquanto a anisomicina agrava ainda mais o dano miocárdico nessas condições experimentais.

O inibidor do JNK alivia a expressão de enzimas cardíacas e proteínas cardíacas no soro de ratos

Os resultados do ELISA mostraram que, comparados ao grupo Acon, as expressões de CK-MB, AST e LDH foram significativamente reduzidas no grupo Acon + SP600125, enquanto as expressões de CK-MB, AST e LDH aumentaram após a ação de Anis (n = 3 ratos por grupo, ANOVA unidirecional, p < 0,05). Além disso, em comparação com o grupo Acon, a expressão de cTn-I e h-FABP foi significativamente reduzida no grupo Acon + SP600125 (n = 3 ratos por grupo, ANOVA unidirecional, p < 0,05). Comparado ao grupo Acon + SP600125, a expressão de cTn-I e h-FABP aumentou significativamente no grupo Acon + Anis (n = 3 ratos por grupo, ANOVA unidirecional, p < 0,05) (Figura 8A–8B).

DISPONIBILIDADE DE DADOS:

Todos os dados brutos utilizados neste estudo estão disponíveis nos arquivos suplementares anexados ao manuscrito.

Figura 1: Ilustração eletrocardiograma de arritmia em ratos (após 6 horas de ação do Acon). De cima a baixo, o grupo de controle, o grupo Acet, o grupo Acon-1 mg e o grupo Acon-2 mg. Tipos de arritmias em Acon-1mg-A-gavage e Acon-2 mg-A-gavage (em ordem de ocorrência de arritmias de cima para baixo): Acon-1mg-A-gavage: contrações ventriculares prematuras; bigeminismo ventricular prematuro; taquicardia ventricular bidirecional. Acon-2 mg-A-gavage: contrações ventriculares prematuras; bigeminismo ventricular prematuro; Breve surto de taquicardia ventricular. Abreviações; B-gavage = Antes do gavage de Acon; A-gavage = Depois de Acon gavage. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Dano miocárdico e coloração por colágeno no tecido miocárdico de rato, indicados por coloração HE e Masson. (A) As alterações patológicas no tecido miocárdico de rato foram detectadas por coloração HE (a seta amarela indica os vacúolos arredondados formados por cardiomiócitos danificados); barra de balança = 100 μm. (B) Coloração por colágeno no tecido miocárdico de rato foi detectada por coloração de Masson; escala = 50 μm. Média ± DS, n = 3. Todos os valores P foram calculados usando análise independente unidirecional da variância. *p < 0,05, **p < 0,01. 40x e 400x. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Os níveis de CK-MB, AST, LDH, cTn-I e h-FABP no soro de rato indicaram dano ao miocárdio. (A–F). Os níveis de CK-MB, AST, LDH, cTn-I e h-FABP foram medidos usando kits ELISA. Média ± SD, n = 3. Todos os valores-p foram calculados usando análise independente unidirecional da variância. *p < 0,05, **p < 0,01. Abreviações; CK-MB = Creatina Quinase-MB; AST = Aspartato aminotransferase; LDH = lactato desidrogenase; cTn-I = Troponina cardíaca I; h-FABP = proteína de ligação a ácidos graxos do tipo cardíaco. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Resultados do acoplamento molecular de Acon com a via JNK. (A–B) e (D–E) Os diagramas de interação 2D de Acon com a proteína JNK1/2. (C) e (F) Os diagramas de interação 3D de Acon com a proteína JNK1/2. Abreviações; JNK = c-Jun Quinase N-terminal. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Acon aumenta o nível de fosforilação do JNK. (A–B) Os níveis de expressão de p-JNK1/2 e JNK1/2 nos tecidos miocárdicos de ratos foram detectados por Western bloting. Média ± DS, n = 3. Todos os valores-p foram calculados usando análise independente unidirecional da variância. *p < 0,05, *p < 0,01. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Inibidor de JNK inibe a fosforilação de JNK induzida por Acon. Os níveis de expressão de p-JNK1/2 e JNK1/2 nos tecidos miocárdicos de ratos foram detectados por Western bloting. Média ± DS, n = 3. Todos os valores-p foram calculados usando análise independente unidirecional da variância. *p < 0,05, **p < 0,01. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 7: Inibidor do JNK alivia danos patológicos do miocárdio e coloração de colágeno em ratos. (A) As alterações patológicas nos tecidos miocárdicos do rato foram detectadas por coloração por HE (a seta amarela mostra os vacúolos redondos formados por cardiomiócitos danificados); escala = 100 μm. (B) A coloração por colágeno no tecido miocárdico de rato foi detectada por coloração de Masson; escala = 50 μm. Média ± SD, n = 3. Todos os valores-p foram calculados usando análise independente unidirecional da variância. *p < 0,05, **p < 0,01. 40 e 400x. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: O inibidor de JNK regula para baixo os níveis de CK-MB, AST, LDH, cTn-I e h-FABP no soro de ratos. (A–B) Os níveis de expressão de CK-MB, AST, LDH, cTn-I e h-FABP foram detectados pelos kits de ensaio ELISA. Todos os valores-p foram calculados usando análise independente unidirecional da variância. Média ± SD, n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01. Abreviações; CK-MB = creatina quinase-MB; AST = aspartato aminotransferase; LDH = lactato desidrogenase; cTn-I = troponina cardíaca I; h-FABP = proteína de ligação a ácidos graxos do tipo cardíaco. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

	Controle	Acet	Acon-1 mg	Acon-2 mg
Rats	9	9	9	9
Número de mortes de ratos	0	0	0	0

Tabela 1: Número de mortes de ratos após 1 hora de ação Acon. 1 hora após a administração do Acon, nenhum rato morreu no grupo Contrôle, grupo Acet, grupo Acon-1 mg e grupo Acon-2 mg. (O número de animais finalmente incluídos na análise por grupo foi 3, e ratos mortos não foram substituídos).

	Controle	Acet	Acon-1 mg	Acon-2 mg
Rats	9	9	9	9
Número de mortes de ratos	0	0	0	0

Tabela 2: Número de mortes de ratos após 3 horas de ação Acon. 3 horas após a administração do Acon, nenhum rato morreu no grupo Contrôle, grupo Acet, grupo Acon-1 mg e grupo Acon-2 mg. (O número de animais finalmente incluídos na análise por grupo foi 3, e ratos mortos não foram substituídos).

	Controle	Acet	Acon-1 mg	Acon-2 mg
Rats	9	9	9	9
Número de mortes de ratos	0	0	4	4

Tabela 3: Número de mortes de ratos após 6 horas de ação Acon. 6 horas após a administração do Acon, 4 dos 9 ratos morreram no grupo Acon-1 mg, e 4 dos 9 ratos morreram no grupo Acon-2 mg. (O número de animais finalmente incluídos na análise por grupo foi 3, e ratos mortos não foram substituídos).

	Controle	DMSO	Acon	Acon + SP600125	Acon + Anis
Rats	9	9	9	9	9
Número de mortes de ratos	0	0	3	1	3

Tabela 4: Número de mortes de ratos após Anis e SP600125 ação. O número de mortes de ratos variou entre os diferentes grupos de tratamento: no grupo Acon-2 mg, 3 em cada 9 ratos morreram; no grupo Acon+SP600125, 1 em cada 9 ratos morreu; e no grupo Acon + Anis, 3 de cada 9 ratos morreram. (O número de animais finalmente incluídos na análise por grupo foi 3, e ratos mortos não foram substituídos).

Grupo	Peso cardíaco (g)
Controle	0,71 ± 0,03
Acet	0,73 ± 0,02
Acon-1mg (1 h)	0,73 ± 0,06
Acon-2mg (1 h)	0,75 ± 0,02
Acon-1mg (3 h)	0,71 ± 0,04
Acon-2mg (3 h)	0,77 ± 0,03
Acon-1mg (6 h)	0,72 ± 0,03
Acon-2mg (6 h)	0,77 ± 0,02
DMSO	0,70 ± 0,03
Acon + SP600125	0,74 ± 0,03
Acon + Anis	0,75 ± 0,04

Tabela 5: O peso do coração dos ratos. Não houve diferença significativa no peso cardíaco entre os grupos.

Ligando	JNK1	JNK2
Acon	-7,8 Kcal/mol	-8,41 Kcal/mol

Tabela 6: Resultados dos estudos de acoplamento molecular. As pontuações de acoplamento entre Acon e JNK1 são de -7,8 Kcal/mol, e as pontuações de acoplamento entre Acon e JNK2 são de -8,41 Kcal/mol.

Figura suplementar 1: Ilustração eletrocardiograma de arritmia em ratos (após 1 hora de ação do Acon). De cima a baixo, o grupo de controle, o grupo Acet, o grupo Acon-1 mg e o grupo Acon-2 mg. Tipos de arritmias em Acon-1mg-A-gavage e Acon-2 mg-A-gavage (em ordem de ocorrência de arritmia de cima para baixo): contrações ventriculares prematuras; bigeminismo ventricular prematuro; triplete ventricular prematuro; taquicardia ventricular de curta explosão; taquicardia ventricular monomórfica; taquicardia ventricular bidirecional. Acon-2 mg-A-gavage: Taquicardia ventricular bidirecional. Abreviações; B-gavage = Antes do gavage de Acon; A-gavage = Depois de Acon gavage. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Ilustração eletrocardiogramática de arritmia em ratos (após 3 horas de ação do Acon). De cima a baixo, o grupo de controle, o grupo Acet, o grupo Acon-1 mg e o grupo Acon-2 mg. Tipos de arritmias em Acon-1mg-A-gavage e Acon-2 mg-A-gavage (em ordem de ocorrência da arritmia de cima para baixo): contrações ventriculares prematuras; breves surtos de taquicardia ventricular; taquicardia ventricular bidirecional. Acon-2 mg-A-gavage: contrações ventriculares prematuras; taquicardia ventricular bidirecional. Abreviações; B-gavage = Antes do gavage de Acon; A-gavage = Depois de Acon gavage. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: O Acon promove dano miocárdico e coloração por colágeno após 1 hora de ação do Acon. (A) As alterações patológicas nos tecidos miocárdicos do rato foram detectadas por coloração HE (Nota: a seta amarela mostra os vacúolos redondos formados por cardiomiócitos danificados); escala = 100 μm. (B) Fibrose no tecido miocárdico de rato foi detectada por coloração de Masson; escala = 50 μm. Média ± DS, n = 3. Todos os valores-p foram calculados usando análise independente unidirecional da variância. *p < 0,05, **p < 0,01, 40x e 400x. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 4: O Acon promove dano ao miocárdio e coloração por colágeno após 3 horas de ação do Acon. (A) As alterações patológicas nos tecidos miocárdicos do rato foram detectadas por coloração por HE (a seta amarela mostra os vacúolos redondos formados por cardiomiócitos danificados); escala = 100 μm. (B) A coloração por colágeno no tecido miocárdico de rato foi detectada por coloração de Masson; escala = 50 μm. Média ± DS, n = 3. Todos os valores-p foram calculados usando análise independente unidirecional da variância. *p < 0,05, **p < 0,01. 40x e 400x. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A Acon pode induzir arritmias e danos no miocárdio; no entanto, os mecanismos subjacentes do dano miocárdico induzido por Acon permanecem incertos. Neste estudo, foi estabelecido com sucesso um modelo de rato de intoxicação aguda por Acon com lesão do miocárdio. Esses resultados demonstraram que a ativação da via de sinalização JNK pode representar um mecanismo chave a jusante no dano do miocárdio induzido por intoxicação aguda por Acon. Especificamente, os níveis de fosforilação de JNK1/2 foram significativamente elevados em ratos com arritmias induzidas por Acon e danos do miocárdio. Além disso, a inibição da via JNK reverteu parcialmente o dano miocárdico causado pela intoxicação aguda por Acon. Esses achados sugerem que a ativação da via JNK desempenha um papel importante na patogênese do dano miocárdico induzido por aconitina.

A principal causa de morte por intoxicação aguda por Acon é a cardiotoxicidade. Estudos anteriores mostraram que, após o tratamento com Acon, as fibras miocárdicas em ratos se tornaram degeneradas e desordenadas, a coloração nuclear se aprofundou, ocorreu infiltração de neutrófilos e vacúolas redondas^{apareceram 28}. É consistente com os resultados da pesquisa. A coloração com HE revelou que o tecido do miocárdio no grupo tratado com Acon apresentou alterações patológicas, incluindo disposição desordenada do feixe muscular, alargamento dos espaços musculares e ruptura das fibras musculares. Além disso, em condições normais, as enzimas cardíacas CK-MB, AST, LDH e as proteínas cardíacas cTn-I e h-FABP são encontradas em quantidades muito pequenas no^{soro 29}. Quando as células do miocárdio são danificadas, esses marcadores serão liberados no sangue em grandes^quantidades 30,31,32,33.

Os resultados deste estudo mostram que CK-MB, AST, LDH, cTn-I e h-FABP no soro venoso de ratos do grupo Acon Gavage aumentaram em graus variados a cada ponto de observação. O nível de expressão é maior após 6 horas na administração intragástrica. Esse achado é consistente com estudos anteriores³⁴. Eles descobriram que o Acon causou danos aos cardiomiócitos H9C2 de ratos e aumentou os níveis de AST. Enquanto isso, estudos anteriores usaram Acon para induzir danos ao miocárdio em ratos e estudar os efeitos dos antídotos no dano^{miocárdico 35}. Eles constataram que os níveis de LDH e CK-MB no soro de ratos com dano miocárdico estavam elevados. Em resumo, os resultados experimentais da detecção articular de marcadores de lesão miocárdica mostram que o modelo de rato de dano miocárdico induzido por intoxicação aguda por Acon pode ser estabelecido com sucesso 1, 3 e 6 horas após a administração intragástrica de 1–2 mg/kg de Acon. O efeito de modelagem de 2 mg/kg de Acon após administração intragástrica por 6 horas é o melhor, atendendo aos requisitos dos experimentos subsequentes.

Estudos descobriram que o efeito do Acon nos canais iônicos Na⁺ e Ca²⁺ leva a um aumento na concentração intracelular de íons cálcio, o que ativa ainda mais a via de sinalização P38-MAPK e, subsequentemente, desencadeia a reação em cascata^JNK 36,37,38. A ativação do JNK promove danos no^{miocárdio 39,40}. Isso é consistente com os resultados deste experimento. Neste estudo, descobrimos que o Acon promoveu a fosforilação do JNK1/2 nos cardiomiócitos e ativou a via de sinalização do JNK. Isso sugere que a ativação do JNK pode representar uma resposta de sinalização a jusante que contribui para danos miocárdicos induzidos por aconitina. No entanto, os mecanismos moleculares e farmacocinéticos subjacentes à estimulação da fosforilação JNK1/2 por Acon exigem investigações adicionais.

Estudos mostraram que, quando uma grande quantidade de JNK1/2 é fosforilada, a via de sinalização JNK é ativada, o que, por sua vez, media a expressão descontrolada dos genes no núcleo dos cardiomiócitos e interrompe o ciclo celular. A inibição da via de sinalização JNK pode aliviar danos ao^{miocárdio 41,42}. Nos resultados do HE, o SP600125 inibidor da via JNK pode reduzir significativamente as alterações patológicas no tecido miocárdico induzidas pelo Acon. Enquanto isso, estudos anteriores demonstraram que, em um modelo de rato de infarto agudo do miocárdio induzido por ligadura das artérias coronárias, fibras de colágeno coloridas de azul e deposição de colágeno no tecido miocárdico foram marcadamente aumentados, acompanhados pela ativação da via de sinalização JNK. O tratamento com grânulos da medicina tradicional chinesa reduziu a deposição de colágeno miocárdico por meio da inibição da via de sinalização JNK^43,44.

Em ratos com lesão miocárdica diabética, o teor de fibra de colágeno (coloração azul) e a fração de volume de colágeno (CVF) foram significativamente aumentados. Simultaneamente, a via de sinalização JNK foi ativada. O etanol em baixa dose foi relatado inibindo a ativação da via JNK, atenuando assim o aumento na deposição de fibras de colágeno e no CVF no tecido miocárdico de^{rato 45}. No presente estudo, a análise de acoplamento molecular indicou que a aconitina pode interagir com JNK1 e JNK2 por meio de múltiplas interações não covalentes; No entanto, esses resultados devem ser considerados evidências de apoio e não constituem prova direta de ligação fisiológica. Além disso, experimentos in vivo demonstraram que o Acon, como estressor, aumentava a fosforilação do JNK1/2, ativando assim a via de sinalização do JNK. Essa ativação esteve associada ao aumento da deposição de colágeno (coloração azul) e elevação do FVC no tecido miocárdico de ratos, levando por última vez a danos miocárdicos. No entanto, a adição do inibidor de JNK SP600125 inibiu significativamente os efeitos tóxicos do Acon, reduzindo o aumento do valor de CVF no tecido miocárdico. O dano miocárdico prejudica a integridade normal da membrana miocárdica cardíaca e a perda de conteúdo intracelular para o espaço extracelular, o que se manifesta como níveis aumentados de enzimas miocárdicas no^{sangue 46,47}. Esses resultados mostraram que o aumento dos níveis de enzimas miocárdicas no sangue de rato também indicava que o Acon causava danos no miocárdio. Ao mesmo tempo, os inibidores do JNK inibiram a secreção de enzimas do miocárdio, sugerindo que os inibidores do JNK poderiam aliviar parcialmente o dano do miocárdio causado pelo Acon.

Várias limitações deste estudo devem ser reconhecidas. Primeiro, o tamanho da amostra em cada ponto de tempo era relativamente pequeno (n = 3 por grupo), o que pode limitar o poder estatístico das análises, e nenhuma análise formal de potência foi realizada antes da determinação do tamanho da amostra. Além disso, apenas uma única faixa de dose de Aconitina e períodos de observação relativamente curtos (1–6 h) foram avaliados, o que limitou a avaliação de mudanças patológicas de longo prazo e das relações de resposta à dose. Segundo, embora o aumento da fosforilação de JNK1/2 e a intervenção farmacológica sugiram o envolvimento da via de sinalização JNK na lesão miocárdica induzida por aconitina, os mecanismos a montante que ligam a exposição à aconitina à ativação da JNK não foram totalmente investigados. Sabe-se que a aconitina afeta principalmente canais Na⁺ dependentes de voltagem e a homeostase intracelular Ca²⁺, que pode contribuir para a ativação do JNK a jusante. No entanto, eventos de sinalização relacionados, incluindo vias de estresse oxidativo e sobrecarga de cálcio, não foram examinados diretamente no presente estudo. Terceiro, a análise de acoplamento molecular forneceu apenas evidências de apoio para possíveis interações entre Aconitina e JNK1/2 e não representou ligação fisiológica direta. Nenhuma validação experimental adicional, como ressonância de plasmon superficial ou ensaios pull-down, foi realizada. Além disso, apenas JNK1/2 foram investigados, enquanto o possível papel do JNK3 na cardiotoxicidade induzida por aconitina permanece incerto. Por fim, não foi realizada uma avaliação eletrocardiográfica após SP600125 ou intervenção com anisina. Portanto, se a regulação da via JNK afeta diretamente as arritmias ventriculares induzidas por aconitina requer investigação adicional.

Em resumo, o Acon ativa a via de sinalização JNK, evidenciado pelo aumento da fosforilação de JNK1/2, que pode contribuir para danos ao miocárdio, como indicado pelo aumento da deposição de colágeno e pelo aumento da liberação de enzimas cardíacas no tecido miocárdico de ratos. Considerando que a cardiotoxicidade induzida por aconitina envolve múltiplos eventos a montante, incluindo ativação do canal Na⁺, sobrecarga de Ca²⁺ e estresse oxidativo, a ativação da via JNK pode representar um evento chave de sinalização a jusante que contribui para danos ao miocárdio.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4% de paraformaldeído	Wuhan Service-bio Co., Ltd.	HJ203501	Fixação de tecidos
Aconitine (Acon)	Chengdu DeSiTe Biological Technology Co., Ltd.	DRK-0335-960330	Composto tóxico para modelo gavage
Solução Anilina Azul	Beijing Solarbio Co., Ltd.	G1350	Coloração de masonaria
Anisomicina (Anis)	MedChemExpress Co., Ltd.	153154	Ativador/controle de vias JNK
AST ELISA Kit	Wuhan Huamei Biotechnology Co., Ltd.	CSB-E13023r	Detecção de enzimas cardíacas
AutoDock Vina	Código aberto	N/A	Acoplamento molecular
Kit de Ensaio de Proteína BCA	Sangon Biotech (Xangai, China)	Não especificado	Quantificação de proteínas
Centrífuga	Dongguan cnzcn Co., Ltd.	TD5M-WS	1000 e vezes; Centrifugação G
Chem3D Software	PerkinElmer	N/A	Minimização de energia de ligantes
CK-MB ELISA Kit	Wuhan Huamei Biotechnology Co., Ltd.	CSB-E14403r	Detecção de enzimas cardíacas
Kit cTn-I ELISA	Wuhan Huamei Biotechnology Co., Ltd.	CSB-E08594r	Detecção de proteínas cardíacas
Agulha descartável para coleta venosa de sangue	KINDLY Co., Ltd.	https://www.kdlchina.cn/specimen-collection/220.html	Coleta de sangue
Reagente de Quimioluminescência (ECL) Aprimorado	Millipore Co., Ltd.	21302A4	Visualização Western blot
Eosina	Beijing Solarbio Co., Ltd.	20200905	H& Coloração por E
GraphPad Prism 8	GraphPad Software, Inc.	N/A	Análise estatística
Hematoxilina	Wuhan Service-bio Co., Ltd.	CR2203066	H& Coloração por E
Kit ELISA H-FABP	Wuhan Huamei Biotechnology Co., Ltd.	CSB-E16184r	Detecção de proteínas cardíacas
ImageJ Software	Institutos Nacionais de Saúde (NIH)	N/A	Quantificação Western blot
Anticorpo Primário JNK1/2	Biotecnologia HuaAn (Hangzhou, China)	ET1609-42	Anticorpo Western blot
LDH ELISA Kit	Biotecnologia Ligada a Enzimas de Xangai	ml003416	Detecção de enzimas cardíacas
Solução Masson Blue	Beijing Solarbio Co., Ltd.	20220303	Coloração de masonaria
Leitor de Microplacas	Thermo Fisher Scientific	ME001000C	Medição ELISA OD (450 nm)
Microscópio Óptico (Olympus C33)	Olympus (Tóquio, Japão)	C33	Imagem histológica
Cera de parafina	Leica  Co., Ltd.	2110068	Embedding de tecidos
PBST Buffer	Meilunbio Co., Ltd.	MA0015-Abr-27G2	Amortecedor de lavagem
Anticorpo primário p-JNK1/2	Biotecnologia HuaAn (Hangzhou, China)	ET1601-28	Anticorpo JNK fosforilado
Banco de Dados de Proteínas (PDB)	RCSB	https://www.rcsb.org/	Fonte da estrutura da proteína
Kit de Extração de Proteínas	Sangon Biotech (Xangai, China)	C510003-0050	Extração de proteínas tecidusuais
Banco de Dados PubChem	NIH	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov	Fonte da estrutura do ligante
Membrana PVDF	Millipore Co., Ltd.	R1PB81493	Membrana de transferência Western blot
PyMOL	Schrö dinger, Inc.	https://pymol.org/	Visualização do acoplamento
SDS-PAGE Gel (10%)	Beijing Solarbio Co., Ltd.	817X031	Eletroforese proteica
Leite em Pó Desnatado	Beijing Solarbio Co., Ltd.	http://www.solarbio-hd.com/solarbiohd-Products-23261665/	Reagente bloqueante (5%)
Pentobarbital de sódio	Thermo Fisher Scientific Inc.	57-33-0	Anestésico para procedimentos em animais
SP600125 (inibidor de JNK)	MedChemExpress Co., Ltd.	112518	Inibidor da via JNK
Instalação de Habitação de Animais SPF	Universidade Médica de Kunming	N/A	Condições de habitação dos animais
Ratos-de-Sprague-Dawley (macho, 2 meses, ~230 g)	Beijing Huafukang Biological Technology Co., Ltd.	http://www.hfkbio.com/	Animais experimentais (n = 51)
Hematoxilina de Weigert Ferro	Guangzhou Wexis Co., Ltd.	18092001	Coloração de masonaria
Xylene	Tianjin Tjhxsj Co., Ltd.	20220208	Desobstrução de tecidos