Isolamento robusto e identificação multiplexada de células raras circulantes por meio de microfluídica centrífuga contínua e imunocitoquímica de hidrogel

Resumo

Este estudo apresenta um fluxo de trabalho microfluídico centrífugo contínuo para isolamento eficiente e identificação de células raras circulantes. O sistema permite controle preciso de líquidos e minimiza a perda celular, possibilitando a análise simultânea de múltiplos subtipos de CRC, incluindo CTCs e cCAFs, para melhorar a precisão diagnóstica.

Resumo

Células raras circulantes (CRCs), incluindo células tumorais circulantes (CTCs) e fibroblastos associados ao câncer circulantes (cCAFs), são biomarcadores promissores para diagnóstico e prognóstico do câncer. No entanto, sua abundância extremamente baixa e heterogeneidade fenotípica tornam o isolamento eficiente e a análise multiparamétrica tecnicamente desafiadores. Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho microfluídico centrífugo contínuo para o isolamento e identificação sequencial de CRCs a partir do sangue total. O cartucho é composto por cinco câmaras interconectadas com válvulas controláveis que permitem o manuseio preciso do gradiente de densidade, do meio e das camadas sanguíneas durante a centrifugação. Baseado em uma plataforma de enriquecimento previamente validada, o fluxo de trabalho atual integra imobilização celular à base de hidrogel com imunocitoquímica multiplexada para apoiar a identificação e caracterização a jusante de múltiplos subtipos de CRC, incluindo CTCs e cCAFs. Após o isolamento, as células são imobilizadas dentro de uma matriz de hidrogel para apoiar a retenção celular durante imunocoloração repetida e análise baseada em imagem. Usando esse fluxo de trabalho, tanto CTCs quanto cCAFs foram identificados a partir da mesma amostra, demonstrando a viabilidade da análise integrada de múltiplas populações de células raras circulantes dentro de um único fluxo de trabalho de biópsia líquida. Essa plataforma oferece uma abordagem prática e reprodutível para caracterização de células raras a jusante em aplicações de biópsia líquida.

Introdução

Células raras circulantes (CRCs) são definidas como células que existem na corrente sanguínea em frequências extremamente baixas em comparação com componentes sanguíneos normais, como glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e plaquetas. As CRCs originam-se de diversas fontes, como subprodutos de processos biológicos, remodelação tecidual, cicatrização de feridas ou lesões vasculares. Exemplos representativos incluem células endoteliais circulantes, células fetais circulantes, megacariócitos, eritroblastos e várias células-tronco ou^{progenitoras 1,2}. Embora a existência de CRCs isoladamente não reflita necessariamente um estado patológico, níveis elevados frequentemente indicam condições fisiológicas ou patológicas^{anormais 3,4}. Assim, a detecção e caracterização sensível das CRCs fornecem insights valiosos sobre processos fisiológicos e patológicos dinâmicos que ocorrem no corpo.

Entre os subtipos de CRC, células tumorais circulantes (CTCs) e fibroblastos associados ao câncer circulantes (cCAFs) são os principais biomarcadores do câncer. CTCs fornecem evidências diretas de disseminação celular tumoral e são amplamente^{estudadas 5}. Mudanças na enumeração das CTC estão frequentemente associadas à detecção precoce, prognóstico e monitoramento da resposta^{terapêutica 6}. Paralelamente, os cCAFs representam componentes estromais liberados na corrente sanguínea, refletindo as interações do microambiente tumoral e a formação do nicho^{pré-metastático 7}. No entanto, comparadas às CTCs, a pesquisa sobre cCAFs ainda é limitada, e sua utilidade clínica está apenas começando a ser^explorada.

CTCs e cCAFs podem fornecer informações biológicas complementares em biópsias líquidas, já que as CTCs refletem características de disseminação e metastática das células tumorais, enquanto as cCAFs podem representar remodelação estromalizada e sinais de progressão associados ao microambiente tumoral. A análise simultânea dessas duas populações de células raras circulantes pode, portanto, apoiar uma compreensão mais integrada da progressão do câncer do que a análise de qualquer uma das populações isoladamente. No entanto, sua utilidade clínica e translacional é substancialmente limitada pela extrema raridade no sangue periférico, pela ausência de marcadores universalmente aceitos de cCAFs e pela significativa heterogeneidade da expressão dos marcadores entre subpopulações celulares, que juntos dificultam a identificação confiável. Assim, minimizar a perda celular durante o enriquecimento e identificação é fundamental para garantir uma análise robusta e confiável. Além disso, a caracterização abrangente da diversidade funcional e de marcadores dos CTCs e cCAFs é essencial para elucidar seus papéis na metástase e para o desenvolvimento de biomarcadores clinicamente^{significativos 8,9}.

Aqui, apresentamos um método para o isolamento simultâneo dos cCAFs e CTCs^10,11, combinado com identificação multimarcador usando encapsulamento por hidrogel de imunocitoquímica (ICC)¹² por hidrogel. Os métodos atuais de isolamento de CRC frequentemente enfrentam limitações técnicas, incluindo perda celular durante o processamento em múltiplas etapas, captura restrita de células fenotipicamente heterogêneas e viés de seleção associado a estratégias de enriquecimento dependentes de marcadores. Em contraste, a plataforma microfluídica centrífuga contínua usada neste estudo baseia-se em uma estrutura abrangente de enriquecimento, reduzindo assim a dependência de marcadores convencionais de seleção positiva. O desempenho analítico e de fluxo de trabalho da plataforma de enriquecimento subjacente foi descrito em nossos estudos^{anteriores 9}.

Com base nessa plataforma validada, o presente estudo foca na integração da imobilização celular baseada em hidrogel e da imunocitoquímica multiplexada para possibilitar o isolamento e identificação abrangente de múltiplas populações de células raras circulantes, incluindo CTCs e cCAFs, dentro de um fluxo de trabalho unificado. Ao combinar enriquecimento, retenção celular estável e análise repetida compatível com coloração, esse protocolo fornece uma estrutura prática para análise integrada de células raras a partir de amostras líquidas de biópsia.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de sangue humano de pacientes e doadores saudáveis foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho de Revisão Institucional (IRB) do Hospital Severance. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Hospital de Separação (IRB nº 4-2013-0059). Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação do dispositivo

1. Pressione o botão de energia para ligar o instrumento.
2. Acione o interruptor de bloqueio do laser e depois ligue o interruptor de energia do laser .
3. Inicie o software operacional e confirme que o sistema inicia normalmente.
4. Na interface principal do software, selecione Operação do Dispositivo e escolha o protocolo pré-definido para amostras padrão de sangue total EDTA.

2. Operação do dispositivo -^1ª etapa

NOTA: Detalhes das posições da entrada e da estrutura do cartucho são mostrados na Figura 1A.

1. A partir da entrada 6, adicione 2 mL de Reagente A (meio de gradiente de densidade) à câmara inicial.
2. A partir da entrada 8, adicione 875 μL do Reagente A à câmara de depleção.
3. Monte o cartucho no suporte de discos, garantindo o equilíbrio adequado para a centrifugação.
4. Pressione o botão Door no CTCeptor para abrir o suporte, depois monte o rack de discos no CTCeptor e prenda-o usando os parafusos de fixação.
5. Pressione o botão Door para fechar o suporte e execute o passo Spin Down usando o software CTCeptor (aproximadamente 30 s).
6. Após confirmar que o Reagente A foi transferido para a parte inferior da câmara inicial, solte os parafusos de fixação e remova o rack de discos do instrumento mantendo o cartucho montado.

3. Operação do dispositivo -^2ª etapa

1. Antes de manusear amostras de sangue, realize todos os procedimentos em um armário certificado de segurança biológica e use equipamentos de proteção individual apropriados, incluindo luvas, jaleco e proteção ocular, de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança.
2. Com o cartucho removido do instrumento, injete 3 mL de sangue na câmara inicial através da entrada 6.
3. Monte o rack de discos no CTCeptor e fixe-o usando os parafusos de fixação.
4. Execute a etapa de Remoção dos RBCs usando o software CTCeptor (aproximadamente 40 minutos). Durante essa etapa, a centrifugação separa plasma, glóbulos vermelhos e células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) dentro do cartucho, e a fração contendo PBMC é transferida para a próxima câmara para a subsequente depleção dos leucócitos.
5. Após concluir a etapa de Remoção dos RBCs, remova o rack de discos do instrumento.

4. Operação do dispositivo -^3ª etapa

1. Desinfete cuidadosamente a área de trabalho para manter a esterilidade.
2. Manipule o reagente B (esferas de isolamento leucocitário) para garantir uma suspensão homogênea.
3. Prepare o tampão de lavagem misturando Ca²⁺/^{Mg 2}⁺-free DPBS com 0,1% de BSA e 2 mM de EDTA (pH 7,4).
4. Transfira o volume desejado do Reagente B para um tubo de 1,5 mL (por exemplo, 50 μL por cartucho).
5. Adicione o buffer de lavagem cinco vezes o volume do Reagente B e misture suavemente pipetando.
6. Coloque o tubo em um suporte magnético por 1 minuto para permitir que as esferas do Reagente B se acumulem, depois descarte cuidadosamente o sobrenadante.
7. Ressuspenda as esferas no buffer de lavagem em um volume igual ao volume inicial das contas.
8. Guarde as contas a 4 °C até o uso.
9. Imediatamente antes do uso, misture 50 μL das esferas preparadas com 50 μL de DPBS e carregue 100 μL da mistura na entrada 7.
10. Monte o rack de discos no CTCeptor e fixe-o usando os parafusos de fixação.
11. Execute a etapa de Remoção de WBCs usando o software CTCeptor (aproximadamente 50 minutos). Nessa etapa programada, as esferas de isolamento de leucócitos carregadas são misturadas com a fração contendo PBMC por agitação para promover a ligação esfera–WBC, seguida pela remoção da fração de WBC ligada à esfera.
12. Após concluir a etapa de Remoção dos WBCs, remova o rack de discos do instrumento.

5. Recuperação de amostras

1. Insira uma ponta de pipeta na saída 9 da câmara final e resuspenda o conteúdo, depois transfira a amostra coletada para um tubo de 15 mL.
2. Injete 2 mL de DPBS na saída 9, enxágue bem a câmara pipetando e transfira a lavagem para o mesmo tubo de 15 mL.
3. Repita a etapa de lavar duas vezes.
4. Ajuste o volume do fluido coletado no tubo de 15 mL para 14 mL com DPBS, tampe o tubo e misture suavemente por inversão.
5. Centrifuge o tubo a 380 × g por 4 minutos em temperatura ambiente.
6. Remova cuidadosamente o sobrenadante, deixando aproximadamente 1 mL, e use a suspensão restante para análise a jusante.

6. Identificação de CRCs

1. Para preparar o polímero pré-hidrogel, misture DPBS livre de Ca^2⁺/Mg^2⁺, solução A de imunocitoquímica de película hidrogel (HypICC) e o fotoiniciador na proporção de 80:20:1.
2. Misture 870 μL de suspensão CRC com polímero pré-hidrogel de 270 μL.
3. Transfira a mistura para a câmara HypICC e centrifuge a 500 × g por 5 minutos para permitir que as células se assentem na plataforma.
4. Insira o controlador de espessura na câmara HypICC para ajustar a espessura do hidrogel.
5. Irradie a amostra com luz UV (365 nm) por 20–30 s a partir da base para reticular a camada de hidrogel.
6. Remova o controlador de espessura e lave as células encapsuladas em hidrogel três vezes com DPBS.
7. Fixe as células com paraformaldeído (PFA) a 4% por 10 minutos em temperatura ambiente, depois lave as amostras três vezes com DPBS, 10 minutos cada.
8. Permeabilize as células com 0,05% de Triton X-100 por 10 minutos em temperatura ambiente. Depois, lave as amostras três vezes com DPBS, 10 minutos cada.
9. Bloqueie as amostras com 2% de BSA por 1 hora em temperatura ambiente.
10. Incube as amostras com anticorpos primários durante a noite a 4 °C.
11. Lave as amostras cinco vezes com DPBS, 20 minutos por lavagem.
12. Tinga os núcleos com Hoechst por 10 minutos em temperatura ambiente, depois lave as amostras três vezes com DPBS, 10 minutos cada.
13. Se necessário, a incubação secundária de anticorpos pode ser realizada sob as mesmas condições noturnas da incubação primária de anticorpos.
14. Realize imagens de microscopia de fluorescência e identifique CRCs.

7. Imunocoloração multiplex de CRCs

1. Após imunocoloração e exame de imagem, as CRCs podem passar por uma rodada adicional de coloração por anticorpos após a têmpera.
2. Prepare uma solução de têmpera composta por 4,5% de_H2O2 e 24 mM de NaOH em PBS.
3. Remova o DPBS da câmara HypICC e adicione a solução de têmpera.
4. Incube por 1 hora em temperatura ambiente sob luz branca com agitação.
5. Substitua a solução de têmpera e incube por mais 1 hora nas mesmas condições.
6. Lave as amostras quatro vezes com DPBS por 10 minutos por lavagem.
7. Reinicie o procedimento de imunocoloração a partir da etapa de bloqueio usando 2% de BSA.

Resultados

A Figura 1A mostra uma imagem de um único cartucho usado para isolamento de células raras. O cartucho consiste em cinco câmaras individuais conectadas por microcanais e válvulas controláveis que regulam o fluxo de líquidos. A estrutura do cartucho é a seguinte: (1) uma câmara de plasma que coleta plasma separado do sangue total; (2) uma câmara inicial na qual o sangue total é separado em camadas de plasma, glóbulos vermelhos e PBMC; (3) uma câmara de mistura...

Discussão

As CRCs são biomarcadores importantes com potencial de valor tanto para o diagnóstico quanto para o prognóstico do câncer. Para melhorar a utilidade clínica da análise de CRC, entretanto, é importante capturar uma gama mais ampla de populações de CRC fenotipicamente diversas e apoiar a caracterização multiparamétrica^{paralela 13}. Além disso, evidências crescentes em oncoimunologia indicam que componentes imunes e o microambiente tumoral desempenham papéis críticos ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
15 mL Conical Tube	SPL	50015
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28908
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	711-545-152
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	705-585-003
Bovine Serum Albumin	GenDepot	A0100-010
CD45 antibody	Biolegend	304060
CellTracker Green CMFDA	Invitrogen	C7025
CTCD	CTCELLS	CTD-C103	Disc cartridge
CTCD rack	CTCELLS	CTDR-CM3	Disc rack
CTCeptor	CTCELLS	CTM-C2203	CTCeptor
CTR-S Reagent A	CTCELLS	CTR-S1001	density gradient media
CTR-S Reagent B	CTCELLS	CTR-S1002	leukocyte isolation beads
FAP antibody	Invitrogen	PA5-99313
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
HypICC Photoinitiator	CTCELLS	CTR-G1002
HypICC Solution A	CTCELLS	CTR-G1001
HypICC Unit	CTCELLS	CTH-V01	HypICC chamber
Latex glove	Ansell	93743080
Magnetic stand			Fabricated in-house using a 3D printer
Manual Pipetting  (0.5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Manual Pipetting  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Manual Pipetting  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Manual Pipetting  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Manual Pipetting  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
pancytokeratin antibody	Invitrogen	53-9003-82
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)	Welegene	LB001-02
SMA antibody	Invitrogen	PA5-18292
Tip, 10 µL	TipOne	9104020333
Tip, 1250 µL	TipOne	9104020740
Tip, 200 µL	TipOne	9104020422
Triton X-100	Signma	X100-100ML
Whole Blood			Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA
β actin antibody	abcam	ab8226