Um método otimizado para isolar epitélio uretral feminino de camundongos para análise de células únicas e imunofluorescência

Resumo

Este protocolo apresenta um método otimizado para isolar o revestimento epitelial da uretra da fêmea adulta do camundongo para análises posteriores, incluindo citometria de fluxo, imunocoloração e cultura organoide. Os métodos forneceram células epiteliais uretrais enriquecidas e viáveis, como evidenciado pela análise de citometria de fluxo, imagem de montagem total e formação eficiente de organoides.

Resumo

A uretra, revestida por células epiteliais, serve como condutor para a saída de urina do corpo. O revestimento epitelial da uretra é composto por tipos celulares distintos com assinaturas gênicas indicativas de papéis na defesa antimicrobiana e imunológica. Macrófagos residentes embutidos na camada epitelial uretral representam um subtipo transcricionalmente distinto, com supostos papéis na vigilância imune e na apresentação de antígenos. Patógenos urinários sobem pela uretra até a bexiga. Um estudo do revestimento epitelial uretral e das células imunes associadas lançará luz sobre os mecanismos de defesa do hospedeiro no trato urinário inferior. Um objetivo central deste protocolo é fornecer métodos otimizados para dissecar a uretra da fêmea de camundongo e isolar o revestimento epitelial para análises posteriores. O protocolo descreve um método otimizado para isolar tecido epitelial da uretra da fêmea do camundongo por meio de separação enzimática e mecânica suave. Após o isolamento epitelial, são descritos métodos para digestão enzimática suave do epitélio uretral isolado e das células imunes associadas, visando obter suspensões unicelulares de alta viabilidade. O protocolo também detalha métodos para análise de citometria de fluxo das células epiteliais uretrais isoladas de camundongos e das células imunes associadas ao epitelio. Além disso, métodos para gerar organoides epiteliais uretrais 3D estratificados a partir de células epiteliais isoladas são apresentados aqui. O protocolo também detalha um método otimizado para a imunocoloração em montagem total de folhas epiteliais uretrais, que pode ser usado para observar a morfologia e as estruturas moleculares do epitélio uretral do camundongo e das células imunes associadas. No geral, os métodos descritos aqui para isolamento e digestão unicelular de células epiteliais uretrais de camundongos permitem análises posteriores, incluindo imunocoloração, citometria de fluxo, geração de organoides e sequenciamento de RNA unicelular.

Introdução

O trato urinário inferior do camundongo (LUT) é composto por duas partes: a bexiga e a uretra. Durante os estágios embrionários, as estruturas da LUT se desenvolvem a partir da cloaca, uma estrutura transitória derivada do endodermo localizada no intestino caudal posterior. A porção ventral da cloaca, o seio urogenital, forma a bexiga anteriormente e a uretra posteriormente¹. O revestimento da bexiga é bem estudado. Ela forma uma barreira apertada contra componentes urinários por meio de placas cristalinas apicais compostas pelas proteínas ^{uroplacínas 2,3,4}. Embora o revestimento da bexiga seja um epitélio de transição, a uretra apresenta diferenças na arquitetura epitelial do pescoço da bexiga até a abertura uretral distal. Além disso, a uretra apresenta dimorfismo sexual nas estruturas epiteliais e na arquitetura celular. A uretra do camundongo macho é composta por epitélio de transição no pescoço da bexiga, seguido por epitélio colunar e estratificado. A uretra da fêmea do camundongo é revestida por epitélio de transição no pescoço da bexiga e epitélio estratificado não escamoso em múltiplas camadas, pontilhado por pequenos ductos terminando em glândulas secretoras em direção à extremidade^{distal 5}.

As mulheres são mais suscetíveis a infecções urinárias (ITUs), predominantemente causadas por bactérias uropatogênicas que sobem do intestino através da uretra para infectar a^{bexiga 6}. A uretra é a primeira superfície da LUT que entra em contato com patógenos urinários ascendentes. A função das células epiteliais uretrais, especialmente seu papel como barreira imunológica ativa, tem sido pouco estudada. Trabalhos recentes do mesmo grupo forneceram um mapa espacial com resolução de célula única da uretra⁵ da fêmea adulta de camundongo. Identificou um revestimento uretral com três camadas com células basais, intermediárias e apicales. Intercaladas no revestimento epitelial estão células neuroendócrinas^{raras 5,7}. Perto do meio da uretra, pequenos ductos se ramificam do tronco principal da uretra, terminando em grupos de glândulas secretoras, embutidas no compartimento estromal da uretra. Dados transcriptômicos revelaram que as células epiteliais na uretra expressam genes imunomoduladores e antimicrobianos que podem moldar a defesa do^{hospedeiro 5}. Estudar as propriedades e atributos das células epiteliais uretrais relacionadas ao seu potencial de defesa e funções imunomoduladoras pode fornecer novas estratégias para combater as ITUs.

O uso do camundongo para estudar o epitélio uretral permite estudos temporais e investigação do dimorfismo sexual. Dadas as semelhanças do camundongo com o humano em termos de arquitetura celular da bexiga e^{da uretra 1}, o camundongo tem sido amplamente utilizado para estudar o desenvolvimento embrionário do trato urinário^{inferior 1,8,9}. Os camundongos também foram usados em modelos de instilação transuretral para estudar ITU causada por patógenos^urinários 10,11,12. O tecido do trato urinário inferior é difícil de acessar em pacientes, a menos que estejam passando por resseção por câncer ou outros distúrbios. Uma fonte de tecido humano saudável e consistente é difícil de acessar, e o camundongo fornece um modelo útil para investigar tecidos no trato urinário inferior para estudos sobre homeostase tecidual, reparo e resposta a insultos inflamatórios. O revestimento uretral da fêmea e do humano é composto por epitélio de transição no pescoço da bexiga e epitélio estratificado não escamoso e não queratinizado em direção à extremidade distal. Epitélio escamoso é observado na extremidade distal da uretra feminina humana, embora variabilidade seja observada no revestimento uretral feminino humano a partir dos ^5,13 anos. Embora não tenham sido realizadas comparações do revestimento uretral no nível do transcriptoma entre a uretra humana e a do camundongo, o camundongo representa um modelo útil para capturar o padrão epitelial, as interações epitelial-imune e a resposta a infecções na uretra.

Neste estudo, os autores descrevem métodos para dissecação da uretra adulta de camundongo adulto de comprimento total, isolamento do epitélio uretral e digestão enzimática suave para preparar suspensões unicelulares. Este é o primeiro protocolo detalhado para o isolamento e digestão do tecido epitelial uretral feminino de camundongo. O protocolo otimizado gera uma população enriquecida de células epiteliais de células unicelulares que pode ser utilizada para várias análises a jusante. Conforme apresentado no estudo, os autores realizaram citometria de fluxo em uma suspensão unicelular de isolados de células epiteliais uretrais, que demonstra a presença de células individuais viáveis, predominantemente de natureza epitelial. Além disso, essas células epiteliais são capazes de gerar organoides em cultura 3D, que se assemelham ao revestimento uretral estratificado do camundongo. Os autores também demonstram a coloração integral das folhas epiteliais uretrais para estudar a associação de células imunes associadas ao epitelio, especificamente macrófagos, com células epiteliais uretrais. Os métodos descritos neste artigo ajudarão na pesquisa sobre o revestimento uretral e seu papel na defesa imunológica.

Protocolo

Todos os estudos em camundongos foram realizados com a aprovação do Comitê de Ética Animal Institucional (INS-IAE 2022/01(R 1 M2)) e do Comitê de Biossegurança Institucional (inStem/G-141(3)-22/DBJ) no BRIC Instituto de Ciência de Células-Tronco e Medicina Regenerativa, Bengaluru. Fêmeas de camundongos CD-1 ou C57BL6/J, de 6 a 12 semanas de idade, alojados no Centro de Cuidados e Recursos Animal (ACRC) do Centro Nacional de Ciências Biológicas (NCBS), Cluster de Ciências da Vida de Bangalore (BLiSC), foram usados para este estudo. Os camundongos foram alojados em condições específicas livres de patógenos sob um ciclo de 12 horas de luz e escuridão com alimento e água ad libitum.

Todos os materiais utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Dissecação e coleta da uretra adulta fêmea de camundongo

1. Eutanasie o rato usando CO₂ até que ele pare de respirar. Realize luxação cervical como modo de eutanásia secundária.
2. Coloque o rato em posição deitada e borrife etanol a 70% para molhar os pelos do abdômen (Figura 1A).
3. Levante a pele do abdômen com uma pinça e faça uma incisão vertical em direção à parte inferior do corpo, terminando na abertura uretral externa (Figuras 1B e 1C).
4. Identifique a bexiga e levante-a suavemente com pinça. Em alguns casos, pode estar preenchida com urina. Comprima suavemente a bexiga entre as pinças para esvaziá-la.
   NOTA: A bexiga aparecerá como uma estrutura bulbosa.
5. Corte o tecido adiposo e conjuntivo ao redor da bexiga usando pequenas tesouras molas para expor a estrutura em forma de borboleta onde os dois ossos púbicos se unem na sínfise púbica (Figura 1D). A uretra passa sob a sínfise púbica.
6. Corte a sínfise púbica levantando-a com pinças e abrindo com pequenas tesouras de mola (Figura 1E). Remova os fragmentos do osso púbico para que a uretra possa ser vista descendo a partir da bexiga (Figura 1F).
   NOTA: A uretra aparecerá como um tubo vermelho fino que fica na superfície ventral da parede vaginal (Figura 1G).
7. Puxe a bexiga suavemente para cima a partir da cavidade corporal usando pinças finas e passe pequenas tesouras de mola entre a uretra e a parede vaginal para separar os tratos urinário e reprodutivo.
8. Mantenha uma leve tensão na bexiga ao cortar ao longo da parte de trás da uretra para separá-la da parede vaginal (Figura 1H–J). Corte até a abertura uretral distal para obter a uretra do camundongo de comprimento total (1,2–1,5 cm de comprimento) (Figuras 1K e 1L).
9. Separe a uretra da bexiga fazendo um único corte no pescoço da bexiga.

2. Isolamento do tecido epitelial uretral

NOTA: O protocolo para isolar folhas epiteliais da uretra foi modificado e otimizado a partir de um protocolo para isolar o epitélio^{endometrial 14}. A Figura 2 mostra etapas para o isolamento das folhas epiteliais uretrais do compartimento estromal ao redor (Figura 2A).

1. Transfira as uretras dissecadas para uma placa de Petri estéril contendo uma solução salina equilibrada 1x Hanks' fresca (HBSS, Ca e Mg livre, detalhes fornecidos na Tabela Suplementar 1).
   NOTA: Recomenda-se agrupar 4–5 uretras neste estágio para separação epitelial e digestão unicelular.
2. Sob um microscópio dissecante, corte gordura e tecido conjuntivo ao redor da uretra usando pinças de ponta fina e pequenas tesouras molas (Figura 2B).
3. Corte cada uretra em duas partes de tamanho igual transversalmente e coloque sobre o topo de um escorredor de malha de náilon de 100 micrômetros (Figura 2C–G).
4. Lave os tecidos passando 1 mL de 1x HBSS (sem Ca e Mg) sobre os tecidos.
5. Transfira pedaços de tecido para um tubo microcentrífuga (MCT) de 1,5 mL (Figura 2H) contendo 1 mL de Tripsina a 1% (1% de Tripsina, w/v para 1x sHBSSa, detalhes fornecidos na Tabela Suplementar 2).
6. Digere o tecido incubando por 15–30 minutos em um rotador de amostra (30 rpm) a 4 °C.
7. Após a incubação, retire os tubos a partir de 4 °C. Adicione MgCl₂ (1 M MgCl₂, caldo preparado em 1x HBSS) a uma concentração final de 10 mM e a DNase I (10 mg/mL DNase I, estoque preparado em 1x PBS) a uma concentração final de 10 μg/mL no mesmo tubo com os pedaços de tecido.
8. Transfira o tubo para um forno de hibridização a 37 °C em um rotador de amostras para incubar por 15–30 minutos.
   NOTA: Os tempos de incubação da tripsina em 4 °C e 37 °C podem ser ajustados com base na aplicação a jusante. É preferível usar tempos de incubação de 15 minutos para a coloração em montagem completa e incubação de 30 minutos para digestão de célula única.
9. Transfira os tecidos para um MCT de 1,5 mL contendo 10% de soro de ovelha em 1x HBSS (sem Ca e Mg) para neutralizar a atividade da tripsina.
10. Transfira os tecidos uretrais para um novo tubo contendo 1x HBSS gelado (sem Ca e Mg). Depois transfira para uma placa de Petri estéril contendo 1x HBSS gelado.
11. Usando duas pinças de ponta fina, esprema o epitélio da uretra. Segure uma das extremidades da peça uretral usando um par de pinças.
12. Com a outra mão, esprema a peça uretral entre as pontas da pinça, passando por todo o comprimento da peça para espremer o epitélio. Repita isso para os fragmentos uretrais restantes no prato para isolar o epitélio (Figuras 2I–J).
    NOTA: Após a separação mecânica, uma fina camada de tecido epitelial transparente será extrudida do lúmen da uretra. O epitélio uretral pode ser identificado como fragmentos finos de tecido em forma de folha que parecem mais claros (transparentes) que o tecido estromal. Isolados epiteliais devem ser pedaços de tecido finos e transparentes que podem ser transferidos para uma placa de Petri para moção. Isolados de tecido não devem ser completamente decompostos. Se os pedaços de tecido estiverem completamente degradados, o tempo de incubação da tripsina pode ser reduzido.

3. Digestão para suspensão de célula única

1. Transfira pedaços isolados de epitélio para uma placa de Petri estéril usando uma pequena pipeta plástica de transferência ou uma ponta de 200 μL. Reduzir o epitélio em pequenos fragmentos usando pequenas tesouras de mola em uma gota de 1x HBSS adicionada diretamente aos fragmentos (Figura 2K).
   NOTA: Fragmentos de tecido estromais remanescentes após a separação epitelial podem ser digeridos usando o mesmo método do epitélio isolado.
2. Transfira pedaços picados usando uma pipeta para um MCT de 2 mL contendo 1,5 mL de solução digestiva pré-aquecida (37 °C). A solução digestiva Accutase contém o seguinte: Accutase, 10 μM Rocki Y-27632 e 100 μg/mL DNase I.
3. Transfira o tubo contendo o tecido e a solução digestiva para um rotador de amostra em um forno de hibridização a 37 °C. Incube por 1 hora.
   NOTA: O conteúdo do tubo pode ser verificado quanto à digestão bem-sucedida antes de prosseguir. Digestão bem-sucedida: O tecido picado está bem disperso na solução de Accutase, com apenas alguns pedaços visíveis após a incubação. Digestão falhada: Grandes pedaços de tecido ainda estão presentes após a incubação na solução de Accutase. Os tecidos devem ser triturados o mais finamente possível para uma digestão bem-sucedida.
4. Após 1 hora, transfira todo o conteúdo do MCT de 2 mL para um tubo centrífuga de 5 mL e adicione 2 mL de tampão de lavagem (1x PBS sem Ca e Mg, com 1% de albumina sérica bovina).
5. Reduza a rotação da suspensão a 600 x g por 5 minutos em uma centrífuga de 4 °C com um rotor de balde oscilante.
6. Aspire o sobrenadante usando vácuo suave e ressuspenda o pellet em 1 mL de tampão de lavagem usando uma pipeta de 1 mL com ponta de filtro.
7. Usando a ponta da pipeta, desfaça o pellet pipetando para cima e para baixo até que os tufos fiquem menores. Passe a suspensão com 4 tempos por uma agulha de calibre 23 1/2 presa a uma seringa de 1 mL, seguido por 4 a 6 golpes por uma agulha de calibre 26 1/2 presa a uma seringa de 1 mL.
   NOTA: A passagem por uma agulha de calibre pequeno é necessária para obter uma suspensão uniforme de célula única e evitar o agrupamento celular. Embora essa etapa possa causar tensão de cisalhamento e morte celular, os autores otimizaram o número de golpes com agulha e seringa para fornecer uma única suspensão sem morte celular excessiva. Pular essa etapa resulta em uma grande proporção de células agrupadas, o que confundirá análises a jusante como sequenciamento de RNA de célula única e citometria de fluxo.
8. Adicione 1 mL de tampão de lavagem para molhar a superfície de um filtro pré-separação de 30 micrômetros colocado sobre um tubo de 5 mL. Use a seringa conectada à agulha de calibre 26 1/2 para transferir 1 mL da solução celular pelo peneirador.
9. Adicione 1 mL de tampão adicional de lavagem ao tubo que contém as células, e depois retire essa solução com a seringa e passe pelo filtro. Células de pellet por centrifugação a 600 x g por 5 minutos a 4 °C usando um rotor de balde oscilante.
10. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 100 μL de tampão de lavagem, adicionando 100 μL de 1x tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC). Incube a suspensão em temperatura ambiente por exatamente 3 minutos, depois adicione 4 mL de buffer de lavagem e resuspenda o pellet.
    NOTA: A lise dos glóbulos vermelhos é recomendada para remover as células sanguíneas da suspensão epitelial uretral. Embora essa etapa possa ter um efeito menor na viabilidade das células epiteliais, o protocolo utilizou um buffer de lise de glóbulos vermelhos diluído 0,5x e uma incubação de 3 minutos para minimizar a perda celular e preservar a viabilidade celular.
11. Colhe as células por centrifugação a 600 x g por 5 minutos a 4 °C usando um rotor de balde oscilante.
12. Aspire o sobrenadante e resuspenda o pellet em 50–200 μL de buffer de lavagem, de acordo com o tamanho do pellet.
    NOTA: O tamanho do pellet de tecidos obtidos de 4–5 amostras epiteliais uretrais de camundongos agrupadas será pequeno, mas ainda visível a olho nu. É essencial centrífugar as células usando um rotor oscilante de balde para que o pellet se acumule na parte inferior do tubo em vez de ser espalhado ao longo das laterais. Os pesquisadores registraram um rendimento celular de 28.000 a 34.000 células vivas por epitélio uretral de camundongo.
13. Transfira 5 μL de alíquota de células para um MCT de 0,5 mL e adicione 5 μL de azul de tripano. Misture e carregue no hemocitômetro para verificar o rendimento e a viabilidade celular.

4. Análise de citometria de fluxo de isolados unicelulares epiteliais uretrais

1. Aliquota 100.000 células totais em um tubo centrífugo de 5 mL para realizar imunocoloração fluorescente de células individuais a partir do compartimento epitelial ou estromal uretral, para citometria de fluxo. Compense o volume no tubo para 4 mL com 1x PBS.
   NOTA: Para obter resultados confiáveis com citometria de fluxo, recomenda-se um mínimo de 50.000 células por amostra.
2. Reduza a rotação da suspensão da célula a 500 x g por 5 minutos a 4 °C usando um rotor de balde oscilante.
3. Descarte o sobrenadante e resuspenda o pellet em 50 μL de 1x PBS.
4. Adicione 50 μL de 2x corante Ghost Violet 450 (1 μL de corante Ghost em 500 μL de 1x PBS) à suspensão da célula para obter 100 μL de solução de 1x Ghost dye.
   NOTA: O Ghost Dye V450 é um corante de viabilidade reativo à amina que pode ser usado para discriminar entre células viáveis e não viáveis em aplicações de citometria de fluxo.
5. Adicione 5 μL de solução bloqueadora do receptor Fc (anti-camundongo CD16/32) por 100 μL de suspensão celular e incube por 5 minutos em temperatura ambiente.
   NOTA: Esta etapa é necessária para bloquear a ligação da imunoglobulina aos receptores Fc.
6. Incube a suspensão celular no gelo por mais 25 minutos.
7. Dilua a suspensão celular para 5 mL usando tampão de coloração celular (1x PBS, 0,02% (p/v) de azida de sódio e 1% (p/v) de BSA, veja a Tabela Suplementar 3). Centrifuge a 500 x g por 5 minutos a 4 °C usando um rotor de balde giratório. Descarte o sobrenadante e resuspenda o pellet celular em 100 μL de tampão de coloração celular.
   NOTA: Azida de sódio é altamente tóxica. Evite contato com pele, olhos e roupas. Use equipamentos de proteção individual (EPI) adequados ao manusear.
8. Em 100 μL de suspensão celular, adicione 5 μL de anticorpos primários conjugados: anti-CD326/EPCAM (marcando células epiteliais), anti-F4/80 (marcando macrófagos murinos) e anti-CD45 (marcador pan-imune) com diluição de 1:20. Incube a suspensão celular no gelo por 30 minutos.
9. Dilua a suspensão da célula para 5 mL usando o tampão de coloração de células, e depois centrifuge a 500 x g por 5 minutos a 4 °C usando um rotor de balde oscilante. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 500 μL de tampão de coloração celular.
10. Transfira a suspensão da célula através de um filtro de malha de nylon de 35 micrômetros nos tubos de separação da tampa do filtro. Coloque tubos no gelo até análise mais aprofundada.
11. Realize a configuração inicial e a verificação de desempenho no citômetro.
12. Ajuste as tensões usando amostras não coradas e totalmente tingidas. Realize a compensação com controles de contas e prossiga com a aquisição.
    NOTA: Experimentos com mais de um fluoróforo exigem compensação para serem realizados. Prepare os controles de compensação necessários. Você precisará de controles com uma única coloração (ou seja, esferas de compensação) para cada fluoróforo usado no experimento. A compensação pode ser realizada automaticamente de acordo com as configurações do software do citometro de fluxo. Controles FMO (fluorescência menos um) são recomendados para distinguir entre populações celulares positivas e negativas para um determinado fluoróforo. Prepare os FMOs incluindo todos os fluoróforos na amostra, exceto aquele que está sendo controlado.
13. Ajuste portas usando controles FMO (fluorescência menos um) e adquira 50.000 eventos por amostra.

5. Cultura de organoides epiteliais uretrais

NOTA: Para organoides epiteliais uretrais de camundongo, siga os Protocolos, Seção 3, Digestão até suspensão unicelular, etapas 3.1 a 3.11. para obter suspensões de célula única.

1. Resuspenda o pellet de células epiteliais uretrais em meio de expansão organoide de 50–100 μL (detalhes apresentados na Tabela Suplementar 4). Obtenha a viabilidade celular e o número celular contando com um hemocitômetro.
2. Prepare uma mistura 1:4 de suspensão celular (1 parte) e Cultrex (4 partes), com concentração final de 5000 células em 25 μL. Adicione 3 gotículas de suspensão de células de 25 μL (5000 células/gotícula) a cada poço de uma placa de 12 poços.
   NOTA: Sempre pipete Cultrex suavemente com uma ponta cortada para evitar bolhas.
3. Transfira a placa para um incubador a 37 °C (5% de_CO2) por 15 minutos para solidificar as gotículas.
4. Sobrepor as gotículas com 800 μL de meio de expansão organoide, suavemente a partir das laterais do poço, e transferir a placa de volta para a incubadora.
   NOTA: A troca de mídia é necessária a cada 2 dias. Substitua o meio gasto por meio de expansão organoide fresco de 800 μL.
5. Tire imagens dos organoides em todos os dias, do Dia 0 ao 6 dias, usando um microscópio invertido com ampliação de 4x a 20x.

6. Organoides Uretrais, histologia e imunocoloração

ATENÇÃO: O xileno é um solvente altamente inflamável. Use EPI adequado para manusear o produto químico. Colete xileno usado como resíduos de solvente orgânico. Descarte por meio de programas aprovados para resíduos químicos perigosos. O formolão é tóxico e causa irritação na pele, nos olhos e na respiração. Evite contato com a pele e a inalação. Use EPI adequado para manusear o produto químico. Descarte por meio de sistemas institucionais de descarte de resíduos químicos perigosos. O protocolo para incorporar organoides uretrais em blocos de parafina foi modificado e otimizado a partir de um protocolo para incorporar organoides^{endometriais 14}.

1. No 6º dia de cultura organoide, descarte o substrato gasto e lave os organoides com 1x HBSS em temperatura ambiente. Adicione 1,5 mL de formalina neutra tamponada (10%) aos poços por 15 minutos.
2. Descarte o fixador e adicione 1,5 mL de hematoxilina aos poços por 10 minutos. Descarte a mancha e lave duas vezes com 1x HBSS.
3. Adicione 1 mL de agarose UltraPure de baixo ponto de fusão a 2% feita em 1x HBSS em cada poço contendo 3 gotículas, deixe a agarose solidificar por 15 minutos em temperatura ambiente.
4. Remova delicadamente a agarose do poço usando a extremidade plana de uma espátula fina, garantindo que as gotas de Cultrex se soltem junto.
5. Transfira o disco de agarose para uma fita de tecido e desidrate em etanol a 70% por 30 minutos em temperatura ambiente, agitando constantemente.
6. Desidrate ainda em diferentes concentrações de etanol e duração: 90% de etanol por 30 minutos, 100% de etanol por 30 minutos, 100% etanol por 60 minutos, 100% etanol por 90 minutos.
7. Limpe o excesso de etanol e limpe com xileno por 45 minutos em temperatura ambiente, agitação constante. Repita a etapa de limpeza do xileno por 60 minutos.
8. Retire o excesso de xileno e transfira para a cera de parafina infiltrante (65 °C) durante a noite.
9. Adicione uma camada fina de cera de embedding na base de um molde de metal e coloque o disco de agarose sobre ele. Remova o molde do aquecedor de ferrolho e rapidamente o cubra com cera de embutida pelas ripas do fundo do cassete. Deixe solidificar em temperatura ambiente.
10. Corte blocos organoides de parafina em um micrótomo para obter seções de 5 μm. Coloque seções em slides com carga positiva.
11. Coloração por hematoxilina-eosina
    1. Assar deslizes a 60 °C e desparafinizar com xileno e reidratar através de uma série de lavagens com etanol (xileno 1 min, 100% etanol 1 min, 95% etanol 1 min, 75% etanol 1 min)
    2. Lave as lâminas em água da torneira e incube com Hematoxilina nº 2 de Gilla por 3 minutos. Coloque slides sob um jato de água da torneira para desenvolver uma cor azulada.
    3. Incube as lâminas em etanol 95% por 1 min, seguida por solução de eosina a 0,25% por 1 min. Lave os lâminas em água da torneira até a água ficar clara.
    4. Deslizes desidratáveis (95% etanol 1 min, 100% etanol 1 min) e transparentes com xileno (1 min) antes de montar com meio de montagem de endurecimento rápido.
12. Imunocoloração de seções de parafina
    1. Assear seções de parafina de 5 μm em um forno de hibridização a 60 °C por 1–2 horas.
    2. Dewax desliza mergulhando em xileno por 6 minutos em um pote de corante para slides.
    3. Reidratar desliza 100%, 95%, 75% de etanol em água destilada por 6 minutos cada. Depois, lave as lâminas em água destilada por 5 minutos.
    4. Adicione lâminas em um prato quadrado de Pyrex contendo 0,01 M de ácido cítrico (em água destilada) para a recuperação de antígeno, e cubra o recipiente com filme aderente. Realize a coleta de antígeno aquecendo micro-ondas em alta potência por 20 minutos.
    5. Deixe frio a morno por 20 minutos e enxágue as lâminas em PBS por 5 minutos. Desenhe uma barreira hidrofóbica ao redor de seções de tecido e adicione 100 μL/seção de tampão bloqueador de cavalos por 1 h em temperatura ambiente com balanço suave (Veja a Tabela Suplementar 5 para preparação do tampão de bloqueio de cavalo).
    6. Prepare a solução primária de anticorpos em buffer de bloqueio de cavalos adicionando anticorpos primários em uma diluição adequada (1:100–1:200). Adicione 100 μL de solução primária de anticorpos a cada seção. Incube os lâminas durante a noite a 4 °C com balanço suave.
       NOTA: Os organoides foram imunocoloridos com anticorpos contra Queratina 5/KRT5 (marcador epitelial basal), P63 (marcador epitelial basal), KRT4 (marcador epitelial intermediário/suprabasal) e KRT13 (marcador epitelial intermediário/suprabasal).
    7. Após a incubação durante a noite, lave as lâminas em PBS 4 x 5 min em temperatura ambiente com balanço suave.
       NOTA: Todas as etapas subsequentes devem ser realizadas em uma caixa protegida contra luz em temperatura ambiente.
    8. Prepare solução secundária de anticorpos em tampão de bloqueio de cavalos, adicionando anticorpos secundários marcados com fluorescência em uma diluição de 1:500. Incube as lâminas por 1 h em temperatura ambiente com balanço suave.
    9. Lave as lâminas em PBS 4 x 5 min em temperatura ambiente, com balanço suave.
       NOTA: Passo opcional: use kits de têmpera de autofluorescência para extinguir o sinal de autofluorescência.
    10. Incube com solução DAPI de 300 nM por 5 minutos com balanço suave. Lave em PBS por 2 x 5 minutos em temperatura ambiente, com balanço suave.
    11. Monte com solução de montagem anti-descolorido (90% de glicerol, 0,2% de n-propila galato em 1x PBS). Seções de imagem em um microscópio fluorescente de campo amplo.
        NOTA: As configurações de exposição da câmera para cada fluoróforo devem ser ajustadas para maximizar a relação sinal-ruído, evitando a saturação de pixels. Use as mesmas configurações de exposição ao fotografar organoides tingidos em uma determinada sessão.

7. Imunocoloração integral de folhas epiteliais uretrais isoladas

NOTA: Para a imunocoloração completa, siga o Protocolo, Seção 2, Isolamento do tecido epitelial uretral, etapas 2.1 a 2.12. para obter folhas epiteliais uretrais.

1. Transfira cuidadosamente o tecido epitelial usando uma pipeta de transferência ou a ponta de 200 μL para um poço de uma placa de cultura de tecido de 24 poços contendo 500 μL de formalina tamponada neutra a 10%. Fele a tampa do prato com parafina e incube em um balancim por 20 minutos a 4 °C.
   NOTA: Realize todas as etapas no mesmo poço para evitar a perda de tecido epitelial.
2. Aspire cuidadosamente o formol do poço. Faça uma lavagem com 500 μL de 1x PBS e incube em um balanço por 5 minutos em temperatura ambiente. Repita o mesmo passo de lavagem mais uma vez.
3. Adicione 500 μL de solução de permeabilização contendo 1x PBS + 1% Triton X-100 ao poço. Sele a tampa da placa usando parafilme e incube por 2 horas a 4 °C com balanço suave.
4. Aspire cuidadosamente a solução de permeabilização do poço.
5. Realize o bloqueio incubando tecidos em um buffer de bloqueio de cavalo de 500 μL contendo um adicional de 1% de Triton X-100 (a receita do buffer de bloqueio de cavalos está fornecida na Tabela Suplementar 5). Sele a tampa do prato com parafilm e incube durante a noite a 4 °C com balanço suave.
6. Prepare a solução primária de anticorpos em um tampão de bloqueio de cavalos contendo 1% adicional de Triton X-100, adicionando anticorpos primários em diluição adequada (1:100–1:200). Aspire solução bloqueante e adicione 500 μL de solução primária de anticorpos: anti-CDH1 (marcador de células epiteliais) e anti-F4/80 (marcador de macrófagos murinos). Fele a tampa com parafilm e incube por 48–72 horas a 4 °C com balanço suave.
7. Aspire cuidadosamente a solução primária de anticorpos e lave 3 vezes com 1x PBS por 30 minutos em temperatura ambiente, balançando suavemente.
8. Prepare soluções secundárias de anticorpos em tampão de bloqueio de cavalos com um adicional de 1% de Triton X-100, adicionando anticorpos secundários em uma diluição adequada (1:500).
9. Adicione 500 μL de solução secundária de anticorpos ao poço e cubra a placa com papel alumínio, incubando por 4 a 6 horas em temperatura ambiente em um balanços.
10. Aspire cuidadosamente a solução secundária de anticorpos e lave 3 vezes com 1x PBS por 30 minutos cada em temperatura ambiente.
    NOTA: A coloração com DAPI pode ser realizada incubando tecidos com solução DAPI diluída (concentração final de 300 nM) por 10 minutos em temperatura ambiente. Lave os lenços com 1x PBS (2x 5 min) em temperatura ambiente em um balanço.
11. Transfira cuidadosamente os tecidos epiteliais para uma lâmina de vidro ou placa de imagem e adicione uma solução anti-desbotamento (90% de Glicerol, 0,2% de n-propila galato em 1x PBS).
12. Tecidos de imagem em um microscópio fluorescente.
    NOTA: Dada a espessura da amostra, os autores recomendam a obtenção de imagens em um microscópio fluorescente capaz de seccionamento óptico. Neste estudo, os autores usaram um microscópio fluorescente de campo amplo com seção óptica Apotome para remover luz fora de foco e obter z-stacks. Foram obtidas pilhas z de imagem para visualizar projeções dendríticas de macrófagos associados a epiteliais.

Resultados

Dissecação e coleta da uretra do camundongo fêmea adulta

Na primeira parte deste estudo, os autores fornecem um protocolo detalhado para a dissecação da uretra da fêmea do camundongo. Dada sua fixação à parede ventral vaginal e localização sob a sínfise púbica, o método apresentado aqui permite a dissecação limpa da uretra feminina de comprimento total (Figura 1).

Isolamento do tecido epitelial uretral e análise de citometria de fluxo para isolados de célula única

A digestão com tripsina resulta em fácil separação do revestimento epitelial da uretra do estroma ao redor. Folhas epiteliais com maior transparência do que o tecido estromal podem ser observadas após a separação (Figura 2). As folhas epiteliais separadas produziram suspensões de célula única após digestão enzimática. Células isoladas do epitélio uretral apresentam viabilidade consistentemente alta (>80%) por exclusão de azul de tripano em hemocitômetro (Figura 2L) e citometria de fluxo usando corantes de viabilidade para controlar células vivas (Figura 3, Arquivo Suplementar 1).

Os autores realizaram citometria de fluxo para avaliar o enriquecimento de células epiteliais a partir de suspensões unicelulares de epitélio uretral. Para verificar a viabilidade celular, a suspensão celular foi corada com um marcador vivo/morto, o corante fantasma reativo a aminas V450. Os autores observaram consistentemente uma viabilidade celular de >80% pelo marcador vivo/morto. O marcador vivo/morto permitiu a eliminação de detritos e células mortas durante a análise de fluxo. Eles coloriram amostras com um marcador celular epitelial (CD326/EPCAM), um marcador de macrófagos (F4/80) e um marcador de células imunes (CD45) para registrar a composição das células isoladas por esse método. Os resultados da citometria de fluxo mostraram que os autores isolaram uma população celular epitelial enriquecida do epitélio uretral feminino do camundongo. Em ambos os experimentos independentes realizados, o grupo alcançou 80–90% das células epiteliais positivas para EPCAM após o gating em células vivas. Os autores também observaram ~1,30% das células imunes CD45+ na preparação epitelial. Macrófagos associados ao revestimento epitelial representaram ~1,18% das células vivas do compartimento epitelial. A análise de citometria de fluxo de suspensões unicelulares a partir de folhas epiteliais mostra contaminação estromal mínima (5–6%), o que é principalmente atribuído ao endotélio vascular, segundo o estudo^{anterior 5}. O Arquivo Suplementar 1 mostra os resultados da citometria de fluxo para preparações unicelulares dos compartimentos epitelial e estromal. Comparado ao enriquecimento de 80–90% das células epiteliais isoladas do compartimento epitelial, o compartimento estromal também apresentou 40–50% das células epiteliais, que são provenientes dos ductos curtos e do epitélio glandular que se estendem do lúmen uretral para o estroma ao redor (Figura 3, Arquivo Suplementar 1).

Cultura, histologia e imunocoloração de organoides epiteliais uretrais

Os autores também demonstram como células epiteliais isoladas da uretra são viáveis e podem formar organoides em uma matriz 3D, e observaram crescimento de organoides a partir de células epiteliais uretrais individuais até o dia 6 em cultura (Figuras 4B–G). Eles realizaram coloração por hematoxilina-eosina (H&E) para observar a histologia dos organoides (Figuras 4H–J). Os autores observaram duas morfologias distintas de organoides epiteliais uretrais, uma sendo grande e oca, enquanto a outra era menor e sólida. Em ambos os casos, os organoides foram estratificados e marcadores recapitulados expressos no revestimento epitelial da uretra feminina, incluindo KRT5 e P63 marcando a camada basal e KRT4 e KRT13 marcando camadas celulares suprabasais/intermediárias (Figura 4K–N), Figura Suplementar 1). Foram examinadas as diferenças na capacidade de formação de organoides entre a uretra proximal e distal. Organoides gerados pela uretra proximal apresentavam uma proporção maior de organoides ocos, enquanto organoides da uretra distal formavam esferas sólidas (Figura 4O–P). Além disso, observaram diferenças na eficiência de formação de organoides em células epiteliais isoladas das partes proximal e distal da uretra. O epitélio uretral distal formado organoides com maior eficiência do que o epitélio uretral proximal com a mesma densidade inicial de semeadura (5000 células/gotícula) (Figura 4Q–S).

Imunocoloração em montagem completa de folhas epiteliais uretrais isoladas

Os pesquisadores também apresentam um método otimizado para a coloração total das folhas epiteliais uretrais do camundongo fêmea. Aqui, eles coloriram folhas epiteliais com dois marcadores: F4/80 para macrófagos e E-cadherina/CDH1 para marcar as junções célula-célula epitelial (Figura 5). Os tecidos foram fotografados usando um microscópio Zeiss Axio Observer 7 com seção óptica Apotome 3. As folhas epiteliais apresentam forte marcação com o anticorpo CDH1. Preparações inteiras de epitélio uretral, marcadas com anticorpos contra F4/80, mostraram macrófagos formando um eixo de dendritos no revestimento epitelial. Macrófagos podem ser observados enviando processos dendríticos entre células epiteliais da uretra. No geral, os resultados demonstram a utilidade dos protocolos descritos aqui para o estudo do revestimento epitelial da uretra do camundongo feminino.

Figura 1: Dissecação de camundongos para coleta da uretra feminina. (A) Coloque o rato em posição supina e borrife o abdômen com 70% de EtOH. (B–C) Abra o abdômen levantando a pele e fazendo uma incisão vertical. (D) Aparar gordura e tecido conjuntivo para expor os ossos púbicos em forma de borboleta conectados à (flecha em preto) sínfise púbica. (E) Corte a sínfise púbica. (F) Uma vez removidos os ossos pubianos, a uretra pode ser vista descendo (delineada com uma linha pontilhada em preto) a partir da bexiga. (G) Puxe suavemente a bexiga com pinça. A uretra é claramente visível como um tubo vermelho fino. (H–I) Puxe a bexiga para cima a partir da cavidade corporal. Use tensão na bexiga para separar a uretra da parede ventral vaginal. Passe a tesoura entre a uretra e a parede vaginal para separar os tratos urinário e reprodutivo. (J–K) Desprenda a extremidade distal da uretra presa à pele. (Esquerda) Imagem de uma fêmea do trato urinário inferior (FLUT) dissecada, mostrando bexiga e uretra. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Isolamento do epitélio uretral e preparação de uma suspensão unicelular. (A) Esquema que representa a digestão enzimática e a separação mecânica dos compartimentos epitelial e estromais da uretra, seguida pela digestão unicelular. (B) Eliminar a gordura extra do trato urinário inferior feminino. (C–F) Corte a uretra da região do pescoço da bexiga para separar a uretra da bexiga. Depois corte a uretra em duas metades usando uma tesoura fina. (G) Lave as peças da uretra com 1x solução de HBSS passando sobre um filtro de 100 micrômetros. (H) Transferir fragmentos de tecido uretral para uma solução de tripsina a 1%. Incubar em um rotador de amostra na câmara fria. Adicione MgCl₂ e DNase I ao mesmo tubo. Incubar a 37 °C em um forno de hibridização em um rotador de amostra. (I–J) Isole o epitélio apertando suavemente com pinças finas ao longo do fragmento uretral. (K) Os tecidos são picados em pequenos fragmentos usando tesouras finas. Transfira o tecido epitelial picado para a solução digestiva de Accutase e incube a 37 °C em um forno de hibridização em um rotador de amostra. (L) Contar células epiteliais e avaliar a viabilidade usando azul de tripano com um hemocitômetro. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Citometria de fluxo para avaliar suspensões unicelulares dos compartimentos do epitélio uretral e estroma. Citometria de fluxo foi realizada em preparações unicelulares dos compartimentos epitelial (A) da uretra (A) e do estroma (B) do camundongo. Células vivas foram bloqueadas para excluir células mortas coloridas com Ghost Dye V450. Células vivas foram avaliadas quanto à expressão de CD45 (marcador pan-imune), CD326/EPCAM (marcador pan-epitelial) e F4/80 (marcador de macrófagos murinos). Os dados são representativos de 2 experimentos independentes realizados em um grupo de 5–6 camundongos por experimento para gerar amostras epiteliais e estromais. Abreviações; SSC-A = área de pico de dispersão lateral; FITC = isotiocianato de fluoresceína; APC = aloficocianina; PE = ficoeritrina. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Histologia e imunocoloração de organoides epiteliais uretrais. (A) Esquema mostrando o fluxo de trabalho para a geração de organoides epiteliais uretrais. (B–G) Micrografias representativas em campo claro de organoides epiteliais uretrais (UEOs) geradas a partir de células individuais em diferentes dias de expansão in vitro. Imagens representativas em campo claro dos organoides epiteliais uretrais (H) ocos e (I) sólidos (UEOs) corados com hematoxilina e eosina (H&E). (J) Quantificação dos tipos de organoides gerados em três experimentos independentes. A barra de erro representa o erro padrão da média. Imagens representativas de organoides epiteliais uretrais ocos (K) e (L) sólidos (UEOs) imunocoloridos com marcadores epiteliais KRT13 (marcador epitelial suprabasal), KRT5 (marcador epitelial basal) e P63 (marcador epitelial basal). Imagens que mostram canais fluorescentes únicos são representadas em K', K'', K''', L''', L'' e L''''. Imagens representativas de organoides epiteliais uretrais (M) ocos e (N) sólidos (UEOs) imunocoloridos com marcadores epiteliais KRT4 (marcador epitelial suprabasal) e KRT5 (marcador epitelial basal). Imagens que mostram canais fluorescentes únicos são mostradas em M', M'', N' e N". (O) Esquema da dissecação da uretra proximal e distal. (P) Quantificação dos tipos de organoides gerados a partir da uretra proximal e distal em dois experimentos independentes. Micrografias representativas em campo claro dos organoides epiteliais uretrais (UEOs) do dia 6 gerados a partir do epitélio isolado da uretra proximal (Q) e distal (R). Os dados dos organoides gerados a partir da uretra completa são representativos de 3 experimentos independentes realizados com um grupo de 3 a 5 camundongos por experimento. (S) Os dados dos organoides gerados a partir da uretra proximal e distal são representativos de 2 experimentos independentes realizados com um grupo de 3–4 camundongos por experimento. Núcleos marcados com DAPI (azul). (Barras de escala, 100 μM). Esquemas preparados com BioRender e Adobe Illustrator. Criado no BioRender. Binoy Joseph, D. (2026) https://BioRender.com/jvf17v7 Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Imunocoloração total das folhas epiteliais uretrais. (A) Seção congelada de 10 micrômetros da uretra da fêmea adulta do camundongo em meio de corte ideal, mostrando imunocoloração para o marcador macrófago murino F4/80 (em vermelho) e para a proteína epitelial E-cadherina/CDH1 (em verde). (A') representa o zoom na vista do inset em (A). (B) Diagrama esquemático mostrando etapas para a coloração total de folhas epiteliais uretrais isoladas. A imunocoloração wholemount do revestimento epitelial uretral fêmea de camundongo isolado foi realizada com anticorpos contra o marcador macrófago murino F4/80 (em vermelho) e a proteína epitelial E-cadherina/CDH1 (em verde). (C) Imagem representativa da visão unificada. (D) Projeção ortogonal de intensidade máxima do canal vermelho mostrando organização dos macrófagos. (E–F) Vista ampliada do epitélio e macrófagos associados. Barra de escamas brancas, 50 μM. Barra de escala de cinza, 500 μM. Os dados representam 2 experimentos independentes realizados em um grupo de 4–5 camundongos. Esquemas preparados no BioRender e Adobe Illustrator. Criado no BioRender. Binoy Joseph, D. (2026) https://BioRender.com/tjh9opk Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela Suplementar 1: Preparação de 1x HBSS (sem Ca, Mg).Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 2: Preparação de 1x sHBSSa e 1% de solução de tripsina.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 3: Preparação do tampão de coloração de células/fluxo.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 4: Preparação de meios de expansão organoides para organoides epiteliais uretrais.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 5: Preparação do Buffer de Bloqueio de Cavalos.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Contagens celulares para experimento de citometria de fluxo realizado em células individuais dos compartimentos epitelial uretral e estromais de dois experimentos independentes.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 1: Comparação do epitélio uretral feminino adulto de camundongo com organoides epiteliais uretrais. Imagens representativas de (A) epitélio uretral fêmea adulta de camundongo, (B) organoides epiteliais uretrais ocos e (C) organoides epiteliais uretrais sólidos (UEOs) imunocoloridos com marcadores epiteliais KRT13 (marcador epitelial suprabasal), KRT5 (marcador epitelial basal) e P63 (marcador epitelial basal). Imagens que mostram canais fluorescentes únicos são mostradas em A', A'', A',B'', B'', B', C' e C'''. Imagens representativas de (D) epitélio uretral fêmea adulta de camundongo, (E) organoides epiteliais uretrais ocos e (F) organoides epiteliais uretrais sólidos (UEOs) imunocoloridos com marcadores epiteliais KRT4 (marcador epitelial suprabasal) e KRT5 (marcador epitelial basal). Imagens que mostram canais fluorescentes únicos são representadas em D', D''', E', E'', F' e F". Dados representativos de 3 experimentos independentes realizados com um grupo de 3–4 camundongos por experimento. Núcleos marcados com DAPI (azul). (Barras de escala, 100 μM). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

As barreiras epiteliais no corpo são de importância crítica para a defesa do hospedeiro. São compartimentos especializados com múltiplos tipos de células epiteliais e células imunes residentes associadas. Barreiras epiteliais mudam ao longo do desenvolvimento, adquirindo expressão gênica de defesa do hospedeiro frequentemente em resposta a microbiota ou exposições ambientais. Defeitos na integridade epitelial ou na expressão gênica podem influenciar a defesa do^{hospedeiro 15}. É essencial estudar o tecido epitelial isoladamente para entender assinaturas transcriptômicas, bem como para investigar contatos célula-célula e integridade epitelial. Atualmente, nenhum método foi descrito em detalhes otimizado para o isolamento do tecido epitelial uretral da fêmea do camundongo. Enquanto o epitélio da bexiga pode ser isolado apenas pela separação^{mecânica 16}, o epitélio uretral está presente dentro do tubo estromal da uretra e requer uma combinação de separação enzimática e mecânica para isolar o tecido epitelial.

Aqui, os autores apresentam um método otimizado para isolamento de folhas epiteliais do lúmen uretral de camundongos fêmeas. O método pode ser usado para gerar suspensões unicelulares de alta viabilidade de células epiteliais uretrais para aplicações posteriores como citometria de fluxo, cultura de organoides e imunocoloração. A compatibilidade desse método com fluxos de trabalho de sequenciamento de RNA de célula única já foi demonstrada pelo mesmo grupo⁵. Com modificações e otimizações adicionais, o protocolo apresentado aqui pode ser adaptado para extrair tecidos epiteliais de outros órgãos tubulares para aplicações posteriores.

As etapas principais do protocolo envolvem uma dissecação cuidadosa da uretra adulta de camundongo adulta de comprimento total, permitindo o estudo das diferenças regionais ao longo do eixo proximal-distal. Em seguida, o protocolo utiliza digestão enzimática suave para soltar o revestimento epitelial da uretra do estroma ao redor. A digestão enzimática afrouxa o epitelial para permitir a separação mecânica, comprimindo suavemente o tubo uretral entre as pinças para liberar o tecido epitelial. Os pesquisadores otimizaram cuidadosamente o tempo da digestão da tripsina para permitir o isolamento do epitélio uretral com alta viabilidade (> 80%) como folhas para imunocoloração ou para isolamento de célula única a jusante (Figura 3, Arquivo Suplementar 1). A digestão unicelular do epitélio uretral revelou 80–90% das células epiteliais em isolados epiteliais uretrais. Em um estudo anterior, os autores identificaram que as células não epiteliais nesta preparação são compostas principalmente por células imunes associadas ao epitelio e endotélio^{vascular 5}. O método atual para isolamento de célula única gera suspensões de célula única de alta qualidade para aplicações posteriores, como citometria de fluxo e sequenciamento de RNA de célula única, eliminando aglomerados celulares por meio de perturbação mecânica por aspiração de agulha de calibre pequeno e remoção de glóbulos vermelhos por lise suave.

Os resultados demonstram que esse método pode ser usado para enriquecer células imunes específicas de compartimentos (Figura 3). Epitélio isolado da uretra proximal e distal também pode ser estudado separadamente. Além disso, os autores demonstraram que células epiteliais isoladas podem ser usadas para a geração de organoides uretrais que não foram descritos anteriormente (Figura 4). Esses resultados também demonstram variabilidade regional na capacidade de geração de organoides na uretra feminina. Embora estudos recentes do autor tenham mostrado diferenças proximal-distal na expressão gênica epitelial e na organização das células imunes na uretra⁵ da fêmea do camundongo, o estudo atual mostra que as células epiteliais uretrais proximais formam menos organoides do que o epitélio isolado da uretra distal (Figura 4). Uma limitação dessa demarcação espacial entre uretra proximal e distal é que não existe um marco anatômico que possa ser usado no momento da dissecação para distinguir entre essas duas áreas. Neste estudo, os autores dividiram o comprimento da uretra pela metade para obter compartimentos proximal e distal. O método de isolamento epitelial descrito aqui pode ser usado para caracterizar ainda mais as diferenças na expressão gênica e na composição celular entre o epitélio uretral proximal e distal.

Embora o protocolo otimizado apresentado aqui seja acessível e reproduzível, algumas etapas exigem prática e calibração cuidadosa. Em particular, o método de dissecação apresentado aqui exige a extração cuidadosa do tubo uretral, abaixo da sínfise púbica, preservando todo o comprimento da uretra. Além disso, deve-se ter cuidado para remover qualquer tecido vaginal preso à parede uretral dorsal após a dissecação. A gordura presente ao redor do pescoço da bexiga deve ser cuidadosamente removida para reduzir a contaminação por adipócitos durante aplicações a jusante, como o sequenciamento de RNA unicelular. Além disso, a digestão de tripsina deve ser cuidadosamente otimizada com cada lote de enzima para garantir uma digestão consistente. A digestão excessiva do tecido pode levar à perda de viabilidade celular. Os autores otimizaram cuidadosamente o tempo para a digestão da tripsina, indicando uma janela de 15–30 minutos para as etapas de incubação a 4 °C e 37 °C. Isso pode ser ainda mais otimizado com base no lote de enzima utilizado. Também é fundamental triturar os tecidos em pequenos pedaços para uma digestão eficiente de células únicas. Os autores usaram Accutase para uma digestão adicional de células individuais, pois resulta em uma dissociação suave. Em caso de redução na viabilidade celular, o tempo de incubação com Accutase pode ser reduzido. Além disso, os autores incluíram o inibidor de rochas na mistura digestiva de Accutase para aumentar a sobrevivência celular. Recomenda-se a digestão de DNase para reduzir o aglomeramento celular ao digerir o DNA extracelular liberado de células mortas e moribundas. Os autores também recomendam o uso do tampão de lise de glóbulos vermelhos para reduzir a contaminação por glóbulos vermelhos que confundiria resultados posteriores, como citometria de fluxo e sequenciamento de RNA unicelular.

Uma limitação do método de isolamento epitelial apresentado aqui é que ele foi otimizado para a uretra do camundongo fêmea. A uretra do camundongo macho é mais anatomicamente complexa, com variações na arquitetura epitelial da uretra proximal para a distal. Além disso, o método só pode isolar as células epiteliais que revestem o lúmen uretral. Glândulas secretoras uretrais conectadas ao lúmen uretral por meio de ductos epiteliais curtos não podem ser isoladas, pois estão embutidas no tecido estromal. Em vez disso, essas estruturas epiteliais são enriquecidas no compartimento estromal remanescente após o isolamento do revestimento epitelial uretral (Figura 3).

Apesar dessas limitações, esse método proporcionou importantes insights sobre a arquitetura epitelial uretral e permitirá investigações adicionais em células imunes associadas ao epitelio por meio da visualização in situ dos macrófagos associados a epitelios. O método já foi demonstrado ser compatível com fluxos de trabalho de sequenciamento de RNA de célula única para identificar heterogeneidade celular no epitélio uretral e nas células imunes^{associadas 5}. Além disso, a capacidade de isolar o epitélio da uretra proximal e distal permitirá que estudos compreendam diferenças espaciais na uretra. Significativamente, o método de digestão celular epitelial produz células únicas viáveis que podem gerar organoides epiteliais uretrais úteis para estudar as interações hospedeiro-patógeno e a biologia epitelial da uretra. No geral, esses métodos ampliam o conjunto de ferramentas para possibilitar investigações mais profundas na biologia epitelial uretral.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
#5 fine forceps
10% neutral buffered formalin	Sigma Aldrich	HT501128
10X HBSS	Sigma Aldrich	H4641
12-well plate	Corning	3513
30-micron pre-separation filter	Miltenyi Biotec	130-041-407
A83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Accutase	Sigma Aldrich	SCR005
Adobe Illustrator	Adobe		Para fazer painéis de figuras
Adobe Photoshop	Adobe		Para fazer painéis de figuras
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Antibiotic/antimycotic	Sigma Aldrich	A5955
Anti-CD326 (EpCAM)	Invitrogen	17-5791-82	1:20 diluição, para citometria de fluxo
Anti-CD45	Tonbo	35-0451-U100	1:20 diluição, para citometria de fluxo
Anti-CDH1 (Rabbit)	Cell Signalling Technology	3195S	1:200 diluição
Anti-F4/80	Tonbo	50-4801-U100	1:20 diluição, para citometria de fluxo
Anti-F4/80 (Rat)	Invitrogen	14-4801-82	1:200 diluição
Anti-Keratin 13 (Rabbit)	Abcam	ab92551	1:200 diluição
Anti-Keratin 4 (Mouse)	Abcam	ab9004	1:200 diluição
Anti-Keratin 5 (Chicken)	Biolegend	905904	1:800 diluição
Anti-Keratin 5 (Rabbit)	Cell Signaling Technology	71536	1:200 diluição
Anti-p63 (Mouse)	Biocare medical	CM163A	1:200 diluição
Axioobserver 7	Zeiss	431007-9904-000
B27 supplement	Invitrogen	12587010
Bovine serum albumin (BSA), fraction V	Genetix	PG-2330
CD-1 Mice	Charles River, USA	Crl:CD1(ICR)
Cultrex BME	R&D systems	3445-005-01
DAPI solution	Sigma Aldrich	D5942
D-Glucose	Qualigens	Q15405
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Himedia	MB058
di-Sodium Hydrogen Ortophosphate (Na2HPO4)	Qualigens	Q15825
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001
Donkey anti-Chicken IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	703-545-155	1:500 diluição
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	715-545-151	1:500 diluição
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	715-585-151	1:500 diluição
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	711-585-152	1:500 diluição
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	711-605-152	1:500 diluição
Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	712-605-153	1:500 diluição
Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	712-585-153	1:500 diluição
EGF	PeproTech	AF-315-09
Eosin	Himedia	GRM938
Ethanol	Supelco	1.00983
Eukitt mounting media	Sigma Aldrich	3989
FGF10	PeproTech	450-61
Filter cap sorting tubes	Falcon/Corning	352235
Ghost Dye™ Violet 450	Tonbo biosciences	13-0863-T100
Glutamax	Invitrogen	35050061
Glycerol anhydrous	Merck	DA1P692899
Hematoxylin	Polysciences	24243
HEPES	Gibco	15630080
Horse serum	Gibco	26050088
Kaluza Analysis	Beckman Coulter	Kaluza Analysis 2.4	Análise de dados de citometria de fluxo
Magnesium chloride (MgCl2)	Qualigens	Q15535
Mouse TruStain FcX (anti-mouse CD16/32 )	Biolegend	101320
N-acetyl cysteine	Sigma Aldrich	A9165
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636
Noggin	PeproTech	AF-250-38
n-Propyl gallate	Sigma Aldrich	P3130
Paraffin wax	Qualigens	Q19215
Potassium chloride (KCl)	Qualigens	Q13305
Potassium dihydrogen orthophosphate (KH2PO4)	Qualigens	19465
Primocin	Invivogen	ant-pm-05
RBC Lysis Buffer (10X)	Tonbo biosciences	TNB-4300-L100
Retinoic acid	Sigma Aldrich	R2625
Rocki  (Y-27632)	Cell Signalling Technology	13624S
R-spondin 1	PeproTech	315-32