Isolamento e caracterização de exossomos derivados de células-tronco da polpa dentária através das passagens celulares

Resumo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho padronizado para isolar e caracterizar exossomos derivados de células-tronco pulpar dentárias (DPSC) em várias passagens, permitindo a avaliação reprodutível da qualidade dos exossomos e da atividade funcional para aplicações regenerativas.

Resumo

As células-tronco da polpa dentária (DPSCs) representam uma fonte acessível e clinicamente relevante de células-tronco mesenquimatosas, e seus exossomos derivados emergiram como vesículas bioativas promissoras para aplicações livres de células em engenharia de tecidos e medicina regenerativa. No entanto, métodos reprodutíveis e padronizados para isolar e validar funcionalmente exossomos derivados do DPSC continuam limitados, especialmente em relação à variabilidade introduzida durante a expansão celular através das passagens. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho abrangente, padronizado e baseado em kits para o isolamento e purificação de exossomos de meio condicionado a DPSC, compatível com a prática laboratorial rotineira. Esse método permite a recuperação consistente de vesículas intactas, adequadas para caracterização morfológica, molecular e funcional usando técnicas comumente disponíveis. A identidade dos exossomos é avaliada com base na morfologia, distribuição de tamanho e expressão dos marcadores, enquanto a atividade biológica é avaliada por meio de um ensaio anti-inflamatório in vitro definido. Para examinar os efeitos relacionados às passagens de texto, exossomos derivados de diferentes passagens DPSC são comparados usando essa leitura funcional, fornecendo uma estrutura prática para avaliar a consistência durante a expansão celular. Ao integrar isolamento, purificação, caracterização e validação funcional em um único fluxo de trabalho, esse protocolo oferece uma abordagem reprodutível e escalável para gerar exossomos derivados do DPSC validados funcionalmente para pesquisa de biomateriais e aplicações regenerativas.

Introdução

Exossomos derivados de células-tronco mesenquimatosas atuam como mediadores cruciais da comunicação intercelular e demonstram potencial terapêutico significativo nos campos da engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Exossomos são vesículas com diâmetro de 30–150 nm, capazes de entregar moléculas bioativas e regular várias funções nas células receptoras, como proliferação, diferenciação e resposta imune ^1,2. Entre as diversas fontes de células-tronco mesenquimatosas (MSC), as células-tronco da polpa dentária (DPSCs) são de particular interesse devido à sua fácil acessibilidade, robusta capacidade proliferativa, baixo risco tumorigênico e preocupações éticas ^{mínimas 3,4,5}. Exossomos derivados de DPSCs (DPSC-Exos) contêm um repertório diversificado de cargas funcionais, incluindo proteínas, mRNAs e microRNAs, permitindo que retenham muitas das propriedades biológicas de suas células parentais. Estudos anteriores demonstraram que o DPSC-Exos pode promover angiogênese, reparo neural, regeneração óssea e respostas anti-inflamatórias. Além de seus papéis na engenharia de tecidos, os exossomos são cada vez mais reconhecidos como reguladores importantes na oncogênese e na terapia do câncer, onde contribuem para a remodelação do microambiente tumoral, resistência a medicamentos e evasão^{imunológica 6}. Exossomos derivados de MSC, incluindo os provenientes de DPSCs, possuem capacidades inerentes de orientação tumoral e propriedades imunomoduladoras, posicionando-os como veículos promissores de próxima geração para entrega direcionada de medicamentos anticâncer ou como agentes imunoterapêuticos livres de células. Ao contornar várias limitações associadas às terapias celulares, o DPSC-Exos emergiu como um componente bioativo acelular promissor para aplicações^{regenerativas} 7,8,9,10,11,12.

Apesar dessas vantagens, a tradução da pesquisa DPSC-Exo para uso experimental ou clínico reprodutível continua sendo desafiadora. Uma grande limitação é a falta de protocolos unificados e padronizados para isolamento e purificação de exossomos. As abordagens atualmente utilizadas incluem ultracentrifugação¹³, ultrafiltração, precipitação, cromatografia por exclusão de tamanho e captura^{de imunoafinidade 14,15}. Entre esses métodos, a precipitação baseada em polímeros oferece vantagens práticas, incluindo alta produtividade, compatibilidade com uma ampla gama de volumes de amostras e simplicidade operacional, tornando-a adequada para estudos envolvendo grandes números de amostras ou requisitos de ampliação^{16, 17, 18}. Análises comparativas de diferentes métodos de isolamento, especialmente no que diz respeito ao rendimento proteico e à razão partícula-proteína, foram amplamente documentadas na literatura¹⁹. No entanto, a influência do número de passagem do DPSC nas características e atividade biológica dos exossomos derivados não foi suficientemente abordada, representando uma lacuna importante para a padronização e controle de qualidade da produção do DPSC-Exo.

Para abordar essas limitações técnicas, este estudo apresenta um protocolo padronizado baseado em kit para isolar e purificar exossomos a partir de meio condicionado a DPSC. Além da caracterização física e molecular, o protocolo incorpora um ensaio funcional para avaliar a atividade anti-inflamatória de exossomos derivados de diferentes passagens DPSC, permitindo uma avaliação comparativa da consistência dependente da passagem na qualidade e função dos exossomos. O fluxo de trabalho é projetado para uma implementação simples em laboratórios equipados com instalações padrão de cultura celular e biologia molecular. Ele depende de kits comercialmente disponíveis para reduzir a variabilidade interexperimental e pode ser facilmente escalado para acomodar diferentes necessidades experimentais. Para minimizar a variabilidade de doador para doador, os DPSCs são isolados de dentes individuais e expandidos independentemente em vez de agrupados por múltiplos doadores. Esse protocolo é particularmente útil para pesquisadores que buscam gerar exossomos derivados do DPSC validados funcionalmente para aplicações posteriores, incluindo cicatrização de feridas, engenharia de tecidos ósseos e estudos de imunomodulação, onde a consistência de lote a lote é essencial. No geral, oferece um arcabouço prático e padronizado para a produção de exossomos derivados do DPSC para uso em engenharia de tecidos e pesquisa em medicina regenerativa.

Protocolo

Este estudo foi conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque e aprovado pelos comitês de ética institucional. Tecidos pulpares dentários humanos foram obtidos de terceiros molares descartados ou pré-molares ortodônticos coletados no Hospital de Estomatologia de Ningbo, de acordo com as diretrizes éticas institucionais (Protocolo nº NBKQYY2025LS-04; data de aprovação: 30 de maio de 2025). Tecidos de pele humana foram obtidos a partir de amostras descartadas de prepúcio coletadas durante procedimentos de circuncisão rotineira no Departamento de Urologia do Hospital Popular Afiliado da Universidade de Ningbo, de acordo com as diretrizes éticas institucionais (Protocolo nº 2024104; data de aprovação: 30 de outubro de 2024). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os doadores ou seus responsáveis legais antes da coleta da amostra.

1. Isolamento de exossomos derivados de células-tronco da polpa dentária

1. Isolamento, cultura e identificação dos DPSCs
   1. Coleta e transporte de amostras
      1. Colete os terceiros molares humanos intactos de doadores de 18 a 25 anos ou pré-molares de doadores de 12 a 16 anos após extração ortodôntica.
      2. Imediatamente coloque os dentes extraídos em soro fisiológico tamponado (PBS) pré-resfriado, suplementado com 100 U/mL de penicilina-G e 100 μg/mL de estreptomicina.
      3. Transporte as amostras para o laboratório a 4 °C e processe dentro de 6 horas após a extração.
   2. Exposição da polpa dentária e dissociação tecidular
      1. Imergir em etanol a 70% por 30 segundos; lave três vezes com 1× PBS contendo 3% P/S (30 s cada). Remova cuidadosamente os tecidos gengivais e periodontais residuais da superfície do dente usando tesoura estéreis ou bisturi.
      2. Envolva o dente em gaze estéril e depois trinque cuidadosamente a coroa com um martelo esterilizado para expor a câmara polpa.
      3. Separe delicadamente o tecido polpar da dentina, triture-o em pequenos fragmentos (<1 mm³) usando lâminas cirúrgicas estéreis.
      4. Transfira os fragmentos de tecido para um tubo centrífugo de 1,5 mL contendo uma solução digestiva de 2,5 mg/mL de Dispase II e 2,5 mg/mL de colagenose tipo I.
      5. Incube a mistura em uma incubadora a 37 °C por 30–45 minutos com agitação suave.
         NOTA: A duração da digestão enzimática foi determinada com base no volume e grau de homogeneização do tecido pulpar dentário.
   3. Terminação da digestão e cultura celular primária
      1. Interrompa a digestão enzimática adicionando um volume igual do Médio Eagle Modificado (DMEM) da Dulbecco, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS).
      2. Centrifuge a suspensão celular a 200 × g por 5 minutos para pelletar as células e fragmentos de tecido.
      3. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio de cultura completo (α-MEM com 20% de FBS, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina).
      4. Semeie as células ressuspensas e explantações em uma panela de cultura de 60 mm e adicione o meio de cultivo completo a um volume final de 5 mL.
      5. Incube as células a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂.
   4. Manutenção celular e subcultura
      1. Renove o meio de cultura a cada 2–3 dias.
      2. Monitore as células diariamente.
         NOTA: Os DPSCs primários normalmente migram a partir de explantes de tecido e atingem confluência de 80–90% em 7–14 dias.
      3. Para subcultura, descolhe células usando 0,05% de tripsina-etilenediamina, ácido tetraacético (EDTA) quando atingirem 80–90% de confluência.
         ATENÇÃO: A tripsina é um irritante. Use equipamentos de proteção individual adequados, incluindo luvas e óculos de segurança.
      4. Células de passagem em proporção de 1:3 usando o meio de cultivo completo (com 20% de FBS).
      5. Use DPSCs nas passagens 2, 4 e 6 para todos os ensaios de isolamento e funcionalidade de exossomos a jusante.
   5. Caracterização de DPSCs por citometria de fluxo
      1. Destace os DPSCs na passagem desejada usando 0,05% de tripsina-EDTA, neutralize com meio de cultivo completo e colete a suspensão celular.
      2. Centrifuge a 300 × g por 5 minutos em temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em PBS e conte as células. Ajuste a densidade celular para aproximadamente 1 × 10⁶ células/mL.
      3. Aliquota 100 μL da célula em suspensão em cada tubo de citometria de fluxo. Incubar as células com anticorpos conjugados com fluorocromo contra CD44, CD90, CD105, CD45, CD19 e CD14 em diluição de 1:100 em PBS por 30 minutos a 4 °C no escuro.
      4. Lave as células adicionando 1 mL de PBS a cada tubo, seguida de centrifugação a 300 × g por 5 minutos. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e resuspenda o pellet celular em 300–500 μL de PBS para análise.
      5. Incluir anticorpos de controle de isotipo apropriados em concentrações correspondentes para cada fluorocromo para permitir correção de fundo e gating.
      6. Analise amostras usando um citômetro de fluxo equipado com lasers e filtros apropriados para os fluorocromos selecionados. Adquira pelo menos 10.000 eventos por amostra.
      7. Realize a análise de dados usando software de citometria de fluxo. Primeiro, células viáveis com portas baseadas em dispersão frontal (FSC) e dispersão lateral (SSC) para excluir detritos. Depois, aplique a porta de singlet para remover os doublets.
      8. Determine a expressão dos marcadores comparando a intensidade de fluorescência com os controles isotípicos correspondentes para definir populações positivas e negativas.
2. Isolamento e purificação do DPSC-Exos
   1. Preparação do meio condicionado
      1. Cultive DPSCs em um prato de cultura de 10 cm até atingir 70–80% de confluência.
      2. Remova o meio gasto e lave suavemente a monocamada da célula duas vezes com PBS pré-aquecido.
      3. Adicione 10 mL de meio completo suplementado com 10% de FBS esgotado em exossomos.
      4. Incube a cultura a 37 °C até que a confluência celular atinja 90–100% (um processo geralmente superior a 24 horas).
   2. Coleção de meio condicionado
      NOTA: Mantenha todos os passos seguintes no gelo ou a 4 °C.
      1. Transfira o meio condicionado para um tubo de centrífuga.
      2. Centrifuge o meio a 4 °C e 3.000 × g por 10 minutos para remover células e detritos grandes.
      3. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga sem perturbar o pellet.
      4. Centrifuge o sobrenadante a 4 °C e 10.000 × g por 10 minutos para pelletar partículas menores e corpos apoptóticos.
      5. Filtre o sobrenadante através de um filtro de seringa de 0,22 μm para um tubo centrífugo limpo de 50 mL.
      6. Processe imediatamente o meio clarificado para isolamento de exossômicos, ou alíquota, e armazene-o a -80 °C.
         NOTA: O meio condicionado clarificado pode ser armazenado a -80 °C por vários meses. Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
   3. Isolamento de exossomos por precipitação baseada em polímeros
      1. Descongele o meio condicionado clarificado no gelo se ele estivesse congelado.
      2. Em um tubo estéril sobre gelo, combine o meio com uma solução de concentração de exossomos em uma proporção de volume 4:1 (por exemplo, meio 20 mL: solução de 5 mL). Faça vórtice na mistura por 1 minuto para garantir homogeneidade.
      3. Deixe a mistura intocada a 4 °C por 16–18 horas para permitir a precipitação de exossomos.
         NOTA: O tempo de incubação pode ser apropriadamente estendido para potencialmente aumentar o rendimento, mas não deve exceder 24 horas.
      4. Centrifuge a mistura a 4 °C e 10.000 × g por 75–80 minutos para pelletar os exossomos. Aspire cuidadosamente e descarte o sobrenadante sem perturbar a pelota.
      5. Centrifuge o tubo novamente a 4 °C e 10.000 × g por 2 minutos. Remova qualquer sobrenadante residual com uma pipeta.
      6. Resuspenda o pellet do exossomo em 1x PBS (Use 200 μL de PBS por meio condicionado de 20 mL).
      7. Transfira a ressuspensão para um novo tubo centrífugo de 1,5 mL e centrifuge a 4 °C e 12.000 × g por 2 minutos, mantendo o sobrenadante, que é enriquecido com partículas de exossomo (repita se necessário).
   4. Purificação de exossomos
      1. Aplique a suspensão do exossomo a uma coluna de filtro de purificação de exossomos colocada em um tubo de coleta.
      2. Centrifuge a coluna a 4 °C e 3.000 × g por 10 minutos.
      3. Colete o líquido de fluxo do fundo do tubo de coleta. Esse líquido contém os exossomos purificados.
   5. Armazenamento de exossomos purificados
      1. Aliquota a suspensão purificada de exossomos em volumes descartáveis adequados para experimentos a jusante.
      2. Armazene as alíquotas a -80 °C.
         NOTA: A aliquotação é fundamental para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, que podem degradar a integridade dos exossomos e a atividade biológica.
   6. Caracterização e identificação de DPSCs-Exo
      1. Realize a análise morfológica por microscopia eletrônica de transmissão (MET) conforme descrito nos passos 1.2.6.2–1.2.6.6.
      2. Use uma pipeta, extraia 10 μL da amostra preparada de suspensão do exossomo e despegue-a sobre o Parafilme pré-preparado. Coloque a grade de cobre revestida com formvar/carbono, com o lado do filme voltado para baixo, sobre a gota, permitindo que ela adsorva naturalmente por 10–15 minutos.
      3. Use uma tira de papel filtro para absorver o excesso de líquido e deixe secar ao ar livre por um tempo.
      4. Use uma pipeta, retire 10 μL de solução de ácido fosfotungêstico a 2% e despenque sobre o Parafilme. Inverta a grade que completou a etapa de adsorção para que o lado do filme fique voltado para a solução de coloração e deixe agir por 3 a 5 minutos.
      5. Use uma tira de papel filtro para absorver o excesso de líquido e deixe a grade secar sob uma lâmpada incandescente.
      6. Observe e capture imagens usando um microscópio eletrônico de transmissão.
      7. Realize a distribuição de tamanho e análise de concentração por meio de análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), conforme descrito nos passos 1.2.6.8–1.2.6.12.
      8. Enxágue a câmara da amostra três vezes com água ultrapura.
      9. Calibre o instrumento usando esferas de poliestireno padrão de 100 nm conforme as instruções do fabricante. Prossiga com as medições após a calibração bem-sucedida.
      10. Enxágue a câmara da amostra com 1× PBS.
      11. Dilua a amostra do exossomo em 1× PBS (diluição 1:500) e a coloque na câmara da amostra. Monitore o movimento das partículas em tempo real usando o software do instrumento.
      12. Colete dados e gere o relatório de análise correspondente.
      13. Identifique os marcadores proteicos por análise de Western blot, conforme descrito nos passos 1.2.6.14–1.2.6.24.
      14. Lisar amostras de exossomos usando um tampão de lise proteico específico para exossomos e quantificar a concentração de proteínas usando um ensaio de ácido bicincônico (BCA).
      15. Prepare géis de resolução e empilhamento. Carregue quantidades iguais de proteína por via e adicione 5 μL de marcador proteico a cada gel.
      16. Realize eletroforese a uma tensão constante de 80 V até que a frente do corante alcance o gel resolvente, depois aumente para 120 V e continue até que a frente do corante alcance o fundo do gel.
      17. Corte uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) no tamanho adequado e ative-a deixando-a de molho em metanol por 5 minutos.
      18. Prepare um tampão de transferência composto por 25 mM de Tris base, 192 mM de glicina e metanol 20% (v/v) (pH = 8,3). Equilibre todos os componentes de transferência no buffer de transferência.
      19. Montar o sanduíche de transferência na seguinte ordem, do cátodo ao ânodo: esponja – papel filtro – gel – membrana PVDF – papel filtrante – esponja. Remova quaisquer bolhas de ar e realize a transferência de proteína com corrente constante de 300 mA.
      20. Após a transferência, enxágue brevemente a membrana PVDF com soro salino tampado com 0,1% Tween20 (TBST) e bloqueie com leite desnatado a 5% por 1h em temperatura ambiente, com sacudidas suaves.
      21. Incube a membrana com anticorpos primários (por exemplo, anti-CD63 e anti-TSG101) diluídos em leite desnatado a 5% durante a noite a 4 °C com sacudidas suaves. Lave a membrana três vezes com TBST por 5 minutos cada.
      22. Incube com o anticorpo secundário apropriado em temperatura ambiente por 30 minutos, seguido de três lavagens com TBST (5 minutos cada).
      23. Prepare uma nova solução de trabalho por eletroquimiluminescência (ECL) (misture as Soluções A e B na proporção 1:1), aplique na membrana e detecte sinais usando um sistema de imagem por quimiluminescência.

2. Isolamento e cultivo de queratinócitos epidérmicos primários da pele humana

1. Coleta e transporte de amostras
   1. Obtenha amostras de tecido do prepúcio de doadores saudáveis do sexo masculino no The Affiliated People's Hospital da Universidade de Ningbo.
   2. Coloque imediatamente o tecido extraído do prepúcio em PBS de 4 °C suplementado com 100 U/mL de penicilina-G e 100 μg/mL de estreptomicina.
   3. Transporte as amostras para o laboratório a 4 °C e processe em até 6 horas.
2. Preparação asséptica e fragmentação do tecido
   1. Imerga o tecido em etanol a 70% por 30 segundos a 3 minutos.
      NOTA: Ajuste o tempo de imersão com base no tamanho do tecido para a desinfecção inicial.
   2. Usando tesoura estéreis ou bisturi, dissece e remova gordura subcutânea e tecido conjuntivo da amostra de tecido lavado.
   3. Triturá-lo em pequenos fragmentos (tamanho do fragmento <1^{mm 3}) usando lâminas cirúrgicas estéreis.
      NOTA: Triturar 3–4 amostras de tecido normalmente requer menos de 15 minutos. Adicione uma pequena quantidade de PBS durante a moção se o tecido parecer seco.
   4. Transfira a pasta de tecido moído para um tubo centrífugo de 50 mL contendo uma solução digestiva de 2,5 mg/mL de Colagenase Tipo I e 2,5 mg/mL de Dispase II. Adicione 10–20 mL de solução digestiva por pedaço de tecido picado.
   5. Incube a mistura em uma incubadora a 37 °C por 60 minutos. Mantenha uma agitação suave a 80 × g, ou agite vigorosamente o tubo manualmente a cada 20 minutos.
3. Digestão secundária e tratamento com DNase
   1. Adicione 0,25% de Tripsina-EDTA à mistura digestiva em uma proporção de volume de 1:5. Incube o tubo a 37 °C por 25 minutos com agitação suave.
      ATENÇÃO: A tripsina é um irritante. Use equipamentos de proteção individual adequados, incluindo luvas e óculos de segurança.
   2. Adicione a solução de DNase I (10 mg/mL) à mistura em uma proporção de 10 μL por mL do volume total de digestão. Incube a 37 °C por 5 minutos com agitação suave.
4. Terminação da digestão e cultura celular primária
   1. Interrompa a digestão enzimática adicionando um volume igual de DMEM suplementado com 10% de FBS.
   2. Triture a mistura completamente, pipeteando para cima e para baixo aproximadamente 20 vezes para dissociar os fragmentos de tecido. Filtre a suspensão da célula através de um filtro de célula de 100 μm para um novo tubo centrífugo de 50 mL.
   3. Centrifuge a suspensão celular a 200 × g por 5 minutos para pelletar as células e fragmentos de tecido.
   4. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio de cultura completo (α-MEM com 20% de FBS, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina).
   5. Semeie as células ressuspensas e explantações em um recipiente de cultura de 10 cm e adicione o meio de cultivo completo a um volume final de 6 mL.
   6. Incube as células a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂.
      NOTA: Suplemente as culturas de queratinócitos com Y-27632 em concentração final de 5 μM durante a cultura.
5. Manutenção celular e subcultura
   1. Renove o meio de cultura a cada 2–3 dias.
   2. Monitore as células diariamente.
      NOTA: Queratinócitos epidérmicos primários da pele normalmente migram dos explantes de tecido e atingem confluência de 80-90% em 10-14 dias.
   3. Para subcultura, descolhe células usando 0,05% de tripsina-EDTA quando atingirem 80–90% de confluência.
      ATENÇÃO: A tripsina é um irritante. Use equipamentos de proteção individual adequados, incluindo luvas e óculos de segurança.

3. Verificação funcional da função anti-inflamatória dos exossomos a partir de diferentes passagens

1. Semeadura e preparação celular
   1. Semente queratinócitos epidérmicos com uma densidade de 1,5 × 10⁵ células por poço em uma placa de 12 poços. Adicione 1 mL de meio completo a cada poço e cultive as células por 24 horas.
   2. Quando a confluência celular atingir aproximadamente 70%, aspire cuidadosamente o meio, lave suavemente a monocamada celular duas vezes com PBS pré-aquecido de 1×.
2. Estimulação inflamatória e tratamento com exossomos
   1. Induzir um modelo celular psoriasiforme, estimular as células com a mistura de citocinas pro-inflamatórias "M5" (contendo IL-1α, IL-17A, IL-22, Oncostatina M e TNF-α, cada uma com uma concentração final de 10 ng/mL).
   2. Para os grupos de tratamento, coincubar as células estimuladas com DPSC-Exos (50 μg por poço).
   3. Para o grupo controle negativo (NC), adicione um volume equivalente de PBS em vez de exossomos.
      NOTA: Realize todas as estimulações e tratamentos em um meio desprovido de Y-27632 para evitar sua possível interferência nas vias de sinalização inflamatória.
3. Coleta de amostras e análise qRT-PCR (comparação funcional entre passagens)
   1. Colhe as células e extraia RNA após 24 horas de tratamento.
   2. Analise a expressão do principal marcador inflamatório IL-23A.
      1. Compare os efeitos inibitórios na expressão de IL-23A entre grupos de tratamento com exossomos derivados de diferentes passagens (P2, P4 e P6) usando qRT-PCR para avaliar alterações dependentes da passagem na função dos exossmos.
      2. Realize qRT-PCR usando as seguintes condições de ciclagem: desnaturação inicial a 95 °C por 3 minutos, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 10 s e recozimento e extensão a 60 °C por 30 s.
      3. Realize uma análise da curva de fusão de 65 °C a 95 °C para confirmar a especificidade da amplificação.
         NOTA: Sequências de primer: Humano-IL-23A (frente: 5'-GAAGAGGGAGATGAAGAC-3', reverso: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTTC-3'); Humano-H36B4 (frente: 5'-GCAATGTTGCCAGTGTCTGT-3', reverso: 5'-GCCTTGACCTTTTCAGCAAG-3')

Resultados

Identificação e Caracterização de Células-Tronco da Polpa Dentária
Células-tronco primárias da polpa dentária (DPSCs) isoladas usando o protocolo descrito apresentaram crescimento estável e morfologia mesenquimatosa típica durante a expansão in vitro. Como mostrado na Figura 1, as DPSCs nas passagens 2, 4 e 6 apresentavam uma população homogênea de células em forma de fuso, semelhantes a fibroblastos, sem dife...

Discussão

O protocolo padronizado descrito neste estudo fornece uma estrutura reprodutível para o isolamento de células-tronco da polpa dentária (DPSCs), a produção de exossomos derivados do DPSC (DPSC-Exos) e a validação funcional dessas vesículas através de múltiplas passagens celulares. A discussão abaixo destaca considerações processuais críticas, estratégias de otimização, limitações metodológicas e a relevância mais ampla desse fluxo de trabalho para a pesquisa em medicina regenerativa.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de Tripsina-EDTA 0,05%	Gibco	25300054	Devido à sua força digestiva, a tripsina é amplamente utilizada para dissociação celular, passagem rotineira de culturas celulares e dissociação primária de tecidos.
Placa de Cultura de Células e Tecidos de 100 mm	Biofil	TCD010100	Superfície Tratada/Não Tratada Estétil & DNase não pirogênico/RNase
Esferas de 100 nm PS	Thermo Fisher	3100A	Antes de realizar experimentos de análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), o instrumento deve ser calibrado usando um padrão com tamanho de partícula precisamente conhecido (100 nm).
Tubo de centrífuga cônico a granel de 15 mL	KIRGEN	KG2611	Livre de RNase/Dnase e estéril, RNase/Dnase
Grade de cobre revestida com carbono Formvar de 200 malhas	Zhongjing  Scientific  Instrumentos	AZH200	Suporta amostras de exossomos para imagem TEM. O revestimento Formvar-carbono melhora a adesão e condutividade da amostra, enquanto a grade de 200 malhas oferece uma área aberta adequada para distribuição uniforme de partículas e imagem estável.
37 & deg; C Incubador	Termo Científica	51032877	A incubadora de CO2 de 37 graus proporciona um ambiente ideal in vitro.
Tubo de centrífuga cônica a granel de 50 mL	KIRGEN	KG2811	Livre de RNase/Dnase e estéril, RNase/Dnase
Anticorpo anti-CD63 [MX-49.129.5]	Abcam	ab193349	Anticorpo anti-CD63 [MX-49.129.5] (ab193349) é um anticorpo monoclonal de camundongos que detecta CD63 in  Western Blot, citometria de fluxo (intra), citometria de fluxo, IHC-P, ICC/IF. Adequado para  Humano.
Anticorpo Anti-TSG101 [EPR7130(B)]	Abcam	ab125011	Anticorpo Anti-TSG101 [EPR7130(B)] (ab125011) é um anticorpo monoclonal de coelho que detecta TSG101 in  Western Blot, citometria de fluxo (intra), citometria de fluxo, IHC-P, ICC/IF. Adequado para  Humano, Rato, Rato.
Contador automático de células	Countstar	IC1000	Contador automático de células para contagem rápida e precisa de células
Kit de Ensaio de Proteína BCA	Beyotime	P0012	Ter boa relação linear dentro da faixa de concentração de 50 - 2000 e mu; g/ml.
Centrífuga de bancada	BIORIDGE	TD5	Centrífuga de bancada para separação rápida e eficiente das amostras em ambientes laboratoriais
Gabinete de segurança biológica	Termo Científica	1379	O Armário de Segurança Biológica é um dispositivo de contenção estéril que protege operadores, amostras e ambientes contra riscos biológicos, filtrando patógenos transportados pelo ar e prevenindo contaminação cruzada durante trabalhos microbiológicos.
Placa de Cultura Celular, 12 Poços	Eppendorf	0030721110	Cultura de tecidos tratada, com tampa, fundo plano Estéril, livre de pirogens, RNase e RNase detectáveis; DNase, humano & Bact. DNA Não citotóxico
Placa de Cultura Celular, Poço 96	NEST	701001 0714B	Cultura de tecidos tratada, poliestireno, não pirogênico, estéril
Salvamento de células	NCM	C40100	Meio de congelação celular sem soro, sem proteína animal
Colaganose, Tipo I, pó	Gibco	17100017	A colagênase é uma protease que divide a ligação entre um aminoácido neutro (X) e a glicina na sequência Pro-X-Gly-Pro, que é encontrada com alta frequência no colágeno.
Dispase II, pólvora	Gibco	17105041	A dispase II (protease neutra) é uma amino-endopeptidase que hidrolisa as ligações peptídicas N-terminais de resíduos de aminoácidos não polares.
Eagle Médio Modificado de Dulbecco	Gibco	C11995500BT	[+]4,5g/L D-Glicose [+]L-Glutamina [+]110mg/L Piruvato de Sódio
Kit de Transcrição Reversa Evo M-MLV	AG	AG11707	Um reagente dedicado de transcrição reversa para RT-PCR em tempo real. Ele utiliza a transcriptase reversa Evo M-MLV com forte capacidade de extensão, permitindo a síntese eficiente do cDNA em um curto período de tempo.
Solução de Concentração de Exossomos	Umibio	UR52111	Extrair exossomos do supernadante celular
Soro Fetal Bovino Empobrecido em Exossomos	Umibio	UR50202	O soro fetal bovino livre de exossomos foi obtido filtrando o soro fetal bovino saudável coletado de forma estéril, e ≥ 99% dos exossomos endógenos no soro bovino fetal foram removidos. Ele apresentava a mesma taxa de crescimento celular e morfologia do soro bovino fetal antes do processamento.
Soro fetal bovino, qualificado, Austrália	Gibco	10099141	Nível de hemoglobina:   ≤ 30 mg/dL (níveis rotineiros & le; 25 mg/dL)
Human-H36B4	Sangon Biotech	SB002	Atacante: 5'-GCAATGTTGCCAGTGTGTGT-3'; Reverso: 5'-GCCTTGACCTTTTCAGCAAG-3'
Humano-IL-23A	Sangon Biotech	SB002	Atacante: 5'-GAAGAGGGAGATGAAGAGAC-3'; Reverso: 5'-TATCCGATTAGCAGCTTC-3'
Microscópio Biológico Invertido	Leica	DMI1	Observe diretamente as células vivas ou tecidos que estão aderindo às paredes de recipientes, como frascos de cultura e placas de Petri.
Médio Essencial Mínimo	Gibco	C12571500BT	[+]L-Glutamina [+]Ribonucleósides [+]Desoxirribonucleóseos
Kit Rápido de Extração de RNA NcmSpin	NCM	M5106	Este kit pode extrair rapidamente RNA total de até 3.000.000 de células e até 10mg de tecido.
Penicilina-Estreptomicina	NCM	C100C5	Contém 10.000 unidades/ml de penicilina e 10.000 microgramas/ml de estreptomicina. Ele foi filtrado para remover bactérias e pode ser usado diretamente para cultivo celular. Ela previne efetivamente a contaminação bacteriana nas células.
PerfectStart Green qPCR SuperMix	TransGen	AQ601-02-V2	Um corante fluorescente que se liga ao sulco menor de todo DNA de fita dupla e emite luz verde ao ser excitado. Durante a amplificação por PCR, ele se incorpora ao DNA recém-amplificado, resultando em aumento da fluorescência. Durante a etapa de desnaturação, as fitas de DNA se separam, liberando o corante e causando uma queda significativa no sinal de fluorescência.
Soro Tamponado com Fosfato (PBS)	Viva Cell Biosciences	C3582-0500	Sua função é manter o pH do meio dentro da faixa fisiológica e preservar o equilíbrio de pressão osmótica dentro e fora da célula.
Ácido fosfotungístico	Solarbio	G1870	Usado como coloração negativa para preparação de amostras TEM.
Banhos-maria SW agitados	Julabo	(DIN 12876-1)I	Variação de temperatura de trabalho de +20 a +99,9 ° C
Filtro de seringa, 0,22 & mu; m/33 mm, PES	Beyotime	FF362	DNase/RNase Livre Baixa Ligação Proteica Não Pirogênica Envolvida individualmente
Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET)	HITACHI	HT7700	Usado para imagens de alta resolução da morfologia de nanopartículas, incluindo exossomos. Operava com uma tensão aceleradora de 80– 100 kV para visualizar amostras coradas negativamente e confirmar o tamanho, formato e integridade estrutural das partículas.
ZetaView_Particle Metrix	Metrix de partículas	PMX-120	Usado para medir o tamanho das partículas, concentração, potencial Zeta e propriedades de fluorescência das nanopartículas.