Detecção de Hormônios Sexuais em Filme Lacrimal Humano Usando Ensaios de Imunossorvente Ligado a Enzimas

Resumo

Este protocolo descreve um método otimizado de ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) para detectar e quantificar 17β-estradiol e testosterona no fluido lacrimal humano coletado por meio de tubos microcapilares. Essa abordagem permite a medição minimamente invasiva dos níveis de hormônio lacrimal.

Resumo

O filme lacrimal é um fluido complexo e multicamada, essencial para manter a saúde da superfície ocular, clareza visual e proteção contra patógenos e fatores de estresse ambiental. Composto principalmente por lipídios, líquido aquoso, proteínas solúveis e mucinas, ele serve não apenas para lubrificar e proteger o olho, mas também como um valioso meio diagnóstico para distúrbios da superfície ocular, como a doença do olho seco (DED). Hormônios sexuais, incluindo andrógenos e estrogênios, são conhecidos por influenciar a composição do filme lacrimal, mas a medição desses hormônios no fluido lacrimal é limitada pelo baixo volume de amostras e desafios técnicos. Esse protocolo descreve um método passo a passo para adaptar kits de ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) comercialmente disponíveis para detectar e quantificar 17β-estradiol e testosterona em lágrimas basais coletadas usando tubos microcapilares. O fluxo de trabalho incorpora estratégias otimizadas de coleta, diluição e preparação de ensaios para permitir a análise de amostras de lágrimas de baixo volume. O protocolo demonstra a viabilidade e reprodutibilidade da detecção de hormônios no fluido lacrimógeno usando métodos adaptados do ELISA. Resultados representativos são derivados de amostras piloto agrupadas e têm como objetivo ilustrar o desempenho do ensaio, e não diferenças biológicas. Essa abordagem pode apoiar estudos futuros que investiguem o fluido lacrimógeno como matriz para medição hormonal em pesquisas da superfície ocular.

Introdução

O filme lacrimal desempenha papéis vitais na proteção, nutrição e lubrificação da superfície^{ocular 1}. Tem aproximadamente 2–5,5 μm de espessura e 3–10 μL de volume, com uma taxa de rotatividade de 1–2 μL por minuto em um olho^{saudável 2,3}. As glândulas lacrimais secretam o componente aquoso das lágrimas, rico em água, eletrólitos, proteínas e fatores antimicrobianos, enquanto as glândulas de Meibômio produzem lipídios que retardam a evaporação do filme lacrimal, e as células do cálice conjuntivais liberam mucinas que sustentam a lubrificação da superfície^{ocular 4}. A produção de lágrimas ocorre de duas maneiras principais: 1) secreção basal, que mantém um filme lacrimal estável em uma superfície ocular saudável, e 2) secreção reflexa, que é desencadeada por estímulos como irritação, emoção ou luzes fortes. A composição bioquímica difere entre os dois, o que pode, em última análise, influenciar o método usado para coletar lágrimas^{para análise 5,6}. As lágrimas basais geralmente contêm concentrações mais altas de proteínas e lipídios que apoiam a estabilidade do filme lacrimal e a saúde da córnea, enquanto as lágrimas reflexas tendem a ter maior volume aquoso e são mais diluídas para eliminar irritantes e proteger a superfície ocular ^7,8,9.

Como as lágrimas funcionam para modular a inflamação, se defender contra patógenos e fornecer nutrientes para a córnea^{avascular 1}, elas se tornaram um ponto focal para a pesquisa de^{biomarcadores 10}. As lágrimas oferecem uma alternativa minimamente invasiva e relativamente econômica à coleta de sangue para monitorar mudanças fisiológicas, especialmente aquelas que ocorrem próximas ao local da^{doença 8}. Para capturar esses dados com precisão, a coleta adequada é essencial¹⁰. Tubos microcapilares de vidro são amplamente usados para amostragem de rasgos basais porque permitem a coleta com irritação mínima e diluição de^{lágrimas 5}. Esse método minimiza o risco de estimular o rasgo reflexo, que pode alterar a composição da^{laceração 9,11}, posicionando cuidadosamente o tubo para evitar contato com a conjuntiva bulbar e a margem da pálpebra. Usando essa abordagem, os pesquisadores podem obter rasgos basais não diluídos que refletem o estado fisiológico da superfície ocular. Isso garante que a amostra permaneça um meio confiável para quantificar analitos sensíveis, como hormônios^{sexuais 10,12}. No entanto, o volume limitado obtido apresenta desafios analíticos para ensaios bioquímicos posteriores. A coleta de lágrimas basais usando tubos microcapilares normalmente gera alguns microlitros por amostra, o que limita a compatibilidade com ensaios padrão.

A superfície ocular humana é cada vez mais reconhecida como um tecido-alvo para hormônios^{sexuais 13,14}. Evidências que apoiam isso incluem a detecção de transcritos de mRNA para receptores de andrógeno (AR), receptores de estrogênio (RE) e receptores de progesterona (PR) em células acinas das glândulas lacrimais e de Meibômio, bem como nas células epiteliais da córnea, conjuntiva e células do cálice^{conjuntivais 15}. Além disso, mRNAs que codificam enzimas esteroidogênicas foram identificados nesses tecidos, sugerindo a capacidade de converter precursores de esteroides em hormônios sexuais biologicamente^{ativos localmente 16}. Isso indica potencial para síntese hormonal in situ na superfície ocular e levanta uma questão crítica sobre se esses hormônios são secretados pelo filme lacrimal em níveis detectáveis.

Evidências atuais sugerem que os hormônios sexuais são essenciais para a manutenção da homeostase da superfície ocular, embora os mecanismos moleculares precisos ainda estejam sob investigação^13,14. Andrôgenos, como a testosterona, parecem estimular a secreção de lipídios e suprimir a inflamação; Consequentemente, a deficiência de andrógenos é amplamente reconhecida como um fator do olho seco^evaporativo 13,14,17. Em contraste, o papel dos estrogênios é mais complexo e depende do^contexto 13,14,18. Embora estejam envolvidos na modulação da composição e volume das lágrimas, as flutuações de estrogênio, como as que ocorrem durante a menopausa, gravidez ou uso de contraceptivos orais, estão frequentemente associadas a secreção aquosa comprometida, diminuição da estabilidade do filme lacrimal e inflamação da superfície^{ocular 19,20}. Como resultado, indivíduos que apresentam esses desequilíbrios hormonais representam uma população com risco elevado de desenvolver doença do olho seco (DED)13,14,20.

Apesar dessas evidências, monitorar o status hormonal em pacientes com DED continua sendo um desafio. Especificamente, ainda não está estabelecido se os níveis sistêmicos de hormônios séricos refletem com precisão os níveis locais de hormônio no^{olho 21}. Essa distinção é fundamental porque foi demonstrado que os tecidos da superfície ocular possuem receptores de hormônios sexuais e expressão enzimática esteroidogênica que apoiam a síntese local e o metabolismo dos esteroides^{sexuais 16}. Essa capacidade intracrina sugere que as concentrações hormonais locais no filme lacrimal podem diferir significativamente dos níveis^{séricos circulantes 13}. Portanto, a medição direta da concentração hormonal no fluido lacrimal é necessária para entender melhor os efeitos hormonais locais na superfície ocular. No entanto, tais medidas são tecnicamente desafiadoras devido ao pequeno volume de amostras de lágrima disponíveis para análise. Técnicas analíticas avançadas como cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) têm sido usadas para quantificar hormônios no sangue e em fluidos lacrimais com alta sensibilidade, mas esse método requer instrumentação especializada e expertise técnica que podem não ser facilmente acessíveis para todos os^{pesquisadores 21,22}.

O ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) é uma técnica amplamente estabelecida para a detecção e quantificação de proteínas, anticorpos e hormônios. Para a análise de pequenas moléculas, como esteroides sexuais, esse protocolo utiliza um formato de ligação competitiva. Nesse método, o hormônio não marcado presente na amostra lacrimal compete com um análogo hormonal marcado por enzimas por um número limitado de sítios de ligação de anticorpos. Por causa dessa competição, a intensidade do sinal, medida como densidade óptica, é inversamente proporcional à concentração do hormônio na amostra; Efetivamente, um sinal mais baixo indica uma concentração maior do^{hormônio-alvo 23,24}.

O ELISA oferece várias vantagens práticas para quantificação direcionada. É econômico e tecnicamente acessível, permitindo a implementação em ambientes laboratoriais padrão sem a necessidade de instrumentação especializada. Além disso, o ELISA facilita a triagem de alta produtividade em formatos de placas de 96 poços com preparação mínima da amostra, oferecendo tanto eficiência de tempo quanto alta^{reprodutibilidade 23}. No entanto, kits ELISA comercialmente disponíveis são tipicamente otimizados para amostras biológicas de maior volume, como soro ou plasma, e seu desempenho em amostras de lágrima de baixo volume não é bem definido. Para resolver essa limitação, o protocolo incorpora estratégias otimizadas de diluição e manuseio da amostra para possibilitar a detecção de hormônios dentro da faixa de sensibilidade do ensaio.

Neste estudo, apresentamos um protocolo visualizado que adapta kits ELISA comercialmente disponíveis para a detecção e quantificação de 17β-estradiol e testosterona em amostras de lágrimas humanas de baixo volume coletadas usando tubos microcapilares de vidro. Esse protocolo enfatiza modificações práticas na coleta de amostras, manuseio e preparação de ensaios para permitir a medição de hormônios reprodutíveis a partir de volumes de lágrimas limitados. Este trabalho foca em estabelecer um fluxo de trabalho viável para aplicar a metodologia ELISA existente à análise de fluidos de rasgão. Essa abordagem pode servir como base para futuros estudos que investiguem os níveis hormonais locais na superfície ocular.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Indiana (IRB#1908362633), e o consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes da coleta da amostra.

1. Coleção de Filmes Lacrimais

1. Preparação
   1. Determine o volume de rasgo a ser coletado, tendo em mente que 2 réplicas são necessárias para a confiabilidade estatística dos resultados do ELISA.
   2. Prepare um tubo microcentrífuga de 1,5 mL para armazenamento em filme lacrimal.
   3. Selecione tubos microcapilares apropriados para coletar lágrimas. Recomendo começar com 3,33 μL ou 5 μL e mudar para um tamanho menor se for coletar de um volume menor de lágrimas na superfície ocular.
   4. Prepare uma lâmpada de borracha de pressão fornecida com o kit de tubo microcapilar, para facilitar a transferência do fluido lacrimogêneo para um tubo de microcentrífuga.
2. Coleção de Lágrimas
   1. Instrua o participante a olhar para frente ou ligeiramente para cima.
   2. Coloque delicadamente a abertura do tubo microcapilar no menisco de laceração, próximo ao canto lateral, para coletar as rupturas basais.
   3. Minimize o contato com a conjuntiva bulbar e a margem da pálpebra para evitar ao máximo o rasgo reflexo.
   4. Encha o tubo com rasgos até encher.
   5. Se forem necessárias várias sessões de coleta, agende sessões com até 24 horas de diferença e em horários semelhantes ao longo do dia para minimizar a variabilidade dos níveis hormonais.
3. Armazenamento de lágrimas
   1. Ocluir o orifício no topo da lâmpada de borracha de aperto e depois insira o tubo microcapilar na lâmpada enquanto coloca prontamente a ponta aberta dentro do tubo da microcentrífuga para deixar as lágrimas fluírem pelo tubo microcapilar. Pode ser necessário comprimir o bulbo adicional para retirar o máximo possível da amostra de lágrima do tubo microcapilar.
   2. Feche a tampa do tubo da microcentrífuga para evitar a evaporação.
   3. Centrifuge o tubo usando um dispositivo microcentrífuga de bancada a 2.000 × g. por 3–5 segundos para deixar a amostra no fundo do tubo antes do armazenamento.
   4. Armazene a -80 °C para preservar a estabilidade do analito antes da análise.

2. Ensaio de testosterona

1. Prepare os Padrões de Testosterona, siga o protocolo
   1. Siga o protocolo do kit, certifique-se de que reagentes e equipamentos para preparar padrões, controles e amostras de testosterona estejam disponíveis.
   2. Reconstitua o padrão de testosterona com água deionizada ou destilada para obter uma solução padrão de 100 ng/mL. Garanta a reconstituição completa e deixe que ele permaneça por no mínimo 15 minutos.
   3. Prepare a testosterona padrão no dia da experimentação.
   4. Prepare 6 tubos de microcentrífuga para o padrão, com 900 μL de diluiente calibrador no tubo de 10 ng/mL e 400 μL nos tubos restantes.
   5. Pipete 100 μL de solução de estojo no primeiro tubo (tubo de 10 ng/mL), misture bem e troque a ponta da pipeta para a próxima transferência.
   6. Pipete 200 μL do primeiro tubo (tubo de 10 ng/mL) para o próximo tubo (3,33 ng/mL), misture bem, troque a ponta da pipeta para a próxima transferência e repita o passo até o último tubo (0,041 ng/mL).
   7. Nota: Após completar todas as etapas, devem existir 7 concentrações de padrões. O diluente calibrador serve como padrão zero (0 ng/mL). Cada padrão preparado é mais do que suficiente para duas réplicas.
2. Prepare controles de testosterona: Baixa, Média e Alta Concentração
   1. Reconstitua cada frasco com o volume de água deionizada ou destilada indicado no certificado de análise (COA) do kit de controle
   2. Dilua cada controle em 2 vezes no diluente do calibrador antes do uso no ensaio
3. Prepare amostras
   1. Retire amostras de lágrimas a -80 °C e coloque no gelo para descongelar.
   2. Uma vez que as amostras estejam totalmente descongeladas, centrifuge brevemente as amostras de rasgo para garantir que todas as amostras fiquem no fundo dos tubos em temperatura ambiente por 3 a 5 segundos.
   3. Misture 20 μL de amostra com 80 μL de diluiente calibrador para obter um volume total de 100 μL por replicada.
   4. Planeje dois poços replicados para o experimento para confiabilidade e poços de ligação não específica (NSB) para controle em segundo plano.
   5. Nota: Cada amostra é analisada em poços duplicados. Portanto, são necessários 40 μL de amostra de lágrima por participante para realizar o ensaio, misturando com 160 μL de diluiente calibrador para obter um volume total de 200 μL.
4. Procedimento de ensaio
   1. Prepare todos os reagentes, padrões de funcionamento, amostras de rasgo e controles.
   2. Remova os poços excedentes da estrutura da microplaca e restaure-os no pacote dessecante a 4 °C.
   3. Adicione 50 μL de Solução Primária de Anticorpos (de cor azul) a cada poço, excluindo poços designados para poços NSB. Cubra a placa com papel alumínio.
   4. Incube a placa em temperatura ambiente por 1 h em um microplaca oscilante orbital horizontal (órbita de 0,12") ajustado a 500 ± 50 rpm ou na configuração mais próxima disponível.
   5. Prepare um tampão de lavagem suficiente para um total de 8 lavagens, 400 μL/poço/lavagem (4 lavagens antes e 4 lavagens após a etapa de incubação de 3 horas).
   6. Aspire o conteúdo de cada poço e lave a placa 4 vezes com o buffer de lavagem.
   7. Adicione 100 μL de diluiente calibrador aos poços NSB e zero poços padrão.
   8. Adicione 100 μL de amostras padrão, controle e de lágrima preparadas aos poços designados.
   9. Adicione 50 μL do conjugado de testosterona em cada poço e misture bem pipetando.
   10. Incube em temperatura ambiente por 3 horas em um microplate shaker orbital horizontal (órbita de 0,12") ajustado em 500 ± 50 rpm ou na configuração mais próxima disponível.
   11. Aspire cada poço e lave 4 vezes usando o buffer de lavagem.
   12. Prepare a solução do substrato imediatamente antes do uso, misturando o Reagente de Cor A e o Reagente de Cor B na proporção 1:1. Aloque 200 μL por poço. Aspiração completa do tampão residual de lavagem antes da adição do substrato.
   13. Adicione 200 μL de solução de substrato em cada poço em até 15 minutos após a preparação. Incube por 30 minutos em temperatura ambiente na bancada. Proteja da luz cobrindo com papel alumínio.
   14. Adicione 50 μL de Solução de Stop a cada poço na mesma ordem da Solução de Substrato. Misture bem cada poço e a cor deve mudar de azul para amarelo.
   15. Meça a densidade óptica em 450 nm e 560 nm em até 30 minutos após adicionar a solução Stop usando um leitor de microplaca.
   16. Nota: As instruções do fabricante recomendam um comprimento de onda de referência de 540 nm ou 570 nm. Nesse protocolo, um comprimento de onda de 560 nm era usado como a opção mais próxima disponível no leitor de microplacas, para correção de sinal de fundo e imperfeições ópticas.
5. Cálculo
   1. Subtraia a densidade óptica medida em 560 nm (comprimento de onda de referência) da densidade óptica medida em 450 nm.
   2. Subtraia a densidade óptica média do NSB de cada leitura individual de padrões, amostras e controles, e então calcule a média de medições duplicadas.
   3. Gerar uma curva padrão ajustando os dados usando o modelo logístico de quatro parâmetros (4PL).
   4. Determine as concentrações de testosterona interpolando os valores das amostras a partir da curva padrão.
   5. Ajuste as concentrações calculadas aplicando um fator de diluição de 5 para considerar a diluição da amostra 1:5.
   6. Verifique a medição calculando o coeficiente de variação (CV) entre réplicas que não deve exceder 20%.
      1. Nota: %CV = (SD/média) × 100

3. Ensaio de Estradiol

1. Prepare padrões, controles e amostras de estradiol
   1. Siga o protocolo do kit, certifique-se de que reagentes e equipamentos estejam disponíveis para preparar padrões, controles e amostras.
   2. Deixe todos os reagentes e materiais atingirem a temperatura ambiente antes do uso.
   3. Prepare um reagente fresco no dia do experimento.
   4. Padrões e controles estão prontos para uso. Aliquota apenas a quantidade necessária para o ensaio atual para minimizar a contaminação e limitar as repetidas mudanças de temperatura durante o manuseio.
   5. Garantir que seis padrões (nº 0–5) sejam preparados, sendo o Padrão 0 representando 0 pg/mL, e inclua uma amostra controle fornecida com o kit.
   6. Descongele as amostras congeladas de -80 °C colocando-as no gelo.
   7. Centrifuge as amostras de rasgo para garantir que todas estejam no fundo do tubo.
2. Procedimento de ensaio
   1. Remova os poços excedentes da microplaca e restaure-os no pacote dessecante a 4 °C.
   2. Adicione 20 μL de padrões, controles e amostras nos poços.
   3. Nota: cada padrão e amostra deve ser ensaiado com 2 réplicas.
   4. Para garantir uma distribuição homogênea, misture cuidadosamente todos os padrões, controles e amostras imediatamente antes de pipetar nos poços.
   5. Adicione 160 μL de 17 beta conjugado estradiol-HRP nos poços de teste.
   6. Deixe um poço em branco para o substrato.
   7. Cubra o poço com papel alumínio antes de colocá-lo na incubadora. A solução nos poços pode evaporar para a folha de alumínio.
   8. Incube a 37 °C por 2 horas.
   9. Prepare o Wash Buffer com solução de lavagem 10X durante o tempo de incubação.
   10. Quando a incubação estiver concluída, retire o papel alumínio e aspire o líquido dos poços.
   11. Lave cada poço 3 vezes com o Wash Buffer. Deixe de molho > 5 segundos em cada ciclo de lavagem.
   12. Adicione 100 μL de Solução de Substrato TMB em todos os poços.
   13. Cubra toda a placa com papel alumínio e incube em temperatura ambiente por exatamente 30 minutos.
   14. Adicione 100 μL de Solução de Stop em todos os poços na mesma ordem e na mesma taxa da solução de substrato TMB adicionada anteriormente.
   15. Agite a microplaca suavemente e o reagente muda de azul para amarelo.
   16. Meça a absorção em 450 nm dentro de 30 minutos após adicionar a Solução de Stop.
3. Cálculo
   1. Subtraia a absorção do poço em branco das leituras de todos os padrões, amostras e controles para corrigir imperfeições de sinal de fundo e ópticas.
   2. Calcule a média das medições duplicadas.
   3. Gerar uma curva padrão de melhor ajuste usando logística de quatro parâmetros (4PL).
   4. Determine a concentração de estradiol interpolando os valores das amostras a partir da curva padrão..
   5. Verifique a medição calculando o coeficiente de variação (CV) entre réplicas que não deve exceder 20%.
      1. Nota: %CV = (SD/média) × 100.

4. Análise de Dados usando R e RStudio

1. Instale R e RStudio, e instale os pacotes necessários listados na Tabela de Materiais antes de realizar a análise de dados.
2. Importar medições de densidade óptica para padrões, controles e amostras para o software de análise.
3. Pré-processe os dados aplicando correção do comprimento de onda conforme especificado pelo ensaio. Depois, subtrair valores em branco ou NSB e calcular a média das medições duplicadas.
4. Ajuste uma curva padrão usando um modelo de regressão logística de quatro parâmetros (4PL), com concentração como variável independente e densidade óptica como variável de resposta.
5. Realize ajuste de curvas em R usando a função drm() do pacote drc, com o modelo especificado como fct = LL.4() para regressão 4PL, com dados de concentração e densidade óptica como entrada.
6. Verifique a qualidade do ajuste da curva (por exemplo, R² > 0,99 ou boa do ajuste aceitável) antes de interpretar as concentrações da amostra.
7. Calcule as concentrações hormonais por predição inversa usando a função ED() baseada na curva padrão ajustada, especificando a dose efetiva correspondente aos valores de densidade óptica amostrais com base no modelo ajustado.
8. Ajuste as concentrações calculadas aplicando o fator de diluição apropriado (por exemplo, ×5 para uma diluição 1:5).
9. Reporte as concentrações finais de hormônios nas unidades apropriadas (por exemplo, ng/mL ou pg/mL), garantindo consistência com a curva padrão, e exporte os dados processados para análise ou visualização posterior.

Resultados

Estudo do Filme Piloto Tear,

Um total de 20 mulheres (45–63 anos) foram incluídas neste estudo. A classificação de DED foi baseada em sintomas e pelo menos um sinal clínico de DED. Especificamente, todos os participantes da DED apresentaram um escore no Índice de Doença da Superfície Ocular (OSDI) > 12 e pelo menos um olho com tempo de ruptura da lágrima de fluoresceína (TBUT) de < 5 s ou escore de coloração por fluoresceína corneal (CFSS) de ...

Discussão

A coleta e análise de lágrimas permitem fácil acesso para avaliação científica da saúde da superfície ocular e identificação de potenciais biomarcadores^10,22. Nosso protocolo descreve a adaptação bem-sucedida dos métodos ELISA comumente usados para analisar amostras de filme lacrimal em busca de hormônios sexuais. Desenvolvemos esse método para abordar a principal limitação da análise de rasgos, o volume relativamente pequeno de ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
17 beta Estradiol ELISA Kit	Abcam	ab108667
Folha de alumínio	Reynolds Wrap	10900000154	Qualquer folha de alumínio disponível para cozinha para proteger reagentes da luz
Tubo microcapilar 3,33 μL	Drummond	1-000-0033	Inclui um bulbo de compressão para transferência de fluidos
Tubo microcapilar 5 μL	Drummond	1-000-0050	Inclui um bulbo de compressão para transferência de fluidos
Dispositivo de microcentrífuga	Benchmark Scientific	C1012
Tubo de microcentrífuga 1,5 mL	Fisher	05-408-129
Leitor de microplaca	Promega	GM3000
Agitador orbital de microplaca	Labnet International Inc.	S2030-1000-B
Linguagem de computador R	Posit Software, PBC (anteriormente RStudio Inc.)	R versão 4.5.1	Baixe a linguagem R antes do Rstudio através de https://cran.r-project.org/
Software RStudio	Posit Software, PBC (anteriormente RStudio Inc.)	RStudio 2023.06.1 Build 524 "Mountain Hydrangea"	https://posit.co/downloads/
Pacotes R "drc", "ggplot2", "patchwork", "ggpp", "dplyr", "readr", "tidyr", "writexl"	Posit Software, PBC (anteriormente RStudio Inc.)		Instale o pacote no Rstudio
Kit de controle de testosterona	R&D Parameter	QC165	Vendido separadamente do kit ELISA (KGE010)
Kit ELISA de testosterona	R&D Parameter	KGE010