Um modelo abrangente de RAT para avaliação de vias de transporte hepático por meio de amostragem simultânea linfática e vascular sanguínea

Resumo

Este protocolo experimental descreve um modelo de rato canulado por ducto linfático hepático que permite avaliação direta e quantitativa da drenagem linfática e vascular hepática. O modelo permite amostragem simultânea de sangue linfático hepático e sistêmico para investigar o transporte hepático, metabolismo e sinalização imunológica, apoiando estudos de farmacocinética de medicamentos e biologia específica do fígado.

Resumo

O fígado é um centro metabólico e imunológico central que processa nutrientes, xenobióticos e mediadores imunes circulantes. As substâncias chegam aos hepatócitos e outras células hepáticas pelos capilares senoidais que recebem sangue do intestino pela veia porta e da circulação sistêmica pela artéria hepática. O filtrado plasmático dos capilares senoidais drena para o espaço de Disse, onde pode passar por transformação metabólica, participar da vigilância imunológica ou fluir para vasos linfáticos formando linfa hepática. A amostragem de linfa hepática e sangue pode ajudar a possibilitar uma análise detalhada do transporte hepático, dos processos metabólicos e da atividade imunológica. É descrito um modelo cirúrgico de rato que permite amostragem simultânea do fluxo linfático hepático e do sangue sistêmico através de três locais distintos de canulação: ducto linfático hepático, artéria carótida e veia jugular. As canulagens linfáticas e arteriais hepáticas permitem a amostragem contínua, enquanto a cânula da veia jugular pode ser usada para hidratação contínua e suporte de líquidos ou para coleta venosa de sangue, permitindo a comparação entre sangue arterial e venoso. A canulação bem-sucedida gera taxas de fluxo linfático hepático de aproximadamente 0,1 mL/h em ratos anestesiados, permitindo amostragem linfática contínua de até 8 horas enquanto é realizada coleta simultânea de sangue arterial e venoso. Essa configuração permite a comparação direta entre o sangue arterial sistêmico e a saída linfática hepática, possibilitando um exame abrangente do transporte e eliminação hepática, bem como dos processos metabólicos e de sinalização imunológica. Para ampliar ainda mais o modelo, a amostragem terminal da artéria hepática e da veia porta pode ser realizada ao final do procedimento para permitir a comparação direta do fluxo hepático, da saída e do drenagem linfática. Em última análise, essas técnicas fornecem uma plataforma versátil para avaliar processos hepáticos, incluindo farmacocinética de medicamentos, fluxo e metabolismo de nutrientes, e respostas específicas do fígado, sob diversas condições fisiopatológicas.

Introdução

O fígado é um órgão metabólico e imunológico central responsável pelo processamento de nutrientes, desintoxicação de xenobióticos e vigilância imunológica. O fígado é o maior órgão produtor de linfa do corpo. Estudos em grandes mamíferos sugerem que ele contribui de 25% a 50% do fluxo linfático^{total 1,2}. Em roedores, estudos de canulação indicam que aproximadamente 10%–20% do fluxo linfático torácico total se origina no^{fígado 3,4}. A linfa hepática origina-se do plasma filtrado através do endotélio fenestrado dos capilares senoidais dentro do parênquima hepático. Esse filtrado se acumula no espaço de Disse, um compartimento intersticial entre hepatócitos e células endoteliais sinusoidais. O filtrado então passa pelo espaço do Mall em capilares linfáticos portais que convergem em vasos coletores que drenam em direção ao hilo hepático e à cisterna^{quília 5,6}.

O sistema linfático hepático é anatomicamente dividido em redes portal, subcapsular e sublobular ^6,7. Estudos recentes de imagem volumétrica demonstram que os linfáticos hepáticos formam uma rede altamente ramificada dependente do Fator de Crescimento Endotelial Vascular C (VEGF-C), em grande parte confinada aos tratos porta. Essa rede é composta predominantemente por capilares linfáticos que drenam retrogradamente em direção à veia porta. Por outro lado, os linfáticos subcapsular e sublobular, distribuídos ao longo da superfície hepática e nas regiões venosas centrais, respectivamente, são vias adicionais de drenagem. Imagens post-mortem humanas revelaram ainda uma densa rede de vasos linfáticos ao longo das veias hepáticas, indicando que as linfáticas venosas periportal e hepática regulam conjuntamente a saída linfática^{hepática 8}.

A linfa hepática representa um ultrafiltrado derivado do plasma que reflete tanto os processos metabólicos quanto os imunológicos ^9,10. Análises bioquímicas demonstram que a linfa hepática contém albumina, lipoproteínas, citocinas e metabólitos derivados da atividade parênquima^{hepática 3,4,6}, consistente com o perfil proteômico geral do líquido linfático relatado^{em outros tecidos 10}. Estudos iniciais demonstraram que a linfa hepática contém classes distintas de lipoproteínas, sendo as lipoproteínas de alta densidade (HDL) representando uma fração dominante, consistente com o papel central do fígado na síntese e remodelação do^{HDL 11}. Notavelmente, trabalhos mais recentes mostraram que a linfa hepática é enriquecida em HDL e ésteres de colesterol em comparação com a linfa mesentérica, destacando sua contribuição distinta para o tráfego lipídico e o transporte reverso do colesterol³. Além disso, a linfa hepática atua como um condutor imunológico, transportando mediadores imunes, células apresentadoras de antígenos e vesículas extracelulares que ligam microambientes hepáticos à imunidade^{sistêmica 9}.

Alterações na formação e drenagem da linfa hepática são características fundamentais da doença hepática. Na cirrose e hipertensão portal, pressão senoidal elevada provoca um aumento múltiplo na produção linfática, levando a linfangiectasia, fibrose e ascite quando a capacidade de drenagem é ultrapassada. A lesão hepática crônica também promove a linfangiogênese dependente de VEGF-C/VEGFR-3, com remodelação linfática excessiva ou aberrante contribuindo para inflamação hepática, edema e acúmulo^{de lipídios 9,12}. Além disso, na doença hepática esteatótica associada a disfunção metabólica (MASLD) e no carcinoma hepatocelular, o aumento da densidade linfática hepática demonstrou correlacionar-se com a progressão da doença e metástase^13,14.

Apesar do papel fisiológico e clínico central da linfa hepática, ela permanece pouco estudada e pouco explorada em pesquisas experimentais, principalmente devido a desafios técnicos no isolamento da linfa hepática pura. Modelos de coleta linfática torácica e mesentérica foram mais amplamente descritos, mas eles fornecem apenas insights indiretos sobre os mecanismos de transporte hepático. Uma limitação no campo foi abordada desenvolvendo um modelo de canulação linfática hepática em ratos, que permitiu a coleta direta da linfa^{hepática 4}. Com essa abordagem, foi demonstrado que a maior parte da absorção linfática de proteínas terapêuticas administradas por via intravenosa ocorre no fígado e no mesentério. Esses achados destacam a linfa hepática como uma via chave para a troca macromolecular entre o sangue e os sistemas linfático, com importantes implicações para a farmacocinética e a distribuição de terapias^{biológicas 4}.

Para preencher lacunas remanescentes, o presente estudo descreve um modelo abrangente de ratos que permite amostragem simultânea de sangue linfático hepático e sistêmico por meio da canulação do ducto linfático hepático, artéria carótida e veia jugular. Essa abordagem permite a avaliação em tempo real do transporte e troca de solutos entre compartimentos intersticial e sistêmicos hepáticos, fornecendo uma plataforma experimental robusta para investigar o transporte hepático, metabolismo, sinalização imune e disposição de fármacos sob condições fisiológicas e patológicas. O modelo também inclui amostragem terminal opcional da artéria hepática e da veia porta para permitir a comparação direta do fluxo hepático, fluxo de saída e drenagem linfática.

Figura 1. Esquema do modelo de múltiplas canulações para amostragem simultânea linfática e de sangue. Um modelo abrangente de canulação ilustrando amostragem simultânea da artéria carótida, veia jugular, artéria hepática, ducto linfático hepático e veia porta. (A) A artéria carótida é canulada para amostragem intermitente de sangue. (B) A veia jugular externa é canulada para infusão contínua de soro fisiológico para manter a hidratação e compensar a perda de fluido durante a amostragem. (C) A artéria hepática comum, que corre paralela ao ducto linfático hepático, é canulada para amostragem terminal de sangue. (D) O ducto linfático hepático é canulado para coleta contínua de linfa. (E) A veia porta é acessada por perfuração com agulha para amostragem terminal de sangue. Os procedimentos apresentados em (A), (B) e (D) são realizados antes da amostragem terminal, seguidos por (C) amostragem da artéria hepática e, posteriormente, amostragem da veia porta (E). Abreviações: EJV, veia jugular externa; CA, artéria carótida; SVC, veia cava superior; VCI, veia cava inferior; Ao, aorta; CHA, artéria hepática comum; HL, ducto linfático hepático; ML, ducto linfático mesentérico; AME, artéria mesentérica superior; PV, veia porta. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Instituto Monash de Ciências Farmacêuticas (ID de Ética #46283) e conduzidos em estrita conformidade com as diretrizes do Conselho Australiano e da Nova Zelândia para o Cuidado dos Animais em Pesquisa e Ensino (ANZCCART) e com o Código Australiano para o Cuidado e Uso de Animais para Fins Científicos (Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica, Austrália)¹⁵.

Modelos animais: Ratos albinos Rattus norvegicus , machos ou fêmeas, ou ratos Sprague–Dawley (SD) pesando entre 250 e 350 g foram usados. Os animais foram obtidos de fornecedores licenciados de laboratório (Monash Animal Research Platform) e alojados em gaiolas ventiladas individualmente sob temperatura controlada (22 ± 2 °C) e em um ciclo de 12 horas de luz e escuridão, com acesso livre a comida e água antes da experimentação. Os animais foram aclimatados por pelo menos uma semana antes da cirurgia para minimizar a variação fisiológica relacionada ao estresse.

É descrito um modelo de canulação hepática do ducto linfático, artéria carótida e veia jugular que permite amostragem simultânea de sangue linfático hepático e sistêmico. A amostragem opcional de amostragem terminal da artéria hepática e da veia porta pode ser realizada sob anestesia para análise comparativa do fluxo hepático e do fluxo linfático. Os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparativos no dia anterior à cirurgia

1. Jejue o rato durante a noite, se necessário para o protocolo experimental específico. Garanta acesso livre à água o tempo todo.
2. Prepare soro fisiológico estéril para infusão intravenosa durante a coleta linfática. Determine o volume necessário com base na duração da coleta (tipicamente 3–5 horas) e na taxa sugerida de infusão de 1,5–3,0 mL/h para substituir a perda de líquido devido à coleta de linfa e sangue, bem como perdas fisiológicas, como a saída de urina.
3. Prepare três cânulas de polietileno para canulação do ducto linfático hepático, artéria carótida e veia jugular da seguinte forma:
   1. Ducto linfático hepático
      1. Corte uma cânula de 0,8 mm de diâmetro externo (O.D.) e 0,5 mm de diâmetro interno (I.D.) para 30–35 cm. Certifique-se de que o comprimento permita a coleta sem tensão.
      2. Bisel a ponta de inserção a aproximadamente 45° com uma lâmina cirúrgica estéril para facilitar a inserção.
   2. Artéria carótida
      1. Corte uma cânula de 0,8 mm de divisão ocular e 0,5 mm de divisão direta para 20–30 cm. Marque aproximadamente 2–2,5 cm a partir da extremidade interna para indicar a profundidade de inserção.
   3. Veia jugular
      1. Corte uma cânula de 0,8 mm de divisão direta, 0,5 mm de diâmetro interior ou 0,96 mm de divisão direta, 0,58 mm de diâmetro interior para 50 cm ou mais. Marque 1–1,5 cm a partir da extremidade interna para a profundidade de inserção. Certifique-se de que o comprimento possa alcançar a bomba de infusão sem tensão.
4. Prepare uma solução anticoagulante que consista em 0,1% de EDTA em água estéril ou 20 UI/mL de heparina em soro fisiológico estéril.
5. Encha uma seringa de 1 mL com solução anticoagulante e prenda uma agulha de 25G nas cânulas O.D. de 0,8 mm ou uma agulha de 23G nas cânulas O.D. de 0,96 mm.
6. Lave cada cânula com aproximadamente três vezes seu volume interno, garantindo que não restem bolhas de ar.
7. Mantenha as cânulas cheias de anticoagulante e tapadas com a agulha e a seringa durante a noite. A pré-imersão com um anticoagulante minimiza a formação de coágulos.
8. Prepare tubos coletores para sangue e linfa. Adicione solução anticoagulante para alcançar uma concentração final de 1 mg/mL de EDTA ou 10 IU/mL de heparina após a coleta da amostra.

2. Preparativos imediatamente antes da cirurgia

1. Lave todas as cânulas com anticoagulante para confirmar a permeabilidade. Certifique-se de que não haja bolhas de ar.
2. Induza anestesia no rato com 5% de isoflurano em oxigênio a 1 L/min em uma câmara de indução.
3. Monitore a respiração e certifique-se de que a frequência tenha desacelerado para aproximadamente 1,5 respiração por segundo (aproximadamente 90 respirações/min), indicando profundidade anestésica adequada.
   ATENÇÃO: O isoflurano é um anestésico volátil e deve ser usado dentro de um sistema anestésico devidamente ventilado ou exaustor de fumo para minimizar a exposição ocupacional.
4. Transfira o rato para uma almofada cirúrgica aquecida (37°C) e mantenha a anestesia com 1–3% de isoflurano em oxigênio entregue a 0,4–0,6 L/ min via um cone nasal.
5. Confirme profundidade anestésica adequada pela ausência de reflexos corneanos e de beliscão dos dedos. Mantenha a anestesia durante todo o procedimento cirúrgico e o período de coleta linfática.
   NOTA: A anestesia contínua é essencial para prevenir a dor durante a cirurgia e evitar o deslocamento da cânula devido ao movimento.
6. Raspe as regiões cirúrgicas, incluindo o quadrante abdominal direito (da linha média ao flanco direito, aproximadamente 2 cm abaixo da caixa torácica) e a região clavicular direita ou esquerda.
7. Desinfete todas as áreas cirúrgicas usando clorexidina 0,5% seguida de etanol a 70%.

3. Cânula da artéria carótida

NOTA: A canulação da artéria carótida pode ser realizada antes ou depois da canulação da veia jugular.

1. Mantenha a mesma posição dorsal e incisão cervical.
2. Coloque um pequeno suporte (por exemplo, seringa de 3 mL) abaixo do pescoço para elevar a região carotídea.
   NOTA: Esta etapa é opcional.
3. Separe os músculos do pescoço para expor a artéria carótida aproximadamente 1 cm abaixo da superfície da pele.
4. Isole a artéria usando uma pinça de íris curva. Identifique e separe suavemente o nervo vago adjacente para evitar danos ao nervo.
5. Coloque pinças Graefe retas sob a artéria para ocluir o fluxo sanguíneo e passe dois pontos de seda 4-0 por baixo. Amarre firmemente o ponto proximal (craniano).
6. Faça uma pequena incisão na superfície da artéria.
7. Levante suavemente a aba do vaso com a ponta da pinça da lente para estabilizar o lúmen do vaso para a inserção da cânula.
8. Insira a cânula na profundidade pré-marcada de 2 a 2,5 cm. Espere um leve retorno de água; Se for excessivo, volte a ocluir e limpe antes de prosseguir.
   ATENÇÃO: A punção e canulação vascular envolvem instrumentos afiados e devem ser realizados com cuidado para evitar lesões acidentais.
9. Confirme a colocação correta retirando suavemente um pequeno volume de sangue e infundindo solução anticoagulante de volta na cânula sem sentir resistência ou observar inchaço subcutâneo.
10. Fixe a cânula com pontos e feche a extremidade externa com um plugue.
11. O procedimento pode ser pausado brevemente após a canulação da artéria carótida, mantendo a anestesia.
12. Feche o ferimento no pescoço com suturas estéreis. Uma visão geral do isolamento da artéria carótida e da canulação bem-sucedida é mostrada na Figura 2.

Figura 2: Canulação da artéria carótida. (A) Os músculos do pescoço pareados que flanqueiam a artéria carótida (setas laranja). A glândula salivar (setas azuis) está encaixada cranialmente. (B) A artéria carótida exposta está aproximadamente 1 cm abaixo da superfície da pele. A glândula salivar (setas azuis) está encaixada cranialmente. (C) Preparação cirúrgica antes da inserção da cânula, mostrando oclusão do fluxo sanguíneo com pinças Graefe retas e dois pontos de seda isolando a artéria, com sua extremidade superior amarrada. (D) Aproximadamente 2 cm da cânula são inseridos com sucesso na artéria carótida (setas amarelas). A cânula da artéria carótida é indicada pelas setas verdes. (E) A canulação bem-sucedida da artéria carótida foi confirmada pela coleta de sangue para dentro da cânula. (F) Três pontos (tamanho 4-0) são amarrados ao redor da artéria carótida e da cânula para fixação (setas roxas). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Cânula da veia jugular

1. Posicione o rato em reclinação dorsal com o pescoço estendido e a cabeça levemente virada para a esquerda.
2. Identifique a veia jugular acima da clavícula por sua localização e fluxo sanguíneo visível. Faça uma incisão oblíqua de 1 a 1,5 cm da clavícula em direção à traqueia.
3. Dissece de forma direta o tecido subcutâneo para expor a veia.
4. Separe a veia do tecido conjuntivo ao redor usando uma pinça de íris curva. Confirme o isolamento passando pinças por baixo da veia.
5. Coloque dois pontos de seda 4-0 sob a veia em cada extremidade do segmento exposto. Amarre firmemente o ponto craniano (superior) para ocluir o fluxo sanguíneo.
6. Para evitar o retorno de sangue, coloque pinças Graefe retas sob a veia e apoie as alças sobre uma seringa ou suporte.
7. Faça uma pequena incisão (~1 mm) no topo da veia, um terço ao longo do segmento isolado, usando tesoura de íris.
8. Levante suavemente a aba do vaso com a ponta da pinça da lente para estabilizar o lúmen do vaso para a inserção da cânula.
9. Insira a ponta da cânula na incisão usando uma pinça de íris e avance até a profundidade pré-marcada (1–1,5 cm).
10. Libere a oclusão assim que a cânula estiver estabilizada para permitir o fluxo sanguíneo.
    NOTA: Mantenha uma pegada estável para evitar o refluxo venoso. Se ocorrer sangramento, volte a ocluir imediatamente e limpe o campo antes de prosseguir.
11. Confirme a colocação correta retirando suavemente um pequeno volume de sangue e infundindo solução anticoagulante de volta na cânula sem sentir resistência ou observar inchaço subcutâneo.
12. Fixe a cânula com pontos em ambas as extremidades proximal e distal.
13. Obstrua temporariamente o tubo externo, remova a seringa e sele a cânula com um tampão.
14. Cubra a incisão com gaze umedecida com soro salino morno até que a canulação da artéria carótida esteja completa. Imagens representativas do isolamento e canulação da veia jugular são mostradas na Figura 3.

Figura 3: Canulação da veia jugular. (A) A veia jugular (contorno preto pontilhado) está localizada logo abaixo da pele, acima da clavícula. A cânula da artéria carótida estabelecida pode ser observada próxima à veia jugular (setas verdes). (B) A veia jugular é isolada com duas suturas de seda; a extremidade superior é amarrada. (C) Aproximadamente 1 cm da cânula é inserido com sucesso na veia jugular (setas amarelas). A cânula da veia jugular é indicada pelas setas azuis; A cânula da artéria carótida é indicada pelas setas verdes. (D) Três pontos (tamanho 4-0) são amarrados ao redor da veia jugular e da cânula para fixação (flechas roxas). A canulação bem-sucedida da veia jugular foi confirmada por injeção de soro fisiológico suave. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

5. Canulação do ducto linfático hepático

1. Posicione o rato em reclinação dorsal sob um microscópio cirúrgico.
2. Faça uma incisão horizontal cutânea de 4–5 cm da linha média até o flanco direito, aproximadamente 1,5–2 cm abaixo da caixa torácica (Figuras 4A, B).
3. Retraa a pele e faça incisões correspondentes nos músculos oblíquos externo e interno.
4. Cauterize ou liga quaisquer grandes vasos sanguíneos encontrados para evitar perda excessiva de sangue.
5. Reposicione suavemente os órgãos usando cotonetes umedecidos com soro: mova o fígado em direção ao diafragma, o estômago para a esquerda e o intestino delgado para baixo.
6. Mantenha os órgãos retraídos com gaze embebida em soro. O local da incisão e a posição dos órgãos estão ilustrados na Figura 4C.
7. Identifique o ducto linfático hepático (diâmetro ~0,6 mm) usando marcos anatômicos estabelecidos. O ducto corre paralelo e levemente caudal à artéria hepática, situando-se medial ao rim direito e adjacente à veia cava inferior.
8. Observe a aparência do ducto linfático hepático. Normalmente parece translúcida e estreita.
9. Distinga o ducto linfático hepático do ducto linfático mesentérico, que é maior e geralmente parece opaco ou branco devido ao conteúdo de quilomicrôn. O ducto linfático mesentérico pode, portanto, servir como um marco anatômico para auxiliar na identificação do ducto linfático hepático localizado cranialmente.
10. Remova o tecido conjuntivo sobre o ducto linfático e a veia cava usando pinças Graefe retas.
11. Crie uma passagem sob a veia cava inserindo pinças Graefe retas através da cama adiposa sob o rim direito. Avance até que as pontas surjam do lado oposto abaixo da veia cava, paralela ao ducto linfático hepático.
12. Segure a extremidade externa da cânula preparada com a pinça Graefe reta e puxe-a pelo túnel criado sob a veia cava até que a ponta surja do lado oposto.
13. Usando a pinça hemostática Halsted-Mosquito, dobre a ponta de uma agulha de 25G até aproximadamente 90°. Usando a agulha dobrada, perfure o ducto linfático hepático do lado direito (mais próximo do operador).
    ATENÇÃO: Tenha cuidado ao manusear agulhas afiadas durante a perfuração do ducto linfático para evitar lesões acidentais.
14. Certifique-se de que a cânula esteja cheia de solução anticoagulante sem bolhas de ar. Insira a extremidade chanfrada aproximadamente 2 mm no duto.
15. Observe a extremidade externa da cânula para o fluxo linfático (~ 100 μL/h). Se não houver fluxo, ajuste ou reinsira a cânula.
16. Uma vez confirmado o fluxo linfático, tape a cânula antes de aplicar uma pequena gota de adesivo veterinário para fixar o local de inserção. Uma vez seco, confirme o fluxo linfático pelo tubo.
17. Remova a gaze e devolva os órgãos às suas posições originais.
18. Coloque o tubo de coleta contendo a solução anticoagulante abaixo da saída da cânula. Confirme que a linfa está fluindo em direção à gota, para dentro do tubo.
19. Feche a parede abdominal suturando sequencialmente as camadas oblíqua interna, oblíqua externa e da pele. A identificação e a canulação bem-sucedida do ducto linfático hepático são mostradas na Figura 5.
    NOTA: Após a canulação hepática bem-sucedida do ducto linfático, o procedimento pode ser pausado brevemente enquanto a anestesia e a hidratação são mantidas antes do início da coleta linfática.

Figura 4: Exposição aos ductos linfáticos hepáticos. (A) Marco anatômico indicando 1,5–2 cm abaixo da caixa torácica direita para incisão. (B) Incisão através da pele e dos músculos abdominais, expondo os órgãos internos. (C) Órgãos reposicionados para expor o ducto linfático hepático. O fígado é deslocado em direção ao diafragma, o estômago à esquerda do animal, e o intestino delgado está recolhido para baixo. O ducto linfático hepático está localizado entre a artéria hepática (seta verde) e a artéria mesentérica (seta azul). L: fígado; SI: intestino delgado; VCI: veia cava inferior; RK: rim direito. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Identificação e canulação do ducto linfático hepático. (A) As estruturas linfática e arterial podem ser observadas após o reposicionamento dos órgãos e antes da remoção do tecido conjuntivo ao redor. A artéria hepática (setas verdes) está localizada cranialmente em relação ao ducto linfático hepático adjacente (setas amarelas). O ducto linfático mesentérico (setas roxas) está localizado acima da artéria mesentérica (contorno preto pontilhado). Essas estruturas correm perpendicularmente à veia cava inferior. VCI: veia cava inferior; RK: rim direito. (B) O ducto linfático hepático (setas amarelas) pode ser visualizado claramente após a remoção do tecido conjuntivo ao redor. O ducto linfático hepático corre paralelo à artéria hepática (contorno pontilhado em verde) e cranialmente em relação ao ducto linfático mesentérico (setas roxas) e à artéria mesentérica (contorno pontilhado preto). (C) A cânula (setas brancas) é inserida no ducto linfático hepático (setas amarelas) por meio da pequena perfuração feita no ducto linfático (setas laranja). O ducto linfático mesentérico (setas azuis) pode ser visualizado. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

6. Período pós-cirúrgico

1. Imediatamente após a canulação linfática hepática bem-sucedida, inicie a reidratação infundindo soro fisiológico estéril a 1,0–2,0 mL/h através da cânula da veia jugular.
2. Mantenha a infusão durante toda a coleta de linfa. Alternativamente, a reidratação pode ser realizada por meio de cânula gástrica ou duodenal, permitindo que a cânula da jugular seja reservada para coleta venosa de sangue, se necessário.
3. Mantenha o animal sob anestesia em uma almofada cirúrgica aquecida (37°C) durante todo o período de coleta.
4. Monitore a frequência respiratória e a profundidade anestésica durante todo o experimento, observando padrões respiratórios e respostas reflexas, mantendo a anestesia isoflurana por meio de um cone nasal.
5. A hidratação foi mantida por meio de infusão contínua de soro fisiológico (1,0–2,0 mL/h) via cânula da veia jugular.
6. Para minimizar distúrbios fisiológicos, o volume total de sangue coletado antes da amostragem terminal foi limitado a <10% do volume sanguíneo circulante estimado, de acordo com as diretrizes institucionais de ética animal.
7. Colete linfa hepática continuamente em tubos contendo anticoagulantes. Troque os tubos de coleta a cada hora ou conforme necessário.
8. Colete amostras de sangue arterial em pontos de tempo designados:
   1. Oclua temporariamente o tubo externo e prenda uma seringa vazia.
   2. Retire sangue até que o tubo esteja preenchido.
   3. Substitua a seringa por uma nova para coleta de amostras e retire aproximadamente 100–200 μL de sangue arterial em cada ponto designado para a amostragem.
   4. Lave a cânula com solução anticoagulante após cada coleta.
   5. Sele a cânula com um plugue.
9. Após a coleta da amostra, proceda à amostragem terminal da artéria hepática e da veia porta ou mate o rato humanamente com pentobarbitona de sódio (>100 mg/kg) via cânula carotídea ou jugular.

7. Amostragem terminal da artéria hepática e da veia porta

1. Ao final da coleta de linfa e sangue, mantenha anestesia profunda e garanta respiração estável antes de prosseguir com a amostragem vascular terminal.
2. Reabra cuidadosamente a incisão abdominal para expor a cavidade superior abdominal.
3. Retraa suavemente o fígado em direção ao diafragma, o estômago à esquerda e o intestino delgado para baixo, usando gaze umedecida com soro para revelar o ducto linfático hepático canulado.
4. Identifique a artéria hepática, que corre paralela e caudal ao ducto linfático hepático.
   NOTA: A artéria parece menor e mais pálida que a veia porta e apresenta um fluxo mais pulsátil.
5. Prepare uma cânula de polivinil de 0,61 mm de D.O., 0,28 mm I.D., pré-preenchida com solução anticoagulante e livre de bolhas de ar.
6. Usando pinças de íris curvas, isole um segmento curto da artéria hepática e coloque um ponto de seda 4-0 abaixo dele.
7. Levante delicadamente a artéria e coloque um segundo ponto distal à primeira. Amarre a sutura distal para controlar o retorno, deixando a sutura proximal solta para fechamento posterior.
8. Usando uma microtesoura de ponta fina, faça uma pequena incisão transversal (aproximadamente 0,5 mm) na parede arterial entre os pontos.
9. Levante suavemente a aba do vaso com a ponta da pinça Dumont para estabilizar o lúmen do vaso para a inserção da cânula.
10. Insira a extremidade chanfrada da cânula de polivinil na abertura e avance aproximadamente 2–3 mm.
11. Assegure a cânula amarrando o ponto proximal ao redor tanto do vaso quanto da cânula.
12. Confirme a colocação correta observando o fluxo sanguíneo pulsátil para a cânula ou aspirando suavemente uma pequena quantidade de sangue arterial vermelho brilhante.
13. Colete 0,5–1 mL de sangue em um tubo pré-marcado contendo anticoagulante.
14. Após a coleta, retirar a cânula e realizar a hemostase apertando ambas as suturas. A exposição da artéria hepática e o procedimento de canulação estão ilustrados na Figura 6.
15. Identifique a veia porta, que corre medial e perpendicular à artéria hepática. A veia porta tem diâmetro maior e coloração mais escura em comparação com a artéria hepática.
16. Coloque uma agulha de 23G ou 25G em uma seringa de 1 mL, pré-lavada com solução anticoagulante.
17. Insira o bisel da agulha na veia porta em um ângulo raso (aproximadamente 20°–30°) para evitar o colapso ou rasgamento do vaso.
18. Aspire suavemente o volume sanguíneo necessário.
19. Como a punção da veia porta é terminal, o animal é eliminado humanamente imediatamente após a coleta da amostra, administrando >100 mg/kg de pentobarbitona sódica via cânula carótida ou jugular enquanto o animal permanece sob anestesia profunda. A localização da veia porta e o método de amostragem terminal são mostrados na Figura 7.
    ATENÇÃO: A pentobarbitona sódica é uma substância controlada e deve ser manuseada e administrada de acordo com as regulamentações institucionais e os procedimentos de segurança adequados.
20. Confirme a morte por cessação da respiração e da atividade cardíaca antes do descarte do cadáver, de acordo com o Código Australiano para o Cuidado e Uso de Animais para Fins Científicos (NHMRC) ¹⁵ e as diretrizes ANZCCART.

Figura 6: Identificação e canulação da artéria hepática. (A) Exposição da artéria hepática (setas verdes). A artéria hepática está localizada adjacente ao ducto linfático mesentérico (contorno preto pontilhado) e perpendicular à veia cava inferior. VCI: veia cava inferior; L: fígado. (B) Isolamento da artéria hepática usando pinças curvas. (C) Inserção bem-sucedida (setas roxas) da cânula de polivinil de 0,61 mm × 0,28 mm (setas laranja) na artéria hepática (setas verdes), fixada com suturas de seda 4-0 para amostragem terminal de sangue arterial. O ducto linfático mesentérico (contorno preto pontilhado) pode ser visualizado. PV: veia porta. (D) Após a segurança da cânula, a permeabilidade da cânula é confirmada ao extrair sangue para dentro da cânula. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 7: Identificação da veia porta e amostragem terminal. (A) A veia porta (indicada pela agulha 25G) fica entre a artéria hepática (contorno pontilhado branco) e o ducto biliar (contorno pontilhado preto). A veia porta parece maior e mais escura que a artéria hepática e é acessada sob anestesia profunda para coleta terminal de sangue. PV: veia porta; VCI: veia cava inferior; L: fígado; SI: intestino delgado; RK: rim direito. (B) Inserção bem-sucedida da agulha 25G na veia porta (contorno preto pontilhado) para amostragem venosa terminal de sangue. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Resultados

A abordagem cirúrgica descrita na seção de Protocolo permite a identificação clara do ducto linfático hepático, localizado medial ao rim direito e correndo paralelo às artérias celíaca e hepática, conforme já^{relatado 4}. Anatomia representativa e canulação são mostradas na Figura 5. A canulação bem-sucedida é confirmada pelo aparecimento imediato de líquido linfático claro a levemente turvo, livre de contaminação por quilomicrôns leitosos, sugerindo mistura mínima com a linfa mesentérica. Essa observação é consistente com as características relatadas da linfa^{hepática 3}. A identificação da linfa hepática baseava-se em sua posição anatômica em relação à artéria hepática e à veia cava inferior, bem como em sua aparência clara característica, em contraste com a aparência tipicamente opaca ou leitosa da linfa mesentérica.

O fluxo linfático hepático deve permanecer estável durante todo o período de coleta, com uma taxa média de aproximadamente 0,1 mL/^{h 3,4,11}. O fluxo linfático hepático normalmente permanece mais estável por aproximadamente 2–3 horas após a canulação sob condições anestesiadas, embora períodos de coleta mais longos (até ~6–8 horas) possam ser alcançados sob condições experimentais ideais. Os valores representativos do fluxo linfático relatados em estudos anteriores⁴ são resumidos na Tabela 1. O fluxo linfático hepático geralmente é menor do que o relatado para taxas de fluxo dos ductos linfáticos mesentéricos e torácicos em ratos anestesiados.

Locais linfáticos (estado consciente)	Taxa média de fluxo linfático (mL/h)
Linfa torácica (consciente)	1,74 ± 0,33
Linfa torácica (anestesiada)	0,65 ± 0,10
Linfa mesentérica (anestesiada)	0,45 ± 0,11
Linfa hepática (anestesiada)	0,12 ± 0,02

Tabela 1: Taxas médias de fluxo linfático (mL/h) através de canulações dos ductos linfáticos torácicos, mesentéricos e hepáticos em ratos conscientes e anestesiados. Os dados são apresentados como média ± SEM para n = 3–5 ratos. Adaptado da Tabela 3 em Yadav et al. (2018)⁴.

Desfechos representativos ilustrando o transporte linfático de macromoléculas são mostrados na Figura 8. Esses exemplos demonstram como o modelo pode ser usado para avaliar a recuperação linfática após administração intravenosa de macromoléculas terapêuticas, incluindo aproximadamente 60 kDa interferon pegilado α2a (IFN-PEG40), aproximadamente 31 kDa interferon pegilado α2b (IFN-PEG12) e o anticorpo monoclonal trastuzumabe, sugerindo que o fígado é um importante local de extravasação e acesso linfático para terapias^{macromoleculares 4}.

Figura 8: Recuperação linfática de terapias macromoleculares administradas por via intravenosa em linfa torácica, mesentérica e hepática. Porcentagem total de dose recuperada na linfa torácica, mesentérica e hepática após administração intravenosa de interferons PEGilados de diferentes tamanhos moleculares (IFN-PEG12 e IFN-PEG40) e um anticorpo monoclonal (trastuzumabe). Os dados representam a média ± SEM de recuperação de dose ao longo de 8 horas. Adaptado de Yadav et al. (2018)⁴. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

O modelo também permite um perfil detalhado de lipoproteínas da linfa^{hepática 3}. Análises representativas da composição lipídica linfática são mostradas na Figura 9. Comparada à linfa torácica e mesentérica, a linfa hepática apresenta um teor lipídico total marcadamente menor, mas concentrações de proteínas comparáveis às de outras fontes linfáticas. A análise de lipoproteínas da linfa hepática destaca o papel único do fígado no tráfego lipídico e no transporte reverso do colesterol. Dados representativos da composição lipídica são resumidos na Tabela 2. A linfa hepática HDL é enriquecida em ésteres de colesteril, a linfa mesentérica HDL é predominantemente rica em triglicerídeos, e a linfa torácica HDL contém um teor relativamente maior de fosfolipídios. Essas diferenças composicionais indicam papéis distintos de cada fonte linfática no metabolismo e transporte lipídico.

	%wt/wt
Frações	Fosfolipídios	Colesterol livre	Éster de colesteril	Triglicerídeos
Linfa mesentérica
D-HDL	20 ± 3	1 ± 0	5 ± 1	16 ± 1
L-HDL	21 ± 4	2 ± 0	8 ± 2	23 ± 5
Linfa hepática
D-HDL	24 ± 1	3 ± 0	12 ± 3	8 ± 1
L-HDL	23 ± 1	6 ± 1	13 ± 2	14 ± 2
Linfa torácica
D-HDL	25 ± 1	1 ± 0	7 ± 0	11 ± 3
L-HDL	29 ± 1	2 ± 0	11 ± 1	11 ± 0
Plasma
D-HDL	29 ± 2	2 ± 0	20 ± 3	2 ± 0
L-HDL	36 ± 6	2 ± 0	18 ± 3	4 ± 1

Tabela 2: Composição lipídica das frações de lipoproteínas de alta densidade (D-HDL) e leves (L-HDL) isoladas de linfa mesentérica, hepática e torácica, e plasma. Os valores representam a porcentagem em peso (% em peso/peso) de fosfolipídios, colesterol livre, éster de colesterol e triglicerídeos em relação à fração lipídica total. Os dados são apresentados como média ± SEM. Adaptado da Tabela 1 em Gracia et al. (2020)³.

Figura 9: Composição proteica e lipídica da linfa mesentérica, hepática e torácica. Conteúdo proporcional de proteína e lipídio total na linfa mesentérica, hepática e torácica. O teor lipídico inclui fosfolipídeos (PL), triglicerídeos (TG), ésteres de colesterol (CE) e colesterol livre (CF), expressos como a porcentagem do peso lipídico em relação ao peso total de proteínas e lipídios. Os dados são apresentados como média ± SEM. Adaptado de Gracia et al. (2020)³. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

A canulação do ducto linfático hepático é um procedimento tecnicamente difícil, mesmo para microcirurgiões experientes. Vários passos críticos podem aumentar a probabilidade de preservar a integridade dos ductos linfáticos e alcançar um fluxo linfático estável. Ao identificar e isolar o ducto linfático hepático (etapas do protocolo 5.7-5.10), o passo inicial é remover o tecido conjuntivo e a gordura que cobrem o ducto linfático mesentérico e a veia cava próximas ao ducto linfático hepático. O ducto linfático hepático é translúcido e frágil em comparação com o ducto linfático mesentérico, mais grosso e opaco, e pode ser facilmente rompido se manuseado diretamente. O ducto linfático mesentérico serve como um marco anatômico útil, pois a limpeza do tecido sobrejacente revela o ducto linfático hepático localizado superiormente. Como o ducto linfático hepático frequentemente apresenta dobras ou curvaturas, o operador deve selecionar um ponto de canulação ao longo de um segmento reto e orientar a cânula paralelamente ao curso natural do ducto para minimizar o risco de oclusão ou rassão (passos 5.11-5.14).

A própria canulação é o fator mais crítico para o sucesso. Após perfurar o duto (passo 5.13), o acesso intraluminal pode ser confirmado visualmente inserindo a ponta da pinça na abertura e garantindo que apenas uma parede do vaso cubra o instrumento. A aparência de duas paredes opostas indica uma perfuração de ponta contínua. Uma vez confirmado o acesso intraluminal, a cânula pode ser avançada suavemente ao longo do duto no mesmo ângulo. Deve-se ter cuidado para evitar danos à vasculatura adjacente, pois sangramento no campo pode introduzir sangue na cânula de coleta linfática, contaminando a amostra e aumentando substancialmente o risco de formação de coágulos. Após estabelecer o fluxo linfático (passo 5.15), a extremidade coletora da cânula deve ser tapada e o adesivo veterinário deve ser aplicado cuidadosamente para evitar que ela entre no lúmen. A cânula também deve ser verificada em busca de bolhas de ar, pois o ar preso aumenta a pressão de retorno e pode dificultar o fluxo linfático. Como a linfa hepática é gerada sob baixa pressão de propulsão, a extremidade coletora da cânula deve sempre estar posicionada abaixo do nível do local cirúrgico para facilitar a drenagem por gravidade.

A canulação hepática bem-sucedida do ducto linfático é indicada pelo início imediato do fluxo linfático. Uma vez estabelecida, a linfa hepática normalmente flui a aproximadamente 0,1 mL/h, com débito estável por várias horas. A taxa de fluxo pode variar dependendo da anatomia, fisiologia e condições experimentais do animal. Por exemplo, a linfa foi coletada sob anestesia isoflurana neste protocolo. A anestesia isoflurana pode influenciar parâmetros fisiológicos relevantes para a função linfática, e condições experimentais envolvendo anestesia devem ser consideradas ao interpretar as taxas de formação^{linfática 16}. A canulação do ducto linfático hepático requer laparotomia e manipulação microcirúrgica delicada dos vasos linfáticos abdominais, e, portanto, a coleta de linfa de ratos conscientes não é viável nesse modelo. Estudos anteriores comparando o transporte linfático sob condições anestesiadas e conscientes ou usando diferentes regimes anestésicos mostraram que a anestesia pode influenciar modestamente as taxas absolutas de fluxo linfático, mas não altera substancialmente os padrões gerais de transporte^{linfático 4}. Portanto, os valores de fluxo linfático obtidos neste modelo devem ser interpretados no contexto de condições experimentais anestesiadas.

Uma redução gradual ou cessação do fluxo durante a coleta é geralmente causada pela formação de coágulos dentro da cânula, resultante de contaminação sanguínea ou deposição de fibrina. O fluxo pode às vezes ser restaurado localizando e beliscando suavemente a cânula com pinças finas para fragmentar mecanicamente o coágulo, ou aspirando suavemente pela extremidade coletora da cânula para desalojar a obstrução. Se a obstrução estiver confinada à parte externa, a cânula pode ser cortada próximo ao coágulo e reconectada a um tubo novo usando um conector de silicone estéril. Se o coágulo se formar no local da canulação, geralmente é necessária a re-canulação. Nesses casos, pode-se tentar remover o adesivo com muito cuidado para evitar a ruptura do ducto ou dos vasos sanguíneos adjacentes. A hemostasia deve ser alcançada antes de tentar novamente a canulação, pois até mesmo um vazamento leve de sangue para a cânula promove significativamente a coagulação no sistema linfático hepático de baixa pressão.

Fatores fisiológicos também influenciam o fluxo e a permeabilidade da linfa. O fluxo linfático hepático em ratos é inerentemente mais lento do que o fluxo mesentérico ou torácico, mesmo sob condições^{basais 17,18}. Além disso, a anestesia geral pode reduzir o fluxo linfático em outros circuitos linfáticos em comparação com ratos conscientes e em movimento^{livre 19}. Como a canulação linfática hepática requer anestesia e laparotomia, esses fatores provavelmente contribuem para as vazões relativamente baixas e a maior tendência a coágulos observadas durante acumulações prolongadas. Manter a hidratação através da veia jugular ou cânula gastrointestinal durante a coleta ajuda a estabilizar o fluxo linfático e a reduzir a formação de coágulos. Nesse modelo, o fluxo linfático hepático estável é tipicamente possível por 2–3 horas, após as quais o fluxo pode se deteriorar e a coagulação é mais provável. No entanto, sob condições experimentais ideais, a coleta de linfa pode ser mantida por períodos mais longos, com duração máxima de até ~8 horas^{relatadas 4}.

A inclusão de amostragem de artérias hepáticas e veias porta (Figuras 6 e Figuras 7) amplia a aplicabilidade do modelo ao permitir a comparação direta entre o fluxo hepático, o fluxo linfático e a circulação sistêmica. Essa etapa terminal de amostragem permite a avaliação simultânea do transporte microvascular hepático e da eliminação intersticial dentro de um único animal. Tais comparações fornecem insights valiosos sobre a distribuição dos solutos entre os compartimentos vascular hepático e linfático, especialmente para macromoléculas grandes ou compostos lipofílicos dependentes da difusão intersticial.

Apesar desses desafios, o modelo de canulação linfática hepática continua sendo uma técnica valiosa e informativa. O fígado contribui com uma proporção significativa do fluxo linfático total do corpo, e a linfa hepática contém proteínas e outros componentes que se originam do líquido intersticial hepático. Ao amostrar a linfa drenando diretamente do fígado, esse modelo possibilita a análise de moléculas e células que saem do fígado antes de serem diluídas pela linfa mesentérica e sistêmica no ducto torácico. A análise bioquímica da linfa hepática fornece insights sobre o metabolismo intersticial hepático e os processos de transporte^{lipídico 12,20}. Isso complementa as informações obtidas do sangue porta ou sistêmico, que integra os efeitos do metabolismo hepático e da troca extra-hepática. Importante destacar que essa configuração, que combina canulações linfática hepática, arterial carotídea e venosa jugular, permite a avaliação dinâmica dos gradientes de solutos entre o efluxo hepático e o fluxo vascular, proporcionando uma visão mais abrangente do transporte e da eliminação hepática.

Estudos anteriores usando esse modelo demonstram que a amostragem linfática hepática permite a avaliação da recuperação linfática de terapias macromoleculares e a comparação do transporte de solutos entre a linfa hepática e a circulação sistêmica. Juntos, a canulação linfática hepática, a amostragem vascular concomitante e o perfil bioquímico fornecem uma plataforma experimental robusta para estudar a dinâmica microvascular e intersticial hepática. O modelo permite a avaliação simultânea do transporte hepático, metabolismo, processamento lipídico e sinalização imune, e pode ser adaptado para investigar mudanças sob condições fisiopatológicas como MASLD ou inflamação hepática.

Em conclusão, esse modelo cirúrgico refinado, integrando acesso linfático hepático, arterial hepático e venoso portal, oferece uma abordagem abrangente e reprodutível para examinar as vias de transporte hepático. Ele permite a comparação direta do fluxo vascular, efluxo intersticial e drenagem linfática, o que apoia estudos que fornecem insights mecanicistas sobre o transporte específico do fígado, metabolismo e processos farmacocinéticos. Além disso, a capacidade de amostrar a linfa hepática oferece uma oportunidade única para estudar o tráfico de células imunes e antígenos do fígado, oferecendo insights valiosos sobre vigilância imunológica hepática, inflamação e mecanismos de tolerância.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticoagulant solution (EDTA 0.1%)	Invitrogen	AM9261	Prevents clot formation in cannulas and collected samples
Anticoagulant solution (Heparin 20 IU/mL)	Pfizer	00409-2723-01	Prevents clot formation in cannulas and collected samples
Chlorhexidine (0.5%)	McFarlane Medical	12120-OR	Used for surgical site disinfection
Collection tubes (microcentrifuge)	Greiner Bio-One	616201	Used for lymph and blood collection
Cotton gauze	Winc Australia	18874125	Used for organ manipulation and moisture maintenance
Cotton swabs	Pacific Laboratory	1005199	Used for organ repositioning during surgery
Curved iris forceps	Macquarie Medical Systems	TTP5002-5	Used for vessel isolation and tissue manipulation
Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-35	Used to open and stabilize the vessel lumen of the hepatic artery for cannula insertion
Ethanol (70%)	Ajax	AJA214-2.5PL	Used for surgical site disinfection
Halsted-Mosquito hemostat forceps	Fine Science Tools	13009-12	Used to bend the 25G needle for hepatic lymph duct puncture
Heated surgical pad (37 °C)	Ratek	IC-WT1	Maintains body temperature during surgery
Induction chamber	Darvall	1859	Used for initial anesthesia induction
Infusion pump	Adelab Scientific	NE-300	Provides controlled saline infusion via cannula
Iris scissors	Stark Medical	E-AC985-11	Used for skin and muscle incisions
Isoflurane	Provet Pty Ltd	ISOF07	Inhalation anesthetic used for induction and maintenance of anesthesia
Kelman-McPherson lens forceps	ProSciTech	TY-1301	Used to open and stabilize the vessel lumen of the jugular vein and carotid artery for cannula insertion
Needle (23G × 1")	Livingstone	DN23GX1.0LV	Used for portal vein puncture and blood sampling
Needle (25G × 1")	Livingstone	DN25GX1.0LV	Used for cannula flushing and hepatic lymph duct puncture
Nose cone anesthesia system	Darvall	7885	Maintains anesthesia during surgery
Oxygen supply with flowmeter	BOC	400NE	Carrier gas for isoflurane anesthesia
Polyethylene cannula (0.8 mm O.D., 0.5 mm I.D.)	Microtube Extrusions	PE8050	Used for carotid artery, jugular vein, and hepatic lymph duct cannulation
Polyvinyl cannula (0.61 mm O.D., 0.28 mm I.D.)	Microtube Extrusions	PIV6128	Used for hepatic artery cannulation
Silk sutures (4-0)	SMI AG	SM8015	Used to secure vessels and cannulas
Sodium pentobarbitone	Lyppard Australia Pty Ltd	LETH250	Used for euthanasia (>100 mg/kg)
Sterile saline (0.9% NaCl)	FreeFlex	K690531	Used for rehydration and flushing
Straight Graefe forceps	Fine Science Tools	11150-10	Used for delicate vessel isolation
Surgical microscope	Zeiss	Stemi 2000-CS	Used for visualization during hepatic lymph duct cannulation
Surgical sterile blades (for scalpel use)	Livingstone	SBLDCL15	Used for bevelling cannula tips during preparation
Syringe (1 mL)	Terumo	19032-TE	Used for flushing cannulas
Syringe (3 mL)	Terumo	19048-TE	Used for blood sampling
Syringe (30 mL)	Terumo	19034-TE	Used for saline infusion
Vannas scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for vascular incisions
Veterinary tissue adhesive	3M	1469SB	Used to secure hepatic lymph duct cannula