Mecanismos da Decocção Quyu de Shengxian em Insuficiência Cardíaca Usando uma Metabolômica Não Direcionada e Abordagem de Farmacologia de Rede em Ratos

Resumo

Este estudo confirmou o efeito terapêutico da Decocção Shengxian Quyu na insuficiência cardíaca por meio de experimentos com animais. Cromatografia líquida de ultra-performance, espectrometria de massa e análises de farmacologia em redes identificaram potenciais alvos e mecanismos terapêuticos.

Resumo

A decocção de Quyu de Shengxian (SXQY) foi sugerida como uma possível estratégia terapêutica para insuficiência cardíaca (IC), mas seus mecanismos terapêuticos ainda não estão claros. Este estudo investigou os efeitos terapêuticos e os mecanismos subjacentes da SXQY na IC. Um modelo de HF em ratos foi induzido por constrição aórtica transversal (TAC) e tratado com SXQY. A função cardíaca foi avaliada por ecocardiografia transtorácica, e a estrutura do miocárdio e fibrose foram avaliadas usando hematoxilina e eosina e coloração tricromática de Masson. Amostras de soro foram analisadas por metabolômica não direcionada usando cromatografia líquida de ultra-performance–espectrometria de massa tandem. Componentes que entram no sangue foram mapeados para alvos, e alvos relacionados à IC que se cruzam foram analisados usando análise de redes de interação proteína-proteína (PPI), seguidas por análises Gene Ontology e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). O SXQY melhorou significativamente a função cardíaca em ratos TAC, como evidenciado pela diminuição do diâmetro interno do ventrículo esquerdo na diástole, da espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo na diástole, além do aumento da fração de ejeção do ventrículo esquerdo, além de aliviar a hipertrofia do miocárdio, inflamação e fibrose. Um total de 563 compostos de entrada de sangue foram identificados (367 protótipos e 196 metabólitos), com 5 compostos ativos chave identificados no banco de dados de Sistemas de Farmacologia da Medicina Tradicional Chinesa, correspondendo a 63 alvos. A análise de redes revelou 44 genes sobrepostos, com Formononetina, Timosaponina BII e Sinensetina como componentes centrais, e PTGS2, PPARG e HSP90AA1 como alvos centrais. A análise de IBP identificou ainda genes-chave, incluindo ESR1, PTGS2, PPARG, HSP90AA1, JUN e 15 genes adicionais. A análise KEGG indicou que o SXQY atua principalmente por meio de Ca²⁺, fosfatidilinositol 3-quinase–quinase da proteína quinase B, monofosfato cíclico de adenosina e vias relacionadas à inflamação e hormônios. Em conclusão, o SXQY exerce efeitos protetores contra a IC ao melhorar a função cardíaca e atenuar a remodelação miocárdica por meio de mecanismos multicomponente, multialvo e multivias.

Introdução

Insuficiência cardíaca (IC) é uma síndrome clínica caracterizada por preenchimento ventricular comprometido e capacidade de ejeção devido a anormalidades estruturais ou funcionais cardíacas, resultando em uma constelação de sinais e sintomas^clínicos. Como estágio terminal de várias doenças cardíacas, a IC compromete significativamente a qualidade de vida dos pacientes e resulta em alta mortalidade e frequentes reinternações hospitalares, impondo assim uma carga substancial de doença tanto para as famílias quanto para a^{sociedade 2,3}. No manejo clínico, a farmacoterapia para IC forma a base e a base do tratamento, compreendendo principalmente classes de medicamentos chave como diuréticos, inibidores do sistema renina-angiotensina, betabloqueadores, antagonistas dos receptores mineralocorticoides e inibidores do cotransportador 2 de sódio-glicose 3,4,5,6 . Embora esses medicamentos tenham melhorado parcialmente o prognóstico dos pacientes com IC, cada um apresenta certas limitações e efeitos adversos, como distúrbios eletrolíticos, bradicardia e infecções do trato^urinário7. Portanto, terapias farmacológicas para IC ainda merecem investigação adicional.

A Medicina Tradicional Chinesa (MTC) acumulou ampla experiência clínica no manejo a longo prazo da IC. Enfatizando a regulação holística e a intervenção multi-alvo, oferece uma abordagem distinta ao tratamento⁸. Nos últimos anos, vários ensaios clínicos randomizados (ECRs) demonstraram a eficácia terapêutica das fórmulas herbais chinesas para HF 9,10,11,12,13,14,15. A decocção Shengxian Quyu (SXQY) já começou a passar por rigorosos ECRs para confirmar sua eficácia terapêutica, mas seus mecanismos terapêuticos específicos ainda exigem investigação mais aprofundada^{e abrangente 16}. A farmacologia de redes, como uma disciplina emergente que integra biologia de sistemas, polifarmacologia e análise computacional, oferece uma ferramenta poderosa para elucidar os mecanismos holísticos de ação das fórmulas herbais^chinesas 17,18,19. Portanto, este estudo emprega uma estratégia integrada que combina metabolômica não direcionada e farmacologia em rede para identificar componentes absorvidos pelo sangue do SXQY e elucidar seus potenciais mecanismos terapêuticos. Esse trabalho visa fornecer uma base para a aplicação clínica futura do SXQY.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram examinados e aprovados pelo Comitê de Ética e Bem-Estar Animal do Hospital da Amizade China–Japão (aprovação nº zryhyy21-23-01-09) e conduzidos de acordo com os princípios de substituição, redução e refinamento para minimizar o uso e o sofrimento dos animais. Os pesquisadores que realizaram a aquisição e análise de dados (incluindo medições de ecocardiografia e avaliação histológica) foram cegados quanto à alocação de grupos.

Preparação da amostra SXQY

O SXQY é composto pelos seguintes componentes herbais: Astragalus membranaceus (Huangqi) (30 g), Codonopsis pilosula (Dangshen; 20 g), Cornus officinalis (Shanyurou; 15 g), Sparganium stoloniferum (Sanleng; 12 g), Curcuma zedoaria (Erzhu; 15 g), Cimicifuga heracleifolia (Shengma; 10 g), Bupleurum chinense (Chaihu; 10 g), Platycodon grandiflorus (Jiegeng; 10 g), Anemarrhena asphodeloides (Zhimu; 15 g) e Leonurus japonicus (Yimu; 15 g), com um peso total de ervas brutas de 152 g por prescrição. Todos os materiais fitoterápicos foram adquiridos no Departamento de Farmácia do Hospital da Amizade China–Japão e autenticados por um farmacêutico-chefe de acordo com métodos padrão de identificação farmacognóstica. Clinicamente, o SXQY é administrado em uma dose de uma receita (152 g) por dia. Assumindo um peso corporal adulto médio de 70 kg, a dosagem humana correspondente é de 2,17 g (erva bruta)/kg. Com base na normalização da área da superfície corporal entre humanos e ratos, a dosagem equivalente para ratos foi calculada em 13,67 g (erva bruta)/kg. Para a preparação da decocção, uma prescrição de SXQY foi deixada de molho em água destilada na proporção de 10 mL por grama de ervas cruas (v/v, baseado no volume inicial do solvente sem ajuste após a imersão) por 1 hora, seguida de fervura usando um manto elétrico de aquecimento e mantida a 100°C sob fervura contínua por 1 hora. O extrato foi então filtrado através de gaze (tamanho de poro de 200–300 μm). O resíduo foi então extraído mais duas vezes sob condições idênticas. Os filtrados agrupados foram concentrados sob pressão reduzida usando um evaporador rotativo a 60°C até um volume final de 111 mL, resultando em uma concentração de 1,37 g (medicamento bruto)/mL. A decocção concentrada foi filtrada novamente através de gaze (poro de 200–300 μm) e armazenada a 4°C, sendo usada em 24–48 horas. Para administração, a solução foi usada diretamente, e o volume do gavage foi calculado com base na concentração de 1,37 g/mL, resultando em um volume de administração de aproximadamente 10 mL/kg para atingir a dose alvo de 13,67 g/kg.

Modelo Animal

Dezoito ratos machos de 8 semanas de Sprague–Dawley (SD) foram alojados em um ambiente condicionado padrão (23°C ± 2°C, 50 ± 5% de umidade relativa e um ciclo de 12 horas de luz/escuro) com livre acesso a alimento e água. Os animais foram aleatoriamente atribuídos a três grupos (n = 6 por grupo) usando uma tabela de números aleatórios: um grupo operado por simulação (Sham), um grupo de constrição aórtica transversal (TAC) e um grupo tratado com SXQY (SXQY). Ratos dos grupos TAC e tratado com SXQY foram anestesiados por inalação de isoflurano (indução 4%, manutenção 2%) e colocados em posição supina em uma almofada térmica controlada termostaticamente mantida a 37°C. Anestesia adequada foi confirmada pela ausência de respostas reflexas ao beliscão da pata, juntamente com uma frequência respiratória estável e ausência de movimento espontâneo. Pomada oftálmica foi aplicada em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea. Após a intubação endotraqueal, os animais foram conectados a um ventilador de pequeno animal com volume de maré de 4–6 mL por 200 g de peso corporal, taxa respiratória de 70 respirações por minuto e razão inspiratória-espiratória de 1:1.

Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados em condições assépticas. Os instrumentos cirúrgicos foram esterilizados por autoclavagem, e a área operatória foi preparada com barbear e desinfeção com povidona–iodo, seguido de 70% de etanol. Após a preparação do local cirúrgico, foi feita uma incisão na pele torácica esquerda, e os músculos peitorais maiores e menores foram dissecados de forma contundente para expor as costelas. Foi criada uma incisão horizontal de aproximadamente 1,0 cm no segundo ao terceiro espaço intercostal adjacente à borda esternal esquerda. Vasos sanguíneos e fáscia foram separados de forma contunda, e o timo foi suavemente retraído para expor totalmente o arco aórtico.

O arco aórtico foi cuidadosamente levantado entre a artéria inominada direita e a artéria carótida comum esquerda usando pinças curvas estéreis, e uma sutura de seda 2-0 foi passada por baixo. Uma agulha curva de ponta romba calibre 16 (diâmetro externo 1,6 mm) era modificada manualmente ao embotar a ponta e dobá-la para a curvatura apropriada antes do uso, seguida de esterilização com autoclav. A agulha curva de ponta romba preparada era então posicionada paralela ao arco aórtico, após o que a sutura era amarrada firmemente ao redor da aorta e da agulha. A agulha foi imediatamente removida para criar uma constrição padronizada, e o timo foi reposicionado. Após confirmar a ausência de sangramento ativo, a parede torácica e a pele foram fechadas em camadas. Após a operação, a ventilação mecânica foi mantida por aproximadamente 10 minutos até que a respiração espontânea fosse restaurada, indicada por uma frequência respiratória estável e regular e pela capacidade de manter a respiração espontânea sem suporte ventilatório. Nesse ponto, o tubo endotraqueal foi removido. Animais operados por simulação passaram pelos mesmos procedimentos cirúrgicos, exceto que o arco aórtico não foi ligado.

Após a cirurgia, o local da incisão foi desinfetado e os animais foram colocados em gaiolas de recuperação limpas para reduzir o risco de infecção. Os ratos eram então devolvidos à instalação animal para recuperação e hospedagem rotineira. A analgesia foi administrada usando buprenorfina (0,05 mg/kg, subcutânea). Ratos foram observados a cada 12 horas durante as primeiras 72 horas em busca de sinais de dor, sofrimento ou complicações cirúrgicas, incluindo mobilidade reduzida, piloereção, postura anormal, dificuldade respiratória ou deiscência da ferida.

Três dias após a cirurgia, ratos do grupo tratado com SXQY foram administrados oralmente com 1 mL/100 g de peso corporal da decocção SXQY por 9 semanas. Enquanto isso, ratos dos grupos de operação simulada e TAC recebiam um volume igual (1 mL/100 g de peso corporal) de água destilada por gavage.

Ecocardiografia Transtorácica

Ao final do período de tratamento, foi realizada ecocardiografia transtorácica em todos os grupos. Os ratos foram anestesiados por inalação de isoflurano e colocados em posição supina em uma plataforma de imagem dedicada. A parte anterior do tórax foi cuidadosamente raspada e revestida com uma generosa camada de gel de ultrassom. A imagem por ultrassom foi realizada usando um sistema de ultrassom de alta resolução para pequenos animais equipado com um transdutor de alta frequência (18–40 MHz) nos modos B e M. O transdutor foi posicionado suavemente na área coberta por gel, com profundidade ajustada de 12,29 mm e ganho de 22 dB; O foco foi ajustado para otimizar a qualidade da imagem. Imagens e loops de vídeo foram adquiridos para análises quantitativas subsequentes. Foram medidos o diâmetro interno do ventrículo esquerdo na extremidade diastólica (LVIDd) e a espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo na diástole final (LVPWd), e a fração de ejeção do ventrículo esquerdo (LVEF) foi calculada usando a fórmula de Teichholz baseada em medições do modo M. Para cada parâmetro, as medições foram calculadas em média de 3 a 5 ciclos cardíacos consecutivos. Todas as aquisições e análises ecocardiográficas foram realizadas por um operador certificado com treinamento formal em ecocardiografia, de acordo com protocolos ecocardiográficos padronizados.

Coleta e Processamento de Amostras

Após o procedimento de ultrassom, os ratos foram anestesiados com isoflurano. Os animais eram colocados em posição supina, e a cavidade torácica era aberta para expor o coração. Corações eram rapidamente excisados, enxaguados em soro salino frio tamponado com fosfato e seccionados ao longo do plano sagital. Os tecidos cardíacos foram imediatamente fixados com paraformaldeído a 4°C por 24 horas, seguido por desidratação em uma série graduada de etanol (70%, 80%, 90%, 95% e 100%) por 1 hora em cada etapa, durante a qual os tecidos gradualmente se tornaram translúcidos sem encolhimento perceptível. As amostras foram limpas em xileno, infiltradas com parafina derretida a 60°C por 3 horas e deixadas solidificar em temperatura ambiente (RT; 20°C–25°C). Blocos de tecido cardíaco embutidos com parafina foram aparados e seccionados com espessura de 4–6 μm usando microtomo. As seções eram flutuadas em um banho-maria mantido a 45°C, montadas em slides de vidro e secadas a 37°C–40°C durante a noite. As lâminas eram armazenadas em RT sob condições de baixa umidade e usadas em até 1 semana para coloração histológica.

Coloração por Hematoxilina e Eosina (HE)

As seções embutidas em parafina foram processadas da seguinte forma. As seções foram primeiro desparafinizadas por imersão em xileno I, II e III por 5 minutos cada, seguidas por hidratação através de uma série de etanol anidro I e II e soluções de etanol graduadas (95%, 90%, 80%, 70% e 50%) por 5 minutos cada, e finalmente enxaguadas em água destilada, sem resíduos visíveis de cera. As seções foram então tingidas com hematoxilina Harris por 5 minutos e enxaguadas sob água da torneira por 1 a 2 minutos. A diferenciação foi realizada em solução ácida e álcool por aproximadamente 1–2 segundos, com o desfecho determinado por inspeção visual quando o fundo parecia pálido e a coloração nuclear permanecia claramente definida. Em seguida, o azulamento em água a 37°C–45°C e o enxágue com água destilada. Posteriormente, as seções foram contra-tingidas com eosina solúvel em álcool por 40 s, lavadas com água destilada, desidratadas por etanol graduado, limpas em xileno e, finalmente, montadas com resina neutra.

Coloração de Maçon

Seções embutidas em parafina foram desparafinizadas sequencialmente em xileno I, II e III por 5 minutos cada, seguidas por hidratação por etanol anidro I e II e soluções de etanol graduadas (95%, 90%, 80%, 70% e 50%) por 5 minutos cada, e finalmente enxaguadas em água destilada. As seções foram imersas em ácido acético a 0,5% (pré-resfriado a 4°C) por 1 s, seguidas por coloração com a solução de fucsina de um kit comercial de coloração tricromática da Masson's por 10 minutos, seguida pela diferenciação em ácido fosfomilobdico por 5 minutos e contracoloração com azul de anilina por 3 minutos. Todos os reagentes eram componentes do mesmo kit comercial e eram usados conforme as instruções do fabricante. Após a coloração, as seções eram enxaguadas três vezes em ácido acético pré-resfriado a 4°C (aproximadamente 30 s por enxágue), desidratadas por etanol graduado, limpas em xileno e montadas com resina neutra.

Coleta de Amostras de Soro para Análise Metabolômica

Seis ratos machos SD de 8 semanas foram alojados sob as mesmas condições que os do experimento in vivo acima. Os animais foram aleatoriamente designados para um grupo tratado com SXQY e um grupo controle de veículo (água destilada; n = 3 por grupo) usando um método de randomização gerado por computador. Ratos do grupo SXQY receberam SXQY por via oral em uma dose de 1 mL/100 g de peso corporal, enquanto o grupo controle do veículo recebeu um volume igual de água destilada. Após sete dias de gavage diário, a dose final no sétimo dia foi dobrada. Após a última administração, os animais eram jejuados por 12 horas. Ratos foram anestesiados com isoflurano até que a perda do reflexo de retirada do pedal fosse confirmada como indicador de anestesia adequada. Amostras de sangue foram coletadas do plexo venoso retro-orbital usando tubos capilares estéreis e imediatamente transferidas para tubos microcentrífugas de 1,5 mL sem anticoagulante. O sangue total foi então deixado em regime de RT por 1 hora e centrifugado a 1000 × g por 15 minutos a 4°C para obter soro. Quando uma separação clara entre a camada superior transparente do soro e o coágulo apareceu, o soro sobrenadante foi cuidadosamente aspirado e transferido para tubos limpos de microcentrífuga. As amostras de soro foram armazenadas a −80°C até a análise dos componentes que entram no sangue.

Pré-tratamento de Exemplo para Análise Metabolômica

As amostras de soro foram descongeladas no gelo após a remoção do armazenamento de −80°C e brevemente misturadas em vórtices (10 s) para garantir homogeneidade. Uma aliquota de 100 μL de soro foi transferida para um tubo microcentrífuga de 1,5 mL, seguida pela adição de 500 μL de solvente de extração (20% acetonitrila–metanol contendo 2-cloro-L-fenilalanina como padrão interno em concentração final de 1 μg/mL) para induzir a precipitação de proteínas. A mistura foi vórtice vigorosamente por 3 minutos e centrifugada a 12.000 × g por 10 minutos a 4°C. Uma porção de 470 μL do sobrenadante resultante foi transferida para um novo tubo e evaporada até a secura usando um evaporador de nitrogênio sob baixo fluxo controlado de nitrogênio. Após reconstituição em 200 μL de 70% de metanol–água e vórtice por 1 minuto, as amostras foram centrifugadas a 12.000 × g por 10 minutos a 4°C, e 180 μL do sobrenadante clarificado foram transferidos para frascos de autoamostragem para análise de cromatografia líquida–espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS).

Uma alíquota de 200 μL de amostra SXQY foi então transferida para um tubo centrífugo pré-marcado de 1,5 mL. A solução padrão interna de extração foi adicionada a cada amostra com uma razão de volume de 1:1 (v/v). A mistura foi misturada em vórtice por 15 minutos e centrifugada a 12.000 × g por 3 minutos a 4°C. O sobrenadante resultante foi cuidadosamente coletado e filtrado através de uma membrana microporosa de 0,22 μm, resultando em um filtrado transparente sem partículas visíveis. O filtrado foi transferido para frascos de autoamostragem e armazenado a 4°C antes da análise LC-MS/MS (UPLC–MS/MS) de ultra-desempenho.

Preparação de Soluções Internas de Padrão

A solução padrão interna (2-cloro-L-fenilalanina) foi preparada dissolvendo 1 mg do padrão de referência em 1 mL de metanol–água a 70% (v/v), resultando em uma concentração de 1.000 μg/mL. Essa solução padrão foi ainda diluída com o mesmo solvente para obter uma solução padrão interna funcional com concentração final de 1 ppm, que foi preparada na hora, armazenada a 4°C e usada em 48–72 horas.

Condições UPLC–MS/MS

A separação cromatográfica foi realizada usando um sistema UPLC acoplado a um espectrômetro de massa tandem. A separação foi alcançada em uma coluna C18 mantida a 40°C, com vazão de 0,35 mL/min e volume de injeção de 4 μL. A fase móvel consistia em água ultrapura contendo 0,1% (v/v), ácido fórmico (A) e acetonitrila contendo 0,1% (v/v) ácido fórmico (B). A elução gradiente foi aplicada da seguinte forma: 5% B em 0,0 min; aumentou linearmente para 25% B em 2,0 min, 35% B em 3,0 min, 60% B em 5,0 min e 99% B em 6,0 min; se manteve em 99% B por 1,5 min; retornou para 5% B em 7,6 min; e equilibrou em 5% B até 10,0 min.

A detecção por espectrometria de massa era realizada usando um espectrômetro de massa de alta resolução equipado com uma fonte de ionização por eletrospray operando em modos de íons positivos e negativos. As tensões de pulverização foram ajustadas para 3500 V no modo positivo e 3200 V no modo negativo. O gás da bainha e o gás auxiliar foram ajustados para 30 e 5 unidades arbitrárias (definidas por instrumentos), respectivamente. A temperatura do tubo de transferência de íons e a temperatura do vaporizador foram mantidas em 320°C e 300°C, respectivamente. Varreduras completas de MS foram adquiridas em uma faixa m/z de 84–1250 com resolução de 35.000 com um objetivo de controle automático de ganho (AGC) de 1,0 ×^10,6, seguidas pela aquisição MS/MS dependente dos dados (top 10) com resolução de 17.500 com meta AGC de 2,0 × 10,5 e janela de isolamento de 1,0–1,5 m/z. Energias de colisão normalizadas em degraus de 30, 40 e 50 foram aplicadas. Os 10 íons precursores mais intensos foram selecionados para fragmentação com uma duração dinâmica de exclusão de 3 s.

Processamento de Dados Brutos

Os dados brutos de espectrometria de massa foram convertidos para o formato mzML usando o ProteoWizard. Para garantir a confiabilidade analítica, amostras de controle de qualidade (QC) agrupadas foram preparadas misturando volumes iguais de todas as amostras de soro. Amostras de QC foram injetadas em intervalos regulares (uma injeção de QC a cada 5–10 amostras analíticas) durante toda a análise UPLC–MS/MS para monitorar a estabilidade do instrumento, a consistência do tempo de retenção e a reprodutibilidade do sinal. A reprodutibilidade foi avaliada com base no desvio padrão relativo das intensidades de pico em amostras de QC.

Detecção de picos, correção do tempo de retenção e alinhamento de picos foram realizados usando o pacote XCMS. Características com taxa de ausência superior a 50% dentro de qualquer grupo foram excluídas de análises adicionais. A correção de desvio de sinal foi posteriormente aplicada a áreas de pico usando um método de normalização baseado em regressão vetorial de suporte (SVR) implementado no software estatístico R, usando modelagem baseada em QC para corrigir a deriva do sinal ao longo da execução analítica.

A identificação de metabólitos foi realizada comparando as características corrigidas com uma biblioteca de referência padrão interna (contendo aproximadamente 5.000 compostos com dados espectrais MS1 e MS2; proprietários e não publicamente disponíveis), bem como bancos de dados espectrais públicos disponíveis, incluindo o Human Metabolome Database (HMDB), Metabolite and Tandem Mass Spectrometetry Database (METLIN), MassBank e Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS). baseado em correspondência precisa de massa, alinhamento do tempo de retenção e similaridade espectral MS/MS. A correspondência de massa foi realizada usando uma tolerância de ±25 ppm para íons precursores (MS1) e fragmentos (MS2), com tolerância de tempo de retenção de ±6 s. Para busca em bibliotecas, uma tolerância de ±25 ppm foi aplicada a íons precursores (Q1) e ±50 ppm a fragmentos MS/MS, com uma pontuação mínima de correspondência MS/MS de 0,3. Apenas metabólitos com escore de identificação abrangente maior que 0,5 foram retidos para identificação não alvo. A pontuação final foi calculada como uma soma ponderada de fragmentos (0,1), forward (0,3) e reverse (0,6) pontuações correspondentes. Os dados adquiridos nos modos de ionização positivo e negativo foram fundidos no nível do composto. Para anotações duplicadas, foi selecionada a entrada com maior confiança de identificação e maior pontuação. As anotações finalizadas foram compiladas em um arquivo de anotação de metabólitos.

Critérios para Identificação de Compostos Absorvidos

Os constituintes absorvidos do protótipo foram definidos como compostos detectados no extrato SXQY e no grupo tratado com SXQY, com tempos de retenção correspondentes dentro de uma tolerância de ±0,1 min. Além disso, esses compostos deveriam apresentar uma área de pico no grupo tratado com SXQY que fosse pelo menos duas vezes maior que a do grupo de controle do veículo ou que estivessem ausentes das amostras de controle do veículo.

Os metabólitos absorvidos foram identificados usando um conjunto diferente de critérios. Esses compostos não foram detectados no extrato SXQY, mas estavam presentes no grupo tratado com SXQY. Suas características espectrométricas de massa deveriam ser consistentes com transformações metabólicas características, incluindo hidroxilação (Δm/z = +15,9949 Da) e desmetilação (Δm/z = −14,0157 Da). Além disso, a área de pico no grupo tratado com SXQY deveria ser pelo menos duas vezes maior do que a do grupo de controle do veículo, com base nas áreas de pico normalizadas após a correção de desvio do sinal, ou o sinal correspondente deveria ser indetectável nas amostras de controle do veículo.

Recuperação de Genes Relacionados a Compostos Absorvidos

Componentes que ingressam no sangue foram analisados no Banco de Dados e Plataforma de Análise de Sistemas de Farmacologia da Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.ph; acessado em janeiro de 2026^). Compostos documentados no TCMSP foram avaliados como candidatos a constituintes bioativos com base nos limiares farmacocinéticos estabelecidos de biodisponibilidade oral ≥ 30% e semelhança com o medicamento ≥ 0,18²¹. Os alvos supostos correspondentes aos compostos retidos foram posteriormente recuperados, e todos os identificadores de alvo foram padronizados para símbolos genéticos oficiais usando o banco de dados^{UniProt 22}.

Recuperação de Alvos Relacionados a Doenças e Genes de Interseção

Genes relacionados à IC foram coletados do banco de dados GeneCards (https://www.genecards.org/; acessado em janeiro de 2026) usando "insuficiência cardíaca" como termo de busca, e genes com escore de relevância ≥ 10 foram selecionados para análise adicional. Os alvos relacionados ao HF foram posteriormente intersectados com alvos associados ao composto identificados a partir do TCMSP usando a plataforma Weishengxin (https://www.bioinformatics.com.cn; acessada em janeiro de 2026). Os genes sobrepostos foram definidos como alvos de interseção e usados para subsequentes análises de construção de redes de interação proteína-proteína (PPI) e enriquecimento funcional.

Construção de Rede e Análises de Enriquecimento Funcional

A análise PPI dos alvos identificados foi realizada usando o banco de dados STRING (http://cn.string-db.org/; acessado em janeiro de 2026)²³, com a espécie definida como Homo sapiens e um limiar de escore de confiança de ≥0,7. Os dados de interação foram importados para a ferramenta de visualização Cytoscape para visualização de rede. A análise topológica foi realizada usando o plugin NetworkAnalyzer na ferramenta de visualização, e os genes hub foram identificados usando o plugin^{CytoHubba 24,25}. A análise de enriquecimento por Ontologia Gênica (GO) foi realizada nos alvos de interseção, incluindo as categorias de processo biológico (BP), componente celular (CC) e função molecular (MF). Termos GO com valor P < 0,05 foram considerados significativos, e os 10 termos mais enriquecidos de cada categoria foram selecionados para a^{visualização 26}. Os alvos de interseção foram ainda submetidos à análise de enriquecimento de vias da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) usando o pacote clusterProfiler no software estatístico. Vias com valor P < 0,05 foram consideradas estatisticamente significativas, e as 20 vias enriquecidas mais avançadas foram selecionadas para visualização. Essas vias foram posteriormente usadas para construir uma rede de interação^{alvo-caminho 27}.

Análise estatística

Os dados são apresentados como média ± DS. A normalidade da distribuição dos dados foi avaliada usando o teste de Shapiro–Wilk, e a homogeneidade da variância foi avaliada usando o teste de Levene ou o teste de Brown-Forsythe antes da análise. Comparações estatísticas entre os grupos foram realizadas usando análise unidirecional da variância, seguidas pelo teste post hoc de Tukey usando GraphPad Prism. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Ecocardiografia Transtorácica

A análise ecocardiográfica revelou remodelação cardíaca pronunciada e disfunção em ratos TAC (Figura 1). Comparado aos controles simulados, o TAC aumentou significativamente LVIDd e LVPWd, enquanto LVEF foi significativamente reduzido. Notavelmente, a administração de SXQY reverteu parcialmente essas mudanças patológicas, refletidas por uma redução significativa na LVIDd e LVPWd e uma...

Discussão

O SXQY tem sido amplamente utilizado na prática clínica por mais de duas décadas, demonstrando eficácia no tratamento de diversas condições cardiovasculares. Recentemente, seu uso foi estendido para pacientes com insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida e fração de ejeção levemente reduzida^{na fração 16}. No presente estudo, um modelo de rato foi estabelecido por cirurgia TAC para imitar mudanças patológicas da IC, e enquanto isso alguns ratos foram trat...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-cloro-L-fenilalanina	Aladdin	C105993-1g	Padrão interno; ≥ 98%
Acetonitrila (grau LC-MS)	Aladdin	A120771-1L	Solvente de extração
Ácido acético	Solarbio	G1340	Manchas de mação; pré-resfriado a 4 °C; C
Frascos de autoamostragem	Agilent	5190-9590	Para carregamento de amostras LC-MS/MS
Buprenorfina	Cerilliant	B-044S	Analgésico
Coluna C18 (1,8 & mu; m, 2,1 mm × 100 mm)	Águas	176001125	Coluna ACQUITY Premier HSS T3
Tubos capilares, estéreis	Fisherbrand	22-362-566	Coleta de sangue retroorbital
Centrífuga (refrigerada)	KUBOTA	N61196-F000	Para processamento de soro e amostras
Pacote clusterProfiler	Biocondutor	—	Pacote R para análise de enriquecimento KEGG; v4.0.2
Pinça curva, estéril	HL-SQX	HL-JP	Manipulação do arco aórtico
Software Cytoscape	NHGRI	NIH NHGRI Sub-24 HG012107	Versão 6.4.1
Plataforma dedicada de imagem	Fujifilm VisualSonics	Sistema de ultrassom VisualSonics Vevo 1100	Posicionamento animal durante ecocardiografia
Água destilada	N/A	N/A	Preparação da decocção e controle do veículo
Manto de aquecimento elétrico	Midea	WK2102	Fervura por decocção
Tubo endotraqueal	CWE Inc., EUA	SAR-1000	Intubação endotraqueal; O tubo endotraqueal usado neste estudo foi integrado à configuração do ventilador e não era um dispositivo separado ou independente
Etanol (absoluto)	Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd.	64-17-5	Desidratação e esterilização
Ácido fórmico	Aladdin	O930702	Aditivo de fase móvel
Gaze	Solarbio	YA0720	Filtração por decocção; 200– 300 & mu; m tamanho dos poros
Banco de dados GeneCards	GeneCards	—	Coleta de alvos relacionados a doenças; acessado em janeiro de 2026
Banco de dados GNPS	Universidade da Califórnia em San Diego	—	Banco de dados espectral; versão 1.3.16, dados arquivados em dezembro de 2025
Software GraphPad Prism	GraphPad Software	—	Versão 10.1.2; SCR_002798
Bolsa térmica (termostaticamente)	Fisitem	HP-4M	Mantido em 37 & deg; C
Hematoxilina e Eosina (H&; E) Kit de Tingimento	Solarbio	G1120	Coloração histológica
Transdutor de alta frequência	VisualSonics	Vevo F2	18– 40 MHz
Espectrômetro de massa de alta resolução	Thermo Fisher Scientific	Q Exativo	Q HF-X Exativo
Sistema de ultrassom de alta resolução para pequenos animais	Fujifilm VisualSonics	Sistema de ultrassom VisualSonics Vevo 1100	Vevo 2100
Banco de dados HMDB	Grupo de Pesquisa Wishart / Centro de Inovação em Metabolômica, Universidade de Alberta	—	Banco de dados espectral; HMDB versão atual 5.0; lançamento 5.0; Janeiro de 2022
Biblioteca de referência padrão interna	METWARE	—	Composição da biblioteca padrão de referência interna: A biblioteca contém um total de 5.000 compostos e inclui tanto informações MS1 (precursores) quanto dados espectrais MS2 (fragmentação). Declaração de disponibilidade: O formato de dados da biblioteca é .txt. Condição de armazenamento: O banco de dados é armazenado no servidor interno da empresa. Permissões de acesso: Esta biblioteca padrão autoconstruída é uma biblioteca espectral proprietária interna da empresa. Ele é usado exclusivamente para identificação de metabólitos, verificação de resultados e rastreabilidade de qualidade dentro dos fluxos de trabalho analíticos controlados da empresa. A biblioteca não está disponível publicamente para download. Os clientes podem obter resultados de anotações, informações de acertos e descrições de campos necessárias geradas com base nessa biblioteca.
Isoflurano	Sigma-Aldrich	792632	Anestésico inalável
Sistema de cromatografia líquida (UPLC)	SCIEX	ExionLC d.C.	ExionLC d.C.
Banco de dados MassBank	consórcio MassBank; Sociedade de Espectrometria de Massas do Japão / MassBank Europa	—	Banco de dados espectral; versão 2024.06; dados arquivados em dezembro de 2025
Masson' s Kit de Mancha Tricromática	Solarbio	G1340	Coloração histológica
Filtro de membrana (0,22 & mu; m)	Beyotime	FF362	Polietersulfona (PES)
Banco de dados METLIN	O Instituto de Pesquisa Scripps / Laboratório Siuzdak	RRID: SCR_010500	Banco de dados espectral; Este banco de dados não fornece um número de versão anual fixo; Dados Baixados em 2023
Metanol (grau LC-MS)	Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd.	67-56-1	Solvente de extração
Tubos microcentrífugas (1,5 mL)	Corning Life Sciences (Wujiang) Co., Ltd.	MCT-150-C	Processamento de amostras
Microtome	Leica	DSC1	Corte de tecidos
Resina neutra	Solarbio	G8590	Montagem do ferrolho
Evaporador de nitrogênio/fonte de gás	Organomação	N-EVAP	Secagem de amostras
Pomada oftálmica	Aladdin	08-03-8009	Proteção ocular durante a anestesia
Parafina	Solarbio	YA0010	Embedding de tecidos
Paraformaldeído (4%)	Solarbio	P1110	Fixação de tecidos
Soro salino tamponado com fosfato	E VOCÊ	DYP1021	Lavagem de tecidos
Ácido fosfomolíbdico	Solarbio	G1340	Coloração de masonaria
Povidone– Iodo	Solarbio	IP3800	Desinfecção cirúrgica
Software ProteoWizard	Fundação ProteoWizard	—	Versão 3.0.19254
Software R	Fundação R	—	Versão 4.2.2
Evaporador rotativo	QINGDAO JINGCHENG INSTRUMENT CO., LTD	JC-2LZF	Concentração de decocção sob pressão reduzida
Sutura de seda (2-0)	FULAN	NL30RH26A-76	Constrição aórtica
Ventilador para pequenos animais	CWE Inc., EUA	SAR-1000	Ventilação mecânica
Sprague– Ratos-de-Dawley (macho, 8 semanas)	SPF Bio Co., Ltd.	—	RGD_70508; Licença nº SCXK(jing)2024-0001
Banco de dados STRING	Consórcio STRING	—	Análise de interação proteica; acessado em janeiro de 2026
Pacote/script de normalização de regressão vetorial de suporte	MetNormalizador	—	Correção de desvio de sinal; v1.3.02
Banco de dados TCMSP	TCMSP	—	Recuperação de compostos e alvos; acessado em janeiro de 2026
Banco de dados UniProt	Consórcio UniProt	—	Padronização de símbolos genéticos
Gel de ultrassom	MAGNAFLUX	25-912	Ecocardiografia
Água ultrapura	Preparado em laboratório	—	Solvente em fase móvel
Misturador de vórtice	Yalin	VM-ST	Mistura de samples
Banho-maria	Julabo	PURA22	Seção flutuando a 45 °C; C
Plataforma Weishengxin	Weishengxin	—	Análise de interseção de alvos; acessado em janeiro de 2026
Software XCMS	Fundação R	—	Versão 3.16.1
Xylene	Aladdin	X775162	Deparafinização