Um modelo de camundongo de lesão cerebral concussiva em cabeça fechada rotacional única e repetitiva

Resumo

Um modelo reprodutível de camundongo para lesão cerebral concussiva rotacional é descrito, fornecendo um método versátil para investigar as substâncias funcionais e biológicas sutis – incluindo mudanças neurovasculares, inflamatórias e comportamentais – após impacto único ou repetitivo na ausência de dano estrutural cerebral evidente.

Resumo

Lesão cerebral concussiva (CBI), o substrato fisiopatológico subjacente à concussão clínica, é uma condição frequente, porém insuficientemente compreendida, com potencial comprometimento neurológico de longo prazo em um subconjunto de pacientes. Especialmente a CBI repetitiva, ou seja, em esportes de contato, tem sido associada a déficits cognitivos duradouros e neurodegeneração progressiva (por exemplo, encefalopatia traumática crônica, CTE). Para suprir essa lacuna de conhecimento, foi estabelecido um modelo reprodutível de camundongo para lesão cerebral rotacional em cabeça fechada, que recapitula características biomecânicas e patológicas chave da CBI. Um impactador eletromagnético guiado estereotaticamente era usado para aplicar um golpe padronizado no crânio intacto. Para reduzir a tensão focal no crânio e no tecido cerebral adjacente, a ponta impactadora foi equipada com uma tampa de silicone feita sob medida. Essa configuração induzia de forma confiável a rotação da cabeça com baixa variabilidade entre animais, ao mesmo tempo em que prevenia fraturas no crânio ou lesões microscópicas de tecidos. Para preservar a atividade fisiológica neuronal e vascular e evitar efeitos potencialmente neuromoduladores da anestesia profunda, uma lesão cerebral foi induzida em camundongos conscientes sob sedação leve usando o agonista α2 medetomidina. Os impactos induzidos causaram movimentos rotacionais reprodutíveis da cabeça, com apenas uma variabilidade menor atribuída ao posicionamento da cabeça. A integridade estrutural do cérebro foi avaliada usando imagens de ressonância magnética ponderadas em T2 in vivo e confirmada por análises histológicas ex vivo , que não revelaram evidências de perturbação tecidual, contusão ou microhemorragias, mas demonstraram uma leve e generalizada perturbação da interface microvascular. Esse modelo inovador de lesão cerebral rotacional em cabeça fechada fornece uma plataforma experimental robusta para investigações longitudinais de alterações sutis neurovasculares, inflamatórias e da barreira hematoencefálica que ocorrem na ausência de patologia estrutural evidente. Sua aplicação permite insights mecanicistas sobre a fisiopatologia da concussão clínica e potenciais consequências neurodegenerativas de lesões repetitivas, facilitando assim o desenvolvimento de biomarcadores clínicos urgentemente necessários.

Introdução

A lesão cerebral traumática (LCT) continua sendo uma causa significativa de incapacidade de longo prazo em todas as faixas etárias, com adolescentes e jovens adultos sendo desproporcionalmente^{afetados 1,2,3}. A grande maioria dos TCE é classificada como leve (mTBI), comumente chamada de concussão no nível clínico. Embora a concussão, por definição, não esteja associada a danos estruturais cerebrais evidentes detectáveis pela neuroimagem convencional, evidências crescentes sugerem que o mecanismo subjacente da lesão — aqui chamado de lesão cerebral concussiva (CBI) — representa uma entidade fisiopatológica distinta e clinicamente relevante.

Em particular, a CBI repetitiva, especialmente quando ocorre em sucessão temporal próxima, como ocorre frequentemente em esportes de contato e ambientes militares, tem sido associada ao declínio cognitivo persistente, sintomas neuropsiquiátricos e ao desenvolvimento de encefalopatia traumática crônica (CTE^)1,2,3. Essa aparente discrepância entre a natureza leve da lesão inicial e o potencial para sequelas neurológicas de longo prazo representa um grande desafio tanto para o diagnóstico clínico quanto para a pesquisa mecanicista.

Evidências emergentes indicam que alterações sutis, porém sustentadas, na interface neurovascular e neuroglial representam um mecanismo relevante^{da doença 4}. Essas mudanças abrangem integridade da barreira hematoencefálica (BBB), estrutura microvascular, ativação glial, excitabilidade neuronal e processos endógenos de reparo, potencialmente ligando a fisiopatologia em nível celular aos déficits funcionais e comportamentais de longo prazo observados depois, especialmente os repetitivos ^CBI 5,6,7,8 . Coletivamente, tais alterações são cada vez mais reconhecidas como potenciais contribuintes para os déficits funcionais e comportamentais atrasados após a CBI. No entanto, a natureza difusa e multifacetada complica uma compreensão mecanicista e até agora tem dificultado o desenvolvimento de intervenções terapêuticas direcionadas.

Modelos pré-clínicos que recapitulam aspectos-chave da cascata fisiopatológico são ferramentas cruciais para dissecar esses mecanismos e identificar novas vias terapêuticas. Embora exista uma ampla variedade de modelos experimentais de LCT, a maioria foi projetada para simular lesões moderadas a graves ou se basear em danos estruturais^{focais 9,10,11}. Em contraste, há uma impressionante falta de modelos animais para o mecanismo característico de lesão da^{CBI 5}. Na maioria das vezes, um trauma cerebral rotulado como "leve" é induzido por um impacto focal na cabeça rigidamente fixada, ou até mesmo por impacto cortical direto após craniotomia, o que contradiz fundamentalmente o mecanismo difuso de lesão, impulsionado por aceleração-desaceleração, que define a concussão em^{humanos 6,7}. Embora tais abordagens permitam controle preciso sobre os parâmetros da lesão, sua capacidade limitada de replicar a dinâmica das concussões no mundo real reduz sua relevância translacional.

Para superar essas limitações, existem vários métodos para induzir uma lesão cerebral fechada replicável^{e difusa} 12,13,14. Com base nesses conceitos e com o objetivo de minimizar a complexidade técnica, foi desenvolvido um modelo controlado de lesão rotacional em camundongos usando um impactador eletromagnético comercialmente disponível frequentemente empregado em outros modelos experimentais de trauma (ou seja, impacto cortical controlado, CCI). Ao fornecer um impacto reprodutível à cabeça em movimento livre, essa abordagem preserva a integridade estrutural enquanto possibilita a investigação longitudinal de alterações neurovasculares, neurogliais e funcionais após um CBI único e repetitivo sob condições que se aproximam das características biomecânicas da concussão humana.

Combinado com avaliação comportamental longitudinal, imagens in vivo e histologia ex vivo , esse modelo oferece uma plataforma versátil e acessível para explorar alterações neurovasculares, gliais e comportamentais após impactos únicos ou repetitivos. Como tal, é bem adequado para estudar os mecanismos sutis da doença secundária da CBI, identificar parâmetros substitutos translacionais e avaliar potenciais intervenções terapêuticas em um ambiente experimental clinicamente relevante.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais estavam em conformidade com a Lei Alemã de Bem-Estar Animal e eram aprovados por autoridades institucionais e governamentais (LANUV Nordrhein-Westfalen; AZ 81-02.04.2020.A058). Os experimentos foram realizados seguindo as diretrizes do ARRIVE. Um fluxo de trabalho esquemático é detalhado na Figura 1. Esse protocolo induz de forma confiável lesão cerebral concussiva, como evidenciado por um painel definido de resultados estruturais, comportamentais e neurovasculares (Figura 2). Todos os materiais utilizados neste estudo são detalhados na Tabela de Materiais.

1. Considerações gerais

NOTA: Os camundongos eram socialmente abrigados sob condições padronizadas (ciclo de 12 horas luz/escuro) com acesso ad libitum a comida e água. Os camundongos foram aclimatados à instalação experimental por pelo menos 7 dias antes da cirurgia. Um total de 40 camundongos foi utilizado neste estudo piloto, com 10 animais alocados a cada grupo experimental (sham como grupo controle, grupo CBI único, CBI repetitivo em alta frequência e CBI repetitivo em grupo de baixa frequência). Instale um sistema de câmera de alta velocidade na altura dos olhos, com a cabeça do mouse em posição fixa à frente do mouse (por exemplo, 10 cm). Para garantir consistência entre os testes, mantenha a posição e a orientação da câmera constantes. Uma GoPro Hero6 foi usada neste estudo a 240 quadros por segundo (fps) com resolução de 1080px. O software de análise de movimento de código aberto Kinovea (versão 2025.2.0) é utilizado para as análises cinemáticas descritas.

2. Indução de analgesia e anestesia

1. Prepare o montagem, incluindo a estrutura estereotáxica e o acessório para o impactador eletromagnético.
2. Administrar Tramadol (1 mg/mL) por meio de água bebedeira dois dias antes da indução do trauma e continuar por três dias após a (última) cirurgia.
3. Induzir anestesia usando isoflurano em uma mistura de óxido nitroso/oxigênio (_O2 30%,_N2O 70%), com 4–4,5% de isoflurano em uma câmara de indução.
4. Avalie a tolerância cirúrgica usando o reflexo de beliscão do dedo do pé. Prossiga assim que uma resposta de retirada estiver ausente.
5. Retire o mouse da câmara de indução e coloque-o em uma bolsa térmica dentro do quadro estereotáxico. Mantenha a temperatura do núcleo em 37 ± 1,0 °C usando uma sonda retal de fibra óptica. Proteja os olhos da dessecação aplicando pomada oftálmica.
6. Mantenha a anestesia administrando isoflurano a 2,0–2,5% por meio de um cone nasal conectado ao sistema estereotáxico.

3. Preparação do crânio

1. Fixe o mouse dentro do quadro estereotáxico usando barras de ouvido específicas.
2. Raspe o couro cabeludo e desinfete cuidadosamente a área cirúrgica com um antisséptico à base de álcool.
3. Aplicar anestesia local por injeção subcutânea de Bupivacaína (0,1 mg/kg).
4. Reavalie o reflexo de beliscão do dedo antes da incisão na pele. Prossiga apenas na ausência de resposta de retirada para garantir uma profundidade constante de anestesia.
5. Realize uma incisão na linha média da pele de aproximadamente 7 mm para expor o crânio.
6. Expõe cuidadosamente o crânio sobre o osso parietal direito entre Bregma e Lambda.
7. Certifique-se de que o quadro estereotáxico esteja orientado perpendicularmente ao crânio, com o eixo vertical posicionado em um ângulo de 90° em relação à superfície da cabeça.
8. Coloque um pino marcador no suporte estereotáxico e centre-o diretamente em Bregma.
9. Zero todas as coordenadas estereotáxicas e mova o pino marcador para as coordenadas anteroposterior (AP) e mediolateral (ML) predefinidas (em nosso modelo, AP 0,5, ML -2,5). Marque o ponto alvo com uma caneta de feltro resistente à água.

4. Ajuste da analgesia

1. Solte o rato das barras auriculares.
2. Injetar medetomidina por via subcutânea (0,5 mg/kg) e reduzir gradualmente o isoflurano até <0,5%.
3. Mantenha a anestesia em < 0,5% de isoflurano enquanto monitora continuamente a respiração e a temperatura corporal.
4. Permitir o equilíbrio nessas condições por 10 minutos para alcançar um estado estacionário de anestesia, preservando a atividade da rede neuronal. Frequência respiratória, ausência de respostas reflexas e temperatura corporal estável (37 ± 1,0 °C) foram usados como indicadores padronizados para garantir profundidade anestésica comparável entre os animais.

5. Indução de impacto

NOTA: Antes do experimento, fabrique um suporte para a cabeça do modelo animal a partir de isolamento de espuma de tubo de polietileno (PE) comercialmente disponível, uma espuma polimérica de célula fechada e não reticulada, que restringe a aceleração descendente enquanto permite o movimento rotativo. Além disso, fabricar uma ponta esférica de impactador de 5 mm feita sob medida em silpuran (razão 1:1; rigidez 830 kPa).

1. Remova a sonda de temperatura retal e interrompa a administração de isoflurano, depois coloque o rato em posição deitada no suporte da cabeça.
2. Prenda a tampa de silicone feita sob medida na ponta do impactador comercialmente disponível.
3. Monte o impactador eletromagnético no suporte estereotáxico e certifique-se de que o dispositivo esteja orientado em um ângulo de 10° em relação à superfície do crânio.
4. Alinhe a ponta do impactador acima da região alvo pré-definida no crânio.
5. Abaixe a ponta do impactador na posição alongada até que ela toque levemente a superfície do crânio.
6. Retraia a ponta do impactador e avance-a até a profundidade de indentação desejada (ou seja, 3 mm nesses experimentos) em direção à superfície do crânio. Para animais de controle, omitem a redução e aumentem a ponta na mesma quantidade.
7. Comece a gravação do vídeo. Aplicar um único impacto concussivo rotacional acionando o raio eletromagnético através do interruptor de controle com velocidade de 5 mm/s e duração de pulso de 0,1 ms.
8. Retraa o impactador imediatamente após a conclusão do impacto.
9. Antagonize a anestesia com medetomidina usando o antagonista atipamazol (0,5 mg/kg, s.c.).

6. Avaliação pós-impacto e fechamento da ferida

1. Vire o rato para uma posição deitada.
2. Avalie o reflexo de endireitamento registrando o tempo necessário para o animal voltar à posição deitada.
3. Reinduza a anestesia com isoflurano em uma mistura de óxido nitroso/oxigênio (_O2 30%,_N2O 70%) a 4% de isoflurano.
4. Retire o mouse da câmara de indução e coloque-o na almofada térmica perto da estrutura estereotáxica. Mantenha a temperatura do núcleo em 37 ± 1,0 °C usando uma sonda retal de fibra óptica.
5. Fixe o mouse no quadro estereotáxico usando barras auriculares.
6. Feche a incisão cutânea usando pontos interrompidos com filamentos autoabsorventes (por exemplo, Polyglactin 910, 6-0).
7. Transfira o rato para uma caixa de aquecimento e monitore até recuperar totalmente a consciência.
8. Devolva o animal à gaiola de casa.

7. Paradigma de impacto repetido

1. Atribua camundongos a grupos simulados, simples ou repetidos de CBI de acordo com o desenho experimental.
2. Para grupos com lesão repetida, agende sessões subsequentes de CBI em intervalos definidos (por exemplo, a cada 48 horas).
3. Antes de cada CBI subsequente, administrar analgesia pré-operatória via tramadol na água potável, conforme descrito na seção 3.1.
4. Anestesia repetida, marcação estereotáxica e impacto seguindo o mesmo procedimento descrito nas seções 3–6, incluindo anestesia local com bupivacaína (0,1 mg/kg, s.c.), administração de medetomidina (0,5 mg/kg, s.c.) com manutenção de isoflurano em < 0,5%, alvo estereotáxico em AP 0,5 e ML −2,5 em relação ao Bregma, e entrega de impacto concussivo rotacional usando impactador eletromagnético (profundidade de indentação 3 mm, velocidade 5 mm/s, duração do pulso 0,1 ms, ângulo de 10° em relação à superfície do crânio).
5. Garantir posicionamento consistente (posição deitada em um suporte de espuma de polietileno permitindo movimento rotacional), parâmetros de impacto idênticos (ângulo, profundidade, velocidade e duração) e condições padronizadas peri e pós-procedimentais, incluindo antagonização com medetomidina com atipamazol (0,5 mg/kg, s.c.), reindução de anestesia (4% isoflurano em O₂ 30%/N₂O 70%) e controle de temperatura a 37 ± 1,0 °C, ao longo de sessões repetidas para manter a reprodutibilidade entre animais e pontos de tempo.
6. Garantir posicionamento consistente, parâmetros de impacto e condições de recuperação ao longo de sessões repetidas para manter a reprodutibilidade entre animais e pontos de tempo.
7. Monitore continuamente os animais para déficits comportamentais cumulativos após impactos repetidos.

8. Análise cinemática

1. Exporte os vídeos em formato padrão (por exemplo, MP4) para análise e os carregue no software Kinovea.
2. Navegue até a janela de tempo relevante contendo os quadros pré e pós-impacto (por exemplo, de -0,025 a 0,3 s após o impacto). Certifique-se de definir uma taxa de quadros adequada (por exemplo, 240 fps) nas configurações do software. Defina uma referência de escala (por exemplo, distância entre olhos).
3. Use a ferramenta de rastreamento da Kinovae para estabelecer um sistema de rastreamento de três pontos (por exemplo, olho direito, olho esquerdo, nariz; Figura 3A). Comece a rastrear cada ponto e corrija manualmente os erros de rastreamento, especialmente durante movimentos rápidos ou oclusão.
4. Exporte as coordenadas rastreadas como arquivos CSV ou Excel.
   NOTA: Uma análise cinemática adicional foi realizada usando um script personalizado do MATLAB. Os dados de rastreamento com resolução temporal exportados da Kinovea eram importados e pré-processados para remover entradas inválidas e garantir uma escala de tempo consistente. A translação da cabeça foi definida como o centróide dos três pontos de referência rastreados (olho direito, olho esquerdo e nariz), a partir dos quais deslocamento linear, velocidade e aceleração foram derivados usando diferenciação numérica. A rotação da cabeça foi estimada a partir da orientação do eixo olho–nariz, com o deslocamento angular calculado em relação à linha de base pré-impacto e a velocidade angular obtida como sua primeira derivada. Para reduzir a amplificação do ruído, todos os sinais de posição e angulares foram suavizados usando um filtro Savitzky–Golay antes da diferenciação. O principal parâmetro de desfecho foi o deslocamento angular máximo, enquanto os perfis de velocidade e aceleração foram analisados como medidas relativas da dinâmica do movimento da cabeça entre os ensaios.

Resultados

Considerações gerais:

A aplicação desse protocolo induz de forma reprodutiva lesão cerebral concussiva, como demonstrado por um conjunto definido de leituras estruturais, comportamentais e neurovasculares de validação (ver Figura 2). A integridade estrutural foi preservada após a lesão. Não foi detectada perturbação macroscópica ou hemorragia tecidular evidente, indicando que o protocolo induz lesão cerebral conc...

Discussão

Um modelo inédito de camundongo de CBI de cabeça fechada baseado em lesão de aceleração-desaceleração é caracterizado, apresentando uma leve e generalizada deterioração da BBB e um fenótipo neuropsiquiátrico distinto que lembra concussão clínica. Ao reproduzir características-chave da CBI de forma controlada e consistente, preservando a integridade estrutural, o modelo oferece uma estrutura experimental útil e bem caracterizada para estudar os mecanismos subjacentes à CBI e suas sequelas...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Medicação
Antipamezole	Vetoquinol	VM 06043/4004	Antagonista da Medetomidina (antagonista do α2-adrenoceptor), subcutâneo (0,5 mg/kg)
Pomada Oftálmica Bepanthen	Bayer	11809917	Proteção ocular durante a anestesia, tópico
Bupivacaína	Sigma-Aldrich	B1160000	Anestesia local, subcutânea (0,1 mg/kg)
Isoflurano	CP pharma	1214CN	Anestesia, inalação (indução e manutenção)
Medetomidina	Vetoquinol	VM 06043/4003	Adjuvante sedativo/anestésico (agonista do α2-adrenoceptor), subcutaneamente (0,5 mg/kg)
Cloridrato de tramadol (100 mg/mL)	Grünenthal	6867645	Analgésico administrado através da água potável, 1 mg/mL de concentração final para camundongos, de 2 dias antes a 3 dias após a cirurgia
Equipamento
Almofada de pescoço em polietileno	Personalizado		Suporte para posicionamento prono durante o impacto
Capa do Impactor Estereotaxic Silupran	Personalizado		Distribui a carga mecânica, previne danos focais no crânio, anexado à ponta do impactor, 830 kPa
Impactor Estereotaxic	Leica Biosystems	39463923/IM10131	Dispositivo de impacto eletromagnético para entrega de impacto controlada
Ferramentas
GoPro Hero6	GoPro Inc., San Mateo, CA, EUA
Kinovea		(versão 2025.2.0)
MATLAB	MathWorks, Natick, MA, EUA	NA