MiR-483-3p como marcador prognóstico em câncer de pulmão de células não pequenas: supressão da progressão tumoral via regulação descendente do KIF3B

Resumo

A redução da regulação do miR-483-3p é um marcador prognóstico ruim no NSCLC. A superexpressão de miR-483-3p suprime os fenótipos malignos das células NSCLC, cuja função foi revertida pela superexpressão de KIF3B.

Resumo

Os microRNAs desempenham papéis amplos no câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). Para investigar o valor clínico do miR-483-3p em NSCLC e seu alvo molecular, 350 pacientes com NSCLC foram recrutados neste estudo. Os resultados da RT-qPCR mostraram que a expressão histológica tumoral de miR-483-3p diminuiu progressivamente à medida que o estágio de metástase tumor-linfonodo (TNM) aumentava. A curva característica operacional do receptor (ROC) mostrou que o nível histológico de miR-483-3p pode distinguir efetivamente pacientes com NSCLC com estágio alto de TNM (III) daqueles com estágio baixo (I+II) (área sob a curva ROC = 0,869). A curva de Kaplan-Meier mostrou que pacientes com CPNPC com baixa expressão de miR-483-3p apresentaram uma taxa geral de sobrevivência menor em 5 anos. Após ajuste para outros fatores de confusão, a análise multivariada de Cox identificou ainda mais o miR-483-3p como um fator protetor independente para a sobrevivência dos NSCLC. Mecanicamente, o ensaio de RNA pull-down mostrou que a regulação para cima do miR-483-3p foi co-precipitada com o mRNA do KIF3B e inibiu sua expressão, suprimindo assim os fenótipos malignos das células NSCLC e induzindo a apoptose. Em conclusão, a regulação para baixo do miR-483-3p serve como um marcador prognóstico ruim no NSCLC, potencialmente afetando a progressão do câncer ao regular negativamente o KIF3B.

Introdução

Entre as mortes relacionadas ao câncer, o câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é uma das principais causas. Sua alta taxa de mortalidade é atribuída principalmente ao crescimento agressivo de tumores, metástase precoce e desenvolvimento de resistência^{adquirida 1,2,3}. Apesar dos avanços nas estratégias clínicas atuais, o prognóstico geral para pacientes com CPNEs continua ruim ^4,5,6. Além dos desafios biológicos, pacientes com CPNEs frequentemente apresentam uma carga sintomática pesada, incluindo dor, disneia, fadiga e sofrimento psicológico, o que prejudica significativamente sua qualidade de vida e complica o manejo clínico. O cuidado de enfermagem eficaz — como avaliação de sintomas, educação do paciente, suporte psicossocial e coordenação do cuidado multidisciplinar — desempenha um papel crucial na melhoria dos resultados dos pacientes e na adesão ao tratamento. Portanto, uma investigação aprofundada sobre os principais mecanismos moleculares que impulsionam o desenvolvimento e a progressão do CPNPC é de extrema importância para o desenvolvimento de novos biomarcadores prognósticos e estratégias terapêuticas eficazes, bem como para informar intervenções de enfermagem direcionadas que atendam tanto às necessidades centradas na doença quanto no paciente.

MicroRNAs (miRNAs) têm sido amplamente relatados como responsáveis pela regulação da expressão gênica, seja inibindo a tradução dos mRNAs-alvo ou promovendo sua degradação no nível^{pós-transcricional 7}. Pesquisas extensas indicam que os miRNAs desempenham um papel regulatório crucial em vários tipos de câncer, incluindo o NSCLC. Sua desregulação está intimamente associada ao fenótipo maligno de células tumorais e à resistência à^{quimioterapia} 7,8,9,10,11. Portanto, identificar miRNAs que são expressos de forma anormal no NSCLC e possuem papéis funcionais significativos tornou-se um tema quente nas pesquisas tumorais atuais. Nossa análise preliminar de bioinformática revelou uma regulação consistente para baixo do miR-483-3p tanto em pacientes com CPNPC quanto em linhagens celulares resistentes a medicamentos, sugerindo sua possível associação com a progressão adversa da doença. Portanto, este estudo foca no miR-483-3p para explorar sua função no NSCLC. Evidências existentes indicam que o miR-483-3p atua como um gene supressor de tumor em vários cânceres humanos 12,13,14,15, cujo silenciamento acredita-se estar associado à resistência ao gefitinibe no^{NSCLC 16}. No entanto, seu padrão específico de expressão no CPNC, valor prognóstico clínico e mecanismos moleculares subjacentes permanecem incompletamente compreendidos.

O objetivo deste estudo foi esclarecer sistematicamente a importância clínica e as funções biológicas do miR-483-3p no NSCLC, além de elucidar o papel do membro da família cinesina 3B (KIF3B) alvo a jusante. Para alcançar isso, primeiro analisamos sua expressão em amostras de tecido clínico e sua correlação com as características clínico-patológicas e o prognóstico dos pacientes. Posteriormente, foram realizados ensaios funcionais in vitro para investigar os efeitos do miR-483-3p nas funções das células do NSCLC. Além disso, identificamos o KIF3B como um gene-alvo a jusante chave do miR-483-3p por meio de previsão de bioinformática e experimentos de biologia molecular, e validamos a relação regulatória por meio de ensaios funcionais de resgate. Alta expressão de KIF3B está associada ao aumento da proliferação, aumento da migração e resistência à quimioterapia em células^{cancerígenas} 17,18,19,20,21,22, mas seu papel funcional no NSCLC permanece incerto. Até onde sabemos, este estudo é o primeiro a caracterizar o papel e a importância clínica do eixo miR-483-3p/KIF3B no NSCLC sob três perspectivas — prognóstico clínico, identificação do gene alvo e mecanismos funcionais — fornecendo assim potencialmente novos insights para a avaliação do prognóstico do NSCLC e da terapia direcionada.

Protocolo

O Comitê de Ética do Segundo Hospital Afiliado da Universidade Médica de Nanjing aprovou este estudo. Os princípios fundamentais da Declaração de Helsinque foram aplicados de forma consistente ao longo de todo o processo de pesquisa. Foi obtido consentimento informado por escrito de todos os participantes individuais incluídos no estudo. Informações detalhadas sobre todos os materiais e reagentes foram fornecidas na Tabela de Materiais.

Análise de bioinformática:

O banco de dados Gene Expression Omnibus (www.ncbi.nlm.nih.gov) foi aplicado para pesquisar nos conjuntos de dados relacionados ao NSCLC. GSE171517 é uma análise de RNA não codificante baseada nas amostras de soro de pacientes com CPNM e controles saudáveis. GSE110815 é uma análise de matriz de RNA não codificante realizada em células NSCLC resistentes e sensíveis a gefitinibe. Os miRNAs diferencialmente expressos nesses dois conjuntos de dados foram triados estabelecendo um limiar de |_{log 2}FC| 2 ≥, p < 0,05. Embora esses conjuntos de dados tenham origem em compartimentos diferentes (soro, linhagens celulares), utilizamos uma estratégia complementar: miRNAs derivados de soro para potencial biomarcador não invasivo, e miRNAs derivados de linhagens celulares resistentes a medicamentos para relevância funcional para progressão e resistência. A interseção indicou o miR-483-3p para validação tecidual, assumindo que a desregulação entre compartimentos indica relevância biológica robusta para o NSCLC.

Alvos potenciais do miR-483-3p foram previstos simultaneamente nos bancos de dados do miRDB (https://mirdb.org/custom.html) e da base estelar (https://rnasysu.com/encori/index.php). O limiar de triagem nesses dois bancos de dados era, respectivamente, Target Score ≥ 60 e TDMDScore ≥ 1. Depois, uma Plataforma de Análise de Bioinformática (www.bioinformatics.com.cn) foi usada para análise GO usando a interseção desses alvos.

Inclusão de amostras clínicas:

Este estudo é um estudo de coorte observacional retrospectivo baseado em amostras de NSCLC ressecadas cirurgicamente. Este estudo incluiu 350 pacientes com CPNM que passaram por tratamento cirúrgico no hospital, compreendendo 96 pacientes com metástase de linfonodo tumoral (TNM) estágio I, 96 pacientes com doença estágio II e 158 pacientes com doença estágio III. Suas características clínicas detalhadas foram apresentadas na Tabela 1. Todos esses pacientes foram diagnosticados com CPNM por meio de exame histológico. Critérios de exclusão incluem função cardíaca, hepática ou renal comprometida, infecções ativas ou doenças autoimunes, distúrbios psiquiátricos graves ou comprometimento cognitivo, registros clínicos ausentes ou incompletos e falta de obtenção de consentimento informado dos pacientes. A análise clínica foi realizada coletando amostras de tecido tumoral e status de sobrevivência dentro de cinco anos após o diagnóstico. A metodologia de acompanhamento é a seguinte: todos os pacientes foram acompanhados desde a data da cirurgia até sua morte, perda de acompanhamento ou o término do estudo. Durante o primeiro ano, o acompanhamento era realizado a cada 3 meses. A partir de então, foi realizada a cada 6 meses por meio de exames ambulatoriais e entrevistas por telefone. Em cada acompanhamento, foram registradas informações sobre status de sobrevivência, causa da morte, recorrência da doença e tratamento subsequente. O período geral de sobrevivência foi definido como o período desde a data da cirurgia até a morte por qualquer causa.

Processamento celular:

BEAS-2B, uma linha celular epitelial pulmonar humana normal, foi cultivada em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina (P/S). Todas as linhas celulares de NSCLC (HCC827, H1299, H520, A549) foram cultivadas no meio de cultivo dedicado fornecido pelo mesmo fornecedor. A formulação básica do meio especializado para HCC827, H1299 e H520 é RPMI-1640 + 10% FBS + 1% P/S, e que para A549 é F-12K de Ham + 10% FBS + 1% P/S. Células congeladas são rapidamente descongeladas em um banho-maria a 37 °C, centrifugadas para remover o meio criopreservativo e ressuspensas em meio de cultivo fresco. Quando as células atingem 90% de confluência, são digeridas com 0,25% de tripsina-EDTA e passadas em uma proporção de 1:3. Todas as linhas celulares foram verificadas por análise STR (Arquivo Suplementar 1) e estão livres de contaminação por micoplasma. Todos os experimentos in vitro utilizaram células da 4ª à 10ª geração.

O agonista miR-483-3p e seu controle negativo (agonista-NC), o pequeno RNA interferente do KIF3B (si-KIF3B) e seu controle negativo (si-NC), assim como o vetor de superexpressão do KIF3B (oe-KIF3B) e seu controle em branco (oe-NC) foram transfectados usando um reagente de transfecção. A concentração de trabalho do agonista ou agonista-NC do miR-483-3p era de 100 nM, e a quantidade do plasmídeo oe-KIF3B era de 2,5 μg (placa de 6 poços). As células foram colhidas 48 horas após a transfecção para experimentos subsequentes.

RT-qPCR:

O RNA total das amostras de tecido tumoral e das células foi extraído usando o reagente TRIzol. O cDNA transcrito reversamente foi preparado usando um kit de reagentes RT, e então a qPCR foi realizada em um sistema Fast RT-PCR 7500 usando o SYBR Green Pro Taq HS Premix. A expressão relativa de miR-483-3p e KIF3B foi normalizada com o uso doméstico de U6 e GAPDH por meio do método ^2-ΔΔCT . As sequências correspondentes de espoletas são as seguintes:

miR-483-3p (F), 5'-ACACTCCAGCTGGGTCACTCCTCTCTCCTCC-3'

miR-483-3p (R), 5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAAGACGG-3'

KIF3B (F), 5'-ATCCTGGAGCAGAAACGAACAGG-3'

KIF3B (R), 5'-GTTCCAAGGTCTCCTCATCCG-3'

U6 (F), 5'-ATGTTCCAGTATGACTCTA-3'

U6 (R), 5'-ATGTTCCAGTATGACTCTA-3'

GAPDH (F), 5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3'

GAPDH (R), 5'-CCATCCAATCGGTAGCG-3'

A RT-qPCR foi realizada com três réplicas biológicas independentes.

Viabilidade celular:

As células HCC827 (3000 células/poço) e A549 (2000 células/poço), com ou sem transfecção, foram semeadas em uma placa de 96 poços para diferentes períodos de cultura. Após as células aderirem à superfície, a viabilidade celular foi avaliada em pontos de tempo específicos em poços designados. Especificamente, 10 μL do Kit de Contagem Celular-8 (CCK-8) e 90 μL de meio foram adicionados aos poços para uma incubação de 2 horas a 37 °C. A absorvância de cada poço foi então medida em 450 nm usando um leitor de microplacas. A viabilidade celular foi realizada com três réplicas biológicas independentes.

Ensaio Transwell:

O dispositivo de câmara Transwell, revestido por matriz ou não revestido por membrana basal (8 μm), foi utilizado para o ensaio de invasão/migração. Após a câmara superior ser semeada com as células transfectadas de NSCLC (8 × 10⁴, 500 μL), a câmara inferior foi preenchida com 700 μL de DMEM (10% FBS). Foi realizada uma incubação de 24 horas a 37 °C. Após as células na camada superior da membrana da câmara serem suavemente limpas com um cotonete, as células na superfície inferior da membrana foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 20 minutos em temperatura ambiente, depois tingidas com solução de violeta cristalina a 0,1% por 10 minutos em temperatura ambiente, seguidas de uma breve lavagem com água da torneira corrente para remover o excesso de mancha. As células migradas foram contadas manualmente usando um microscópio óptico. Para cada câmara Transwell, três campos de visão não sobrepostos foram selecionados aleatoriamente, e o número de células coradas em cada campo foi contado. Depois, a contagem média de células foi calculada. Essa contagem foi realizada por dois pesquisadores independentes que desconheciam as condições experimentais, e os valores médios resultantes foram usados para análise estatística. O ensaio transwell foi realizado com três réplicas biológicas independentes.

Detecção de apoptose celular

Um kit de coloração Annexin V-FITC/PI foi utilizado para a detecção de apoptose de células NSCLC. Resumidamente, uma suspensão contendo 6 × 10^{células 4} foi preparada pela primeira vez usando 195 μL de buffer de ligação Annexin V-FITC. Depois, Annexin V-FITC (5 μL) e solução de coloração PI (10 μL) foram adicionados sequencialmente para incubação de 20 minutos em temperatura ambiente, no escuro. Após a incubação concluída, o citômetro de fluxo era imediatamente usado para detectar as células a serem testadas. Para cada amostra, 10.000 eventos foram adquiridos. A estratégia de gate era a seguinte: as células eram primeiro bloqueadas em FSC-A vs. SSC-A para excluir detritos, seguidas pelo gate de singlet em FSC-A vs. FSC-H. Células apoptóticas foram então identificadas nos gráficos de pontos Annexin V-FITC vs. PI. Os quadrantes eram definidos usando controles sem coragem e com uma única mancha. A porcentagem de apoptose foi calculada como a soma das células apoptóticas iniciais (Anexina V⁺/PI⁻) e das células apoptóticas tardias (Anexina V⁺/PI⁺). A detecção de apoptose celular foi realizada com três réplicas biológicas independentes.

Puxão para baixo do RNA

O segmento do mRNA KIF3B (KIF3B/NM004798.4/NP004789.1: 32334713–32334791, 5'-AGAAATCTGTGTCCTCTGCCTGCCCTTGTTTCCTGAATGAATGCTTGGGGTTTATGAAAGGAGTGATCCT-3', 78 nt) foi sintetizado in vitro e marcado com biotina usando um kit de destiobiotinilação final de RNA 3'. Após a incubação de extratos celulares com mRNA KIF3B marcado com biotina por 1,5 h a 4 °C, esferas magnéticas de estreptavidina foram adicionadas para uma incubação de 2 horas em temperatura ambiente. Por fim, o nível de miR-483-3p em cada reação foi detectado por RT-qPCR, com três réplicas biológicas independentes.

Análise estatística

As variáveis contínuas neste estudo foram expressas como média ± desvio padrão (média ± SD), enquanto os dados categóricos foram apresentados como contagens. Software de análise estatística apropriado foi utilizado para análise estatística. ANOVA unidirecional/bidirecional foi usada para análise experimental de dados, seguida pelo teste post hoc de Tukey. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

A análise da curva da característica operacional do receptor (ROC) foi realizada para determinar a capacidade da expressão do miR-483-3p de distinguir pacientes com NSCLC com estágio alto (III) daqueles com classificação TNM em estágio baixo (I + II). O índice de Youden (sensibilidade + especificidade – 1) foi usado para identificar o valor de corte que maximizou o equilíbrio entre sensibilidade e especificidade. A área sob a curva (AUC) foi calculada para avaliar a capacidade discriminatória geral da expressão de miR-483-3p. Um AUC > 0,7 foi considerado aceitável. Todas as análises ROC foram realizadas usando GraphPad Prism.

Para análise de sobrevivência, o método de Kaplan-Meier foi usado para estimar curvas de sobrevivência geral. O teste log-rank foi aplicado para comparar distribuições de sobrevivência entre grupos (miR-483-3p grupos de alta vs. baixa expressão). As curvas de Kaplan-Meier foram plotadas com intervalo de confiança (IC) de 95%. Para o modelo multivariado de regressão proporcional a riscos de Cox, foi aplicada a seguinte estratégia de seleção de variáveis: a análise univariada foi realizada primeiro para cada variável candidata. Variáveis com valor p < 0,10 na análise univariada foram consideradas como potenciais preditoras e posteriormente inseridas no modelo de regressão multivariada de Cox. A análise multivariada foi realizada usando o método de seleção progressiva (condicional) baseado no teste de razão de verosimilhança, com critérios de entrada e remoção definidos em p < 0,05 e p > 0,10, respectivamente. A suposição de riscos proporcionais foi verificada para cada variável usando resíduos de Schoenfeld (p > 0,05 indicou que não houve violação). Os resultados foram relatados como razões de risco (HR) com IC 95%. Todos os testes foram bilaterais, e um valor p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo, salvo especificação em contrário.

Resultados

O miR-483-3p regulado em baixa representa um prognóstico ruim no NSCLC

O diagrama de Venn (Figura Suplementar 1) indica que o miR-483-3p parece ter redução tanto em amostras de soro de pacientes com CPNPC quanto em linhas celulares de CPNPC resistentes à quimioterapia. Uma análise ANOVA unidirecional mostrou que a expressão de miR-483-3p no tumor diminuiu progressivamente com o aumento do estágio de TNM (

Discussão

Este estudo investigou sistematicamente o papel do miR-483-3p na supressão de tumores de CPNPC e seu mecanismo subjacente por meio da análise clínica de amostras e exploração de mecanismos moleculares. O objetivo deste estudo foi duplo: (1) determinar se o miR-483-3p serve como marcador prognóstico independente no NSCLC, e (2) elucidar o mecanismo molecular pelo qual o miR-483-3p pode suprimir fenótipos malignos ao direcionar o KIF3B. Nossas descobertas sugerem o valor clínico do miR-483...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,1% violeta cristalino	Solarbio/China	G1064
0,25% tripsina-EDTA	Gibco/EUA	25200056
4% de paraformaldeído	Beyotime/China	P0099
Sistema RT-PCR Rápido 7500	Bio-sistemas Aplicados/EUA	4351106
A549	Procell/China	CL-0016
Meio específico para A549	Procell/China	CM-0016
Kit de coloração Annexin V-FITC/PI	Beyotime/China	C1062S
BEAS-2B	STEM RECELL/China	STM-CL-5102
Kit de Contagem de Células-8 (CCK-8)	Solarbio/China	CA1210
Meio DMEM	MeilunBio/China	PWL003
Soro fetal bovino	Gibco/EUA	A5256701
Software GraphPad Prism	GraphPad	Versão 7.0
H1299	Procell/China	CL-0165
Meio específico para H1299	Procell/China	CM-0165
H520	Procell/China	CL-0402
Médio específico para H520	Procell/China	CM-0402
HCC827	Procell/China	CL-0094
Meio específico para HCC827	Procell/China	CM-0094
MRNA KIF3B	Genscript Biotech/China	Personalizado
Reagente Lipo6000	Beyotime/China	C0526
miR-483-3p agonista/agonista - NC	MedChemExpress/EUA	HY-R01451A
oe-KIF3B/oe-NC	RiboBio/China	Personalizado
Penicilina/estreptomicina	Solarbio/China	P1400
RNA Pierce 3' Kit de Destiobiotitilação Fim	Thermo Fisher Scientific/EUA	20163
PrimeScript RT Reagente (Tempo Real Perfeito)	TaKaRa/Japão	RR037A
si-KIF3B/si-NC	RiboBio/China	Personalizado
SPSS	IBM	Versão 23.0
Esferas magnéticas de estreptavidina	New England Biolabs/EUA	S1420S
SYBR Green & nbsp; Pro Taq  Pré-mistura HS	Biologia Precisa/China	AG11701
Câmara Transwell	Corning/EUA	3428
Reagente Trizol	Invitrogen/EUA	15596026CN