Os Efeitos do Ciclo Menstrual nos Fatores de Crescimento da Fibrina Rica em Plaquetas: Um Estudo Observacional Transversal

Resumo

Este estudo avalia os efeitos das fases do ciclo menstrual na liberação de fatores de crescimento da fibrina rica em plaquetas (PRF).

Resumo

A fibrina rica em plaquetas (PRF) é amplamente utilizada em cirurgia odontológica para procedimentos regenerativos; no entanto, a variabilidade em seu conteúdo biológico continua sendo uma limitação fundamental para a padronização. Este estudo teve como objetivo implementar um fluxo experimental rigorosamente controlado para avaliar como as fases do ciclo menstrual influenciam a liberação dos fatores de crescimento da PRF. Amostras de sangue venoso foram obtidas de 21 voluntárias saudáveis em três fases menstruais pré-definidas (menstrual: dias 1–5; folicular: dias 6–14; lútea: dias 15–28), com todas as coletas realizadas dentro de um período fixo (11:00–11:30) para minimizar a variação circadiana. Para cada fase, tubos separados foram alocados para hemograma completo, análise hormonal (estrogênio, progesterona, hormônio folículo-estimulante [FSH] e hormônio luteinizante [LH]) e preparação de PRF. A PRF foi produzida por centrifugação imediata sob condições padronizadas (708 × g por 12 minutos; rotor de ângulo fixo, 40 °; raio 88 mm; sem anticoagulante). Os coágulos foram verificados macroscopicamente (estrutura homogênea e elástica), cuidadosamente separados da camada de glóbulos vermelhos e pesados individualmente. Para padronizar a liberação do fator de crescimento, cada coágulo foi incubado em meio RPMI-1640 usando uma razão baseada em peso (1 g PRF: 1 mL meio), seguida de incubação controlada a 37 °C com agitação orbital (100 rpm). Os supernadantes foram coletados e armazenados a -80 °C antes da análise. Fatores de crescimento (IGF-1, PDGF, FGF-2, VEGF e TGF-β1) foram quantificados usando ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) em condições uniformes de ensaio. Dentro desse protocolo padronizado, os níveis de FGF-2 foram significativamente mais altos durante a fase folicular em comparação com as fases menstrual e lútea. Uma correlação moderadamente positiva foi observada entre FGF-2 e os níveis de estrogênio nesta fase, enquanto não foram detectadas diferenças estatisticamente significativas para outros fatores de crescimento. Esses achados indicam que a fase do ciclo menstrual pode contribuir para a variabilidade nos perfis de fatores de crescimento derivados da PRF. O protocolo descrito fornece uma estrutura reprodutível para minimizar a variabilidade pré-analítica e analítica em estudos PRF. As implicações clínicas das diferenças relacionadas à fase justificam investigação adicional em estudos que incorporem coortes maiores e resultados de tratamento.

Introdução

Historicamente, o uso de concentrados de plaquetas começou com o desenvolvimento de adesivos de fibrina e evoluiu para várias formulações e protocolos de preparação. A fibrina rica em plaquetas (PRF), introduzida pela primeira vez por Choukroun et al. em 2001, é um concentrado de plaquetas de segunda geração amplamente utilizado em^{odontologia 1}. Esse biomaterial autólogo é obtido por centrifugação sem anticoagulantes e forma uma matriz de fibrina enriquecida com plaquetas, leucócitos e componentes imunes^{circulantes 2}. A rede de fibrina funciona como um andaime que permite a liberação gradual dos fatores de crescimento essenciais para a reparação e regeneração dos tecidos³.

As plaquetas desempenham um papel central na cicatrização de feridas e na hemostasia ao liberar citocinas e fatores de crescimento ao serem^{ativadas 4}. Na PRF, esse processo resulta na liberação sustentada de mediadores-chave, incluindo fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento fibroblasto-2 (FGF-2), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) e fator de crescimento transformante-beta1 (TGF-β1)⁵. Apesar de seu uso clínico generalizado, os achados sobre a eficácia regenerativa da PRF permanecem inconsistentes em estudos ^3,6. Uma das principais fontes de variabilidade é a heterogeneidade das preparações de PRF, que é influenciada tanto por fatores técnicos quanto biológicos.

Do ponto de vista metodológico, diferenças nos protocolos de centrifugação (por exemplo, força centrífuga relativa, duração, tipo de rotor), materiais de tubos e manuseio pós-coleta podem alterar significativamente a arquitetura da PRF e a distribuição^{celular 7}. Além disso, a variabilidade analítica — como falta de padronização no processamento de coágulos, estratégias de normalização inconsistentes e diferenças nas condições de incubação antes do ELISA — pode levar a discrepâncias substanciais nos níveis relatados de fatores^{de crescimento 8}. Essas inconsistências limitam a comparabilidade entre os estudos e reduzem a confiabilidade translacional das pesquisas em PRF.

A variabilidade biológica complica ainda mais a interpretação. Vários fatores relacionados ao paciente, incluindo idade, sexo, contagem de plaquetas, largura da distribuição plaquetária (PDW) e volume médio de plaquetas (MPV), são conhecidos por influenciar a composição da^{PRF 9}. Além disso, influências hormonais, genéticas e ambientais podem modular o comportamento plaquetário e a liberação de^{citocinas 10}. Há evidências tanto diretas quanto indiretas de que os hormônios sexuais afetam a biologia^{plaquetária 11}. O estrogênio, em particular, demonstrou aumentar a resposta plaquetária a agonistas fisiológicos e aumentar a agregação induzida pela trombina por meio de vias mediadas por^{receptores 12}. À medida que os níveis de estrogênio flutuam ao longo do ciclo menstrual, a função das plaquetas e as saídas biológicas associadas também podem variar de acordo^{com 13}. No entanto, a literatura permanece inconsistente, com alguns estudos relatando aumento da ativação plaquetária e outros demonstrando efeitos neutros ou^{inibitórios 14}.

Dada essa variabilidade técnica e biológica combinada, há uma necessidade clara de fluxos de trabalho controlados metodologicamente que minimizem o viés pré-analítico e analítico ao avaliar fatores de crescimento derivados da PRF. Em contraste com muitos estudos anteriores que se baseiam em amostragem por ponto de tempo único, manuseio de coágulos não padronizado ou quantificação de fatores de crescimento não normalizados, o presente estudo emprega um protocolo de coleta de sangue controlado por fase, parâmetros fixos de centrifugação e normalização baseada em peso dos coágulos PRF antes da incubação e análise^{ELISA 8}. Essa abordagem foi projetada para melhorar a reprodutibilidade e permitir uma comparação mais confiável da liberação de fatores de crescimento entre estados fisiológicos.

Abordagens alternativas para a pesquisa em PRF incluem o uso de formulações avançadas como PRF⁷ e PRF 15 injetáveis^{, sistemas} de centrifugação^{horizontal 7} ou implantação direta de membrana sem análise ex vivo. Embora esses métodos possam aumentar o rendimento celular ou a aplicabilidade clínica, frequentemente introduzem variabilidade adicional na quantificação dos fatores de crescimento ou limitam a capacidade de isolar efeitos biológicos específicos. Em contraste, o fluxo de trabalho atual prioriza a padronização analítica e a comparação controlada, tornando-o particularmente adequado para investigar modificadores fisiológicos, como flutuações hormonais.

O protocolo proposto é mais adequado para estudos experimentais ou translacionais controlados que visam quantificar a liberação de fatores de crescimento sob condições padronizadas. Pode ser menos aplicável em ambientes focados exclusivamente em resultados clínicos, preparação simplificada à beira da cadeira ou estudos onde é necessária aplicação imediata de PRF sem processamento. Pesquisadores devem considerar adotar esse fluxo de trabalho quando o objetivo principal é reduzir a variabilidade e melhorar a reprodutibilidade das medições relacionadas à PRF.

Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar a correlação entre os níveis hormonais em diferentes fases do ciclo menstrual e a liberação de fatores de crescimento do PRF, utilizando um quadro metodológico padronizado e reprodutível.

Protocolo

Este estudo foi realizado no Departamento de Periodontologia, Faculdade de Odontologia, Universidade Çukurova, Adana, Turquia, com a participação de 21 voluntárias. Todos os participantes foram informados em detalhes sobre o propósito, o desenho e os procedimentos do estudo, e o consentimento informado por escrito foi obtido antes da inclusão. O protocolo do estudo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Cukurova (Aprovação nº: 125/56, datada de 16.09.2022). Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque para pesquisas envolvendo sujeitos humanos.

Todos os procedimentos envolvendo sangue humano, incluindo precauções de biossegurança e o manuseio e descarte de resíduos bio-perigosos e químicos, foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas de biossegurança conforme estabelecido pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças e pelos Institutos Nacionais de^{Saúde 16}. O pessoal usava equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, ou seja, luvas, jaleco, óculos de proteção. Todo o manuseio das amostras foi realizado em áreas laboratoriais designadas para evitar contaminação e exposição. Resíduos biológicos (resíduos sanguíneos, restos de PRF, consumíveis) foram descartados de acordo com o Protocolo de Gestão de Resíduos Médicos da Universidade de Cukurova e as regulamentações nacionais de resíduos biomédicos. Os objetos cortantes eram colocados em recipientes à prova de perfuração; Os resíduos líquidos eram desinfetados quimicamente antes do descarte e os resíduos sólidos de risco biológico eram autoclavados antes da descarte licenciado.

Seleção de participantes

Indivíduos que atenderam aos seguintes critérios foram incluídos no estudo: ausência de qualquer doença sistêmica, ciclo menstrual regular de 27–30 dias e idade entre 18–25 anos

Indivíduos que atenderam aos seguintes critérios foram excluídos do estudo: Presença de doença sistêmica, ciclo menstrual irregular, uso de qualquer medicamento ou preparação hormonal, presença de distúrbios endócrinos ou hemorrágicos e histórico de sangramento excessivo durante a menstruação

Coleta de sangue e alocação de grupos

Os primeiros dias do ciclo menstrual de cada participante foram usados para construir um protocolo de agendamento. Com base em classificações fisiológicas amplamente aceitas, o ciclo foi dividido em três fases: Dias 1–5 como fase menstrual (associada à queda endometrial), Dias 6–14 como fase folicular (caracterizada pelo aumento dos níveis de estrogênio e desenvolvimento folicular), e Dias 15–28 como fase lútea (marcada por aumento na secreção de progesterona após a ovulação^)12,13. Amostras de sangue foram coletadas de cada participante durante as fases correspondentes. Ao longo de um único ciclo, foram coletados um total de nove tubos por sujeito: três para hemograma completo (um por fase), três para análise de hormônios sexuais (estrogênio, progesterona, hormônio luteinizante (LH), hormônio folículo-estimulante (FSH) e três para preparação de PRF e análise de fatores de crescimento baseada em ELISA. Todas as amostras de sangue foram coletadas entre 11h00 e 11h30 no mesmo horário todos os dias para minimizar a variabilidade biológica. Amostras venosas de sangue foram obtidas da veia antecubital usando um sistema de coleta de sangue estéril baseado em vácuo e agulhas borboleta de 21G para garantir amostragem não traumática. O sangue foi coletado diretamente em tubos de vidro estéreis de 10 mL sem anticoagulante (tubos de PRF), de acordo com os protocolos padrão de preparação de PRF. Para minimizar a variabilidade pré-analítica, todas as amostras foram coletadas pelo mesmo enfermeiro treinado sob condições padronizadas.

Imediatamente após a coleta, os tubos eram manuseados com cuidado, sem agitação, e transferidos para a centrífuga em até 60–90 segundos para evitar coagulação prematura e garantir uma polimerização consistente da fibrina. Os tubos foram posicionados simetricamente dentro do rotor para manter o equilíbrio e evitar variabilidade relacionada à vibração durante a centrifugação. Nenhum aditivo ou anticoagulante foi utilizado em nenhuma etapa do procedimento.

Como resultado, foram estabelecidos três grupos de estudo: Grupo 1: Amostras da fase menstrual, Grupo 2: Amostras da fase folicular, e Grupo 3: Amostras da fase lútea

Etapas de preparação da PRF:

As amostras de sangue eram imediatamente centrifugadas sem anticoagulantes, utilizando uma centrífuga de bancada equipada com um rotor de ângulo fixo (40°; raio: 88 mm). A centrifugação foi realizada em condições padronizadas a 708 × g por 12 minutos à temperatura ambiente (22°C–24 °C). Os valores da força centrífuga relativa (RCF) foram calculados usando a fórmula padrão (RCF = 1,118 × 10⁻⁵ × r × g²), levando em conta o raio do rotor (88 mm), de acordo com os protocolos PRF estabelecidos descritos por Choukroun et ^al.17 e estudos de padronização^{subsequentes 1,3,18}. Após a centrifugação, as três camadas distintas foram identificadas: uma camada inferior de glóbulos vermelhos, uma camada superior de plasma pobre em plaquetas e um coágulo intermediário de PRF. O coágulo de PRF foi removido suavemente com pinças estéreis, evitando a interrupção da interface dos eritrócitos. Os componentes residuais das células vermelhas do sangue foram cuidadosamente aparados com tesoura estéreis.

Os coágulos de PRF foram avaliados macroscopicamente para uma superfície lisa e homogênea, estrutura cilíndrica elástica e consistência densa e firme de acordo com critérios^{pré-definidos 19,20}. Coágulos que não atendiam a esses critérios eram descartados, e novas amostras de sangue eram obtidas quando necessário. Todas as amostras foram processadas sob condições padronizadas e congeladas a -80 °C em até 30 minutos após a coleta para minimizar a degradação proteolítica. As amostras foram armazenadas por uma duração controlada e uniforme (até 4 semanas) antes da análise em lote, para reduzir a variabilidade entre ensaios e garantir a comparabilidade das medições dos fatores de crescimento.

Etapas da análise do ELISA do fator de crescimento:

Coágulos de PRF foram cuidadosamente separados da fração de glóbulos vermelhos sob condições assépticas usando tesouras cirúrgicas estéreis e foram pesados individualmente usando uma balança analítica calibrada. O meio de cultura RPMI-1640 foi adicionado a cada amostra em uma razão fixa baseada no peso do coágulo (1 g PRF: 1 mL meio) para padronizar a extração do fator de crescimento e minimizar a variabilidade associada às diferenças na massa do coágulo. Amostras foram incubadas a 37 °C em um agitador orbital a 100 × g para facilitar a difusão homogênea dos fatores de crescimento solúveis da matriz PRF para o meio de cultura. Após a incubação, os supernadantes foram coletados e armazenados a -80 °C até a análise.

Concentrações de fatores de crescimento, incluindo fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento fibroblasto-2 (FGF-2), fator endotelial vascular de crescimento (VEGF) e fator de crescimento transformante-β1 (TGF-β1), foram quantificadas usando kits comerciais de ensaio imunoenzimático ligado a enzimas (ELISA) de acordo com as instruções do fabricante. Os seguintes kits foram utilizados: Kit ELISA IGF-1 Humano, Kit ELISA PDGF Humano, Kit ELISA FGF-2 Humano, Kit VEGF ELISA Humano e Kit ELISA TGF-β1 Humano. Todas as amostras e padrões foram analisados em duplicado, e a absorvância foi medida a 450 nm usando um leitor de microplacas. Curvas de calibração foram geradas usando regressão logística de quatro parâmetros (4-PL) para determinar as concentrações dos^{analitos 5}.

Passos ELISA

A diluição da amostra foi determinada de acordo com a faixa de concentração esperada e as instruções do fabricante para cada kit ELISA. Amostras esperadas para se enquadrarem na faixa padrão da curva foram analisadas sem diluição. Quando as leituras preliminares ou as concentrações esperadas de analito ultrapassavam o limite superior da curva padrão, as amostras eram diluídas usando o diluiente amostral fornecido no kit e reanalisadas. As concentrações finais foram calculadas multiplicando os valores medidos pelo fator de diluição correspondente.

Padrões (100 μL), preparados por diluição serial de acordo com as instruções do kit FineTest, e amostras não diluídas ou devidamente diluídas foram adicionados a cada poço de uma microplaca pré-revestida de 96 poços. A placa foi incubada a 37 °C por 90 minutos para permitir a ligação do antígeno. Todas as amostras e padrões foram analisados em duplicado. Após a incubação, o líquido foi removido sem lavagem e 100 μL de solução de trabalho de anticorpos de detecção marcada com biotina foram adicionados a cada poço. A placa foi incubada a 37 °C por 60 minutos. Após a incubação, os poços foram aspirados e lavados três vezes usando 350 μL de tampão de lavagem de 1× por poço. O tampão de lavagem era deixado nos poços por aproximadamente 1 minuto em cada ciclo de lavagem para garantir a remoção adequada dos componentes não ligados. Em seguida, 100 μL de solução conjugada de trabalho de peroxidase de raiz-forte (HRP)–estreptavidina foram adicionados a cada poço, e a placa foi incubada a 37 °C por 30 minutos. Os poços foram lavados cinco vezes usando 350 μL de buffer de lavagem por poço para minimizar o sinal de fundo. Em seguida, 90 μL de solução substrato de tetrametilbenzidina (TMB) foram adicionados a cada poço, e a placa foi incubada a 37 °C por 10–20 minutos no escuro para permitir o desenvolvimento da cor, enquanto a reação era monitorada visualmente. A reação enzimática foi encerrada adicionando 50 μL da solução de parada fornecida com o kit a cada poço, resultando em uma mudança de cor de azul para amarelo.

A absorvância foi medida em 450 nm usando um leitor de microplacas em até 5 minutos após a adição da solução de parada. Uma curva padrão foi gerada usando as concentrações conhecidas fornecidas no kit, e a curva foi ajustada usando um modelo de regressão logística de quatro parâmetros (4-PL). As concentrações da amostra foram calculadas de acordo e corrigidas para quaisquer fatores de diluição.

Análise estatística

As variáveis numéricas foram resumidas como média ± desvio padrão para dados normalmente distribuídos, e como mediana com valores mínimo–máximo quando as suposições de normalidade não foram atendidas. Variáveis categóricas foram expressas como frequências e percentuais. A normalidade dos dados numéricos foi avaliada usando o teste de Shapiro–Wilk. Para comparações de medições numéricas repetidas obtidas dos mesmos indivíduos em diferentes momentos de tempo, foi aplicada a análise de variância por medidas repetidas (ANOVA) quando as suposições paramétricas foram satisfeitas; caso contrário, o teste de Friedman era utilizado. Correlações entre variáveis numéricas não normalmente distribuídas foram avaliadas usando o coeficiente de correlação de postos de Spearman. Análises estatísticas foram realizadas usando software estatístico (IBM SPSS Statistics versão 26.0), e um valor p bilateral < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Não foram observados dados ausentes, pois todas as participantes completaram a amostragem em todas as três fases menstruais. Os parâmetros completos do hemograma estavam dentro dos intervalos de referência fisiológica para todas as amostras, apoiando a consistência da qualidade da amostra e a confiabilidade da preparação com PRF.

Avaliação dos parâmetros sanguíneos nas fases menstruais

Uma comparação dos parâmetros ...

Discussão

O ciclo menstrual é um processo fisiológico complexo orquestrado por flutuações hormonais que impulsionam mudanças em vários sistemas dentro do corpo feminino. Neste estudo, investigamos o conteúdo de PRF obtido de amostras de sangue coletadas durante diferentes fases do ciclo menstrual e analisamos os níveis de fatores de crescimento dentro desse PRF.

O ciclo menstrual foi dividido em três fases com base em classificações fisiológicas amplamente aceitas: a fa...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Balanço analítico	Equilíbrio de precisão (legibilidade de 0,001 g)	Sartorius	Entris
Tubos de coleta de sangue	Tubos de vidro, sem anticoagulante (10 mL)	BD	Sistema de vacú
Centrífuga	Centrífuga de bancada	Hettich	Universal 320R
Kit ELISA & ndash; FGF	Kit FGF ELISA humano	FineTest	EH0541
Kit ELISA & ndash; IGF-1	Kit humano IGF-1 ELISA	FineTest	ER0030
Kit ELISA & ndash; PDGF	Kit ELISA PDGF Humano	FineTest	ER1240
Kit ELISA & ndash; TGF-β 1	TGF-& beta; 1 kit ELISA	FineTest	EH0287
Kit ELISA & ndash; VEGF	Kit VEGF ELISA humano	FineTest	EH0327
HRP– Conjugado de estreptavidina	Reagente ELISA (incluído no kit)	FineTest	Incluído no kit
Incubadora	Incubadora com controle de temperatura (37 & deg; C)	Memmert	—
Tubos microcentrífugas	Tubos estéreis (1.5– 2 mL)	Eppendorf	—
Leitor de microplacas	Leitor de absorção de 450 nm	BioTek	ELx800
Agulha	Agulha descartável estéril de 21G	BD	—
Agitador orbital	Shaker ajustável (100 rpm)	IKA	KS 3000 i controle
Equipamento de proteção individual	Luvas, jaleco, óculos de proteção	Vários	—
RPMI-1640 médio	Meio de cultura celular	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	11875-093
Software de análise estatística	Software de análise de dados (Versão 26.0)	IBM	Estatísticas SPSS
Solução de paragem	Reagente de parada ELISA	FineTest	Incluído no kit
Substrato TMB	Substrato cromogênico para ELISA	FineTest	Incluído no kit
Buffer de lavagem	Buffer de lavagem ELISA (1×)	FineTest	Incluído no kit