Um Método Integrado para Modelagem de AVC Fototrombótico e Registro In Vivo de Optrode da Atividade Neuronal e Astrocítica em Ratos Comportando-se

Resumo

Esse protocolo oferece um método integrado que inclui entrega viral, implantação de optrodo, indução fototrombótica, registro simultâneo da atividade de astrócitos e neurais, e estimulação optogenética de astrócitos. Esse método integrado visa fornecer investigação simultânea da relação astrócito-neurônio nos estágios agudo a crônico do AVC isquêmico.

Resumo

Investigar a dinâmica entre astrócitos e neurônios após um AVC isquêmico é essencial para entender os mecanismos de recuperação pós-AVC. No entanto, as metodologias atuais frequentemente falham em capturar interações em tempo real entre neurônios e astrócitos em animais executando tarefas comportamentais específicas, limitando nossa capacidade de investigar a fase aguda da patologia do AVC. Este protocolo apresenta um método integrado que combina modelagem fototrombótica do AVC com gravação simultânea de eletrofisiologia multicanal e fotometria de fibras em camundongos acordados e comportados, usando um optrode fabricado sob medida. O protocolo inclui indução de isquemia focal por fototrombose seguida de registro simultâneo de picos neuronais e transientes de cálcio astrocíticos. O optrode permite a administração simultânea de fototrombose, registro do sinal de cálcio e manipulação optogenética sem exigir procedimentos cirúrgicos separados. Resultados representativos validam o sucesso no registro simultâneo do sinal de cálcio astrocítico e dos picos neuronais. A manipulação optogenética dos astrócitos produz mudanças mensuráveis nos padrões de disparo neuronal (redução na frequência de disparo de neurônios piramidais em 1,55 ± 0,45 Hz e do interneurônio em 3,64 ± 1,37 Hz em comparação com a estimulação pré-optogenética, n = 2), confirmando que o sistema é capaz de investigar interações astrócito-neurônio. Essa abordagem integrada aborda lacunas críticas na metodologia de pesquisa sobre AVC, fornecendo registros multimodais em tempo real desde o estágio agudo até o crônico do AVC em animais comportados.

Introdução

O AVC isquêmico continua sendo um desafio global primário para a saúde, representando uma das principais causas tanto de mortalidade quanto de incapacidade adquirida de longo prazo no^{mundo 1,2,3}. A alta taxa de incapacidade associada ao AVC isquêmico está associada a uma ampla variedade de sintomas clínicos, que vão desde paralisia motora e perda sensorial até comprometimento ^{cognitivo 4,5,6}. Há uma necessidade urgente de obter uma compreensão mais profunda dos mecanismos patológicos e de recuperação do AVC isquêmico durante a fase de reparo. Além da falha neuronal, a falha catastrófica dos astrócitos foi destacada recentemente ^7,8. Os astrócitos, as células gliais mais abundantes, são um componente essencial do sistema nervoso central, assim como da sinapse tripartite. Em todas as fases da cascata isquêmica, os astrócitos desempenham um papel indispensável e afetam profundamente a recuperação neuronal e^{funcional 9,10,11}. No cérebro saudável, astrócitos e neurônios são funcionalmente acoplados através da sinapse tripartite, onde processos astrocíticos cobrem terminais pré e pós-sinápticos e participam ativamente da transmissão^{sináptica 7,8}. Os astrócitos regulam as concentrações extracelulares de glutamato por meio de transportadores excitatórios de aminoácidos, mantêm a homeostase do potássio por meio dos canais Kir4.1 e modulam a força sináptica pela liberação de gliotransmissores via exocitose dependente de^{cálcio 7,8}. Nesse contexto, transientes intracelulares de cálcio astrocíticos representam atividade astrocítica e estão fortemente ligados à disparação^{neuronal 7}. Durante o AVC isquêmico, essa relação finamente ajustada é rapidamente interrompida. O colapso dos gradientes iônicos após a falha de energia desencadeia liberação massiva de glutamato e despolarização em expansão, levando a lesão neuronal excitotóxica e proliferação de astrócitos^{reativos 12}. Astrócitos dentro e ao redor do núcleo do infarto passam por uma cascata de mudanças patológicas, incluindo sobrecarga de cálcio, comprometimento da recaptação de glutamato, perda do acoplamento sinaptique e falha da liberação do^{gliotransmissor 13}. Simultaneamente, a atividade de picos neuronais é profundamente suprimida à medida que os neurônios perdem viabilidade e integridade potencial^{membrana 14,15}. Na zona peri-infarto, neurônios sobreviventes e astrócitos reativos participam de interações dinâmicas que são consideradas fundamentais para determinar o resultado da recuperação pós-AVC; No entanto, os correlatos eletrofisiológicos e de cálcio em tempo real dessa interação em animais acordados e comportados permanecem pouco^{caracterizados 13,16}. Consequentemente, compreender a atividade astrocítica lado a lado com os sinais neuronais é considerado um pilar para a recuperação funcional neural após lesão isquêmica.

A fototrombose é um modelo isquêmico amplamente utilizado; Utiliza corante fotossensível e luz localizada para induzir lesões isquêmicas em áreas^{específicas-alvo 17}. Os protocolos atuais de modelagem e registro de AVC dificultam a investigação da interação astrócito-neurônio pós-AVC por três principais gargalos^técnicos 17,18,19. A segregação entre modelagem e gravação é uma desvantagem comum da maioria dos protocolos atuais, causando um intervalo de tempo entre o estabelecimento do modelo e a gravação em tempo real^{do sinal 20,21}. No entanto, minutos a horas após o AVC isquêmico são um período essencial durante o qual tanto neurônios quanto astrócitos passam por flutuações^{drásticas 12,22}. Sem o monitoramento simultâneo da interação astrócito-neurônio imediatamente após o incidente isquêmico, a investigação da intervenção precoce eficaz no AVC isquêmico será profundamente prejudicada. Outra limitação dos protocolos atuais está no isolamento das modalidades de registro; A maioria das metodologias atuais é otimizada para um único tipo de sinal. Por exemplo, a eletrofisiologia multicanal oferece detecção de disparo neuronal e potenciais de campo local (LFPs), mas é cega para os estados de sinalização das células^{gliais 15,16}. Por outro lado, o monitoramento da dinâmica astrocítica por meio de in vivo. A imagem de cálcio captura flutuações astrocíticas, mas carece de dados de disparo neuronal. O último gargalo dos protocolos atuais parece ser o status de registro do animal; Na maioria dos protocolos, o animal é anestesiado ou em movimento livre. No entanto, a disfunção motora é considerada uma das sequelas mais problemáticas do AVC; Compreender a ligação entre certos comportamentos e os eventos de neurônios de astrócitos é essencial. Portanto, há uma necessidade urgente de um método integrado capaz de realizar um modelo de AVC fototrombótico enquanto simultaneamente captura sinais de astrócitos e neurônios em camundongos acordados realizando certos testes comportamentais. As metodologias existentes abordam apenas um subconjunto desses requisitos. A imagem de cálcio com dois fótons oferece uma resolução espacial excepcional da dinâmica dos microdomínios astrocíticos no cérebro intacto, mas exige que os animais sejam fixos na cabeça ou anestesiados, impedindo avaliação comportamental naturalista, e não pode capturar simultaneamente dados de picos neuronais^{multicanais 13}. A fotometria de fibra independente permite o monitoramento de cálcio astrocítico em animais que se comportam livremente, mas permanece cega aos padrões de disparo neuronal, não oferecendo leitura eletrofisiológica da função^{do circuito 16}. A eletrofisiologia extracelular multicanal resolve a atividade de pico das unidades neurônicas e potenciais de campo locais com alta resolução temporal, mas não fornece informações sobre o estado de sinalização dos^{astrócitos 15}. No entanto, nenhuma dessas abordagens pode simultaneamente induzir um AVC fototrombótico precisamente localizado e realizar registros multimodales a partir do mesmo local anatômico sem interrupção.

Para enfrentar as limitações técnicas existentes, propomos este sistema integrado. Esse sistema aborda todas as três limitações dentro de um único dispositivo implantado cronicamente, possibilitando indução simultânea de fototrombose, registro astrocítico de cálcio por fotometria de fibras e eletrofisiologia neuronal multicanal em camundongos acordados e de comportamento livre — desde o início do AVC até as fases crônicas do AVC. A viabilidade desse método é validada pela implantação crônica de um optrodo personalizado nos cérebros de camundongos que expressa um indicador de cálcio específico para astrócitos e um vetor viral optogenético. Usando o método, transientes de cálcio astrocítico e atividades de disparo neuronal são registrados e analisados simultaneamente durante tarefas comportamentais e sob modulações optogenéticas.

Protocolo

Esse protocolo recebeu aprovação do Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Medicina Chinesa de Guangzhou (00379474) e foi conduzido seguindo as diretrizes e regulamentos elaborados pelo Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todas as medidas possíveis foram implementadas para minimizar o número de animais utilizados neste estudo.

1. Entrega por vetor viral

NOTA: Esta seção descreve a injeção estereotáxica de vetores AAV específicos de astrócitos no córtex motor (M1FL). O objetivo é alcançar uma expressão estável e específica para astrócitos tanto do indicador de cálcio GCaMP6s quanto do construto optogenético opto-vTRAP antes da implantação do optrodo. Principais equipamentos necessários: estrutura estereotáxica, sistema digital vernier, micropipeta de vidro e bomba de microinfusão.

1. Coloque o rato na câmara de indução; Inicie a indução da anestesia com isoflurano 3%–4% e a concentração de isoflurano pode ser aumentada até no máximo 5% no primeiro minuto até que o camundongo fique sem resposta.
   ATENÇÃO: Isoflurano é um agente anestésico volátil. Realize todos os procedimentos sob ventilação ativa. Evite exposição pessoal prolongada.
2. Transfira o camundongo para a estrutura estereotáxica equipada com uma máscara anestésica e use isoflurano 1–2% para manter um plano anestésico profundo.
3. Verifique a profundidade da anestesia a cada 10 minutos por meio do ritmo respiratório, reflexo palpebral e beliscão no dedo do pé. Mantenha a temperatura corporal do mouse entre 36 e 37,5 °C com uma almofada aquecida controlada por feedback.
4. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar danos na córnea durante a cirurgia.
5. Prenda o mouse a uma estrutura estereotáxica com barras auriculares e uma barra de boca. Ajuste as barras auriculares para garantir que a cabeça do mouse esteja simetricamente fixa. Certifique-se de que a cabeça esteja imobilizada com sondagem suave.
6. Remova os pelos cuidadosamente com creme depilatório e realize uma incisão na linha média com tesoura cirúrgica para expor o crânio. Limpe o periósteo usando soro fisiológico e cotonetes para expor Bregma e Lambda.
7. Abaixe a micropipeta de vidro para tocar Bregma e Lambda sucessivamente; note a coordenada Z no vernier digital. Ajuste a barra da boca para garantir que a diferença seja <0,04 mm.
8. Abaixe a micropipeta de vidro até tocar Bregma e reajuste o vernier digital para zero. Mova a micropipeta 2,3 mm para a esquerda e direita do Bregma sucessivamente; note a coordenada Z no vernier digital. Ajuste as barras auriculares para garantir que as diferenças bilaterais estejam <0,04 mm.
9. Resetar o vernier digital para zero no Bregma e marcar o córtex motor (M1FL; AP: +1,5 mm, ML: +0,74 mm). Use uma microfuradeira com brocas de 0,5 mm (ponta redonda) para furar um pequeno furo de aproximadamente 0,5 mm de diâmetro no local marcado. Furar cuidadosamente para evitar sangramentos e danos ao tecido cerebral; Coloque solução fisiológica gelada para compensar o calor gerado durante o processo de perfuração.
10. Abaixe a micropipeta de vidro conectada a uma bomba de microinfusão até o local alvo (DV: -0,94 mm da superfície cerebral). Antes de carregar, misture AAV9-GfaABC1D-GCaMP6s e AAV9-GfaABC1D-opto-vTRAP em volumes iguais para preparar uma mistura viral. Infunde 400 nL da mistura (200 nL de cada vetor) a uma taxa de 50 nL/min.
    NOTA: O coquetel viral contém: 200 nL do indicador de cálcio específico para astrócitos (AAV-GfaABC1D-GCaMP6s, 1,0 × 10¹³ vg/mL) e 200 nL do vetor viral optogenético específico para astrócitos (AAV-GfaABC1D-opto-vTrap, 1 × 10¹³vg/mL). A transdução bem-sucedida específica para astrócitos foi verificada em um subconjunto de animais por coloração imunofluorescente para GFAP, confirmando a colocalização do repórter fluorescente com células positivas para GFAP e a ausência de expressão em células negativas para GAP.
    ATENÇÃO: Vetores AAV são agentes biológicos recombinantes; Lidar com todos os vetores virais e resíduos sob as diretrizes de biossegurança da instituição.
11. Deixe a pipeta no lugar por 10 minutos após a conclusão da infusão para permitir melhor difusão viral e evitar o refluxo. Retire lentamente a pipeta, suture o couro cabeludo (4-0, 20 mm, 3/8 de círculo) e coloque o rato em uma bolsa térmica até que ele se recupere totalmente.
    NOTA: Um período de 3 a 4 semanas é necessário para a expressão viral ideal. A linha do tempo detalhada do protocolo está ilustrada na Figura 1A.

2. Inspeção de Optrode e verificação funcional

NOTA: Antes da implantação, o optrode fabricado sob medida deve ser inspecionado fisicamente e testado opticamente para confirmar que é capaz de fornecer luz nos três modos funcionais (fototrombose, estimulação optogenética e fotometria de fibras). Principais equipamentos necessários: microscópio, medidor de potência óptica e fontes de laser em 532 nm, 488 nm, 470 nm e 405 nm.

1. Inspeção física do optrode:
   1. Coloque o optrode fabricado sob um microscópio para inspecionar a disposição dos locais de gravação.
   2. Certifique-se de que os 16 microfios de tungstênio estejam agrupados uniformemente e envolvam a fibra óptica central. Verifique se há fios dobrados ou cruzados que possam causar curtos-circuitos.
   3. Confirme que a ponta da fibra óptica é mais curta que os microfios de tungstênio (Figura 1B).
      NOTA: A ponta da fibra óptica deve estar embutida em 100-200 μm a partir das pontas do^{eletrodo 23}. Esse deslocamento, adotado de Lee et ^al.22, garante que o cone de luz cubra suficientemente a área de gravação, evitando ruído fotoelétrico excessivo. Os pesquisadores são incentivados a verificar empiricamente o deslocamento apropriado sob seu próprio optrode.
2. Conecte a fibra óptica à fonte de modelagem a laser e à fonte de gravação. Use um medidor de potência óptica para medir a saída na ponta da fibra para os seguintes três modos funcionais (Figura 1B):
   1. Modo de modelagem fototrombótica: Verifique se o sistema pode fornecer luz de onda contínua (CW) de alta intensidade (532 nm).
      NOTA: Fibra com NA 0,22 é usada neste experimento. O diâmetro estimado do ponto iluminado entre 100 e 200 μm abaixo da ponta da fibra é aproximadamente de 200 a 400 μm. Certifique-se de que a potência na ponta atinja >20 mW para garantir ativação bem-sucedida da Rose Bengal e formação de trombos.
   2. Modo de manipulação optogenética: Teste a saída do laser pulsado (por exemplo, 488 nm para opto-vTrap).
      NOTA: Calibre a potência para 10 mW na ponta; isso é otimizado para ativação opto-vTRAP na profundidade de gravação de 0,94 mm no córtex motor. Para outras regiões cerebrais, recomenda-se a verificação comportamental ou eletrofisiológica.
   3. Modo fotometria de fibra (registro de cálcio): Teste a luz de excitação de baixa potência (por exemplo, 470 nm e 405 nm).
      NOTA: Garantir que a saída seja estável e mantida em um nível muito baixo (<50 μW) para minimizar a fototoxicidade e o fotobranqueamento do indicador de cálcio (por exemplo, GCaMP6s) durante o registro de longo prazo.

3. Implantação crônica de optrode

NOTA: Esta seção aborda o procedimento cirúrgico para implantar cronicamente o optrode no local da injeção viral. A localização precisa das coordenadas de injeção é fundamental para garantir que os eletrodos de gravação e a fibra óptica amostrem a região da expressão dos GCaMP6s e opto-vTRAP. Principais equipamentos necessários: estrutura estereotáxica, microfuradeira, pinças, parafusos de cranioplastia, gel de agarose e cimento dental.

1. Para anestesia, fixação estereotáxica, preparação do crânio e equilíbrio, siga o mesmo procedimento descrito na seção 1, exceto que, durante a incisão no couro cabeludo, remova 1,5 cm × 1,5 cm do couro cabeludo, garantindo que permaneça pele suficiente ao redor dos olhos.
2. Limpe o crânio com peróxido de hidrogênio e soro fisiológico 0,9%. Identifique o Bregma e resete o vernier digital para zero.
3. Use a furadeira (0,8 mm, ponta redonda) para rugar levemente a superfície do crânio e permitir melhor aderência do cimento dentário.
4. Marque o córtex motor com um marcador (M1FL; AP: 1,5 mm, ML: 0,74 mm), depois use-o como ponto central para desenhar um quadrado de 5 mm × 5 mm (Figura 1C).
   1. Use uma microfuradeira em uma velocidade apropriada (cerca de 10.000 rpm) e trace o quadrado. Deixe cair soro gelado constantemente sobre o caminho da perfuração durante a perfuração para compensar o calor produzido pela perfuração em alta velocidade e evitar danos ao tecido cerebral. Pare imediatamente se o retalho ósseo afrouxar (Figura 1C).
5. Perfure três pequenos furos (0,5 mm de diâmetro) sobre o hemisfério contralateral e o cerebelo, e implante parafusos de cranioplastia nos furos. Certifique-se de que cada parafuso alcance a dura-mater, mas evite qualquer penetração adicional e danos extras ao tecido cerebral (Figura 1C).
6. Use pinças para remover o retalho ósseo que foi afrouxado anteriormente. Evite qualquer força adicional para baixo durante a remoção para evitar danos ao tecido cerebral e manter a dura-máter intacta.
   NOTA: Se ocorrer algum sangramento, uma esponja hemostática pode ser usada para estancar rapidamente o sangramento.
7. Use pinças com ponta ultrafina (<0,03 mm × 0,01 mm) para remover a dura-máter na janela craniana. Evite que a ponta da pinça belisque diretamente qualquer tecido cerebral durante esse processo.
   NOTA: Após a remoção do osso, é muito importante manter o tecido cerebral úmido. Recomenda-se usar bolas de algodão estéreis embebidas em soro para cobrir a janela quando não houver procedimento, para evitar inchaço e danos neuronais devido à secura.
8. Fixe o optrode no braço micromanipulador da estrutura estereotáxica e mova-o acima da janela craniana. Entrelace firmemente os fios prateados de aterramento e referência do optrode aos três parafusos de cranioplastia (Figura 1C).
9. Limpe a superfície da janela craniana com soro fisiológico estéril para garantir que não haja sangramentos ou coágulos sanguíneos que dificultem a inserção de eletrodos. Reduza lentamente o optrodo até a profundidade desejada (DV: -0,94 mm) a uma taxa de 1 μm/s.
   NOTA: O tecido cortical exposto deve ser umedecido com soro fisiológico estéril durante a implantação.
10. Aplique uma camada de agarose sobre a janela craniana após a implantação para proteger o tecido cortical do cimento dentário.
11. Aplique 3 a 4 camadas de cimento dental para cobrir o crânio exposto, garantindo que todo o optrode fique ancorado. Remova o rato da estrutura estereotáxica assim que o cimento dental ficar rígido (Figura 1C).
12. Administre analgesia por 3 a 5 dias e permita que o camundongo se recupere por 1 a 2 semanas antes de registrar e modelar.

4. Modelagem fototrombótica e registro concorrente

NOTA: Esta seção descreve a habituação comportamental, o registro basal, indução do AVC por fototrombose e procedimentos de registro longitudinal pós-AVC. A fototrombose é administrada através do optrodo implantado, enquanto a eletrofisiologia simultânea e o registro de fotometria de fibras são mantidos. Principais equipamentos necessários: aparelho rotativo, medidor de força de aderência, sistema de fotometria de fibra, sistema de gravação neural multicanal, corante Rose Bengal e fonte de laser a 530 nm.

1. Faça o rato passar por treinamento comportamental antes de modelar.
   NOTA: Todos os animais foram alojados e testados sob condições laboratoriais padronizadas. Condições de alojamento: temperatura ambiente 20–25 °C, umidade relativa 50%–60%, em um ciclo de 12 horas luz/escuro (luzes acesas às 07:00). Os animais tiveram acesso livre a comida e água durante todo o estudo. Todos os exames e procedimentos cirúrgicos foram realizados durante a fase luz. Sessões de registro comportamental foram realizadas durante a fase luz, em um horário consistente a cada dia, para minimizar a variação circadiana na atividade neuronal e na dinâmica do cálcio astrocítico. O recinto de gravação também era mantido a uma temperatura ambiente de 20–25 °C.
   1. Para o teste rotativo, faça o mouse correr continuamente na haste rotativa por 5 minutos em 3 testes consecutivos, com o rotatorio acelerando de 4 a 40 RPM em 5 minutos.
   2. Para o teste de força de aderência, faça o rato aprender a puxar a barra de teste com as patas dianteiras e complete três testes consecutivos com resultados que variam menos de 10%.
2. Defina os parâmetros de aquisição de dados para fotometria de fibra.
   1. Use um sistema de fotometria de fibra de comprimento de onda duplo ou triplo para excitar o indicador de cálcio (por exemplo, GCaMP6s). Para GCaMP6s, ajuste o canal de sinal para 470 nm e o canal de controle para 405 nm para corrigir artefatos de movimento e autofluorescência.
      NOTA: É muito importante testar novamente a potência do laser de gravação para garantir que a saída na ponta da fibra esteja entre 20 e 40 μW, evitando fotobranqueamento e fototoxicidade.
   2. Defina a taxa de amostragem de aquisição de dados para 60–100 Hz, o que será suficiente para capturar transientes de cálcio astrocíticos.
3. Defina os parâmetros de aquisição de dados para eletrofisiologia multicanal.
   1. Certifique-se de que todos os componentes do sistema de gravação (incluindo o dispositivo para o teste de força de aderência e a gaiola) estejam devidamente aterrados para reduzir o ruído. Use uma referência mediana comum (CMR) durante a gravação para eliminar artefatos globais.
      NOTA: É muito importante verificar a visão do espectrograma de sinal no sistema de gravação para garantir que não exista interferência na linha de energia e que o ruído causado por artefatos de movimento seja minimizado. Artefatos de movimento grande podem indicar falha nos parafusos e fixação do fio terra durante a cirurgia de implantação.
   2. Certifique-se de que os sinais de banda larga e LFP sejam selecionados no software de gravação e monitore qualquer ruído ocorrido durante a sessão de gravação.
4. Realize a gravação de base.
   1. Anestesiação breve com isoflurano (dentro de 60 s); Conecte o Optrode à linha de gravação por meio de um adaptador.
   2. Coloque o rato em um ambiente semelhante a uma gaiola para gravação e permita 10 minutos de aclimatação após o despertar.
   3. Realize a gravação simultaneamente ao teste de força de pegada, o mouse deve puxar a barra de teste uma vez a cada minuto por 5 minutos.
   4. Garanta que testes comportamentais sejam precisamente marcados com data e hora tanto em sistemas de fotometria multicanal quanto em fibra para permitir o alinhamento dos dados (Figura 1D).
5. Estabeleça um modelo fototrombótico.
   1. Administre uma solução de corante de Rose Bengal a 1,5% intraperitonealmente (i.p.) em uma dose de 10–20 mg/kg, aguarde 5 minutos para que o contraste circule pela vasculatura cortical.
      ATENÇÃO: Rose Bengal é um corante fotossensibilizante. Proteja o reagente da luz ambiente forte. Use luvas e proteção ocular ao manusear.
   2. Anestesie o camundongo com isoflurano seguindo os mesmos parâmetros de indução e manutenção descritos anteriormente.
   3. Quando o camundongo estiver em um plano anestésico profundo e mantido com uma máscara anestésica, conecte a sonda óptica do optrode à fonte do laser.
   4. Induza isquemia focal fornecendo um feixe de laser de 530 nm a 15 mW através do optrodo implantado por 5–8 min.
      ATENÇÃO: O laser de 530 nm a 15 mW é perigoso. Todos os pesquisadores devem usar proteção ocular de segurança a laser. Nunca olhe diretamente para a ponta da fibra durante a fototrombose.
6. Faça gravações pós-AVC.
   1. Coloque o mouse em uma almofada aquecida para a recuperação. Quando o camundongo estiver totalmente acordado (normalmente em até 10 minutos), inicie a primeira gravação aguda pós-AVC.
   2. Repita o registro diariamente para monitorar de perto o progresso da doença.
7. Realize manipulação optogenética.
   1. Além do registro dos sinais de cálcio e da emissão do feixe de laser para indução isquêmica, o optrodo também é capaz de fornecer estimulação optogenética, como mostrado em resultados representativos (Figura 4).
   2. Conecte o optrode a um estimulador a laser optogenético com comprimento de onda e potência adequados (neste caso, é 488 nm, 10 mW, 5 min para opto-vTrap), e ligue o estimulador para realizar a manipulação optogenética.

5. Pipeline de análise de dados multimodal

NOTA: Esta seção descreve o fluxo de trabalho de análise para processar os dados eletrofisiológicos multicanal (separação por picos), sinais de cálcio astrocítico (cálculo ΔF/F) e o alinhamento cruzado dos dois fluxos de dados. Software necessário: Plexon Offline Sorter (software offline de separação de picos), NeuroExplorer (software de análise de dados neurais) e software de análise de OFRs RWD (fotometria por fibra).

1. Separação de picos neuronais (Sistema Plexon):
   1. Importe os arquivos .pl2 brutos para o software offline de ordenação de picos. Aplique um filtro digital passa-banda alta (<300 Hz) para isolar a atividade de picos de alta frequência.
   2. Defina um limiar de tensão (tipicamente -5 desvios padrão do ruído) para detectar picos de potencial.
   3. Após a triagem manual e invalidação das formas de onda do ruído, utilize a função de varredura no software offline de classificação de picos para realizar análise de componentes principais (PCA) para agrupar formas de onda e escanear diferentes clusters de^{neurônios 24}.
   4. Inspecione os histogramas do intervalo entre picos (ISI). Garantir que cada "Unidade Única" tenha uma taxa de violação do ISI de <1% (refletindo o período refratário). A taxa de violação do ISI é mostrada no canto superior esquerdo de cada unidade no software offline de classificação de picos.
   5. Exporte os carimbos de data ordenados para o software de análise de dados neurais. Use o histograma de taxa e os histogramas peri-evento versus função de tempo no software de análise neural de dados para gerar histogramas de taxa e histogramas de tempo peri-estímulo (PSTH).
   6. Saia o comprimento médio da forma de onda e a taxa média de disparo de cada unidade a partir da seção estatística no software de análise de dados neurais para análise adicional.
2. Processamento de sinais de cálcio astrocítico (software de análise de fotometria de fibra)
   1. Abra os dados brutos de fluorescência (canal de 470 nm para sinal e canal de 410 nm para controle de movimento) no software de análise.
   2. Na seção de pré-processamento do sistema de fotometria de fibra, execute 410 nm como controle para correção de movimento, defina o coeficiente de suavização para 8 e escolha PLS Fit como correção de base.
   3. Calcule a variação na fluorescência (ΔF/F) usando a fórmula²⁵:
      
   4. Realize análise do sinal de cálcio dos astrócitos com base em carimbos de tempo de eventos, extraia dados peri-eventos para visualização (por exemplo, mapas de calor e traços de médias) e calcule a área sob a curva (AUC).
3. Correlação sincronizada entre astrócitos e neurônios
   1. Alinhe os picos neuronais e os sinais de cálcio dos astrócitos usando o carimbo de tempo do evento comportamental compartilhado como tempo zero.
   2. Após extrair os dados peri-eventos, alinhe os dois fluxos de dados a esse tempo zero compartilhado e visualize a correlação astrócito-neurônio (Figura 3).

Resultados

Linha do tempo experimental

A Figura 1 resume a linha do tempo experimental e os principais marcos cirúrgicos. Um intervalo de três semanas entre a injeção viral e a implantação do optrodo é fundamental para alcançar expressão adequada de GCaMP6s, e sinais robustos de cálcio astrocítico devem ser confirmados examinando os traços de fotometria de fibras durante o período de registro inicial antes da indução do AVC....

Discussão

O protocolo integrado descrito aqui apresenta um avanço significativo no estudo das interações astrócito-neurônio durante a progressão do AVC isquêmico. Ao combinar indução fototrombótica com monitoramento opto-eletrofisiológico em tempo real e manipulação optogenética, essa metodologia faz a ponte entre o início do AVC e a observação da reorganização em nível de circuito de neurônios e astrócitos. Trabalhos recentes de Boyce et al. demonstraram a viabilidade da gravação combinada de fot...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2% TTC Staining Solution	Solarbio	G3005
Agorose	Biosharp	BS081
Body Temperature Maintenance System / Homeothermic Monitor	RWD life Science	69002
Cranial Screws	Zhongke Huida	23092007
Data Acquisition and Analysis Software(Fiber photometry)	RWD life Science	ORFs
Data Acquisition and Analysis Software(Multi-channel electrophysiology)	Plexon	PlexControl, Offline Sorter, Neuroexplorer
Digital laboratory stereotactic frame	RWD life Science	68804
Forcep	FST	11252-00	Forcep diameter 0.005 mm ´ 0.025 mm
Laser power meter	Sanwa	LP10
Laser Speckle Blood Flow Imaging System	Pericam AB	Pericam PSI NR
Mice	Risemice	C57BL/6J
Miniature handheld cranial drill	RWD life Science	78001
Mouse Viral Micro-injector	RWD life Science	68025
Optrode	Customized	Kedou	Customized with 16 tungsten electrode surrounding 1 optical fiber
Prism	GraphPad	5.01 version
R studio	Posit	version 4.4.1
rAAV-GfaABC1D-GCaMP6s	BrainVTA	PT-2560	Astrocyte-specific calcium indicator
rAAV-GfaABC1D-opto-vTrap	BrainCase	BC-2446	Astrocyte-specific optogenetic viral vector
Rose Bengal Dye	Sigma-Aldrich	198250	Photosensitive dye for thrombus induction/Sigma-Aldrich
Trolley-mounted anesthesia workstation	RWD life Science	R520	Anesthesia machine for controllable inhalation anesthesia for mice