Aqui, apresentamos um protocolo para imagem intravital de um Mycobacterium tuberculosis aprovado por BSL-2 atenuado. Cepa no pulmão murino usando uma janela pulmonar permanente. Essa abordagem permite a análise longitudinal com resolução de célula única das interações precoces hospedeiro-patógeno, incluindo localização bacilar, dinâmica vascular e captação de macrófagos dentro do mesmo microambiente pulmonar.
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Artigo de método
Imagem intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado no pulmão murino durante infecção intravascular precoce
Neste artigo
Resumo
Resumo
A microscopia intravital permite a visualização direta de processos celulares dinâmicos dentro de tecidos intactos. No entanto, sua aplicação ao Mycobacterium tuberculosis (Mtb) tem sido limitada pelos requisitos de contenção do Nível de Biossegurança 3 (BSL-3) e pelos desafios técnicos de estabilizar o pulmão para imagens de alta resolução. Aqui, apresentamos um protocolo que combina a Janela Torácica para Imagem de Alta Resolução do Pulmão Murino (WHRIL) com mc27902, uma cepa tripla auxotrófica de Mtb geneticamente definida e aprovada para uso sob condições BSL-2. Também descrevemos a geração domc28471, um derivado expressor de tdTomate do mc27902, sua preparação para infecção intravenosa e a aplicação para imagem intravital em camundongos repórteres. Esse sistema permite visualização em tempo real da dinâmica precoce da infecção, incluindo a rápida entrada bacilar na vasculatura pulmonar, agregação, disseminação no parênquima pulmonar e captação de macrófagos no mesmo microambiente pulmonar nos primeiros 3 dias após a infecção. Ao permitir a imagem longitudinal de bacilos e interações hospedeiro-patógeno em resolução de célula única, essa abordagem supera limitações importantes associadas a modelos convencionais de imagem e de alta contenção. Esse protocolo fornece uma plataforma prática compatível com BSL-2 para imagens intravitais em tempo real de micobactérias atenuadas no pulmão e estabelece uma base para estudos mecanicistas de fisiologia bacteriana, reconhecimento do hospedeiro e eliminação imunomediada.
Introdução
A microscopia intravital de alta resolução transformou o estudo do comportamento celular dinâmico em tecidos intactos ao permitir a visualização direta da migração celular, interações vasculares e vigilância imune na resoluçãode célula única 1,2,3,4. Embora essas abordagens sejam amplamente utilizadas em pesquisas sobrecâncer 3,5, sua aplicação em infecções pulmonares tem sido limitada por movimentos respiratórios, fragilidade dos tecidos e restrições de biossegurança. Avanços recentes em plataformas de imagem torácica, incluindo janelas ópticas estabilizadas a vácuo e permanentemente implantadas, abordaram muitos desses desafios técnicos ao fornecer imagens estáveis e sem movimento do microambiente pulmonar por períodosprolongados 6,7,8,9,10 . Janelas permanentemente implantáveis, em particular, são ferramentas poderosas, pois permitem visualizações repetidas do fluxo vascular, dinâmica das células imunes e comportamento de célula única ao longo de horas a semanas, e foram fundamentais na definição dos mecanismos da metástase do câncer, permeabilidade vascular e vigilânciaimunológica 11,12.
Apesar desses avanços, a imagem intravital não havia sido aplicada anteriormente à infecção por Mycobacterium tuberculosis (Mtb) no pulmão in vivo de mamíferos com resolução unicelular. Os precedentes mais próximos vêm de imagens intravitais de infecções micobacterianas em outros contextos. Imagens em tempo real da infecção por Mycobacterium marinum em embriõesde peixe-zebra 13 revelaram interações precoces entre macrófagos e início de granuloma, enquanto imagens de dois fótons dos granulomas induzidos por BCG no fígadode camundongo 14,15 revelaram dinâmicas de macrófagos e células T durante o desenvolvimento do granuloma e demonstraram apresentação limitada de antígenos e função efetora das células T dentro das lesões granulomatosas. Esses estudos estabeleceram insights fundamentais sobre as interações micobacterianas hospedeiro-patógeno, mas não alcançaram o pulmão mamíferointacto 8,16.
Abordagens de imagem intravital também foram aplicadas ao pulmão em outros contextos infecciosos e biológicos, incluindo imagem pulmonargeral 8, estudos que revelam que a patrulha de macrófagos alveolares pode ocultar bactériasdo sistema imunológico 17 e caracterizam a resposta mieloide imediata à infecção por SARS-CoV-2 no pulmãohumano 16. Imagens intravitais também foram aplicadas em pulmões infectados por influenza, permitindo a visualização direta do comportamento dinâmico das células imunológicas no tecido pulmonarinfectado 18,19.
Abordagens de imagem óptica de corpo inteiro utilizando a tecnologia de excitação microendoscópicade fibra óptica 20 e fluorescência de enzimasrepórteres 21,22 permitiram a detecção sensível de Mtb em pulmões de camundongo, mas não conseguem detectar aglomerados individuais ou pequenos de bacilos, rastrear a dinâmica da agregação bacteriana ou visualizar interações diretas entre micobactérias e células hospedeiras dentro do tecido pulmonar intacto. Abordagens de imagem intravital de alta contenção foram implementadas para pulmões infectados em ambientes BSL-3, incluindo infecção porSARS-CoV-2 23 e plataformas de imagem multifótona focadas emMtb 24. Esses estudos demonstram a viabilidade de imagear pulmões infectados sob contenção, mas tais configurações continuam tecnicamente exigentes e não são amplamente acessíveis. O trabalho com MTB virulento requer contenção de BSL-3, apresentando desafios significativos de engenharia e biossegurança para imagensintravitais 23,24. Como resultado, a maioria dos estudos sobre infecção inicial por MTB depende de ensaios finais estáticos que não conseguem capturar a dinâmica espacial e temporal do comportamento bacteriano dentro do pulmão.
O desenvolvimento de cepas de MTB triplo-auxotróficas geneticamente definidas e aprovadas pela BSL-2 oferece uma oportunidade única para superar essas limitações. A cepa mc2 7902, um derivado do auxotrófico Mtb pantotenato-leucina-arginina do H37Rv, é totalmente atenuada, não se replica em camundongos imunocomprometidos, mantém a coloração ácida-resistente clássica, apresenta suscetibilidade normal a fagos e pode ser manuseada com segurança fora das instalaçõesBSL-3 25. Essas propriedades tornam omc27902 um substituto ideal para estabelecer abordagens de imagem intravital e sondar as interações precoces hospedeiro-patógeno sob redução de contenção de biossegurança.
Aqui, aplicamos a Janela para Imagem de Alta Resolução do Pulmão (WHRIL) com mc28471, um derivado fluorescente que expressa tdTomate da cepa tripla auxotrófica de Mtb mc27902, para visualizar a infecção precoce por Mtb no pulmão murino intacto. Experimentos foram realizados em camundongos Rag2-/- imunocomprometidos cruzados com camundongosMacBlue 27, nos quais o promotor Csf1r impulsiona a expressão da proteína fluorescente ciano aumentada (ECFP) em monócitos, micróglias e subconjuntos de células dendríticas e macrófagos. O transgene MacBlue permite a visualização clara das populações de fagocitos mononucleares durante a infecção inicial por MTB. Optamos por utilizar camundongos deficientes em Rag2 para focar o sistema nas interações inatas hospedeiro-patógeno mais precoces e evitar a complexidade adicional das respostas imunes adaptativas durante a curta janela de imagem examinada aqui. Importante destacar que essa técnica não se restringe a camundongos deficientes em Rag2 e também pode ser realizada em animais imunocompetentes.
Ao combinar uma janela pulmonar permanente com uma cepa de MTB atenuada fluorescente compatível com BSL-2, essa plataforma possibilita imagens intravitais seriadas das interações bacili-célula hospedeira no mesmo microambiente pulmonar com resolução de célula única durante vários dias. Embora demonstrada aqui para infecção precoce, a plataforma em si não é inerentemente restrita a pontos temporais iniciais e pode, em princípio, ser aplicada a estágios posteriores dependendo do modelo experimental e do desenho do estudo. Como a aplicação bem-sucedida dessa plataforma de imagem depende do uso da preparação bacilar fluorescente específica descrita aqui, incluímos as etapas essenciais necessárias para gerar e preparar esse reagente como parte do protocolo completo. Esta plataforma fornece imagens diretas e em tempo real do comportamento das MTB in vivo e estabelece uma base para futuros estudos mecanicistas de fisiologia bacteriana, reconhecimento do hospedeiro e eliminação mediada pelo sistema imunológico.
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Protocolo
Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança e cuidado animal, e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal do Albert Einstein College of Medicine (IACUC). A cepa mc28471 é um transformador pYUB1169 do mc27902, uma cepa de MTB tripla auxotrófica aprovada para uso em BSL-2. Todo o trabalho envolvendo bactérias vivas foi realizado usando precauções padrão para o manuseio de micobactérias.
1. Construção da cepa Mtb tdTomato aprovada pela BSL-2 mc28471
- Geração do mc 2 8471 BSL-2-safe que expressa tdTomato por transformação plasmídica
- Transforme a cepa tripla-auxotrófica aprovada pela BSL-2 mc27902 com o plasmídeo micobacteriano epissomal pYUB1169, que contém o gene tdTomato expresso do promotor G13, para gerar o derivado fluorescente mc28471.
- Inocule 100 μL de mc2 7902(densidade óptica a 600 nm (OD600 nm) de 0,7-1,0) em 10 mL de Middlebrook 7H9 estéril suplementado com enriquecimento OADC (10% (v/v)), glicerol (0,2% (v/v)), D-pantotenato (24 mg/L), L-leucina (50 mg/L), L-arginina (200 mg/L), propionato de sódio (0,1 mM) e tyloxapol (0,05% (v/v)) em um frasco de tinteiro de 30 mL.
- Incube a cultura, agitando lentamente (100 rpm) a 37 °C até atingir OD600 nm de 0,7-1,0.
- Transfira as células para um tubo cônico de centrífuga de 15 mL e centrifuge por 10 minutos a 3.000 x g em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 mL de glicerol estéril a 10% contendo 0,05% (v/v) de tyloxapol (wash #1). Repita centrifugação e lava duas vezes. Ressuspenda o pellet celular em 0,175 mL de glicerol 10% contendo 0,05% (v/v) de tiloxapol e adicione 2 μL de DNA pYUB1169 (100-200 ng de DNA).
- Transfira o mc27902 e o pYUB1169 para uma cubeta de eletroporação de 0,2 cm. Espere 10 minutos. Toque a conceta 2x a 3x para remover bolhas de ar e eletropore a 2.500 mV, 1.000 Ω, 25 μF, constante de tempo 20 ms, em temperatura ambiente.
- Adicione 1 mL de Middlebrook 7H9 estéril suplementado com enriquecimento OADC (10% (v/v)), glicerol (0,2% (v/v)), D-pantotenato (24 mg/L), L-leucina (50 mg/L), L-arginina (200 mg/L), propionato de sódio (0,1 mM) e tiloxapol (0,05% (v/v)) à cuveta e transfira o conteúdo da cubeta para um tubo cônico de centrífuga de 15 mL. Incube o tubo enquanto agita a 37 °C durante a noite.
- Placa de 0,1 mL da mistura de transformação sobre uma placa de ágar Middlebrook 7H10 suplementada com enriquecimento OADC (10% (v/v)), glicerol (0,2% (v/v)), D-pantotenato (24 mg/L), L-leucina (50 mg/L), L-arginina (200 mg/L), propionato de sódio (0,1 mM) e kanamicina (20 mg/L). Centrifuge a mistura de transformação restante, descarte 0,9 mL do sobrenadante e resuspenda a pastilha celular no sobrenadante residual. Coloque as células ressuspensas em uma segunda placa de ágar Middlebrook 7H10, contendo os mesmos suplementos e antibióticos. Incube as placas a 37 °C por 3–4 semanas. Colônias rosas indicam transformantes bem-sucedidos.
- Escolha uma colônia rosa isolada e cultive-a a 37 °C, agitando lentamente, em 5 mL de Middlebrook 7H9 estéril suplementado com enriquecimento OADC (10% (v/v)), glicerol (0,2% (v/v)), D-pantotenato (24 mg/L), L-leucina (50 mg/L), L-arginina (200 mg/L), propionato de sódio (0,1 mM), tiloxapol (0,05% (v/v)) e 20 mg/L de kanamicina em um frasco de tinteiro de 30 mL.
- Preparação do MC28471 para infecção intravenosa
- Cultive 10 mL demc28471 a 37 °C, agitando lentamente, em Middlebrook 7H9 estéril suplementado com enriquecimento OADC (10% (v/v)), glicerol (0,2% (v/v)), D-pantotenato (24 mg/L), L-leucina (50 mg/L), L-arginina (200 mg/L), propionato de sódio (0,1 mM), tiloxapol (0,05% (v/v)) e 20 mg/L de kanamicina em um frasco de tinteiro de 30 mL até a fase média logaritaria (OD600 nm deve estar entre 0,7 e 1,0).
- Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL e centrifuge por 10 minutos a 3.000 x g em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 mL de soro salino estéril tamponado com fosfato contendo 0,05% (v/v) de tiloxapol (PBS-T, wash #1). Repita centrifugação e lava duas vezes. Resuspenda o pellet celular em 4 mL de PBS-T e sonice as células com potência de 100 W, 2x 1.000 J.
- Meça a densidade óptica da cultura e dilua-a em PBS-T para uma concentração final de 5 x 106 CFUs por injeção, usando a conversão aproximada de que um OD600 nm de 1 corresponde a 1 x 108 CFU/mL. Como essa relação pode variar com as condições de deformação e crescimento, OD600 nm deve ser calibrado empiricamente em relação aos valores de CFU placadas para garantir precisão e reprodutibilidade.
2. Implante permanente de janela pulmonar em camundongos para imagem intravital
- Prepare um mouse Rag2KO MacBlue para imagem intravital. Neste estudo, foi utilizado um camundongo macho de 10 semanas pesando 30 g. No entanto, camundongos de ambos os sexos, com idades entre 8 e 12 semanas de idade e dentro da faixa de peso esperada para essa idade, são adequados para esse procedimento. Essa cepa expressa proteína fluorescente ciano (ECFP) aprimorada em macrófagos em um fundo de knockout Rag2 e foi gerada cruzando camundongos B6.129S6-Rag2tm1FwaN12 (Rag2, Modelo RAGN12) com camundongos Tg (Csf1r-GAL4/VP16, UAS-ECFP)1Hume/J (Stock No. 026051).
- Implante a Janela para Imagem de Alta Resolução do Pulmão (WHRIL) 24 horas antes da infecção bacteriana para fornecer acesso óptico estável ao pulmão e permitir a recuperação antes da imagem.
- Induza anestesia com 5% de isoflurano em uma câmara de indução. Confirme a profundidade adequada da anestesia antes de iniciar qualquer procedimento e monitore o animal durante a cirurgia e a imagem para evitar dor, sofrimento ou comprometimento respiratório.
- Administrar analgesia pré-operatória: injetar 10 μL (0,1 mg/kg) de buprenorfina diluída em 90 μL de PBS estéril por via subcutânea.
- Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea durante a anestesia.
- Amarre um ponto de seda 2-0 na base de um cateter 22G, deixando caudas de ~2 polegadas para fixar o cateter.
- Intube o camundongo com o cateter atado por sutura. Visualize a abertura traqueal por transiluminação e confirme a posição usando um bulbo de inflação (subida bilateral do tórax).
NOTA: A intubação inadequada pode causar trauma nas vias aéreas ou ventilação inadequada. Prossiga somente após a confirmação da colocação correta pela expansão bilateral do peito. - Fixe o cateter de intubação amarrando o ponto de seda 2-0 ao redor do focinho após a intubação bem-sucedida. Conecte o cateter ao ventilador.
- Coloque o camundongo no decúbito lateral direito sobre uma plataforma cirúrgica aquecida para expor o tórax esquerdo, depois fixe os membros anteriores, posteriores e costas com fita adesiva para manter a posição estável durante todo o procedimento.
- Reduza o isoflurano para 3% pelo restante da cirurgia. Remova pelos da parte superior esquerda do tórax usando creme depilatório.
- Prepare o campo cirúrgico com uma solução antisséptica. Levante a pele e faça uma incisão circular de 5-10 mm com um punção de biópsia (33-35-SH) aproximadamente 7 mm à esquerda do esterno e 7 mm acima da margem subcostal, centralizada sobre o espaço intercostal do6º ao7º .
- Inspecione o campo exposto em busca de embarcações superficiais. Se for necessária divisão de um vaso visível, cauterize ambas as extremidades para manter a hemostasia. Remova o tecido mole sobrejacente para expor claramente as costelas antes de entrar na cavidade torácica.
- Segure e eleve a 6ª ou 7ª costela com pinças e perfure suavemente o músculo intercostal entre elas usando tesouras micro-dissecantes rombas (lado arredondado voltado para o pulmão) para entrar na cavidade torácica.
NOTA: Entre na cavidade torácica de forma suave e sob visualização direta para evitar lacerações no pulmão, nos vasos intercostais ou nos tecidos ao redor. - Aplique rajadas curtas e suaves de ar comprimido na abertura intercostal para esvaziar temporariamente a superfície pulmonar adjacente e separá-la da parede torácica antes de criar a abertura da janela.
- Posicione o punção de biópsia na ferramenta de corte e guie a ferramenta de corte pela abertura intercostal, mantendo-a paralela à parede torácica. Faça um defeito circular de 5 mm na caixa torácica.
- Coloque um ponto de cordão de bolsa de seda 5-0 a ~1 mm da borda do defeito circular, passando entre as costelas adjacentes para circundar a abertura.
- Assente a moldura da janela de modo que as bordas do defeito da parede torácica se encaixem no sulco da estrutura, depois aperte e fixe o ponto de cordão da bolsa para travar a estrutura no lugar.
- Coloque adesivo gel de cianoacrilato em uma seringa de 1 mL. Levante suavemente a estrutura para separá-la do pulmão e depois aplique uma fina camada de adesivo de cianoacrilato na superfície inferior da estrutura.
- Seque a superfície do pulmão usando um fluxo contínuo e suave de ar comprimido até que a superfície pareça fosca.
NOTA: Use apenas um fluxo de ar suave e evite a secagem prolongada, pois força excessiva ou secagem excessiva podem ferir a superfície pulmonar e prejudicar a aderência da janela. - Usando pressão positiva na extremidade expiratória (PEEP), infle o pulmão e depois fixe a janela na estrutura. Solte o PEEP e mantenha pressão na moldura da janela por 20-30 segundos.
NOTA: Pressão excessiva durante a inflação ou colocação do quadro pode danificar o pulmão ou comprometer a vedação. Aplique apenas a pressão mínima necessária para alcançar uma aposição suave. - Coloque uma segunda sutura de cordão de seda 5-0 a <1 mm da borda da incisão da pele. Esconda a pele sob a moldura, certifique-se de que qualquer pele extra seja capturada sob a moldura da janela ou aparada, depois aperte firmemente o ponto do cordão da bolsa e amarre com firmeza.
- Usando um captador a vácuo, aplique uma camada muito fina de adesivo na parte inferior do engobe de 5 mm, raspando o excesso na borda de um vidro retangular da cobertura. Novamente, seque a superfície dos pulmões com um fluxo contínuo e suave de ar comprimido.
- Posicione o revestimento circular dentro do reentrimento da moldura da janela em um ângulo raso (~15°) acima da superfície pulmonar. Aumente brevemente a pressão nas vias aéreas para inflar o pulmão, depois gire o coverslip para uma posição paralela de modo que a superfície do pulmão fique oposta à parte inferior do vidro. Mantenha uma pressão suave por aproximadamente 25 segundos enquanto o adesivo fixa, depois desconecte o captador a vácuo da lâmina de cobertura.
NOTA: Evite prender bolhas ou aplicar excesso de adesivo durante a colocação do coverslip, pois pode reduzir a qualidade da imagem, prejudicar a vedação ou ferir a superfície do pulmão. - Aplique uma pequena quantidade de cianoacrilato líquido na interface entre o engobe de cobertura e a estrutura metálica para reforçar a vedação hermética.
- Prenda uma agulha estéril em uma seringa de insulina de 1 mL. Insira a agulha logo abaixo do processo xifoide e avance em direção ao ombro esquerdo através do diafragma até a cavidade torácica. Aspire suavemente para remover o ar intratorácico residual.
NOTA: Avance a agulha com cuidado para evitar perfurar o pulmão, o coração ou os principais vasos. Aspire suavemente e somente até que o ar residual seja removido. - Desligue o isoflurano e continue ventilando com 100% de oxigênio até que uma frequência respiratória quase normal ao despertar esteja quase retomada. Não deixe o animal descuidado durante a recuperação. Se a respiração espontânea normal não retomar prontamente, forneça o cuidado de suporte adequado ou faça a eutanásia de acordo com as diretrizes institucionais.
- Remova o ponto de fixação, extube o rato e coloque-o em uma gaiola limpa e aquecida para recuperação. Monitore o animal até que esteja totalmente em movimento; Camundongos que não recuperam a respiração normal devem ser eutanasiados de acordo com as diretrizes institucionais.
- Administrar analgesia pós-operatória: injetar 10 μL (0,1 mg/kg) de buprenorfina diluída em 90 μL de PBS estéril por via subcutânea.
3. Imagem intravital
- Permita que os camundongos se recuperem após a implantação da janela antes da imagem. Realize exames de imagem de 1 a 5 dias após a cirurgia.
- Induza anestesia com isoflurano a 3% e mantenha-se em 1,5% durante toda a duração da imagem.
- Insira o adaptador personalizado para a placa de palco e a moldura da janela entre a pele e a borda externa da moldura pulmonar da janela e fixe uma placa padrão de palco para microscópio usando fita adesiva.
- Coloque o mouse com o adaptador personalizado de moldura de placa para janela acoplado ao palco de tradução do microscópio. Mantenha a temperatura corporal em ~37 °C usando uma câmara aquecida por ar forçado com loop de feedback do sensor de temperatura.
- Com o camundongo na placa do palco, puxe suavemente a pele ao redor do olho do lado da injeção para expor o canto medial e injete FITC-dextrano (150 kDa; 20 mg/mL, 100 μL) retro-orbitalmente para marcar a vasculatura.
- Adquira imagens instantâneas, z-stack ou time-lapse da vasculatura pulmonar antes da injeção bacteriana, utilizando os seguintes parâmetros.
- Para configurações de microscopia confocal: Profundidade de bits: 12 bits, Taxa de quadros: 2 fps, Tamanho da imagem: 512 × 512 pixels, Tamanho do pixel: 0,497 μm/pixel, 0,994 μm/pixel, Tamanho do passo Z: 2 μm, Profundidade total de z: 50–70 μm, Média de quadros: 3, Velocidade de varredura: 2 μs/pixel (977 linhas/s), Comprimentos de onda de excitação a laser: 405 nm, 488 nm, 559 nm, Potência do laser na amostra: 230 μW (405 nm), 75 μW (488 nm), 40 μW (559 nm), Filtros de detecção: 430-470 nm (Azul), 505-540 nm (Verde), 575-675 nm (Vermelho), Ganhos do detector: 800 V para Azul, 650 V para Verde, 700 V para Vermelho, Diâmetro do orifício: 60 μm ou 1 unidade Airy para 559 nm
- Para microscopia multifotônica, utilize os mesmos parâmetros de imagem usados na microscopia confocal, exceto que um laser de excitação de 920 nm foi usado com potência de laser de 25 mW na amostra.
- Injetar retro-orbitalmente 5 x 106 CFUs tdTomato expressing mc28471.
NOTA: Realize injeções retroorbitais apenas com treinamento e contenção adequados, pois uma técnica inadequada pode causar lesão ocular, sangramento ou falha na entrega do inóculo. - Adquira imagens instantâneas, z-stack e time-lapse de células e vasculares marcadas por tuberculose e fluorescência usando os parâmetros de imagem em 3.6.1 e 3.6.2. Ajuste o ganho de todos os detectores para maximizar o sinal, evitando a saturação do detector.
- Após a imagem, desligue o isoflurano e retire o mouse do microscópio. Mantenha o rato aquecido e monitore até a recuperação total.
- Repita a imagem nos seguintes momentos após a injeção de MC28471: 0-60 min, 6 horas e 3 dias. Para cada sessão de imagem, reinjete FITC-dextrano (100 μL, retro-orbitalmente) para visualizar a vasculatura, e então adquira imagens conforme descrito nos passos 3.8-3.9.
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Resultados
Após eletroporação e seleção de canamicina, colônias isoladas de mc28471 apresentaram fluorescência vermelha brilhante, confirmando a expressão estável de tdTomate. Os bacilos MC28471 foram expandidos, preparados como uma suspensão de célula única e administrados por via intravenosa a camundongos portadores de WHRIL implantado cirurgicamente. Imagens intravitais foram realizadas para visualizar a dinâmica inicial da infecção por Mtb no microambiente pulmonar. Para e...
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Discussão
Esta plataforma aborda uma lacuna real na pesquisa sobre tuberculose ao permitir a visualização direta das interações entre bacilos e células hospedeiras no pulmão intacto do mamífero sob condições BSL-2. Estratégias prévias de imagem in vivo, incluindo detecção óptica de corpo inteiro usando excitação microendoscópicade fibra óptica 20, imagem de fluorescência enzimáticarepórter 21 e Mtb22 fluorescente no i...
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesses.
Agradecimentos
Esse trabalho foi apoiado pelas seguintes bolsas: AI26170; A Fundação Família Evelyn-Lipper e o Centro Biofotônico Gruss Liper. Agradecemos o apoio da Instalação de Imagem Analítica, apoiada pela Subvenção P30 do Centro de Câncer do NCI CA013330.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 15 ml conical tube | Corning | 430790 | |
| 2-0 silk tie | Ethicon, Inc | LA55G | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| 5-0 silk purse-string suture | Ethicon, Inc | 640G | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Injeção de 10 μL de buprenorfina (solução de estoque de 0,3 mg/mL) diluída em 90 μL de PBS estéril (dose final = 0,1 mg/kg) |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 234790 | |
| D-calcium pantothenate | Acros | 243305000 | |
| ECM 630 Electroporation System Complete, with Safety stand | BTX Harvard Apparatus | 45-0051 | |
| Electroporation cuvette | Fisher Scientific | FB102 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S-1G | 150 kDa |
| Glycerol | Fisher Chemicals | G33-1 | |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | Para agarrar e elevar a costela durante o procedimento de implantação da janela pulmonar |
| Isoflurane | Pivetal | 78949580 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Kanamycin | Goldbio.com | K-120-25 | |
| L-arginine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | A5131-100G | |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| MacBlue mice | Jackson Labs | Strain #: 026051 | |
| Middlebrook 7H10 Agar | Difco | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 broth | Difco | 271310 | |
| Middlebrook OADC Enrichment | Becton Dickinson | 212351 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| PETG media inkwell bottle | Thermo Scientific | 342020 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-5623 | Para monitorar o volume tidal do mouse’s via intubação durante a cirurgia |
| Plasmid pYUB1169 | Plasmid custom made | ||
| Rag2 KO mice | Jackson Labs | Strain #: 008449 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Sodium propionate | Thermo Scientific | A17440.36 | |
| Sonicator | Fisher Scientific | FB705 | |
| Sorval Centrifuge X pro series | Thermo Scientific | 75009020 | |
| Spectrophotometer Genesys 10 UV | Thermo Spectronic | 335903 | |
| SurgiSuite | Kent Scientific | SURGI-M02 | Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22G |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T0307-50G | |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
Referências
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