NEAT1-Mediada Disfunção da Barreira Intestinal por Ligação com miR-29b-3p em Células Caco-2 Danificadas por Lipopolissacarídeo

Resumo

Este estudo avaliou NEAT1 como marcador diagnóstico e regulador da disfunção da barreira intestinal na síndrome do intestino irritável com predomínio de diarreia. NEAT1 estava elevado no soro dos pacientes, ligava-se ao miR-29b-3p e seu silenciamento melhorou os parâmetros de barreira, apoptose e inflamação em células Caco-2 danificadas por lipopolissacarídeo.

Resumo

A patogênese da síndrome do intestino irritável com diarreia (SII-D) é pouco clara, e as terapias disponíveis permanecem limitadas. Este estudo avaliou o valor diagnóstico de NEAT1 na SII-D e explorou seu possível mecanismo regulador. Foram incluídos 116 pacientes com SII-D e 116 controles saudáveis. Os níveis séricos de NEAT1 e miR-29b-3p foram detectados por PCR quantitativa em tempo real com transcrição reversa (RT-qPCR), e curvas de característica operacional do receptor (ROC) foram utilizadas para avaliar o valor diagnóstico. Para estudos mecanicistas, foi estabelecido um modelo de células epiteliais intestinais Caco-2 tratadas com lipopolissacarídeo (LPS). A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio com o kit de contagem celular-8 (CCK-8), a apoptose por citometria de fluxo, a integridade da barreira pela resistência elétrica transepitelial (TEER) e os níveis de mRNA de ZO-1, ocludina e claudina-2 por RT-qPCR. Ensaios de repórter de dupla luciferase (DLR) e de imunoprecipitação de RNA (RIP) foram utilizados para verificar a relação de ligação entre NEAT1 e miR-29b-3p. NEAT1 apresentou alta expressão, e miR-29b-3p baixa expressão em pacientes com SII-D, e seus níveis mostraram forte correlação negativa. O silenciamento de NEAT1 aumentou os níveis de miR-29b-3p, melhorou a viabilidade celular e a TEER, reduziu a apoptose, aumentou os níveis de mRNA de ZO-1 e ocludina, diminuiu os níveis de mRNA de claudina-2 e atenuou os indicadores associados à lesão da barreira em células Caco-2 tratadas com LPS. Em conjunto, esses resultados indicam que NEAT1 sérico é um biomarcador candidato para SII-D e que o eixo NEAT1/miR-29b-3p pode estar envolvido na disfunção da barreira intestinal.

Introdução

A síndrome do intestino irritável com diarreia (IBS-D) é uma desordem gastrointestinal funcional comum, caracterizada por dor abdominal, distensão abdominal e alterações nos hábitos intestinais¹. Atualmente, o mecanismo fisiopatológico da IBS-D ainda não foi totalmente elucidado². Os métodos de tratamento são majoritariamente paliativos, com eficácia limitada e alta taxa de recorrência³. Acredita-se geralmente que a IBS-D envolva a interação de múltiplos fatores, tais como a desregulação do eixo cérebro-intestino, hipersensibilidade visceral, inflamação intestinal de baixo grau e disfunção da barreira intestinal^4,5. Embora esses critérios tenham padronizado o diagnóstico em certa medida, eles são subjetivos e podem levar a atrasos no diagnóstico ou a classificações incorretas, especialmente quando os sintomas do paciente se sobrepõem aos da doença inflamatória intestinal ou de outras doenças orgânicas. Na prática clínica habitual, atualmente não existem biomarcadores objetivos validados para a IBS-D. Portanto, investigar um novo alvo molecular que possa servir como ferramenta diagnóstica e tenha potencial valor terapêutico tornou-se uma necessidade urgente na atual área de pesquisa da IBS-D.

Nos últimos anos, os RNAs não codificantes longos, como moléculas-chave na regulação epigenética, demonstraram grande potencial como marcadores diagnósticos e alvos terapêuticos em diversas doenças^6,7. A causa principal da DII-D é a disfunção da barreira intestinal⁸. A destruição das proteínas das junções apertadas leva ao "vazamento intestinal", o que por sua vez ativa a resposta imune da mucosa^9,10. A ativação do sistema imunológico libera diversos fatores pró-inflamatórios que podem causar disfunção intestinal ao ativar o sistema imunoneural intestinal. Estudos indicaram que alguns lncRNAs podem regular a barreira epitelial intestinal^11,12. O NEAT1 foi relatado como superexpresso no tecido da mucosa colônica de pacientes com colite¹³. A inibição do lncRNA NEAT1 pode aliviar a disfunção nas células epiteliais intestinais (IECs) na colite ulcerativa¹⁴. No entanto, o perfil de expressão do NEAT1 na DII-D e seu valor diagnóstico ainda não foram investigados. Além disso, o NEAT1 pode ter potencial como biomarcador diagnóstico¹⁵. Se o NEAT1 for expresso de forma anormal no soro de pacientes com DII-D, isso poderia complementar os critérios atuais de Roma IV, fornecendo uma ferramenta diagnóstica molecular. Enquanto isso, o perfil de expressão do miRNA também mudou significativamente em pacientes com DII. Por exemplo, a subexpressão do miR-29b-3p foi associada à patogênese da DII¹⁶. No entanto, os mecanismos reguladores upstream que controlam a expressão do miR-29b-3p na DII-D permanecem completamente inexplorados. Em particular, o papel do NEAT1 como RNA endógeno competitivo (ceRNA) do miR-29b-3p no contexto da DII-D nunca foi investigado, embora esse mecanismo já esteja bem estabelecido em outras doenças^17,18. Além disso, embora estudos anteriores tenham se concentrado principalmente na expressão em nível tecidual, o potencial do NEAT1 circulante como biomarcador sérico não invasivo para o diagnóstico da DII-D permanece totalmente desconhecido.

Hipotetizamos que o lncRNA-NEAT1 pode participar na regulação da função da barreira intestinal na DII-D ao atuar como uma ceRNA que sequestra o miR-29b-3p. Com base no contexto de pesquisa acima, este estudo tem como objetivos: (1) avaliar os níveis de NEAT1 e miR-29b-3p no soro de pacientes com DII-D e seu valor diagnóstico; (2) validar a interação direta de ligação entre NEAT1 e miR-29b-3p; e (3) elucidar o papel funcional do eixo NEAT1/miR-29b-3p na regulação da integridade da barreira intestinal e da inflamação, utilizando um modelo de células Caco-2 tratadas com LPS.

Protocolo

Inclusão de pacientes

Todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito após compreenderem plenamente o conteúdo da pesquisa. O Comitê de Ética do Hospital Popular da Nova Área de Pudong, Xangai, revisou e aprovou este protocolo de pesquisa (n.º 2024k007). O tamanho da amostra foi calculado utilizando o G*Power: o teste selecionado foi o teste t, e o teste estatístico foi planejado para detectar diferenças entre duas amostras independentes. Com um tamanho do efeito d = 0,5, α = 0,05 e poder estatístico = 0,9, o cálculo indicou que um mínimo de 86 indivíduos deveria ser incluído em cada grupo. Para levar em conta circunstâncias imprevistas potenciais durante o ensaio, 116 pacientes foram incluídos em cada grupo. Um total de 116 pacientes com SII-D que procuraram o Hospital Popular da Nova Área de Pudong, Xangai, entre julho de 2024 e julho de 2025, foram incluídos neste estudo como grupo experimental. Os critérios de inclusão foram: (1) SII-D que atendem aos critérios diagnósticos de Roma IV; (2) colonoscopia indicando ausência de lesões orgânicas na mucosa. Critérios de exclusão: (1) pacientes com doença inflamatória intestinal (DII), câncer colorretal, etc.; (2) pacientes diabéticos; (3) pacientes com histórico recente de cirurgia abdominal; e (4) pacientes com insuficiência grave cardíaca, hepática ou renal. Paralelamente, 116 voluntários saudáveis que correspondiam às características demográficas dos pacientes, como idade e sexo, foram recrutados como grupo controle. Os controles saudáveis foram confirmados como não tendo histórico de doenças gastrointestinais crônicas ou sintomas clínicos correspondentes. Foram coletados cinco mililitros de sangue venoso periférico de todos os indivíduos. O sobrenadante foi então transferido para um congelador de ultra-baixa temperatura a -80 °C para criopreservação antes da subsequente extração de RNA.

Cada participante preencheu um questionário de 10 dias para registrar as seguintes manifestações clínicas: (a) avaliação da intensidade da dor abdominal utilizando uma escala visual analógica de 10 pontos; (b) frequência da dor abdominal durante o período do levantamento (número de dias com dor); (c) frequência das evacuações (número máximo de evacuações por dia); (d) Escala de Características Fecais de Bristol para avaliar as características das fezes. O estado emocional dos participantes foi avaliado utilizando a Escala de Ansiedade e Depressão Hospitalar (HADS).

Cultura celular e modelagem

As células Caco-2 foram cultivadas rotineiramente em meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina, em incubadora a 37 °C e 5% de CO₂. A linhagem celular Caco-2 diferencia-se espontaneamente em uma monocamada polarizada de células com junções apertadas e microvilosidades, exibindo características morfológicas e funcionais semelhantes às das células epiteliais intestinais maduras. O LPS desencadeia uma resposta inflamatória e rompe as junções apertadas no epitélio intestinal, aumentando a permeabilidade intestinal — um processo altamente semelhante às características patológicas da DII-D. Além disso, considerando que células Caco-2 tratadas com LPS têm sido amplamente utilizadas em estudos anteriores^19,20,21 para modelar disfunção da barreira e inflamação relacionadas à DII, o tratamento com lipopolissacarídeo (LPS) em células Caco-2 foi escolhido neste estudo para estabelecer um modelo in vitro de DII-D. Após as células atingirem aproximadamente 80% de confluência, o meio de cultura foi substituído por meio completo contendo 5 µg/ml de LPS²², e as células foram estimuladas por 24 h. Células cultivadas convencionalmente sem LPS foram utilizadas como grupo controle.

Transfeção de células

Para investigar os papéis de NEAT1 e miR-29b-3p em células Caco-2, as células Caco-2 foram transfectadas. As células foram divididas em seis grupos, conforme a seguir: 1. grupo controle (sem tratamento); 2. grupo LPS; 3. grupo LPS + si-NC; 4. grupo LPS + si-NEAT1; 5. grupo LPS + si-NEAT1 + inibidor NC; e 6. grupo LPS + si-NEAT1 + inibidor de miR-29b-3p. Foram projetados e sintetizados dois RNAs interferentes pequenos (si-NEAT1) direcionados ao NEAT1: si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) e si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). Um siRNA com sequência aleatória não direcionada (si-NC) foi utilizado como controle negativo. Paralelamente, o inibidor de miR-29b-3p e seu controle negativo também foram sintetizados. Inibidor de miR-29b-3p: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. Controle negativo: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.

Células Caco-2 foram semeadas em placas de 24 poços e transfectadas quando os cultivos atingiram 60–70% de confluência, seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, 1,25 µL de siRNA foi diluído em 25 µL de meio com soro reduzido para obter uma concentração final de siRNA de 50 nM. Para inibição de miRNA, 2 µL do inibidor de miR-29b-3p ou seu controle negativo foi diluído em 25 µL de meio com soro reduzido até uma concentração final de 100 nM. Separadamente, 1,5 µL do reagente de transfeção foi misturado com 25 µL de meio com soro reduzido. O siRNA diluído (ou inibidor/controle negativo) foi então misturado ao reagente de transfeção diluído para formar o complexo de transfeção, que foi adicionado gota a gota às células. Seis horas após a transfeção, a mistura de transfeção foi substituída por meio completo fresco, e as células foram mantidas por mais 48 h antes dos ensaios funcionais subsequentes. A eficiência da redução ou inibição foi confirmada por RT-qPCR antes de experimentos adicionais.

PCR quantitativa reversa em tempo real (RT-qPCR)

O RNA total foi isolado de amostras de soro e de células Caco-2 submetidas aos tratamentos indicados. Resumidamente, cada amostra foi lisada com 1 mL do reagente de extração de RNA e combinada com 200 µL de clorofórmio. Após centrifugação a 12.000 × g por 15 min a 4 °C, a fase aquosa superior foi transferida para um tubo novo, misturada com 500 µL de isopropanol e mantida a −20 °C por 30 min. As amostras foram então centrifugadas a 12.000 × g por 10 min a 4 °C. O pellet de RNA resultante foi lavado duas vezes com etanol a 75%, seco ao ar e ressuspenso em 20 µL de água livre de RNase. O rendimento e a pureza do RNA foram medidos com um microespectrofotômetro, e somente amostras com A₂₆₀/A₂₈₀ valores de 1,8–2,0 foram utilizados. O RNA foi transcrito reversamente em cDNA seguindo o protocolo do fabricante. Para a detecção de NEAT1, ZO-1, occludina, claudina-2, e GAPDH, 1 µg de RNA total foi utilizado para cada reação de 20 µL de transcrição reversa contendo 1× tampão RT, 0,5 mM dNTPs, 0,5 µM de iniciador oligo(dT), 200 U de transcriptase reversa e água livre de RNase. A reação foi realizada a 37 °C por 15 min, seguida pela inativação da enzima a 85 °C por 5 s.

A PCR quantitativa foi realizada com cDNA como molde, utilizando um sistema de PCR em tempo real baseado em SYBR Green. Os níveis de expressão de NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, occludina, e claudina-2 foram medidos com primers específicos para cada gene. U6 foi utilizado como gene de referência para miR-29b-3p, enquanto GAPDH foi usado para normalizar NEAT1 e os genes relacionados às junções apertadas. A expressão relativa foi calculada utilizando o método 2−ΔΔCt. As sequências dos primers estão listadas na Tabela 1.

Ensaio de viabilidade celular

Células Caco-2 na fase log foram semeadas em placas de 96 poços a 1 × 10⁴ células por poço. Foram montados um grupo controle em branco (contendo apenas o meio de cultura), um grupo controle (células não tratadas) e um grupo experimental (células Caco-2 sob diferentes condições de tratamento), com 5–6 poços em duplicata em cada grupo. As células foram distribuídas em quatro pontos temporais: 0, 24, 48 e 72 h. Uma placa de cultura separada foi preparada para cada ponto temporal para evitar a abertura repetida do incubador durante as medições. Após o período de cultura, adicionou-se 10 µL de solução CCK-8 a cada poço, evitando a formação de bolhas. Em seguida, a placa de cultura foi devolvida ao incubador a 37 °C e 5% de CO₂ e incubada no escuro por 2 h. A absorbância de cada poço foi medida imediatamente a 450 nm utilizando um leitor de microplacas. Por fim, a viabilidade celular foi expressa como uma porcentagem.

Ensaio de apoptose celular

A apoptose foi quantificada por citometria de fluxo após coloração com anexina V-FITC/PI. Células Caco-2 de cada grupo de tratamento foram coletadas e lavadas duas vezes com PBS frio. A centrifugação foi realizada a 300 × g durante 5 min a 4 °C. O pellet celular foi então ressuspenso em 100 µL de tampão de ligação 1×, seguido da adição sequencial de 5 µL de anexina V-FITC e 5 µL de PI. Após mistura suave, as amostras foram incubadas por 15 min à temperatura ambiente, no escuro. Em seguida, foram adicionados 300 µL de tampão de ligação 1×, e a suspensão foi cuidadosamente homogeneizada antes de ser transferida para um tubo de citometria de fluxo de 5 mL. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo dentro de 1 h.

Resistência elétrica transepitelial (TEER)

A permeabilidade foi avaliada mediante a medição dos valores de resistência transepitelial (TEER) de células Caco-2²³. As células Caco-2 foram inoculadas em câmaras Transwell e cultivadas por 21 dias para formar uma monocamada densa. Foram realizadas seis réplicas biológicas independentes para cada condição experimental, bem como cinco réplicas técnicas para cada condição. Antes e após o tratamento experimental, os valores de TEER de cada grupo foram medidos com um medidor de resistência transepitelial, utilizando eletrodos esterilizados com etanol e equilibrados com PBS. Resumidamente, a haste longa do eletrodo foi imersa no meio de cultura basolateral e a haste curta no meio de cultura apical, evitando o contato com a membrana de filtro. Após a estabilização, o valor da resistência (Ω) foi registrado, e as medições foram repetidas até que três leituras consistentes fossem obtidas. A resistência de filtros Transwell em branco (sem células) foi medida nas mesmas condições, e esse valor foi subtraído de todas as leituras experimentais. TEER (Ω·cm²) = (resistência da amostra – resistência do branco) × área efetiva da membrana. Os dados são apresentados como: (grupo experimental/grupo controle) × 100%.

Ensaio imunoenzimático (ELISA)

Os sobrenadantes de células Caco-2 de diferentes grupos de tratamento foram coletados após 24 h de cultivo. Os níveis de citocinas pró-inflamatórias, incluindo fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8) e interleucina-1β (IL-1β), foram medidos utilizando reagentes comerciais de ELISA de acordo com as instruções do fabricante. O ensaio foi realizado rigorosamente conforme as instruções. As amostras e os padrões foram adicionados às placas previamente revestidas com anticorpos, seguidos de incubação e lavagem. Em seguida, foi adicionado o anticorpo de detecção biotinilado. Após nova incubação e lavagem, foi adicionada a estreptavidina marcada com peroxidase de rábano-picante. Por fim, o substrato TMB foi adicionado para desenvolvimento da coloração, e a reação foi interrompida com a solução de parada. A absorbância de cada poço foi medida imediatamente a 450 nm utilizando um leitor de microplacas.

Western blot

As proteínas foram isoladas de células Caco-2 após os tratamentos indicados utilizando tampão RIPA contendo inibidores de protease. Os níveis de proteína foram medidos por meio de ensaio de ácido bicinconínico (BCA). Para cada amostra, 30 µg de proteína foram carregados por poço, separados em géis de SDS-PAGE a 10% e transferidos para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas em leite desnatado a 5% durante 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos contra ZO-1 (1:1.000), occludina (1:500), claudina-2 (1:1.000) e GAPDH (1:5.000). Após lavagem, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados à HRP por 1 h à temperatura ambiente. As bandas foram detectadas por quimiluminescência aprimorada (ECL) e a intensidade das bandas foi analisada utilizando o ImageJ. O GAPDH foi utilizado como controle de carga.

Ensaio de repórter duplo de luciferase (DLR)

Os locais potenciais de ligação do miR-29b-3p à sequência de NEAT1 foram previstos por meio do banco de dados ENCORI (https://rnasysu.com/encori/). Posteriormente, fragmentos de NEAT1 contendo locais de ligação do tipo selvagem (WT) ou mutantes (MUT) foram clonados no vetor repórter pmirGLO. O plasmídeo recombinante construído foi cotransfectado nas células com análogos do miR-29b-3p (Sentido: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antissentido: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) ou inibidores e seus respectivos controles negativos (mimic NC, Sentido: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antissentido: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’). Quarenta e oito horas após a transfeção, as células foram coletadas e as atividades da luciferase de vaga-lume e da luciferase de renila foram determinadas utilizando um reagente de detecção de dupla luciferase. A atividade da luciferase de renila foi utilizada como referência interna para padronização.

Ensaio de imunoprecipitação de RNA (RIP)

Para o ensaio de RIP, células Caco-2 foram coletadas, lavadas com PBS e incubadas no gelo por 15 min em 200 µL de tampão de lise RIP suplementado com inibidores de protease e RNase. Os lisados celulares foram centrifugados a 16.000 × g durante 10 min a 4 °C, e 10 µL de cada sobrenadante foram mantidos como controle de entrada. Para imunoprecipitação, 40 µL de microesferas magnéticas Protein A/G foram rotacionados com 5 µg de anticorpo anti-Ago2 ou IgG normal em 200 µL de tampão de lavagem RIP por 30 min à temperatura ambiente. Após três lavagens com 500 µL de tampão de lavagem RIP, 100 µL da suspensão de microesferas foram combinados com 100 µL de lisado, ajustados para um volume final de 1 mL com tampão de lavagem RIP e incubados durante a noite a 4 °C com rotação. As microesferas foram então lavadas cinco vezes com 500 µL de tampão de lavagem RIP e ressuspendidas em 150 µL do mesmo tampão. A digestão proteica foi realizada pela adição de 15 µL de proteinase K (20 mg/mL) e 15 µL de SDS a 10%, seguida de incubação a 55 °C por 30 min com agitação. O sobrenadante foi coletado e o RNA foi isolado com o reagente de extração e precipitado durante a noite. O enriquecimento de NEAT1 e miR-29b-3p foi então avaliado por RT-qPCR.

Análise da localização subcelular

Células Caco-2 foram separadas em frações nuclear e citoplasmática utilizando o reagente comercialmente disponível de separação nuclear-citoplasmática referenciado, seguindo as instruções do fabricante. O RNA total foi extraído desses dois componentes, e a distribuição de NEAT1 no núcleo e no citoplasma foi detectada por RT-qPCR. A calibração foi realizada utilizando U6 (predominantemente nuclear) e mRNA de GAPDH (predominantemente citoplasmático) como indicadores da eficiência de separação.

Análise estatística

Para amostras clínicas de soro, uma análise de potência (t-teste, d = 0,5, α = 0,05, potência = 0,9) indicou que era necessário um mínimo de 86 indivíduos por grupo. Para levar em conta circunstâncias imprevistas potenciais durante o ensaio, 116 pacientes foram incluídos em cada grupo para detectar diferenças clinicamente significativas. A normalidade dos dados para variáveis contínuas foi avaliada utilizando o teste de Shapiro-Wilk. Como todos os dados contínuos apresentavam distribuição normal (P > 0,05), foram aplicadas análises paramétricas. Variáveis categóricas foram analisadas utilizando o teste qui-quadrado. Experimentos baseados em células incluíram seis réplicas biológicas independentes, com cinco réplicas técnicas para cada réplica biológica. Os dados são apresentados como média ± DP. Comparações entre dois grupos de variáveis contínuas foram realizadas utilizando o t-teste de Student, enquanto comparações entre múltiplos grupos foram analisadas por ANOVA unifatorial seguida pelo teste post hoc de Tukey. A significância estatística foi definida como P < 0,05.

Resultados

Expressão de NEAT1 e valor diagnóstico

Em comparação com o grupo controle saudável (CS), os níveis de expressão de NEAT1 em pacientes com IBS-D foram significativamente mais altos (P < 0,0001; Figura 1A). A área sob a curva (AUC) de NEAT1, conforme mostrado pela curva característica de operação do receptor (ROC), foi de 0,867 (IC 95%: 0,821–0,913). Sua especificidade foi de 75,9%, enquanto sua sensibilidade foi de 84,5% (Figura 1B). Isso sugere que a expressão anormal de NEAT1 no soro de pacientes com IBS-D pode servir como um novo biomarcador diagnóstico para a condição.

Além disso, os dados clínicos dos pacientes nos grupos saudável e IBS-D foram comparados. Os resultados não mostraram diferenças significativas entre os dois grupos quanto à idade, sexo ou outras características (P > 0,05). No entanto, houve diferenças significativas nos escores do HADS, nas evacuações intestinais e nas formas das fezes (P < 0,0001, Tabela 2). Em relação à frequência da dor abdominal, 69 pacientes apresentaram sintomas por ≥ 5 dias, correspondendo a 59,48% dos casos. Quanto à gravidade da dor abdominal, 72 pacientes tiveram escore ≥ 5, representando 62,07% (Tabela 2). Isso indica que os pacientes com IBS-D são claramente distinguíveis do grupo controle pelos seus sintomas. Dada a associação clínica entre os níveis elevados de NEAT1 e os sintomas de IBS-D, investigamos em seguida o impacto funcional de NEAT1 na integridade da barreira intestinal utilizando um modelo de células Caco-2 tratadas com LPS.

Efeitos de baixos níveis de NEAT1 no dano à barreira intestinal e nas respostas inflamatórias em células Caco-2 tratadas com LPS

Para modelar a disfunção da barreira intestinal e a inflamação de baixo grau observadas na DII-D, tratamos células Caco-2 com LPS. Quando o LPS foi adicionado às células, NEAT1 os níveis foram regulados para cima em comparação com o grupo controle. Após transfeção com si-NEAT1, o NEAT1 nível foi acentuadamente reduzido em comparação com o grupo LPS + si-NC (P < 0.0001, Figura 2A). O tratamento com LPS reduziu a viabilidade celular e aumentou a apoptose em relação ao grupo controle. Após a eliminação NEAT1, a viabilidade celular aumentou e a taxa de apoptose diminuiu em comparação com o grupo LPS + si-NC (P < 0.001; Figura 2B, C). Após silenciar NEAT1, o TEER reduzido pelo LPS foi significativamente restaurado (P < 0.0001, Figura 2D). O LPS reduziu a expressão de mRNA de ZO-1 e occludina e expressão aumentada de claudina-2 em relação aos controles, enquanto NEAT1 a diminuição revertida essas alterações (P < 0.001, Figura 2E-). O tratamento com LPS pode desencadear uma resposta inflamatória em células. Os níveis dos fatores pró-inflamatórios TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-1β nas células foram maiores do que no grupo controle. Após a silenciamento de NEAT1, o conteúdo de fatores pró-inflamatórios nas células foi significativamente reduzido em comparação com o grupo si-NC (P < 0.0001, Figura 3A-D). Isso sugere que baixos NEAT1 níveis reduzem a disfunção da barreira intestinal induzida por LPS e as respostas inflamatórias, e que NEAT1 pode contribuir para a progressão da DII-D.

Associação direta de NEAT1 e efeitos sobre o miR-29b-3p em células Caco-2

Em células Caco-2, NEAT1 é encontrado principalmente no citoplasma (Figura 4A). Os sítios de ligação de NEAT1 e miR-29b-3p foram previstos pelo banco de dados ENCORI. Com base nisso, projetamos as sequências WT-NEAT1 e MUT-NEAT1 (Figura 4B). Os resultados do experimento DLR indicaram que os mimetizadores de miR-29b-3p reduziram a atividade enzimática de WT-NEAT1 em relação ao NC do mimetizador, enquanto seus inibidores a aumentaram em relação ao NC do inibidor. Por outro lado, nenhum dos tratamentos teve influência sobre MUT-NEAT1 (P < 0,0001, Figura 4C). O ensaio de RIP revelou que NEAT1 e miR-29b-3p estavam acentuadamente abundantes na fração anti-Ago2 em comparação com o grupo anti-IgG, indicando uma interação específica entre os dois (P < 0,0001, Figura 4D). Esses resultados indicam que NEAT1 se liga especificamente a miR-29b-3p. Enquanto isso, o nível de miR-29b-3p foi notavelmente reduzido em pacientes com IBS-D em comparação ao grupo HC (P < 0,0001, Figura 4E). A AUC da curva ROC foi de 0,856 (IC 95%: 0,808–0,905), com sensibilidade de 89,7% e especificidade de 71,6% (Figura 4F). A análise de correlação de Pearson revelou uma correlação inversa entre os níveis de NEAT1 e a expressão de miR-29b-3p (r = -0,744, P < 0,0001, Figura 4G).

Efeitos da baixa expressão de NEAT1 no dano à barreira intestinal em células Caco-2 tratadas com LPS e nos níveis de miR-29b-3p

Em células Caco-2 tratadas com LPS, a expressão de miR-29b-3p foi significativamente reduzida em comparação com o grupo controle. A transfeção com si-NEAT1 aumentou os níveis de miR-29b-3p, enquanto a transfeção com o inibidor de miR-29b-3p reduziu novamente os níveis de miR-29b-3p (P < 0,0001, Figura 5A). O silenciamento de NEAT1 aumentou a viabilidade celular e diminuiu a apoptose, e esses efeitos foram anulados pelo inibidor de miR-29b-3p (P < 0,01, Figura 5B,C). A redução induzida pelo LPS no TEER foi restaurada pelo silenciamento de NEAT1, e essa restauração foi novamente impedida pelo inibidor de miR-29b-3p (P < 0,0001, Figura 5D). O tratamento com LPS levou à diminuição da expressão de mRNA de ZO-1 e occludina e ao aumento da expressão de mRNA de claudina-2 em comparação com o grupo controle. Após o silenciamento de NEAT1, os níveis de miR-29b-3p aumentaram, os níveis de mRNA de ZO-1 e occludina aumentaram e os níveis de mRNA de claudina-2 diminuíram em comparação com o grupo LPS + si-NC. Após a inibição de miR-29b-3p, os níveis de mRNA de ZO-1 e occludina diminuíram, e os níveis de mRNA de claudina-2 aumentaram em comparação com o grupo LPS + si-NEAT1 + inibidor NC (P < 0,001, Figura 5E-G). NEAT1 (principalmente o subtipo citoplasmático NEAT1_1) atua como esponja para miR-29b-3p. O silenciamento de NEAT1 libera miR-29b-3p, regulando indiretamente para cima ZO-1 e occludina e regulando para baixo claudina-2, o que atenua a ruptura da barreira induzida pelo LPS. Esses resultados sugerem que, neste modelo, miR-29b-3p regula positivamente a expressão de ZO-1 e occludina e negativamente a claudina-2, e que os efeitos do silenciamento de NEAT1 são mediados, ao menos em parte, por miR-29b-3p.

Examinamos ainda os níveis de expressão das proteínas das junções íntimas por meio de análise de western blot. Conforme mostrado na Figura 5H, o silenciamento de NEAT1 aumentou a expressão reduzida pelo LPS de ZO-1 e ocludina e suprimiu a expressão de claudina-2 em comparação com o grupo LPS + si-NC. No entanto, a co-transfecção com um inibidor de miR-29b-3p enfraqueceu o efeito protetor do silenciamento de NEAT1 em comparação com o grupo LPS + si-NEAT1 + inibidor NC. Esses resultados apoiam a conclusão de que o silenciamento de NEAT1 restaura a expressão das proteínas das junções íntimas, pelo menos em parte, por meio da upregulação de miR-29b-3p, melhorando assim a função da barreira intestinal.

Efeitos dos níveis baixos de NEAT1 na inflamação intestinal em células Caco-2 tratadas com LPS e na expressão de miR-29b-3p

Em células Caco-2 tratadas com LPS, o LPS desencadeou uma resposta inflamatória. Os níveis dos fatores pró-inflamatórios TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-1β foram significativamente mais altos do que no grupo controle. Após o silenciamento de NEAT1, os níveis de miR-29b-3p aumentaram, enquanto os níveis dos fatores pró-inflamatórios diminuíram significativamente em comparação com si-NC. Após a inibição de miR-29b-3p, os níveis dos fatores inflamatórios aumentaram novamente (P < 0,0001, Figura 6A-D). Portanto, o silenciamento de NEAT1 suprime a liberação de citocinas inflamatórias, pelo menos em parte, por meio da upregulação de miR-29b-3p.

Esses resultados indicam que os níveis de NEAT1 estão anormalmente elevados no soro de pacientes com IBS-D e que NEAT1 apresenta uma alta AUC para distinguir pacientes com IBS-D de controles saudáveis. Mecanicamente, NEAT1 se liga diretamente e sequestra o miR-29b-3p no citoplasma. Em modelos celulares e experimentos de resgate funcional, o silenciamento de NEAT1 aumentou a expressão do miR-29b-3p, melhorou a sobrevivência celular e o TEER, reduziu a apoptose e atenuou a liberação de citocinas pró-inflamatórias. Esses achados sustentam a hipótese de que NEAT1 regula negativamente a integridade da barreira intestinal ao inibir o miR-29b-3p e sugerem que o direcionamento de NEAT1 pode oferecer uma estratégia diagnóstica e terapêutica potencial para o IBS-D.

Disponibilidade dos dados:

Os dados brutos subjacentes às figuras e tabelas são fornecidos como Arquivo Suplementar 1 (planilha de dados brutos) e Arquivo Suplementar 2 (imagens não editadas de western blot).

Figura 1. Expressão e valor diagnóstico de NEAT1 em pacientes com IBS-D. (A) Níveis de expressão de NEAT1 no soro de controles saudáveis (HC, n = 116) e pacientes com IBS-D (n = 116) detectados por RT-qPCR; (B) Análise da curva ROC de NEAT1 para discriminar pacientes com IBS-D de controles saudáveis. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 116 por grupo). **** P < 0,0001. Abreviações: IBS-D = síndrome do intestino irritável com diarreia; ROC = característica de operação do receptor. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 2. Efeito do NEAT1 sobre a lesão da barreira intestinal induzida por LPS em células Caco-2. (A) A transfeção com si-NEAT1 reduz os níveis de NEAT1 induzidos por LPS; (B) Viabilidade celular medida pelo ensaio CCK-8 aos 0, 24, 48 e 72 h. O silenciamento do NEAT1 aumenta a viabilidade celular; (C) Taxa de apoptose determinada por citometria de fluxo com coloração por Annexina V-FITC/PI. O silenciamento do NEAT1 reduz as taxas de apoptose; (D) Resistência elétrica transepitelial (TEER) medida em monocamadas de Caco-2. A inibição do NEAT1 aumenta o TEER celular; (E-G) Níveis de expressão de mRNA de (E) ZO-1, (F) occludina e (G) claudina-2 medidos por RT-qPCR. O silenciamento do NEAT1 eleva a expressão de mRNA de ZO-1 e occludina e diminui os níveis de mRNA de claudina-2. Os dados são apresentados como média ± DP de seis experimentos independentes (n = 6 por grupo). *** P < 0,001; **** P < 0,0001, LPS comparado ao controle, LPS + si-NEAT1 comparado ao LPS + si-NC. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Figura 3. Efeito do silenciamento de NEAT1 na liberação de citocinas pró-inflamatórias induzida por LPS em células Caco-2. (A-D) Concentrações de (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8 e (D) IL-1β nos sobrenadantes de cultura celular medidas por ELISA. O silenciamento de NEAT1 reduz os níveis de TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-1β induzidos por LPS. Os dados são apresentados como média ± DP de seis experimentos independentes (n = 6 por grupo). **** P < 0,0001, LPS versus controle, LPS + si-NEAT1 versus LPS + si-NC. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 4. Ligação direta de NEAT1 e associação com miR-29b-3p. (A) Localização subcelular de NEAT1 em células Caco-2 determinada por fracionamento nuclear-citoplasmático (U6: controle nuclear, GAPDH: controle citoplasmático). NEAT1 está principalmente localizado no citoplasma; (B) Sequências preditas de ligação WT e MUT de NEAT1 para miR-29b-3p provenientes do banco de dados ENCORI; (C) O ensaio DLR confirmou a relação de ligação entre NEAT1 e miR-29b-3p; (D) RIP confirmou a relação de ligação entre NEAT1 e miR-29b-3p. Os dados em A, C e D são média ± DP de seis experimentos independentes (n = 6 por grupo). (E) Níveis de expressão sérica de miR-29b-3p em controles saudáveis (HC, n = 116) e pacientes com IBS-D (n = 116); (F) Curva ROC de miR-29b-3p para discriminar pacientes com IBS-D de controles saudáveis; (G) Análise de correlação de Pearson entre os níveis de NEAT1 e miR-29b-3p em pacientes com IBS-D. NEAT1 apresentou correlação negativa com a expressão de miR-29b-3p (r = -0,744, P < 0,0001). Os dados em E são média ± DP (n = 116 por grupo). **** P < 0,0001. Abreviaturas: WT = tipo selvagem; MUT = mutante; DLR = repórter duplo de luciferase; RIP = imunoprecipitação de RNA. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Figura 5. Efeitos do silenciamento de NEAT1 na função da barreira intestinal em células Caco-2 tratadas com LPS e na miR-29b-3p. (A) O silenciamento de NEAT1 aumenta os níveis de miR-29b-3p, enquanto a transfeção com inibidores de miR-29b-3p reduz a expressão de miR-29b-3p. (B) Viabilidade celular medida pelo ensaio CCK-8. Baixos níveis de NEAT1 aumentam a viabilidade celular ao elevar a miR-29b-3p; (C) Taxa de apoptose determinada por citometria de fluxo. Baixos níveis de NEAT1 reduzem a taxa de apoptose ao aumentar a miR-29b-3p; (D) Baixos níveis de NEAT1 aumentam a resistência elétrica transepitelial (TEER) das células ao elevar o nível de miR-29b-3p; (E-G) Expressão de mRNA de (E) ZO-1, (F) occludina e (G) claudina-2. Baixos níveis de NEAT1 aumentam a expressão de ZO-1 e occludina e reduzem a expressão de mRNA de claudina-2 ao potencializar a miR-29b-3p. (H) Imagens representativas de western blot mostrando a expressão proteica de ZO-1, occludina, claudina-2 e GAPDH sob as condições de tratamento indicadas. Os dados são apresentados como média ± DP de seis experimentos independentes (n = 6 por grupo). ** P < 0,01; *** P < 0,001; **** P < 0,0001, LPS versus controle, LPS + si-NEAT1 versus LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + miR-inibidor versus LPS + si-NEAT1 + inibidor NC. Abreviatura: miR-inibidor = inibidor de miR-29b-3p; TEER = resistência elétrica transepitelial. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Figura 6. Efeitos do silenciamento de NEAT1 na inflamação em células Caco-2 tratadas com LPS e na miR-29b-3p. (A-D) Concentrações de (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8 e (D) IL-1β nos sobrenadantes do cultivo celular medidos por ELISA. Baixos níveis de NEAT1 reduzem o conteúdo de TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-1β no sobrenadante celular ao aumentar a miR-29b-3p. Os dados são apresentados como média ± DP de seis experimentos independentes (n = 6 por grupo). **** P < 0,0001, LPS versus controle, LPS + si-NEAT1 versus LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + miR-inibidor versus LPS + si-NEAT1 + inibidor NC. Abreviação: miR-inibidor = inibidor de miR-29b-3p. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gene	Sequência da ponta
NEAT1 sentido	5’-GTGGCTGTTGGAGTCGGTAT-3’
NEAT1 antissentido	5’-TAACAAACCACGGTCCATGA-3’
ZO-1 sentido	5’-GCCGCTAAGAGCACAGCAA-3′
ZO-1 antissentido	5’-TCCCCACTCTGAAAATGAGGA-3’
Occludin sentido	5’-ATGGCAAAGTGAATGACAAGCGG-3’
Occludin antissentido	5’-CTGTAACGAGGCTGCCTGAAGT-3’
Claudin-2 sentido	5’-GTGACAGCAGTTGGCTTCTCCA-3’
Claudin-2 antissentido	5’-GGAGATTGCACTGGATGTCACC-3’
miR-29b-3p sentido	5’-GCTCTAGATCAGTTACAGAAAGACCACGA-3’
miR-29b-3p antissentido	5’-GCTCTAGATAGTGTCCATGCACGGACC-3’
GAPDH sentido	5’-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3’
GAPDH antissentido	5’-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3’
U6 sentido	5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’
U6 antissentido	5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’

Tabela 1: Sequências dos iniciadores.

Indicador	Grupo controle (N=116)	Grupo IBS-D (N=116)	P
Idade, anos
< 40	63	54	0,293
≥ 40	53	62
Sexo
Masculino	64	66	0,895
Feminino	52	50
Tabagismo
NÃO	58	53	0,599
SIM	58	63
Consumo de álcool
NÃO	63	58	0,599
SIM	53	58
HADS, pontuação
< 8	96	26	< 0,0001
≥ 8	20	90
Movimentos intestinais, número/dia
< 4	103	51	< 0,0001
≥ 4	13	65
Forma das fezes, escore de Bristol
< 5	87	25	< 0,0001
≥ 5	29	91
Frequência de dor abdominal, número de dias
< 5	/	47	/
≥ 5	/	69
Intensidade da dor abdominal, pontuação
< 5	/	44	/
≥ 5	/	72

Tabela 2: Comparação das características demográficas e clínicas entre controles saudáveis e pacientes com SII-D. Os valores são apresentados como contagem de participantes em cada grupo (n = 116/grupo). As diferenças entre os grupos foram avaliadas utilizando o teste qui-quadrado. Abreviação: HADS = Escala Hospitalar de Ansiedade e Depressão; IBS-D = síndrome do intestino irritável com diarreia.

Arquivo Suplementar 1: Dados brutos subjacentes às figuras e tabelas. Este arquivo contém os dados numéricos brutos utilizados para gerar os resultados quantitativos apresentados na Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5 e Figura 6, e os dados demográficos/clínicos resumidos na Tabela 2.Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Imagens brutas de western blot. Este arquivo contém as imagens brutas de western blot para ZO-1, occludina, claudina-2 e GAPDH correspondentes ao painel representativo de western blot mostrado na Figura 5H.Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A DII é uma desordem funcional gastrointestinal comum. Seu mecanismo patológico ainda não foi totalmente elucidado. Nos últimos anos, os lncRNA, como moléculas-chave na regulação epigenética, demonstraram grande potencial no campo do diagnóstico e tratamento de doenças. O lncRNA NEAT1 tem sido estudado em diversas doenças, como câncer colorretal²⁴, glioma²⁵ e infarto do miocárdio²⁶. Múltiplos estudos mostraram que o NEAT1 participa da regulação das respostas inflamatórias¹³, da proliferação celular²⁷ e da integridade da barreira intestinal²⁸. No entanto, a expressão específica do NEAT1 na DII, seu valor clínico e os mecanismos regulatórios subjacentes à DII ainda não foram amplamente explorados.

NEAT1 é regulado positivamente em diversas condições inflamatórias, como pneumonia²⁹, osteoartrite³⁰, rinite³¹ e sepse³². Nossos resultados estão de acordo com os relatados nesses estudos: a expressão de NEAT1 é significativamente aumentada em pacientes com IBS-D. Isso sugere que ela pode estar associada ao início do IBS-D. Atualmente, o diagnóstico do IBS-D baseia-se principalmente nos critérios sintomáticos de Roma IV, e não há biomarcadores laboratoriais objetivos disponíveis. Embora esses critérios tenham se mostrado eficazes em pesquisas e em muitos contextos clínicos, ainda apresentam limitações, incluindo subjetividade, sobreposição de sintomas com outras doenças e atrasos diagnósticos. A análise adicional da curva ROC indica que NEAT1 possui valor diagnóstico relativamente bom em pacientes com IBS-D. Os níveis séricos de expressão de NEAT1 distinguem eficazmente pacientes com IBS-D de controles saudáveis, com uma AUC de 0,867 e alta sensibilidade e especificidade. Isso sugere que NEAT1 tem potencial como ferramenta para complementar os critérios de Roma IV no diagnóstico ou como um novo marcador diagnóstico para IBS-D. Por exemplo, pacientes que apresentam dor abdominal crônica e alterações nos hábitos intestinais e que possuem níveis elevados de NEAT1 podem ser avaliados com maior confiança quando os resultados do biomarcador são considerados juntamente com os critérios de Roma IV. Isso facilita o início precoce de tratamentos direcionados aos sintomas e evita exames invasivos desnecessários. Por outro lado, em pacientes com resultados normais do biomarcador, mas que atendem aos critérios de Roma IV, é recomendado um acompanhamento mais rigoroso para excluir outras doenças orgânicas. Portanto, a integração desses biomarcadores na prática clínica deve melhorar a precisão e a eficiência diagnóstica, embora ainda seja necessária validação prospectiva em ambientes clínicos.

Os sintomas clínicos apresentados por pacientes com SII-D podem estar relacionados à função de barreira intestinal prejudicada³³. Essa função é mediada principalmente pela estrutura das junções apertadas (TJ) entre as células epiteliais intestinais, nas quais as proteínas ZO-1 e ocludina desempenham papéis importantes^34,35. A ZO-1 está envolvida na manutenção da barreira mecânica e da permeabilidade do epitélio mucoso³⁶. A ocludina é principalmente responsável pela formação das junções apertadas entre as células, as quais são cruciais para manter sua função de barreira³⁷. A proteína da junção apertada claudina-2 desempenha um papel importante na formação de canais porosos de desvio celular, entre outras funções³⁸. Em pacientes com SII-D, as proteínas ZO-1 e ocludina geralmente estão reduzidas, a claudina-2 está aumentada, a barreira intestinal está danificada e a permeabilidade está aumentada. Este estudo constatou que o silenciamento de NEAT1 aumentou o valor de TEER no modelo celular in vitro, o que apoia um efeito prejudicial de NEAT1 sobre a barreira intestinal nesse modelo. Em nível molecular, a inibição da expressão de NEAT1 levou a uma significativa recuperação nos níveis de expressão de mRNA das proteínas-chave das junções apertadas, ZO-1 e ocludina, enquanto a expressão da claudina-2 diminuiu. Isso sugere que NEAT1 pode regular negativamente a expressão das proteínas das junções apertadas, interrompendo a barreira física do epitélio intestinal e aumentando sua permeabilidade. Em última instância, isso pode levar ao fenômeno do "intestino permeável". Além disso, a inflamação de baixo grau amplamente presente no SII-D é um fator importante que agrava os danos à barreira³⁹. Inúmeros estudos confirmaram que os lncRNAs podem atuar como nós reguladores-chave nas vias de sinalização inflamatória⁴⁰. Nossa pesquisa está de acordo com isso. O silenciamento de NEAT1 reduziu significativamente a liberação das citocinas pró-inflamatórias TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-1β induzida pelo LPS. Isso é altamente semelhante ao papel de NEAT1 como um lncRNA pró-inflamatório em outros modelos inflamatórios, indicando que, no SII-D, pode existir um ciclo vicioso de inflamação-dano da barreira-inflamação, no qual NEAT1 desempenha um papel importante.

MicroRNAs (miRNAs) são outra classe importante de fatores envolvidos na regulação de doenças. O miR-29b-3p é pouco expresso em diversas respostas inflamatórias celulares induzidas por LPS^41,42. Em consonância com a maioria dos estudos, observamos que os níveis de miR-29b-3p estavam significativamente reduzidos no soro de pacientes com IBS-D e apresentavam uma forte correlação negativa com NEAT1 upregulação. Demonstramos ainda que NEAT1 liga-se diretamente e sequestra o miR-29b-3p no citoplasma neste modelo. O experimento de resgate funcional mostrou ainda que NEAT1 afeta a viabilidade e a apoptose de células Caco-2, bem como os níveis de ZO-1, occludina, e o mRNA da claudina-2, pelo menos em parte por meio do miR-29b-3p, e, em última instância, influencia a integridade da barreira intestinal. Notavelmente, nossos dados indicam que, no contexto da disfunção da barreira intestinal associada à SII, os níveis de miR-29b-3p apresentam correlação positiva com ZO-1 e níveis de occludina. Essa regulação positiva pode ser indireta; por exemplo, o miR-29b-3p pode suprimir a transcrição de proteínas das junções apertadas ao direcionar seus repressores transcricionais, removendo assim a repressão e promovendo a expressão de ZO-1 e occludina. Essa hipótese também é apoiada por estudos anteriores, que relataram que o miR-29b-3p exerce um papel protetor em condições inflamatórias ao direcionar reguladores negativos da função de barreira⁴².

No entanto, os genes-alvo pelos quais o miR-29b-3p regula a expressão do mRNA de ZO-1 e da ocludina exigem investigação adicional para completar a rede ceRNA, o que representa uma limitação do nosso estudo atual. Além disso, nosso estudo apresenta outras limitações: primeiro, foi um estudo unicêntrico com um tamanho de amostra relativamente pequeno (apenas 116 pacientes com IBS-D foram incluídos). O valor diagnóstico clínico do NEAT1 ainda precisa ser validado por meio de estudos de coorte prospectivos em larga escala e multicêntricos. Segundo, este estudo baseia-se principalmente em análises clínicas de associação e modelos celulares in vitro. No futuro, serão necessários modelos animais para verificar o papel desse eixo in vivo. Terceiro, a rede específica de genes-alvo downstream do miR-29b-3p envolvida na patogênese do IBS-D ainda não foi totalmente elucidada. Estudos futuros devem focar em: (1) validar o valor diagnóstico do NEAT1 e do miR-29b-3p em pacientes com IBS-C e IBS-M; (2) testar a eficácia terapêutica de intervenções direcionadas ao NEAT1 em modelos animais; e (3) elucidar o mecanismo molecular preciso pelo qual o miR-29b-3p regula as proteínas das junções íntimas. Tais esforços facilitarão a translação clínica de nossos achados.

Em conclusão, NEAT1 é altamente expresso em pacientes com IBS-D e possui bom valor diagnóstico nessa coorte. Níveis baixos de NEAT1 podem promover a viabilidade celular, reduzir a apoptose, aliviar os danos à barreira intestinal e suprimir respostas inflamatórias mediante o aumento dos níveis de miR-29b-3p em células Caco-2 tratadas com LPS. O eixo NEAT1/miR-29b-3p fornece uma nova perspectiva sobre os mecanismos fisiopatológicos complexos do IBS-D. NEAT1 pode atuar como um biomarcador diagnóstico potencial para IBS-D, e o eixo NEAT1/miR-29b-3p pode representar um alvo terapêutico potencial para essa condição.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de 24 poços	Corning	CLS3524	Para semeadura de células
Placas de 96 poços	Corning	CLS3599	Para semeadura de células em ensaios CCK-8
Kit de apoptose Annexina V-FITC/PI	Invitrogen	V13242	Para detecção das taxas de apoptose
Anticorpo monoclonal anti-AGO2	Proteintech	67934-1-Ig	Para imunoprecipitação de complexos de RNA ligados ao Ago2
Anticorpo anti-Claudina-2	Invitrogen	32-5600	Anticorpo primário, diluição 1:1000
Anticorpo anti-GAPDH	Cell Signaling Technology	5174	Anticorpo primário, diluição 1:5000; controle de carga
Anticorpo anti-IgG humano	Proteintech	10284-1-AP	Utilizado como controle negativo para o ensaio de RIP
Anticorpo anti-Ocludina	Abcam	ab31721	Anticorpo primário, diluição 1:500
Anticorpo anti-ZO-1	Proteintech	21773-1-AP	Anticorpo primário, diluição 1:1000
Células Caco-2	SUNNCELL	SNL-068	Para construção de modelos de barreira epitelial intestinal
Kit CCK-8	Solarbio	CA1210	Kit de ensaio de proliferação celular
Clorofórmio	Sigma-Aldrich	C2432	Para separação de fases na extração de RNA
Meio DMEM	Gibco	11965092	Para cultivo celular
Kit de ensaio Dual-Luciferase Reporter	ThermoFisher	16186	Para detecção da atividade de luciferase
Kit ELISA (para IL-1β)	R&D Systems	DY201	Para detecção de proteínas-alvo em sobrenadantes de cultivo celular
Kit ELISA (para IL-6)	R&D Systems	D6050B	Para detecção de proteínas-alvo em sobrenadantes de cultivo celular
Kit ELISA (para IL-8)	R&D Systems	NBP3-28022	Para detecção de proteínas-alvo em sobrenadantes de cultivo celular
Kit ELISA (para TNF-α)	R&D Systems	DTA00D	Para detecção de proteínas-alvo em sobrenadantes de cultivo celular
Substrato de quimioluminescência aprimorada (ECL)	Thermo Fisher	32106	Para visualização de bandas proteicas
Etanol (75%)	Sigma-Aldrich	459844	Para lavagem do pellet de RNA
SFB (Soro Fetal Bovino)	Gibco	10099141	Para cultivo celular
Citômetro de fluxo	Beckman Coulter	B53002	Para detecção das taxas de apoptose
Anticorpos secundários conjugados à HRP	Cell Signaling Technology	7074	Catalisam a geração de sinal quimioluminescente a partir de substratos ECL
Isopropanol	Sigma-Aldrich	1133502500	Para precipitação de RNA
Lipofectamina 3000	ThermoFisher	L3000015	Reagente de transfeção
Lipopolissacarídeo (LPS)	Sigma-Aldrich	L2880	Para indução da construção do modelo celular
Leitor de microplacas	BioTek	Epoch 2	Para detecção da absorbância de amostras em placas de 96 poços
Microsspectrofotômetro Nanodrop	Thermo Scientific	ND-2000C	Para determinação da concentração e pureza de RNA
Leite desnatado em pó	Coolaber	CN7861	Para bloqueio de membranas (solução a 5%)
Kit PARIS	Thermo Fisher	AM1921	Para fracionamento nuclear-citoplasmático
Penicilina–Estreptomicina	Gibco	15140122	Para resistência ao crescimento celular contra contaminação
Kit Pierce BCA para ensaio de proteína	Thermo Fisher	23225	Para determinação de concentrações proteicas
Vetor pmirGLO Dual-Luciferase	Promega	E1330	Vetor de gene repórter de dupla luciferase
Kit PrimeScript RT Reagente	Takara	RR047A	Para transcrição reversa de RNA em cDNA
Membrana PVDF	Millipore	IPVH00010	Para transferência proteica após SDS-PAGE
Instrumento de PCR quantitativo em tempo real com fluorescência	Applied Biosystems	4365464	Para detecção de genes-alvo
Tampão de lise RIPA (com inibidores de protease)	Thermo Fisher	89901	Para extração total de proteínas de células
Kit de imunoprecipitação de proteínas ligadoras de RNA	Sigma-Aldrich	17-701	Ensaio de imunoprecipitação de proteínas ligadoras de RNA (RIP) utilizando microesferas magnéticas Protein A/G
Reagentes de SDS-PAGE (gel a 10%)	TargetMol	C0189	Para separação de proteínas por peso molecular
Mistura mestra SYBR Green	Thermo Fisher	4309155	Para uso em testes de PCR
Medidor de TER (Volt-Ohmímetro)	Millipore	MERS00002	Medidor de resistência transepitelial, medição da integridade de monocamada
Câmaras Transwell	Corning Costar	CLS3413	Para cultivo de monocamadas celulares e medição de TER
Reagente TRIzol	Invitrogen	15596026CN	Para extração total de RNA