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Artigo de investigação

NEAT1-Mediada Disfunção da Barreira Intestinal por Ligação com miR-29b-3p em Células Caco-2 Danificadas por Lipopolissacarídeo

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DOI:

10.3791/71021

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14 de agosto de 2026

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1Department of Internal Medicine, Heyuan Street Community Healthcare Center of Heilongjiang Province Daqing City Datong District, 2Department of Gastroenterology, The Second Hospital of Hebei Medical University, 3Department of Gastroenterology, Shanghai Pudong New Area People's Hospital, 4Department of organ Transplantation, Shanxi Bethune Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Third Hospital of Shanxi Medical University, Tongji Shanxi Hospital

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este estudo avaliou NEAT1 como marcador diagnóstico e regulador da disfunção da barreira intestinal na síndrome do intestino irritável com predomínio de diarreia. NEAT1 estava elevado no soro dos pacientes, ligava-se ao miR-29b-3p e seu silenciamento melhorou os parâmetros de barreira, apoptose e inflamação em células Caco-2 danificadas por lipopolissacarídeo.

Resumo

A patogênese da síndrome do intestino irritável com diarreia (SII-D) é pouco clara, e as terapias disponíveis permanecem limitadas. Este estudo avaliou o valor diagnóstico de NEAT1 na SII-D e explorou seu possível mecanismo regulador. Foram incluídos 116 pacientes com SII-D e 116 controles saudáveis. Os níveis séricos de NEAT1 e miR-29b-3p foram detectados por PCR quantitativa em tempo real com transcrição reversa (RT-qPCR), e curvas de característica operacional do receptor (ROC) foram utilizadas para avaliar o valor diagnóstico. Para estudos mecanicistas, foi estabelecido um modelo de células epiteliais intestinais Caco-2 tratadas com lipopolissacarídeo (LPS). A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio com o kit de contagem celular-8 (CCK-8), a apoptose por citometria de fluxo, a integridade da barreira pela resistência elétrica transepitelial (TEER) e os níveis de mRNA de ZO-1, ocludina e claudina-2 por RT-qPCR. Ensaios de repórter de dupla luciferase (DLR) e de imunoprecipitação de RNA (RIP) foram utilizados para verificar a relação de ligação entre NEAT1 e miR-29b-3p. NEAT1 apresentou alta expressão, e miR-29b-3p baixa expressão em pacientes com SII-D, e seus níveis mostraram forte correlação negativa. O silenciamento de NEAT1 aumentou os níveis de miR-29b-3p, melhorou a viabilidade celular e a TEER, reduziu a apoptose, aumentou os níveis de mRNA de ZO-1 e ocludina, diminuiu os níveis de mRNA de claudina-2 e atenuou os indicadores associados à lesão da barreira em células Caco-2 tratadas com LPS. Em conjunto, esses resultados indicam que NEAT1 sérico é um biomarcador candidato para SII-D e que o eixo NEAT1/miR-29b-3p pode estar envolvido na disfunção da barreira intestinal.

Introdução

A síndrome do intestino irritável com diarreia (IBS-D) é uma desordem gastrointestinal funcional comum, caracterizada por dor abdominal, distensão abdominal e alterações nos hábitos intestinais1. Atualmente, o mecanismo fisiopatológico da IBS-D ainda não foi totalmente elucidado2. Os métodos de tratamento são majoritariamente paliativos, com eficácia limitada e alta taxa de recorrência3. Acredita-se geralmente que a IBS-D envolva a interação de múltiplos fatores, tais como a desregulação do eixo cérebro-intestino, hipersensibilidade visceral, inflamação intestinal de baixo grau e disfunção da barreira intestinal4,5. Embora esses critérios tenham padronizado o diagnóstico em certa medida, eles são subjetivos e podem levar a atrasos no diagnóstico ou a classificações incorretas, especialmente quando os sintomas do paciente se sobrepõem aos da doença inflamatória intestinal ou de outras doenças orgânicas. Na prática clínica habitual, atualmente não existem biomarcadores objetivos validados para a IBS-D. Portanto, investigar um novo alvo molecular que possa servir como ferramenta diagnóstica e tenha potencial valor terapêutico tornou-se uma necessidade urgente na atual área de pesquisa da IBS-D.

Nos últimos anos, os RNAs não codificantes longos, como moléculas-chave na regulação epigenética, demonstraram grande potencial como marcadores diagnósticos e alvos terapêuticos em diversas doenças6,7. A causa principal da DII-D é a disfunção da barreira intestinal8. A destruição das proteínas das junções apertadas leva ao "vazamento intestinal", o que por sua vez ativa a resposta imune da mucosa9,10. A ativação do sistema imunológico libera diversos fatores pró-inflamatórios que podem causar disfunção intestinal ao ativar o sistema imunoneural intestinal. Estudos indicaram que alguns lncRNAs podem regular a barreira epitelial intestinal11,12. O NEAT1 foi relatado como superexpresso no tecido da mucosa colônica de pacientes com colite13. A inibição do lncRNA NEAT1 pode aliviar a disfunção nas células epiteliais intestinais (IECs) na colite ulcerativa14. No entanto, o perfil de expressão do NEAT1 na DII-D e seu valor diagnóstico ainda não foram investigados. Além disso, o NEAT1 pode ter potencial como biomarcador diagnóstico15. Se o NEAT1 for expresso de forma anormal no soro de pacientes com DII-D, isso poderia complementar os critérios atuais de Roma IV, fornecendo uma ferramenta diagnóstica molecular. Enquanto isso, o perfil de expressão do miRNA também mudou significativamente em pacientes com DII. Por exemplo, a subexpressão do miR-29b-3p foi associada à patogênese da DII16. No entanto, os mecanismos reguladores upstream que controlam a expressão do miR-29b-3p na DII-D permanecem completamente inexplorados. Em particular, o papel do NEAT1 como RNA endógeno competitivo (ceRNA) do miR-29b-3p no contexto da DII-D nunca foi investigado, embora esse mecanismo já esteja bem estabelecido em outras doenças17,18. Além disso, embora estudos anteriores tenham se concentrado principalmente na expressão em nível tecidual, o potencial do NEAT1 circulante como biomarcador sérico não invasivo para o diagnóstico da DII-D permanece totalmente desconhecido.

Hipotetizamos que o lncRNA-NEAT1 pode participar na regulação da função da barreira intestinal na DII-D ao atuar como uma ceRNA que sequestra o miR-29b-3p. Com base no contexto de pesquisa acima, este estudo tem como objetivos: (1) avaliar os níveis de NEAT1 e miR-29b-3p no soro de pacientes com DII-D e seu valor diagnóstico; (2) validar a interação direta de ligação entre NEAT1 e miR-29b-3p; e (3) elucidar o papel funcional do eixo NEAT1/miR-29b-3p na regulação da integridade da barreira intestinal e da inflamação, utilizando um modelo de células Caco-2 tratadas com LPS.

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Protocolo

Inclusão de pacientes

Todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito após compreenderem plenamente o conteúdo da pesquisa. O Comitê de Ética do Hospital Popular da Nova Área de Pudong, Xangai, revisou e aprovou este protocolo de pesquisa (n.º 2024k007). O tamanho da amostra foi calculado utilizando o G*Power: o teste selecionado foi o teste t, e o teste estatístico foi planejado para detectar diferenças entre duas amostras independentes. Com um tamanho do efeito d = 0,5, α = 0,05 e poder estatístico = 0,9, o cálculo indicou que um mínimo de 86 indivíduos deveria ser incluído em cada grupo. Para levar em conta circunstâncias imprevistas potenciais durante o ensaio, 116 pacientes foram incluídos em cada grupo. Um total de 116 pacientes com SII-D que procuraram o Hospital Popular da Nova Área de Pudong, Xangai, entre julho de 2024 e julho de 2025, foram incluídos neste estudo como grupo experimental. Os critérios de inclusão foram: (1) SII-D que atendem aos critérios diagnósticos de Roma IV; (2) colonoscopia indicando ausência de lesões orgânicas na mucosa. Critérios de exclusão: (1) pacientes com doença inflamatória intestinal (DII), câncer colorretal, etc.; (2) pacientes diabéticos; (3) pacientes com histórico recente de cirurgia abdominal; e (4) pacientes com insuficiência grave cardíaca, hepática ou renal. Paralelamente, 116 voluntários saudáveis que correspondiam às características demográficas dos pacientes, como idade e sexo, foram recrutados como grupo controle. Os controles saudáveis foram confirmados como não tendo histórico de doenças gastrointestinais crônicas ou sintomas clínicos correspondentes. Foram coletados cinco mililitros de sangue venoso periférico de todos os indivíduos. O sobrenadante foi então transferido para um congelador de ultra-baixa temperatura a -80 °C para criopreservação antes da subsequente extração de RNA.

Cada participante preencheu um questionário de 10 dias para registrar as seguintes manifestações clínicas: (a) avaliação da intensidade da dor abdominal utilizando uma escala visual analógica de 10 pontos; (b) frequência da dor abdominal durante o período do levantamento (número de dias com dor); (c) frequência das evacuações (número máximo de evacuações por dia); (d) Escala de Características Fecais de Bristol para avaliar as características das fezes. O estado emocional dos participantes foi avaliado utilizando a Escala de Ansiedade e Depressão Hospitalar (HADS).

Cultura celular e modelagem

As células Caco-2 foram cultivadas rotineiramente em meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina, em incubadora a 37 °C e 5% de CO₂. A linhagem celular Caco-2 diferencia-se espontaneamente em uma monocamada polarizada de células com junções apertadas e microvilosidades, exibindo características morfológicas e funcionais semelhantes às das células epiteliais intestinais maduras. O LPS desencadeia uma resposta inflamatória e rompe as junções apertadas no epitélio intestinal, aumentando a permeabilidade intestinal — um processo altamente semelhante às características patológicas da DII-D. Além disso, considerando que células Caco-2 tratadas com LPS têm sido amplamente utilizadas em estudos anteriores19,20,21 para modelar disfunção da barreira e inflamação relacionadas à DII, o tratamento com lipopolissacarídeo (LPS) em células Caco-2 foi escolhido neste estudo para estabelecer um modelo in vitro de DII-D. Após as células atingirem aproximadamente 80% de confluência, o meio de cultura foi substituído por meio completo contendo 5 µg/ml de LPS22, e as células foram estimuladas por 24 h. Células cultivadas convencionalmente sem LPS foram utilizadas como grupo controle.

Transfeção de células

Para investigar os papéis de NEAT1 e miR-29b-3p em células Caco-2, as células Caco-2 foram transfectadas. As células foram divididas em seis grupos, conforme a seguir: 1. grupo controle (sem tratamento); 2. grupo LPS; 3. grupo LPS + si-NC; 4. grupo LPS + si-NEAT1; 5. grupo LPS + si-NEAT1 + inibidor NC; e 6. grupo LPS + si-NEAT1 + inibidor de miR-29b-3p. Foram projetados e sintetizados dois RNAs interferentes pequenos (si-NEAT1) direcionados ao NEAT1: si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) e si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). Um siRNA com sequência aleatória não direcionada (si-NC) foi utilizado como controle negativo. Paralelamente, o inibidor de miR-29b-3p e seu controle negativo também foram sintetizados. Inibidor de miR-29b-3p: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. Controle negativo: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.

Células Caco-2 foram semeadas em placas de 24 poços e transfectadas quando os cultivos atingiram 60–70% de confluência, seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, 1,25 µL de siRNA foi diluído em 25 µL de meio com soro reduzido para obter uma concentração final de siRNA de 50 nM. Para inibição de miRNA, 2 µL do inibidor de miR-29b-3p ou seu controle negativo foi diluído em 25 µL de meio com soro reduzido até uma concentração final de 100 nM. Separadamente, 1,5 µL do reagente de transfeção foi misturado com 25 µL de meio com soro reduzido. O siRNA diluído (ou inibidor/controle negativo) foi então misturado ao reagente de transfeção diluído para formar o complexo de transfeção, que foi adicionado gota a gota às células. Seis horas após a transfeção, a mistura de transfeção foi substituída por meio completo fresco, e as células foram mantidas por mais 48 h antes dos ensaios funcionais subsequentes. A eficiência da redução ou inibição foi confirmada por RT-qPCR antes de experimentos adicionais.

PCR quantitativa reversa em tempo real (RT-qPCR)

O RNA total foi isolado de amostras de soro e de células Caco-2 submetidas aos tratamentos indicados. Resumidamente, cada amostra foi lisada com 1 mL do reagente de extração de RNA e combinada com 200 µL de clorofórmio. Após centrifugação a 12.000 × g por 15 min a 4 °C, a fase aquosa superior foi transferida para um tubo novo, misturada com 500 µL de isopropanol e mantida a −20 °C por 30 min. As amostras foram então centrifugadas a 12.000 × g por 10 min a 4 °C. O pellet de RNA resultante foi lavado duas vezes com etanol a 75%, seco ao ar e ressuspenso em 20 µL de água livre de RNase. O rendimento e a pureza do RNA foram medidos com um microespectrofotômetro, e somente amostras com A260/A280 valores de 1,8–2,0 foram utilizados. O RNA foi transcrito reversamente em cDNA seguindo o protocolo do fabricante. Para a detecção de NEAT1, ZO-1, occludina, claudina-2, e GAPDH, 1 µg de RNA total foi utilizado para cada reação de 20 µL de transcrição reversa contendo 1× tampão RT, 0,5 mM dNTPs, 0,5 µM de iniciador oligo(dT), 200 U de transcriptase reversa e água livre de RNase. A reação foi realizada a 37 °C por 15 min, seguida pela inativação da enzima a 85 °C por 5 s.

A PCR quantitativa foi realizada com cDNA como molde, utilizando um sistema de PCR em tempo real baseado em SYBR Green. Os níveis de expressão de NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, occludina, e claudina-2 foram medidos com primers específicos para cada gene. U6 foi utilizado como gene de referência para miR-29b-3p, enquanto GAPDH foi usado para normalizar NEAT1 e os genes relacionados às junções apertadas. A expressão relativa foi calculada utilizando o método 2−ΔΔCt. As sequências dos primers estão listadas na Tabela 1.

Ensaio de viabilidade celular

Células Caco-2 na fase log foram semeadas em placas de 96 poços a 1 × 104 células por poço. Foram montados um grupo controle em branco (contendo apenas o meio de cultura), um grupo controle (células não tratadas) e um grupo experimental (células Caco-2 sob diferentes condições de tratamento), com 5–6 poços em duplicata em cada grupo. As células foram distribuídas em quatro pontos temporais: 0, 24, 48 e 72 h. Uma placa de cultura separada foi preparada para cada ponto temporal para evitar a abertura repetida do incubador durante as medições. Após o período de cultura, adicionou-se 10 µL de solução CCK-8 a cada poço, evitando a formação de bolhas. Em seguida, a placa de cultura foi devolvida ao incubador a 37 °C e 5% de CO₂ e incubada no escuro por 2 h. A absorbância de cada poço foi medida imediatamente a 450 nm utilizando um leitor de microplacas. Por fim, a viabilidade celular foi expressa como uma porcentagem.

Ensaio de apoptose celular

A apoptose foi quantificada por citometria de fluxo após coloração com anexina V-FITC/PI. Células Caco-2 de cada grupo de tratamento foram coletadas e lavadas duas vezes com PBS frio. A centrifugação foi realizada a 300 × g durante 5 min a 4 °C. O pellet celular foi então ressuspenso em 100 µL de tampão de ligação 1×, seguido da adição sequencial de 5 µL de anexina V-FITC e 5 µL de PI. Após mistura suave, as amostras foram incubadas por 15 min à temperatura ambiente, no escuro. Em seguida, foram adicionados 300 µL de tampão de ligação 1×, e a suspensão foi cuidadosamente homogeneizada antes de ser transferida para um tubo de citometria de fluxo de 5 mL. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo dentro de 1 h.

Resistência elétrica transepitelial (TEER)

A permeabilidade foi avaliada mediante a medição dos valores de resistência transepitelial (TEER) de células Caco-223. As células Caco-2 foram inoculadas em câmaras Transwell e cultivadas por 21 dias para formar uma monocamada densa. Foram realizadas seis réplicas biológicas independentes para cada condição experimental, bem como cinco réplicas técnicas para cada condição. Antes e após o tratamento experimental, os valores de TEER de cada grupo foram medidos com um medidor de resistência transepitelial, utilizando eletrodos esterilizados com etanol e equilibrados com PBS. Resumidamente, a haste longa do eletrodo foi imersa no meio de cultura basolateral e a haste curta no meio de cultura apical, evitando o contato com a membrana de filtro. Após a estabilização, o valor da resistência (Ω) foi registrado, e as medições foram repetidas até que três leituras consistentes fossem obtidas. A resistência de filtros Transwell em branco (sem células) foi medida nas mesmas condições, e esse valor foi subtraído de todas as leituras experimentais. TEER (Ω·cm2) = (resistência da amostra – resistência do branco) × área efetiva da membrana. Os dados são apresentados como: (grupo experimental/grupo controle) × 100%.

Ensaio imunoenzimático (ELISA)

Os sobrenadantes de células Caco-2 de diferentes grupos de tratamento foram coletados após 24 h de cultivo. Os níveis de citocinas pró-inflamatórias, incluindo fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8) e interleucina-1β (IL-1β), foram medidos utilizando reagentes comerciais de ELISA de acordo com as instruções do fabricante. O ensaio foi realizado rigorosamente conforme as instruções. As amostras e os padrões foram adicionados às placas previamente revestidas com anticorpos, seguidos de incubação e lavagem. Em seguida, foi adicionado o anticorpo de detecção biotinilado. Após nova incubação e lavagem, foi adicionada a estreptavidina marcada com peroxidase de rábano-picante. Por fim, o substrato TMB foi adicionado para desenvolvimento da coloração, e a reação foi interrompida com a solução de parada. A absorbância de cada poço foi medida imediatamente a 450 nm utilizando um leitor de microplacas.

Western blot

As proteínas foram isoladas de células Caco-2 após os tratamentos indicados utilizando tampão RIPA contendo inibidores de protease. Os níveis de proteína foram medidos por meio de ensaio de ácido bicinconínico (BCA). Para cada amostra, 30 µg de proteína foram carregados por poço, separados em géis de SDS-PAGE a 10% e transferidos para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas em leite desnatado a 5% durante 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos contra ZO-1 (1:1.000), occludina (1:500), claudina-2 (1:1.000) e GAPDH (1:5.000). Após lavagem, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados à HRP por 1 h à temperatura ambiente. As bandas foram detectadas por quimiluminescência aprimorada (ECL) e a intensidade das bandas foi analisada utilizando o ImageJ. O GAPDH foi utilizado como controle de carga.

Ensaio de repórter duplo de luciferase (DLR)

Os locais potenciais de ligação do miR-29b-3p à sequência de NEAT1 foram previstos por meio do banco de dados ENCORI (https://rnasysu.com/encori/). Posteriormente, fragmentos de NEAT1 contendo locais de ligação do tipo selvagem (WT) ou mutantes (MUT) foram clonados no vetor repórter pmirGLO. O plasmídeo recombinante construído foi cotransfectado nas células com análogos do miR-29b-3p (Sentido: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antissentido: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) ou inibidores e seus respectivos controles negativos (mimic NC, Sentido: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antissentido: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’). Quarenta e oito horas após a transfeção, as células foram coletadas e as atividades da luciferase de vaga-lume e da luciferase de renila foram determinadas utilizando um reagente de detecção de dupla luciferase. A atividade da luciferase de renila foi utilizada como referência interna para padronização.

Ensaio de imunoprecipitação de RNA (RIP)

Para o ensaio de RIP, células Caco-2 foram coletadas, lavadas com PBS e incubadas no gelo por 15 min em 200 µL de tampão de lise RIP suplementado com inibidores de protease e RNase. Os lisados celulares foram centrifugados a 16.000 × g durante 10 min a 4 °C, e 10 µL de cada sobrenadante foram mantidos como controle de entrada. Para imunoprecipitação, 40 µL de microesferas magnéticas Protein A/G foram rotacionados com 5 µg de anticorpo anti-Ago2 ou IgG normal em 200 µL de tampão de lavagem RIP por 30 min à temperatura ambiente. Após três lavagens com 500 µL de tampão de lavagem RIP, 100 µL da suspensão de microesferas foram combinados com 100 µL de lisado, ajustados para um volume final de 1 mL com tampão de lavagem RIP e incubados durante a noite a 4 °C com rotação. As microesferas foram então lavadas cinco vezes com 500 µL de tampão de lavagem RIP e ressuspendidas em 150 µL do mesmo tampão. A digestão proteica foi realizada pela adição de 15 µL de proteinase K (20 mg/mL) e 15 µL de SDS a 10%, seguida de incubação a 55 °C por 30 min com agitação. O sobrenadante foi coletado e o RNA foi isolado com o reagente de extração e precipitado durante a noite. O enriquecimento de NEAT1 e miR-29b-3p foi então avaliado por RT-qPCR.

Análise da localização subcelular

Células Caco-2 foram separadas em frações nuclear e citoplasmática utilizando o reagente comercialmente disponível de separação nuclear-citoplasmática referenciado, seguindo as instruções do fabricante. O RNA total foi extraído desses dois componentes, e a distribuição de NEAT1 no núcleo e no citoplasma foi detectada por RT-qPCR. A calibração foi realizada utilizando U6 (predominantemente nuclear) e mRNA de GAPDH (predominantemente citoplasmático) como indicadores da eficiência de separação.

Análise estatística

Para amostras clínicas de soro, uma análise de potência (t-teste, d = 0,5, α = 0,05, potência = 0,9) indicou que era necessário um mínimo de 86 indivíduos por grupo. Para levar em conta circunstâncias imprevistas potenciais durante o ensaio, 116 pacientes foram incluídos em cada grupo para detectar diferenças clinicamente significativas. A normalidade dos dados para variáveis contínuas foi avaliada utilizando o teste de Shapiro-Wilk. Como todos os dados contínuos apresentavam distribuição normal (P > 0,05), foram aplicadas análises paramétricas. Variáveis categóricas foram analisadas utilizando o teste qui-quadrado. Experimentos baseados em células incluíram seis réplicas biológicas independentes, com cinco réplicas técnicas para cada réplica biológica. Os dados são apresentados como média ± DP. Comparações entre dois grupos de variáveis contínuas foram realizadas utilizando o t-teste de Student, enquanto comparações entre múltiplos grupos foram analisadas por ANOVA unifatorial seguida pelo teste post hoc de Tukey. A significância estatística foi definida como P < 0,05.

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Resultados

Expressão de NEAT1 e valor diagnóstico

Em comparação com o grupo controle saudável (CS), os níveis de expressão de NEAT1 em pacientes com IBS-D foram significativamente mais altos (P < 0,0001; Figura 1A). A área sob a curva (AUC) de NEAT1, conforme mostrado pela curva característica de operação do receptor (ROC), foi de 0,867 (IC 95%: 0,821–0,913). Sua especificidade foi de 75,9%, enquanto sua sensibilidade f...

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Discussão

A DII é uma desordem funcional gastrointestinal comum. Seu mecanismo patológico ainda não foi totalmente elucidado. Nos últimos anos, os lncRNA, como moléculas-chave na regulação epigenética, demonstraram grande potencial no campo do diagnóstico e tratamento de doenças. O lncRNA NEAT1 tem sido estudado em diversas doenças, como câncer colorretal24, glioma25 e infarto do miocárdio26. Múltiplos estudos mostraram que o NEAT1 participa ...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas de 24 poçosCorningCLS3524Para semeadura de células
Placas de 96 poçosCorningCLS3599Para semeadura de células em ensaios CCK-8
Kit de apoptose Annexina V-FITC/PIInvitrogenV13242Para detecção das taxas de apoptose
Anticorpo monoclonal anti-AGO2Proteintech67934-1-IgPara imunoprecipitação de complexos de RNA ligados ao Ago2
Anticorpo anti-Claudina-2Invitrogen32-5600Anticorpo primário, diluição 1:1000
Anticorpo anti-GAPDHCell Signaling Technology5174Anticorpo primário, diluição 1:5000; controle de carga
Anticorpo anti-IgG humanoProteintech10284-1-APUtilizado como controle negativo para o ensaio de RIP
Anticorpo anti-OcludinaAbcamab31721Anticorpo primário, diluição 1:500
Anticorpo anti-ZO-1Proteintech21773-1-APAnticorpo primário, diluição 1:1000
Células Caco-2SUNNCELLSNL-068Para construção de modelos de barreira epitelial intestinal
Kit CCK-8SolarbioCA1210Kit de ensaio de proliferação celular
ClorofórmioSigma-AldrichC2432Para separação de fases na extração de RNA
Meio DMEMGibco11965092Para cultivo celular
Kit de ensaio Dual-Luciferase ReporterThermoFisher16186Para detecção da atividade de luciferase
Kit ELISA (para IL-1β)R&D SystemsDY201Para detecção de proteínas-alvo em sobrenadantes de cultivo celular
Kit ELISA (para IL-6)R&D SystemsD6050BPara detecção de proteínas-alvo em sobrenadantes de cultivo celular
Kit ELISA (para IL-8)R&D SystemsNBP3-28022Para detecção de proteínas-alvo em sobrenadantes de cultivo celular
Kit ELISA (para TNF-α)R&D SystemsDTA00DPara detecção de proteínas-alvo em sobrenadantes de cultivo celular
Substrato de quimioluminescência aprimorada (ECL)Thermo Fisher32106Para visualização de bandas proteicas
Etanol (75%)Sigma-Aldrich459844Para lavagem do pellet de RNA
SFB (Soro Fetal Bovino)Gibco10099141Para cultivo celular
Citômetro de fluxoBeckman CoulterB53002Para detecção das taxas de apoptose
Anticorpos secundários conjugados à HRPCell Signaling Technology7074Catalisam a geração de sinal quimioluminescente a partir de substratos ECL
IsopropanolSigma-Aldrich1133502500Para precipitação de RNA
Lipofectamina 3000ThermoFisherL3000015Reagente de transfeção
Lipopolissacarídeo (LPS)Sigma-AldrichL2880Para indução da construção do modelo celular
Leitor de microplacasBioTekEpoch 2Para detecção da absorbância de amostras em placas de 96 poços
Microsspectrofotômetro NanodropThermo ScientificND-2000CPara determinação da concentração e pureza de RNA
Leite desnatado em póCoolaberCN7861Para bloqueio de membranas (solução a 5%)
Kit PARISThermo FisherAM1921Para fracionamento nuclear-citoplasmático
Penicilina–EstreptomicinaGibco15140122Para resistência ao crescimento celular contra contaminação
Kit Pierce BCA para ensaio de proteínaThermo Fisher23225Para determinação de concentrações proteicas
Vetor pmirGLO Dual-LuciferasePromegaE1330Vetor de gene repórter de dupla luciferase
Kit PrimeScript RT ReagenteTakaraRR047APara transcrição reversa de RNA em cDNA
Membrana PVDFMilliporeIPVH00010Para transferência proteica após SDS-PAGE
Instrumento de PCR quantitativo em tempo real com fluorescênciaApplied Biosystems4365464Para detecção de genes-alvo
Tampão de lise RIPA (com inibidores de protease)Thermo Fisher89901Para extração total de proteínas de células
Kit de imunoprecipitação de proteínas ligadoras de RNASigma-Aldrich17-701Ensaio de imunoprecipitação de proteínas ligadoras de RNA (RIP) utilizando microesferas magnéticas Protein A/G
Reagentes de SDS-PAGE (gel a 10%)TargetMolC0189Para separação de proteínas por peso molecular
Mistura mestra SYBR GreenThermo Fisher4309155Para uso em testes de PCR
Medidor de TER (Volt-Ohmímetro)MilliporeMERS00002Medidor de resistência transepitelial, medição da integridade de monocamada
Câmaras TranswellCorning CostarCLS3413Para cultivo de monocamadas celulares e medição de TER
Reagente TRIzolInvitrogen15596026CNPara extração total de RNA

Referências

  1. Ren M, Ma J, Qu M. Network pharmacology integrated with molecular docking and molecular dynamics simulations to explore the mechanism of Shaoyao Gancao Tang in the treatment of asthma and irritable bowel syndrome. Medicine (Baltimore). 2024;103(50).
  2. Zhao C, Zhou X, Shi X. The influence of Nav1.9 channels on intestinal hyperpathia and dysmotility. Channels (Austin). 2023;17(1):2212350.
  3. Jiang J, et al. Effectiveness of Tong-Xie-Yao-Fang combined with Si-Ni-San for irritable bowel syndrome: a protocol for systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2021;100(11).
  4. Lenoir M, Wienke J, Fardao-Beyler F, Roese N. An 8-week course of Bifidobacterium longum 35624 is associated with a reduction in the symptoms of irritable bowel syndrome. Probiotics Antimicrob Proteins. 2025;17(1):315-27.
  5. Tao E, et al. Early life stress induces irritable bowel syndrome from childhood to adulthood in mice. Front Microbiol. 2023;14:1255525.
  6. Biswas S, et al. Expressions of serum lncRNAs in diabetic retinopathy: a potential diagnostic tool. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:851967.
  7. Li W, et al. Functional roles of non-coding RNAs in panvascular diseases. J Vis Exp. 2025;(226).
  8. Shin SY, et al. The effect of phloroglucinol in patients with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. J Neurogastroenterol Motil. 2020;26(1):117-27.
  9. Yang S, et al. Ginseng-derived nanoparticles alleviate inflammatory bowel disease via the TLR4/MAPK and p62/Nrf2/Keap1 pathways. J Nanobiotechnology. 2024;22(1):48.
  10. Zhang J, et al. Role of the gut microbiota in complications after ischemic stroke. Front Cell Infect Microbiol. 2024;14:1334581.
  11. Chen S, et al. The role of lncRNAs in regulating the intestinal mucosal mechanical barrier. Biomed Res Int. 2021;2021:2294942.
  12. Lu Q, et al. The role of long noncoding RNAs in intestinal health and diseases: a focus on the intestinal barrier. Biomolecules. 2023;13(11):1674.
  13. Li F, et al. Knockdown of long non-coding RNA NEAT1 relieves inflammation of ulcerative colitis by regulating the miR-603/FGF9 pathway. Exp Ther Med. 2022;23(2):131.
  14. Ni S, Liu Y, Zhong J, Shen Y. Inhibition of lncRNA NEAT1 alleviates intestinal epithelial cells dysfunction in ulcerative colitis by maintaining the homeostasis of the glucose metabolism through the miR-410-3p-LDHA axis. Bioengineered. 2022;13(4):8961-71.
  15. Aparicio P, et al. Serum lncRNAs NEAT1, PVT1 and H19 as novel biomarkers for sarcopenia diagnosis and treatment response. Noncoding RNA Res. 2025;14:166-76.
  16. Martínez C, et al. miR-16 and miR-125b are involved in barrier function dysregulation through the modulation of claudin-2 and cingulin expression in the jejunum in IBS with diarrhoea. Gut. 2017;66(9):1537-8.
  17. Che F, et al. Lnc NEAT1/miR-29b-3p/Sp1 form a positive feedback loop and modulate bortezomib resistance in human multiple myeloma cells. Eur J Pharmacol. 2021;891:173752.
  18. Zhang Y, et al. LncRNA NEAT1/miR-29b-3p/BMP1 axis promotes osteogenic differentiation in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Pathol Res Pract. 2019;215(3):525-31.
  19. Ludidi S, et al. The intestinal barrier in irritable bowel syndrome: subtype-specific effects of the systemic compartment in an in vitro model. PLoS One. 2015;10(5).
  20. Fan Z, et al. Investigation of the biomarkers and mechanism based on endoplasmic reticulum stress in irritable bowel syndrome. Arab J Gastroenterol. 2025;26(4):337-46.
  21. Zhang H, Xiong Z, He Y, Su H, Jiao Y. Cimifugin improves intestinal barrier dysfunction by upregulating SIRT1 to regulate the NRF2/HO-1 signaling pathway. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(3):2897-908.
  22. Zhang Y, et al. Decreased expression of microRNA-510 in intestinal tissue contributes to post-infectious irritable bowel syndrome via targeting PRDX1. Am J Transl Res. 2019;11(12):7385-97.
  23. Li BR, et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. J Vis Exp. 2018;(140).
  24. Zhang M, et al. The lncRNA NEAT1 activates Wnt/β-catenin signaling and promotes colorectal cancer progression via interacting with DDX5. J Hematol Oncol. 2018;11(1):113.
  25. Liang J, Liu C, Xu D, Xie K, Li A. LncRNA NEAT1 facilitates glioma progression via stabilizing PGK1. J Transl Med. 2022;20(1):80.
  26. Yu Q, et al. Silencing of lncRNA NEAT1 alleviates acute myocardial infarction by suppressing miR-450-5p/ACSL4-mediated ferroptosis. Exp Cell Res. 2024;442(2):114217.
  27. Gong Z, Zhang Y, Jiang Y, Chen P, Ji J. LncRNA NEAT1 targets miR-342-3p/CUL4B to inhibit the proliferation of cutaneous squamous cell carcinoma cells. J Oncol. 2022;2022:8145129.
  28. Han M, et al. LncRNA NEAT1 protects uremic toxin-induced intestinal epithelial barrier injury by regulating miR-122-5p/Occludin axis. PLoS One. 2025;20(5).
  29. Cui J, Wang J, Lv Y, Xu D. LncRNA NEAT1 regulates infantile pneumonia by sponging miR-146b. Mol Biotechnol. 2021;63(8):694-701.
  30. Xiao P, et al. LncRNA NEAT1 regulates chondrocyte proliferation and apoptosis via targeting miR-543/PLA2G4A axis. Hum Cell. 2021;34(1):60-75.
  31. Wu X, et al. Aberrant expressions of circulating lncRNA NEAT1 and microRNA-125a are linked with Th2 cells and symptom severity in pediatric allergic rhinitis. J Clin Lab Anal. 2022;36(3).
  32. Wang K, Liu Y, Chai Y. NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 axis regulates macrophage polarization and inflammation in sepsis models. J Vis Exp. 2026;(227).
  33. Tojo González R, et al. Síndrome de intestino irritable: papel de la microbiota y probióticos [Irritable bowel syndrome; gut microbiota and probiotic therapy]. Nutr Hosp. 2015;31(Suppl 1):83-8.
  34. Hwang HJ, et al. Ferulic acid as a protective antioxidant of human intestinal epithelial cells. Antioxidants (Basel). 2022;11(8):1448.
  35. Wu Y, et al. Probiotics (Lactobacillus plantarum HNU082) supplementation relieves ulcerative colitis by affecting intestinal barrier functions, immunity-related gene expression, gut microbiota, and metabolic pathways in mice. Microbiol Spectr. 2022;10(6).
  36. Kuo WT, et al. The tight junction protein ZO-1 is dispensable for barrier function but critical for effective mucosal repair. Gastroenterology. 2021;161(6):1924-39.
  37. Furuse M, et al. Occludin: a novel integral membrane protein localizing at tight junctions. J Cell Biol. 1993;123(6 Pt 2):1777-88.
  38. Wang Z, et al. Binding of Trichinella spiralis C-type lectin with syndecan-1 on intestinal epithelial cells mediates larval invasion of intestinal epithelium. Vet Res. 2023;54(1):86.
  39. Kaya İslamoğlu ZG, Unal M, Küçük A. Atopic dermatitis in adults and irritable bowel syndrome: a cross-sectional study. Indian J Dermatol. 2019;64(5):355-9.
  40. Ma C, et al. LncRNA PTS-1 protects against osteoarthritis through the miR-8085/E2F2 axis. J Inflamm Res. 2025;18:347-66.
  41. Tong Y, Zhou Z, Tang J, Feng Q. miR-29b-3p inhibits the inflammation injury in human umbilical vein endothelial cells by regulating SEC23A. Biochem Genet. 2022;60(6):2000-14.
  42. Li Z, et al. miR-29b-3p protects cardiomyocytes against endotoxin-induced apoptosis and inflammatory response through targeting FOXO3A. Cell Signal. 2020;74:109716.

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