Associação do RNA sérico CASC11 com a gravidade da lesão e inflamação na lesão da medula espinhal

Resumo

Em pacientes com lesão medular (LME), a regulação para cima do CASC11 está associada à gravidade da lesão. In vitro, a regulação para baixo do CASC11 aliviou a apoptose e a inflamação, sugerindo uma associação com o eixo miR-130b-5p/SPP1 . Esses resultados sugerem o possível papel do CASC11 como candidato a biomarcador na patogênese da LME.

Resumo

Lesão medular (LME) é um trauma grave do sistema nervoso central. Este estudo observacional, em âmbito único e in vitro , investigou o potencial diagnóstico do CASC11 e seu possível mecanismo regulador na LM utilizando amostras clínicas de soro e modelos celulares estimulados por lipopolissacarídeos. Os níveis de CASC11, miR-130b-5p e SPP1 foram medidos por reação em cadeia quantitativa da polimerase em tempo real (RT-qPCR). As funções celulares e as relações de direcionamento foram avaliadas por meio de kit de contagem celular 8 (CCK-8), citometria de fluxo, western blot, ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA), repórter de dual-luciferase e imunoprecipitação de RNA (RIP). O CASC11 foi altamente expresso na LME e associado à inflamação como potencial biomarcador diagnóstico. Em células PC-12 tratadas com lipopolissacarídeos (LPS), o silenciamento do CASC11 aliviou a atividade celular suprimida, a apoptose e a inflamação, que foram revertidas pelo inibidor de miR-130b-5p. Esses achados sugerem que o CASC11 está associado à gravidade da LME, enquanto dados in vitro indicam seu envolvimento em respostas inflamatórias e apoptóticas através do eixo CASC11/miR-130b-5p/SPP1 . Este estudo é limitado pelo seu design de centro único e pela falta de validação in vivo .

Introdução

Lesão medular (LME) denota um distúrbio sistêmico temporário ou permanente decorrente de danos na medula espinhal causados por forças ou doenças externas, resultando em comprometimento das funções motoras, sensoriais, reflexas e do sistema nervoso^{autônomo 1,2}. Os pacientes frequentemente enfrentam déficits e complicações funcionais físicas ao longo da vida, impondo sofrimento e fardos consideráveis a indivíduos e famílias. A etiologia da LME é amplamente classificada em origens traumáticas e não^{traumáticas 3}. Lesões traumáticas, predominantemente resultantes de fraturas na coluna devido a forças externas como acidentes de trânsito, quedas de altura e incidentes esportivos, representam um desafio crescente no manejo clínico da^{LME 4}. Enquanto isso, a cascata de lesões secundárias iniciada após a lesão primária, especialmente a desregulação da resposta inflamatória e a apoptose neuronal, são consideradas fatores cruciais que contribuem para a deterioração contínua da função neurológica. Estudos recentes destacaram o papel crítico da neuroinflamação, regeneração e recuperação funcional na fisiopatologia e reparo da LM⁵. Como resposta secundária central, a neuroinflamação desempenha um papel duplo no processo de lesão e reparo dos tecidos. Dada a limitada capacidade regenerativa da medula espinhal lesionada, é necessária uma abordagem terapêutica sinérgica que combine tratamento anti-inflamatório, transplante celular, reabilitação e intervenções^moleculares. Embora uma variedade de estratégias diagnósticas e terapêuticas tenha sido estabelecida para LME, a prática clínica atual depende predominantemente de exames de imagem⁷. No entanto, essas técnicas são limitadas por seus altos requisitos para equipamentos avançados, requisitos rigorosos para pacientes e despesas financeiras^{substanciais 8}. Consequentemente, há uma necessidade urgente e não atendida por um biomarcador laboratorial conveniente, preciso e não invasivo. A identificação de tal marcador permitiria o diagnóstico precoce da LME sem interromper os protocolos convencionais de tratamento, facilitando assim o desenvolvimento de intervenções terapêuticas mais oportunas e eficazes.

RNA longo, não codificante (lncRNA) representa uma categoria importante de moléculas funcionais de RNA que, apesar de não terem potencial codificante de proteínas, são integrantes para uma ampla gama de funções biológicas, incluindo a regulação da inflamação e^{da apoptose9}. Os LncRNAs atuam como esponjas moleculares para microRNAs (miRNAs), impedindo assim efetivamente que esses miRNAs se liguem e silenciem seus mRNAs^{alvo 10}. Por exemplo, o lncRNA MAGI2-AS3 media o miR-223-3p para acelerar a cicatrização da^{fratura 11}. O direcionamento para a rede de lncRNA OIP5-AS1/miR-128-3p/Nrf2 apresenta uma abordagem terapêutica promissora para melhorar a recuperação na SCI¹². CASC11, caracterizado por um transcrito de 872 pb localizado no cromossomo 8q24.21, é reconhecido como uma molécula com expressão desregulada em vários cânceres humanos¹³. O CASC11 apresenta expressão positiva em pacientes com osteoporose pós-menopáusica e tem a capacidade de diferenciar indivíduos afetados dos controles^{saudáveis 14}. Além disso, o CASC11 apresenta um padrão de regulação para cima e potencial terapêutico semelhante em pacientes com^{fraturas 15}. Com base nesses relatos, o CASC11 pode regular as respostas inflamatórias e a atividade celular. Apesar dessas informações, o padrão de expressão e o papel biológico do CASC11 na LME permanecem completamente desconhecidos. Considerando que hiperinflamação e apoptose são principais fatores que impulsionam a LME secundária, hipotetizamos que o CASC11 pode ser um biomarcador candidato e fator regulador na LME. Este estudo investigou a associação clínica e o potencial biomarcador do CASC11 na LME analisando coortes de pacientes e modelos celulares in vitro (Figura 1). Além disso, exploramos um possível mecanismo molecular do CASC11, incluindo seu papel potencial na modulação da resposta inflamatória após a LME.

Protocolo

Matrícula das disciplinas

Pacientes com trauma agudo na medula espinhal (n = 300) tratados no hospital de janeiro de 2023 a maio de 2025 foram selecionados e classificados no grupo de lesão completa da medula espinhal (CSCI) (grau A, n = 98), grupo de lesão incompleta da medula espinhal (ISCI) (graus B, C e D; n = 95) e grupo de função neurológica normal (NNF) (grau E, n = 107) de acordo com a Escala de Insuficiência da American Spinal Injury Association (classificação AIS). Para pacientes do grupo NNF, evidências radiológicas de LM, como edema, contusão ou compressão, foram confirmadas por ressonância magnética (RM), mas nenhum déficit sensorial ou motor foi demonstrado. Outros 90 participantes saudáveis recrutados no mesmo período foram selecionados como grupo controle. Os critérios de inclusão foram: (1) diagnóstico de LM confirmado por imagem (ressonância magnética ou tomografia), de acordo com as diretrizes de manejo clínico^{estabelecidas 16}; (2) trauma sofrido dentro de 24 horas antes da internação; e (3) participantes adultos com dados clínicos completos. Os critérios de exclusão foram: (1) histórico de cirurgia anterior relacionada a fratura ou LME; (2) doença arterial coronariana grave ou doença cardiopulmonar significativa; (3) lesão craniocerebral aguda e grave; e (4) tumores malignos, doenças cardiovasculares/cerebrovasculares ou doenças imunológicas. A aprovação para este estudo foi obtida do Comitê de Ética do Quarto Hospital Popular de Shenzhen, e o consentimento informado foi obtido dos participantes. Os procedimentos utilizados neste estudo seguiram os princípios da Declaração de Helsinque.

Coleção de espécimes

Amostras venosas de sangue (5 mL) foram coletadas dos participantes na admissão usando tubos separadores séricos dentro de 24 horas após a lesão. O sangue foi deixado coagular em temperatura ambiente por 30 minutos e depois centrifugado a 3.000 × g por 10 minutos a 4 °C. O soro sobrenadante foi cuidadosamente separado, aliquotado em microtubos livres de RNase e armazenado a -80 °C até análise adicional.

Cultura celular e indução de LPS

Células de feocromocitoma de rato (PC-12) e microglias murinas (BV-2) foram cultivadas no meio Eagle modificado de Dulbecco, suplementado com 10% de soro fetal bovino a 37 °C. Para estabelecer modelos de lesão inflamatória in vitro , células PC-12 e BV-2 foram expostas a lipopolissacarídeos (LPS) em concentrações de 0, 1, 5 e 10 μg/mL durante 12 horas^{e 17} horas. Cada concentração foi testada em três réplicas biológicas independentes.

RT-qPCR

O RNA total foi isolado das amostras usando um protocolo de extração de fenol-clorofórmio, seguido pela precipitação com isopropanol. A pureza do RNA foi avaliada por espectrofotometria, e amostras com uma razão A_{260/280 nm} na faixa de 1,8–2,1 foram usadas para análise a jusante. O RNA foi transcrito reversamente em cDNA de acordo com o protocolo do kit de transcrição reversa, e o cDNA resultante foi usado como molde para reações RT-qPCR com uma pré-mistura SYBR Green em um instrumento PCR. Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi usado como gene de referência para o mRNA CASC11 e SPP1 , e RNA nuclear pequeno (U6) foi usado como gene de referência para miR-130b-5p. Para amostras de soro, cel-miR-39 sintético foi injectado no soro antes da extração de RNA para controlar variações na recuperação do RNA. Os primers eram os seguintes: CASC11 dianteiro 5'-ACCCTATGGAGAACCAGAC-3' e reverso 5'-GAGGACCAACTCAGTAGGAAAT-3'; miR-130b-5p para frente 5'-ATCCATGGTTGAGCTTCCG-3' e para trás 5'-TAGTGCAACCTCGTCAGAGC-3'; e SPP1 mRNA para frente 5'-GTTAAACAGGCTGATTCTGG-3' e 5'-CATGGTCATCATCATCATTCA-3' reverso. A expressão foi calculada usando o método ^2-ΔΔCt . Cada reação RT-qPCR foi realizada em réplicas técnicas triplicadas com três réplicas biológicas.

Transfecção

O silenciamento CASC11 (si-CASC11), miM/inibidor miR-130b-5p, plasmídeo de superexpressão de SPP1 (ov-SPP1) e seus respectivos controles negativos (NC) foram sintetizados e transfectados em células PC-12 e BV-2 usando um reagente de transfecção. A eficiência da transfecção foi avaliada 48 horas após a transfecção em réplicas biológicas triplicadas.

Ensaio de proliferação e apoptose

Para o ensaio de viabilidade celular, as células foram semeadas em placas de 96 poços a 5 × 10³ células por poço e cultivadas por 24 horas para permitir a fixação. Após essa incubação, 10 μL do reagente CCK-8 foram dispensados em cada poço, seguidos por incubação por 2 horas a 37 °C. A densidade óptica era então registrada em 450 nm com um leitor de microplaca. Para a detecção de apoptose, as células foram destacadas com tripsina, enxaguadas duas vezes com soro tampão fosfatado (PBS) e suspensas em tampão de ligação até uma concentração final de 1 × 10⁶ células/poço. Em seguida, 100 μL da suspensão foram colocados em um tubo de citometria de fluxo de 5 mL, seguido pela adição de 5 μL de Annexin V-FITC e 5 μL de solução de coloração de iodeto propidio (PI). As amostras foram misturadas suavemente e mantidas por 15 minutos em temperatura ambiente, protegidas da luz. O tampão de ligação foi então adicionado a um volume adicional final de 400 μL por tubo, e as células apoptóticas foram quantificadas por citometria de fluxo. Todas as condições foram analisadas usando três réplicas técnicas em três experimentos biológicos independentes.

Ensaio de atividade com dupla luciferase

Os alvos a jusante do CASC11 e do miR-130b-5p foram previstos por meio de sites de bioinformática (lncRNASNP2 e TargetScan). Fragmentos contendo as sequências complementares do tipo selvagem (wt) ou mutantes (mut) foram sintetizados e clonados em um vetor repórter duplo-luciferase para construir plasmídeos repórteres wt e mut. As células PC-12 foram semeadas e co-transfectadas com miR-130b-5p mimic/inibidor e os plasmídeos wt/mut construídos usando um reagente de transfecção à base de lipídios. Após 48 horas, a atividade da luciferase foi quantificada para avaliar a interação. Cada grupo consistia em três réplicas técnicas e três réplicas biológicas.

Ensaio de imunoprecipitação de RNA (RIP)

O RIP foi realizado usando um kit de imunoprecipitação de proteínas que se ligam a RNA. As células foram lisadas com tampão de lise e incubadas com anticorpo anti-Ago2 ou anticorpo IgG normal. Complexos RNA-proteína foram enriquecidos usando esferas magnéticas. Após a lavagem, as proteínas ligadas foram removidas e o RNA imunoprecipitado foi isolado. Os níveis de enriquecimento do CASC11 e do miR-130b-5p foram quantificados por RT-qPCR. Cada grupo consistia em três réplicas técnicas e três réplicas biológicas.

Western blot

Lisados proteicos foram preparados a partir de células PC-12 e BV-2 usando tampão de lise celular, e o teor total de proteína foi medido com um ensaio de BCA. Para cada amostra, 30 μg de proteína foram carregados em géis SDS-PAGE de 12% e transferidos para membranas PVDF após separação eletroforética. As membranas foram bloqueadas por 2 horas em temperatura ambiente em leite desnatado a 5% diluído em TBST e depois incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra Bcl-2, Bax, caspase-3 clivada e GAPDH em diluição de 1:1.000. Após a lavagem, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP por 1 hora em temperatura ambiente. Os sinais proteicos foram analisados usando software de análise de imagem, e densidades de bandas foram usadas para avaliar a expressão de proteínas relacionadas à apoptose. Os experimentos com western blot incluíram três réplicas biológicas, com três réplicas técnicas para cada grupo.

ELISA

As concentrações das citocinas inflamatórias TNF-α, IL-1β e IL-6 no soro do paciente e nos supernadantes das células PC-12 e BV-2 foram quantificadas usando kits ELISA, conforme as instruções do fabricante. Amostras foram incubadas em poços pré-revestidos, e anticorpos de detecção foram adicionados para incubação posterior. Conjugados enzimáticos foram adicionados e incubados. Após a lavagem, substratos foram adicionados para o desenvolvimento da cor e as reações foram encerradas. A absorvância foi medida em 450 nm usando um leitor de microplacas e convertida em concentrações de fatores inflamatórios com base na curva padrão fornecida. Cada ensaio ELISA foi realizado em réplicas técnicas triplicadas em três réplicas biológicas independentes.

Análise estatística

As variáveis contínuas foram reportadas como média ± desvio padrão (DS), e variáveis categóricas foram apresentadas como números e porcentagens (n, %). Comparações entre dois grupos foram realizadas usando o teste t de Student. Para comparações envolvendo mais de dois grupos, foi aplicada a análise unidirecional da variância (ANOVA), seguida pelo teste pós-hoc de Tukey. A capacidade do CASC11 de discriminar entre grupos clínicos foi avaliada usando análise da curva da característica operacional do receptor (ROC). As associações entre duas variáveis foram examinadas pela análise de correlação de Pearson. Para experimentos baseados em células, cada grupo continha três réplicas biológicas independentes, e cada medição era repetida em três réplicas técnicas. A significância estatística foi definida como P < 0,05.

Resultados

Dados básicos dos assuntos

As características basais dos pacientes nos grupos Contra, NNF, ISCI e CSCI são apresentadas na Tabela 1. A análise estatística não revelou diferenças significativas entre grupos em variáveis, como sexo, idade, índice de massa corporal (IMC), etiologia da lesão e tempo da lesão (P > 0,05). Diferenças significativas entre os quatro grupos foram observadas quanto ao tempo de internação, grau A...

Discussão

A LME é uma condição devastadora do sistema nervoso central que frequentemente resulta em déficits significativos na sensibilidade, controle motor e função autonômica, diminuindo substancialmente a qualidade de vida e o prognóstico a longo prazo do^{paciente 18}. Os pacientes podem apresentar comprometimento funcional e perda sensorial após trauma na coluna, e estudos de imagem (como ressonância magnética) podem ser utilizados para avaliar a ocorrência da LM

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BCA protein assay kit	Yeasen, China	P0010
CCK-8 solution	Sigma-Aldrich, USA	96992
Dual-luciferase reporter vector	Promega, USA	E133A	pmirGLO vector
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	ATCC, Manassas, VA, USA	30-2002
ELISA kit for IL-1β	R&D Systems, USA	DY401
ELISA kit for IL-6	R&D Systems, USA	HS600B
ELISA kit for TNF-α	R&D Systems, USA	DTA00C
Fetal bovine serum	Gibco, Grand Island, NY, USA	10099141
Flow cytometer	BD FACSCalibur, USA	FACS101
Image analysis software	NIH, Bethesda, MD, USA	version 1.44p	ImageJ software
Isopropanol	Beijing Chemical Factory, China	32064
Lipid-based transfection reagent	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	L3000008	Lipofectamine 3000
Lipopolysaccharide	Sigma-Aldrich, USA	L2880
Lysis buffer	Beyotime, China	P0013D	RIPA lysis buffer
Microplate reader	Reagen, China	RNE90002
PC-12 and BV-2 cells	ATCC, Manassas, USA
Phenol-chloroform reagent	Thermo, USA	15596026	Trizol reagent
Reverse transcription kit	Takara, Japan	RR047A	PrimeScript RT Kit
RNA-binding protein immunoprecipitation kit	Millipore, USA	17-700	Magna RIP Kit
RNase-free microtubes	Axygen, Corning, NY, USA	MCT-150-C-S
Serum separator tubes	Terumo, Tokyo, Japan	VP-AS109K60
Statistical analysis software	San Diego, USA	version 9.0	GraphPad Prism
SYBR Green premix	Takara, Japan	RR420A	SYBR Premix Ex Taq