Um Sistema Microfluídico para Modelagem de Disfunção Endotelial sob Estresse Fisiológico Combinado de Cisalhamento Pulsátil e Hiperglicemia Oscilatória

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar e operar um sistema microfluídico que expõe células endoteliais à hiperglicemia oscilatória sincronizada e ao estresse de cisalhamento pulsátil. Essa abordagem fornece um modelo in vitro fisiologicamente relevante para estudar a disfunção endotelial diabética. Esse protocolo permite a medição quantitativa do estresse oxidativo e das respostas das células endoteliais.

Abstract

A disfunção endotelial em complicações vasculares diabéticas envolve interações complexas entre distúrbios metabólicos, especificamente glicose oscilatória (OG) e estresse de cisalhamento pulsátil (PSS). Embora esses fatores tenham sido investigados isoladamente, os modelos convencionais permanecem limitados a fluxo laminar estático de alta glicose ou fluxo laminar simplificado, carecendo da capacidade de imitar o acoplamento espaçotemporal integrado encontrado na vasculatura diabética. Ao utilizar uma plataforma microfluídica programável, esse protocolo oferece uma plataforma valiosa para investigar os efeitos integrados da hiperglicemia oscilatória sincronizada e da PSS fisiológica nas células endoteliais. Este protocolo visa modelar a disfunção endotelial sob condições metabólicas e mecânicas acopladas fisiologicamente relevantes. O uso de um chip de polidimetilsiloxano (PDMS) combinado com um sistema de controle movido por pressão permite a modulação precisa e independente de formas de onda de fluxo e perfis de concentração de glicose. A fidelidade hemodinâmica do sistema é validada por Velocimetria de Imagem de Micropartículas (Micro-PIV), enquanto a resposta celular é caracterizada quantitativamente pelo monitoramento dos níveis de espécies reativas intracelulares de oxigênio (ROS) e da viabilidade celular. Resultados representativos demonstram que a PSS fisiológica atenua efetivamente a lesão oxidativa induzida pela OG. Esse efeito é demonstrado pela redução dos níveis intracelulares de ROS e pela melhoria da viabilidade celular sob condições de estimulação combinada. Dependendo da questão de pesquisa, parâmetros como padrões de tensão de cisalhamento, frequências de oscilação da glicose e geometrias dos canais podem ser ajustados. Esse método serve como uma ferramenta versátil para estudos mecanicistas de vias mecanobiológicas e triagem de medicamentos para intervenções terapêuticas em doenças vasculares diabéticas.

Introduction

A disfunção endotelial é um evento crítico precoce no desenvolvimento de complicações vasculares diabéticas, impulsionada tanto por distúrbios metabólicos quanto por forças hemodinâmicas^{anormais 1,2}. Os níveis de OG, em vez de hiperglicemia sustentada isoladamente, são cada vez mais reconhecidos como potentes indutores de estresse oxidativo e sinalização inflamatória nas células endoteliais, levando a lesão vascular e homeostase^{comprometida 3,4,5}. Simultaneamente, o estresse de cisalh....

Protocol

Declaração de ética:

NOTA: Todos os reagentes, dispositivos e softwares usados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Fabricação de chips microfluídicos

1. Use software de projeto assistido por computador (CAD) para projetar a estrutura do chip microfluídico (L x L x H = 2 mm x 30 mm x 0,1 mm, Figura 1A) e faça o molde mestre do SU-8 por meio de uma empresa comercial.
2. Misture o agente de cura PDMS e o pré-polímero em uma proporção de 10:1 em peso em um copo limpo e mexa vigorosam....

Results

Validação micro-PIV do campo de fluxo dentro do canal microfluídico
A Figura 1D apresenta uma visão geral da plataforma microfluídica usada para investigar as respostas endoteliais à estimulação metabólica e mecânica acoplada. O sistema integra um chip microfluídico PDMS de canal reto com um módulo de controle de fluxo movido por pressão, permitindo a aplicação da condição OG juntamente com PSS fisiológica. Uma estratégia programável de .......

Discussion

O sistema microfluídico aqui descrito fornece uma plataforma robusta e fisiologicamente relevante para investigar os efeitos integrados da OG e PSS na função das células endoteliais. A principal vantagem desse método reside em sua capacidade de controlar e desacoplar com precisão estímulos mecânicos e bioquímicos dentro de um microambiente definido. Ao contrário das culturas estáticas convencionais que não possuem forças hemodinâmicas ou dos modelos animais que frequentemente obscurecem .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% Tripsina-EDTA	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211052	Dissociação celular
Seringa de 1 mL	Shanghai Zhengbang Medical Science Co., Ltd.	1mL	Injetar fluido
Prato de cultura de 60 mm	NEST Biotechnology Co., Ltd.	705001	Cultura celular
90°C; Conector de aço inoxidável inclinado	Luoyang Mayer Trading Co., Ltd.	1,3 mm	Dispositivo de vedação de adaptadores
Software AutoCAD	Autodesk	RRID:SCR_014981	Software de projeto assistido por computador
Garrafa de vidro boronizada	Hunan Aidete Scientific Instruments Co., Ltd.	Passe duplo 100mL	Reservatório
Calcein-AM/PI Kit	Beyotime	BYT-c2015	Coloração
Incubadora celular	ESCO	Esco CelMate	Cultura celular
CellROX Deep Red	Invitrogen	C10422	Coloração
D-glicose	Sigma Aldrich	47249	Glicose
D-mannitol	Macklin	M813423	Equilíbrio da pressão osmótica
DynamicStudio	Dantec Dynamics	V8.6	Software de análise PIV
Soro fetal bovino (FBS)	Gibco	14190-094	Médio
Fibronectina	Sigma Aldrich	F-2006	Adesão celular
Micropartículas fluorescentes	Termo Científica	G0100	Micro-PIV
Revestimento de vidro	Citotest Scientific Co., Ltd.	#1	Chip microfluídico
DMEM de glicose alta	Solarbio	12100	Médio
Câmera de alta velocidade	Dantec Dynamics	FlowSense EO	Micro-PIV
ImageJ	NIH	RRID:SCR_003070	Software de processamento de imagem
Microscópio de fluorescência invertida	Olympus	IX73	Viabilidade celular
Microscópio de fluorescência invertida	Olympus	IX83	Observação e aquisição
DMEM de glicose baixa	Solarbio	31600	Médio
Origem	OriginLab	RRID:SCR_014212	Software de análise de dados e gráficos
PDMS	Dow Inc.	184	Chip microfluídico
Penicilina/estreptomicina (P/S)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211092	Médio
Soro tampão de fosfato (PBS)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211031	Cultura celular
Purificador de plasma	Jiarun Wanfeng Technology Co., Ltd.	PC-6D	Chip microfluídico
Sistema de controle de pressão programável	Elvesys	OB1 MK4	Controle de fluxo
Tubo de silicone	Nanjing Runze Fluid Control Equipment Co., Ltd.	96410	1mm*3mm
Molde mestre SU-8	Grupo Boao Biology Co. Ltd.	N/A	Chip microfluídico
Controlador de válvula	Elvesys	MUX Wire V3	Controle de fluxo