Um Sistema Microfluídico para Modelagem de Disfunção Endotelial sob Estresse Fisiológico Combinado de Cisalhamento Pulsátil e Hiperglicemia Oscilatória

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar e operar um sistema microfluídico que expõe células endoteliais à hiperglicemia oscilatória sincronizada e ao estresse de cisalhamento pulsátil. Essa abordagem fornece um modelo in vitro fisiologicamente relevante para estudar a disfunção endotelial diabética. Esse protocolo permite a medição quantitativa do estresse oxidativo e das respostas das células endoteliais.

Abstract

A disfunção endotelial em complicações vasculares diabéticas envolve interações complexas entre distúrbios metabólicos, especificamente glicose oscilatória (OG) e estresse de cisalhamento pulsátil (PSS). Embora esses fatores tenham sido investigados isoladamente, os modelos convencionais permanecem limitados a fluxo laminar estático de alta glicose ou fluxo laminar simplificado, carecendo da capacidade de imitar o acoplamento espaçotemporal integrado encontrado na vasculatura diabética. Ao utilizar uma plataforma microfluídica programável, esse protocolo oferece uma plataforma valiosa para investigar os efeitos integrados da hiperglicemia oscilatória sincronizada e da PSS fisiológica nas células endoteliais. Este protocolo visa modelar a disfunção endotelial sob condições metabólicas e mecânicas acopladas fisiologicamente relevantes. O uso de um chip de polidimetilsiloxano (PDMS) combinado com um sistema de controle movido por pressão permite a modulação precisa e independente de formas de onda de fluxo e perfis de concentração de glicose. A fidelidade hemodinâmica do sistema é validada por Velocimetria de Imagem de Micropartículas (Micro-PIV), enquanto a resposta celular é caracterizada quantitativamente pelo monitoramento dos níveis de espécies reativas intracelulares de oxigênio (ROS) e da viabilidade celular. Resultados representativos demonstram que a PSS fisiológica atenua efetivamente a lesão oxidativa induzida pela OG. Esse efeito é demonstrado pela redução dos níveis intracelulares de ROS e pela melhoria da viabilidade celular sob condições de estimulação combinada. Dependendo da questão de pesquisa, parâmetros como padrões de tensão de cisalhamento, frequências de oscilação da glicose e geometrias dos canais podem ser ajustados. Esse método serve como uma ferramenta versátil para estudos mecanicistas de vias mecanobiológicas e triagem de medicamentos para intervenções terapêuticas em doenças vasculares diabéticas.

Introduction

A disfunção endotelial é um evento crítico precoce no desenvolvimento de complicações vasculares diabéticas, impulsionada tanto por distúrbios metabólicos quanto por forças hemodinâmicas^{anormais 1,2}. Os níveis de OG, em vez de hiperglicemia sustentada isoladamente, são cada vez mais reconhecidos como potentes indutores de estresse oxidativo e sinalização inflamatória nas células endoteliais, levando a lesão vascular e homeostase^{comprometida 3,4,5}. Simultaneamente, o estresse de cisalhamento hemodinâmico é um dos principais determinantes do fenótipo endotelial, com a PSS sob condições fisiológicas de exercício promovendo a produção de óxido nítrico, a defesa antioxidante e a proteção vascular ^6,7,8. Portanto, compreender os efeitos integrados da hiperglicemia oscilatória e da estimulação hemodinâmica é essencial para elucidar os mecanismos da disfunção endotelial.

Modelos convencionais in vitro, que frequentemente dependem de condições estáticas de alta glicose ou fluxo laminar simplificado, não conseguem replicar a complexa e dinâmica interação entre sinais metabólicos e mecânicos presentes in^{vivo 9,10,11}. Embora modelos animais capturem aspectos sistêmicos do diabetes, eles carecem da resolução celular necessária para dissecar a sinalização sob condições microambientais^{controladas 12}. A tecnologia microfluídica oferece uma alternativa eficaz, proporcionando controle espaço-temporal preciso de estímulos bioquímicos e biomecânicos em geometrias fisiologicamente relevantes¹³, e impulsionou avanços recentes significativos em diversas aplicações biomédicas^{inovadoras 14,15}. Por exemplo, Chen et ^al.16 projetaram um dispositivo microfluídico com tensão de cisalhamento espacial e temporal da parede e sinalização ATP para estudar a dinâmica intracelular de Ca²⁺ em células endoteliais. Yu et ^al.11 desenvolveram um sistema de chip microfluídico hemodinâmico para detectar as respostas celulares sob diferentes combinações de PSS fisiológico e altas concentrações de glicose. Embora esses sistemas tenham sido usados para estudar respostas endoteliais a estresse de cisalhamento ou perturbações metabólicas de fator único, poucos conseguiram integrar com sucesso tanto oscilações de glicose quanto PSS em um único sistema. Portanto, ainda falta um protocolo padronizado e reproduzível que sincronize ambos os fatores em um ambiente microfluídico controlado.

Esse método preenche essa lacuna estabelecendo um sistema microfluídico reproduzível capaz de fornecer OG e PSS acoplados. O objetivo principal dessa abordagem é modelar o estresse oxidativo, a viabilidade celular comprometida e as respostas mecanobiológicas subjacentes à disfunção endotelial de maneira fisiologicamente relevante. Ao contrário da cultura estática ou câmaras convencionais de perfusão, essa abordagem aprimora os modelos existentes ao permitir a modulação simultânea e controlada de estímulos metabólicos e mecânicos, aproximando-se mais do microambiente vascular diabético. Além disso, o sistema é compatível com imagens de células vivas, monitoramento em tempo real e análise molecular, tornando-o adequado para uma ampla gama de aplicações, incluindo estudos mecanicistas, modelagem de doenças e triagem de medicamentos para função endotelial e lesão.

Protocol

Declaração de ética:

NOTA: Todos os reagentes, dispositivos e softwares usados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Fabricação de chips microfluídicos

1. Use software de projeto assistido por computador (CAD) para projetar a estrutura do chip microfluídico (L x L x H = 2 mm x 30 mm x 0,1 mm, Figura 1A) e faça o molde mestre do SU-8 por meio de uma empresa comercial.
2. Misture o agente de cura PDMS e o pré-polímero em uma proporção de 10:1 em peso em um copo limpo e mexa vigorosamente manualmente por 5 minutos.
3. Coloque o recipiente em uma câmara de vácuo abaixo de -0,08 MPa por no mínimo 15 minutos para remover as bolhas de ar presas durante o processo de mistura.
   NOTA: Para agilizar a remoção das bolhas e evitar transbordamento, ventile temporariamente a câmara até a pressão atmosférica para estourar as bolhas grandes e então reaplique imediatamente o vácuo. Repita esse ciclo de ventilação 2–3 vezes até que a mistura a granel fique completamente transparente e livre de bolhas macroscópicas.
4. Despeje o PDMS sobre a pastilha colocada em uma placa de Petri de vidro.
5. Desgasificou o PDMS sobre a pastilha em um dessecador por mais 15 minutos para remover quaisquer bolhas que pudessem ter se formado durante a colagem.
   NOTA: Se alguma micro-bolha persistente permanecer presa perto ou dentro das estruturas do molde mestre do SU-8, sopre-as suavemente até a borda ou estoure-as usando um soprador manual de borracha. A remoção completa das bolhas de ar é crucial para evitar defeitos estruturais nos microcanais.
6. Coloque a placa de Petri contendo mofo e polímero em um forno quente ajustado a 80 °C por 2 horas.
   ATENÇÃO: Use luvas resistentes ao calor ao manusear materiais quentes
7. Cuidadosamente retire a placa de polímero solidificada do molde mestre usando um bisturi.
8. Use uma ferramenta de perfuração de núcleo (por exemplo, 1,2 mm de diâmetro) para criar as portas de entrada e saída nas extremidades designadas dos canais na laje de polímero.
9. Limpe o revestimento de vidro e a face padronizada da laje de polímero com fita adesiva.
   PONTO DE PAUSA: As placas de PDMS curadas e perfuradas podem ser armazenadas em um recipiente limpo (por exemplo, uma placa de Petri lacrada) em temperatura ambiente por várias semanas antes do tratamento com plasma e da colagem.
10. Trate tanto a laje de polímero quanto o revestimento de vidro com um limpador de plasma a 65W de potência sob ar ambiente por 60 segundos.
11. Alinhe imediatamente a face do canal polimérico com o lado tratado da lâmina de vidro.
12. Pressione suavemente para criar um canal microfluídico permanente e fechado.

2. Preparação e semeadura das células endoteliais

1. Coloque o chip microfluídico colado em uma garrafa de vidro boronizado cheia de água desionizada e esterilize por autoclav a 121 °C e 15 psi por 20 minutos.
   NOTA: Submerga o chip em água durante o autoclaving para equalizar a pressão e evitar a deformação dos microcanais PDMS. Isso também ajuda a remover bolhas de ar aprisionadas e prepara os canais para a introdução subsequente do fluido.
   PONTO DE PAUSA: Os chips microfluídicos esterilizados podem ser armazenados com segurança no frasco de vidro lacrado em temperatura ambiente por até várias semanas até serem necessários para a semeadura celular.
2. Coloque o fragmento esterilizado em um recipiente de cultura de 60 mm preenchido com uma mistura 1:1 de fosfato tampão salino (PBS) e baixo nível de glicose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
3. Introduza 100 μg·^mL-1 de fibronectina no canal usando uma seringa de 1 mL e incube a 37 °C por 4 horas.
   NOTA: Certifique-se de que o chip microfluídico esteja posicionado abaixo do nível do líquido. Conecte a mangueira adaptadora à agulha da seringa, encha a mangueira com líquido e insira-a abaixo do nível do líquido, conecte a entrada e então injete para garantir que não entrem bolhas.
4. Adicione 24,5 mM de D-manitol ao DMEM de glicose baixa (5,5 mM de glicose) para elevar a pressão osmótica. Adicione 5 mM de glicose D ao DMEM de glicose alta (25 mM de glicose) a um nível final de 30 mM de glicose. Faça meio de cultura normal de glicose (NG) e meio de cultura de glicose alta (HG) suplementados com 20% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina (P/S), respectivamente.
5. Aqueça 1× PBS, tripsina, NG e meios de cultura HG em banho-maria a 37 °C. Colhe as Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana (HUVECs) do prato de cultivo com confluência de 90%. Desprenda as células usando solução de Tripsina-EDTA a 0,25% e incube a 37 °C por 30 segundos. Conte as células colhidas e ajuste a concentração para 1 x 10⁶ células/mL em meio NG e meio HG, respectivamente.
6. Injete 100 μL da suspensão da célula na entrada de um chip microfluídico usando uma seringa de 1 mL, utilizando meio NG para o grupo controle e meio HG para o grupo experimental. Coloque chips microfluídicos em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO₂ por 48 horas.
   NOTA: Permita que as células aderam por pelo menos 4 horas antes do processamento adicional. Alterne manualmente os dois meios de cultura a cada 2 horas para estimular a hiperglicemia oscilatória durante a fase de cultura estática. Mantenha as células em 5,5 mM de glicose durante a noite para imitar a situação in vivo (Figura 1B).

3. Configuração de estimulação dinâmica

1. Preencha dois reservatórios de 100 mL com meios de cultivo NG e HG, respectivamente, e conecte-os aos canais correspondentes do sistema programável de controle de pressão.
2. Ligue os reservatórios, a válvula magnética de duas posições e três vias e o chip microfluídico usando tubos de silicone.
3. Use conectores de aço inoxidável com ângulo de 90° de 1,3 mm de diâmetro para conectar as portas de entrada e saída do chip PDMS ao tubo.
   NOTA: Esterilize previamente os reservatórios de 100 mL, tubos de silicone e conectores de aço inoxidável em um autoclave de alta pressão e alta temperatura.
4. Calcule a vazão (Q) necessária para atingir o PSS alvo (τ). Use a fórmula τ = (6μQ)/(wh²), onde μ a viscosidade, w é a largura do canal e h é a altura do canal.
5. Defina um PSS fisiológico alvo (τ = 10 ± 2 dyn·^cm-2, 1 Hz), que corresponde a uma vazão calculada de 200 ± 40 μL·^min-1.
6. Programe a bomba de ar programável para gerar uma função de onda senoidal para manter o PSS. Programe o controlador de válvula para trocar de canal a cada 5 minutos para gerar uma oscilação de glicose em onda quadrada durante a estimulação dinâmica.
7. Ligue o sistema de bombas programáveis para fornecer o OG combinado e PSS por um total de 30 minutos.

4. Micro-PIV para verificação de campo de fluxo

1. Prepare os meios NG e HG contendo uma concentração volumímica de 0,05% de micropartículas fluorescentes (1 μm). Certifique-se de que as partículas estejam distribuídas uniformemente e livres de agregação.
2. Coloque um chip microfluídico limpo, livre de células (idêntico ao usado nos experimentos com células) no palco do microscópio de fluorescência invertida.
3. Conecte todos os componentes do sistema (Figura 1C).
   1. Conecte a fonte de pressão ao controlador de pressão.
   2. Conecte o controlador de pressão ao controlador de válvula, que está conectado ao computador para controle automatizado das formas de onda de pressão.
   3. Conecte as saídas do controlador de pressão aos reservatórios HG e NG por meio de tubulações separadas.
   4. Conecte ambos os reservatórios à válvula de pressão 3/2, que alterna entre meios HG e NG de acordo com o protocolo oscilatório de glicose programado.
   5. Conecte a saída da válvula de pressão 3/2 à entrada do chip microfluídico por meio de tubos.
   6. Conecte a saída do chip microfluídico ao reservatório de resíduos.
   7. Coloque o chip microfluídico no palco do microscópio para obter imagens de células vivas durante todo o experimento.
      NOTA: Certifique-se de que todas as conexões dos tubos estejam seguras e livres de vazamentos antes de iniciar o fluxo.
4. Acione a câmera de alta velocidade (operando a 15 Hz em modo de duplo quadro) após o fluxo estar estável para capturar pares sequenciais de imagens das micropartículas em movimento. Ajuste o atraso de tempo preciso (Δt) entre os dois quadros de cada par para 80 μs.
5. Capture imagens para a Região de Interesse (ROI) dentro do canal. Selecione o ROI no centro da seção do canal reto (Figura 2A), equidistante tanto da entrada quanto da saída, para evitar efeitos finais e garantir medições representativas de fluxo.
6. Processe os pares de imagens adquiridos usando software de análise PIV. Use um algoritmo adaptativo de correlação cruzada multi-passagem, começando com uma área inicial de interrogação de 64 × 64 pixels e refinando até uma área final de 16 × 16 pixels com um passo de grade de 8 × 8 pixels, para determinar o vetor de deslocamento (Δx) das partículas entre os dois quadros.
7. Calcule o vetor de velocidade (v) para cada área de interrogatório usando a fórmula v = Δx / Δt.

5. Aquisição de dados

NOTA: Quantifique a viabilidade e função celular usando o kit Calcein-AM/iodeto de propidium (PI) e a sonda fluorescente de estresse oxidativo de células vivas para verificar os danos causados pelas flutuações da glicose e avaliar o efeito da coestimulação.

1. Viabilidade celular
   1. Prepare a solução funcional Calcein-AM/PI de acordo com as instruções do fabricante no ponto final experimental.
      ATENÇÃO: PI é um mutagênico conhecido e suspeito de carcinógeno que se intercala no DNA. Manuseie com extremo cuidado. Use luvas e manuse-se dentro de um local de trabalho seguro designado.
   2. Enxágue o canal uma vez com PBS e introduza a solução de trabalho Calcein-AM/PI no canal. Incube o dispositivo a 37 °C com 5% de_CO2 por 30 minutos no escuro.
   3. Capture imediatamente imagens fluorescentes das células coradas usando um microscópio de fluorescência invertida equipado com uma lente objetiva de 10×. Use o filtro FITC (Verde) para Calcein-AM e o filtro TRITC ou Rhodamine (Vermelho) para PI.
2. Meça ROS intracelular
   1. Prepare a solução de trabalho fluorescente de estresse oxidativo de célula viva (ver Tabela de Materiais) na concentração especificada pelo fabricante (5 μM) em PBS.
      ATENÇÃO: Sondas fluorescentes e seus solventes comuns (como DMSO) podem ser tóxicos e facilitar a absorção de substâncias perigosas pela pele. Use luvas e manuse-se dentro de um local de trabalho seguro designado.
   2. Lave o canal três vezes com PBS e introduza a solução fluorescente fluorescente de estresse oxidativo de célula viva no canal. Incube o chipo a 37 °C com 5% de CO2 por 30 minutos no escuro.
   3. Lave o canal três vezes com PBS para remover a sonda não ligada. Capture imediatamente imagens fluorescentes usando o conjunto de filtros Far-Red (excitação 640 nm, emissão 665 nm) através de uma lente objetiva de 20×, mantendo exatamente os mesmos parâmetros de exposição para todos os grupos.
      NOTA: O aumento da intensidade da fluorescência indica níveis mais altos de ROS.

6. Análise de dados

PONTO DE PAUSA: Uma vez que todas as imagens fluorescentes brutas e imagens de câmeras de alta velocidade sejam adquiridas e salvas com segurança em um disco rígido, o processamento subsequente de imagens, análise quantitativa e comparações estatísticas podem ser pausados e realizados posteriormente.

1. Quantificar a viabilidade celular
   1. Abra as imagens adquiridas Calcein-AM (verde) e PI (vermelho) no ImageJ (veja Tabela de Materiais). Ajuste manualmente o limiar para cada canal para distinguir sinais fluorescentes de fundo. Use a função contador de células para contar células fluorescentes, ajustando o tamanho mínimo da célula de acordo com o tamanho observado da célula, e conte o número de células vivas (N_Vivas) e mortas (N_Mortas) em múltiplos campos de visão.
      NOTA: N_Vivo refere-se ao número de células Calcein-AM-positivas (verdes), N_Dead refere-se ao número de células PI-positivas (vermelhas).
   2. Calcule a porcentagem de células vivas (N_vivas / (N_vivas + N_mortas) x 100%) para cada condição experimental usando um software de planilha. Calcule a média e o desvio padrão em múltiplos campos de visão usando software de análise estatística para comparação entre grupos.
2. Quantificar ROS intracelular
   1. Arraste a imagem de escolha no ImageJ. Defina a escala calibrando o tamanho do pixel usando os metadados do microscópio (ou uma grade de referência conhecida): Analisar | Defina a escala.
   2. Remover um sinal de fundo uniforme e inespecífico de toda a imagem usando a função de subtração de fundo: Process | Subtraia o Contexto.
   3. Ajuste manualmente o controle deslizante do limiar para segmentar e defina o sinal intracelular ROS: Imagem | Ajustar | Limiar. Uma vez que o limite seja definido, use Analisar | Defina as Medidas para escolher Área e Valor Cinza Médio. Defina o tamanho mínimo da célula de acordo com o tamanho observado e meça a intensidade média do sinal segmentado dentro do ROI da monocamada da célula: Analisar | Analise partículas.
   4. Relate o nível ROS para cada condição experimental como a média dos valores medidos (por exemplo, intensidade média) derivados de pelo menos três campos de visão selecionados aleatoriamente por chip.
3. Realizando comparações estatísticas
   1. Insira os resultados quantitativos (percentual de viabilidade e intensidade média ROS) em softwares de análise de dados e gráficos (veja Tabela de Materiais).
   2. Determine a significância estatística comparando os grupos experimentais com o grupo controle usando a Análise Bidirecional da Variância (ANOVA), seguida pelo teste pós-hoc de Tukey, com nível de significância p = 0,05. Use o software para realizar a análise e gerar gráficos com barras de erro representando o desvio padrão (SD).

Results

Validação micro-PIV do campo de fluxo dentro do canal microfluídico
A Figura 1D apresenta uma visão geral da plataforma microfluídica usada para investigar as respostas endoteliais à estimulação metabólica e mecânica acoplada. O sistema integra um chip microfluídico PDMS de canal reto com um módulo de controle de fluxo movido por pressão, permitindo a aplicação da condição OG juntamente com PSS fisiológica. Uma estratégia programável de ...

Discussion

O sistema microfluídico aqui descrito fornece uma plataforma robusta e fisiologicamente relevante para investigar os efeitos integrados da OG e PSS na função das células endoteliais. A principal vantagem desse método reside em sua capacidade de controlar e desacoplar com precisão estímulos mecânicos e bioquímicos dentro de um microambiente definido. Ao contrário das culturas estáticas convencionais que não possuem forças hemodinâmicas ou dos modelos animais que frequentemente obscurecem ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211052	Dissoação celular
1 mL syringe	Shanghai Zhengbang Medical Science Co., Ltd.	1mL	Injetar fluido
60 mm culture dish	NEST Biotechnology Co., Ltd.	705001	Cultura celular
90° angled stainless-steel connector	Luoyang Mayer Trading Co.,Ltd.	1.3 mm	Dispositivo de vedação do adaptador
AutoCAD software	Autodesk	RRID:SCR_014981	Software de design assistido por computador
Boronized glass bottle	Hunan Aidete Scientific Instruments Co., Ltd.	Double-pass 100mL	Reservatório
Calcein-AM/PI Kit	Beyotime	byt-c2015	Coloração
Cell incubator	ESCO	Esco CelMate	Cultura celular
CellROX Deep Red	Invitrogen	C10422	Coloração
D-glucose	Sigma Aldrich	47249	Glicose
D-mannitol	Macklin	M813423	Equilibrar a pressão osmótica
DynamicStudio	Dantec Dynamics	V8.6	Software de análise PIV
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	14190-094	Meio
Fibronectin	Sigma Aldrich	F-2006	Adesão celular
Fluorescent microparticles	Thermo Scientific	G0100	Micro-PIV
Glass coverslip	Citotest Scientific Co.,Ltd.	#1	Chip de microfluidos
High glucose DMEM	Solarbio	12100	Meio
High-speed camera	Dantec Dynamics	FlowSense EO	Micro-PIV
ImageJ	NIH	RRID:SCR_003070	Software de processamento de imagem
Inverted fluorescence microscope	Olympus	IX73	Viabilidade celular
Inverted fluorescence microscope	Olympus	IX83	Observação e aquisição
Low glucose DMEM	Solarbio	31600	Meio
Origin	OriginLab	RRID:SCR_014212	Software de análise de dados e criação de gráficos
PDMS	Dow lnc.	184	Chip de microfluidos
Penicillin/streptomycin (P/S)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211092	Meio
Phosphate buffer saline (PBS)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211031	Cultura celular
Plasma cleaner	Jiarun Wanfeng Technology Co., Ltd.	PC-6D	Chip de microfluidos
Programmable pressure control system	Elvesys	OB1 MK4	Controle de fluxo
Silicone tube	Nanjing Runze Fluid Control Equipment Co., Ltd.	96410	1mm*3mm
SU-8 master mold	Boao Biology Group Co. Ltd.	N/A	Chip de microfluidos
Valve controller	Elvesys	MUX Wire V3	Controle de fluxo