Artigo de método

Uma plataforma microfluídica para investigar a precipitação microbiana de óxidos metálicos em meios porosos

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DOI:

10.3791/71047

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12 de junho de 2026

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1Department of Civil and Environmental Engineering, University of California, Davis, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, Davis, 3Energy Geosciences Division, Earth and Environmental Sciences Area, Lawrence Berkeley National Laboratory

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta um sistema microfluídico para estudar a precipitação microbiana dos minerais de óxido de manganês. A formação de biominerais é medida in situ por microscopia óptica e análise de imagem. Essa abordagem pode ser adaptada para investigar a precipitação de outros minerais biogênicos de cores distintas em ambientes porosos.

Resumo

Migrorganismos comumente precipitam nanopartículas de óxido metálico em solos, sedimentos e outros meios porosos ambientalmente relevantes. No entanto, a formação e reatividade dos óxidos de manganês (Mn) e ferro (Fe) permanecem pouco caracterizadas em ambientes fisicamente complexos. Embora sistemas laboratoriais possam incorporar meios porosos como substrato, eles exigem amostragem destrutiva e não são facilmente passíveis de análises em escala de poros. A natureza dinâmica, porém inacessível, dos meios porosos, requer, portanto, a capacidade de resolver precipitação mineral mediada microbianamente in situ e em tempo real. Para fechar essa lacuna, uma plataforma microfluídica é desenvolvida para avaliar a precipitação microbiana de óxidos metálicos em um espaço poroso modelo. Essa plataforma é validada com a bactéria oxidante de Mn Pseudomonas putida GB-1. O desenvolvimento do biofilme e a precipitação associada de óxidos de Mn são visualizados sob fluxo contínuo com microscopia de campo claro colorido em time-lapse. Um algoritmo de subtração de imagem é então combinado com medições de massa de ponto final para estimar a taxa de precipitação de óxido de Mn. Essa abordagem fornece uma ferramenta para testar sistematicamente como a precipitação microbiana de óxidos metálicos varia em resposta às mudanças nas condições físicas e químicas.

Introdução

Os minerais de óxido metálico desempenham um papel crítico no ciclobiogeoquímico 1. Óxidos de manganês (Mn) e ferro (Fe) são carregados negativamente em pH circunneutro e absorvem facilmente metais catiônicos 2,3,4,5,6,7,8, regulando a disponibilidade de micronutrientes e a mobilidade dos contaminantes na rizosfera e na zona hiporeica. Esses minerais influenciam a estabilidade e degradação da matériaorgânica 9,10,11,12, ditando a absorção de carbono por plantas e microrganismos do solo. Em sistemas projetados (por exemplo, filtros de tratamento de água, áreas úmidas construídas), a precipitação de óxidos metálicos é diretamente alavancada para a remoção de Mn ou Fe e remediação de contaminantescoexistentes 13,14,15,16,17. Esses óxidos metálicos são identificáveis por suas cores características, que variam do ocre ao marrom escuro e aopreto 18,19.

A precipitação de óxidos metálicos é comumente facilitada por microrganismos em um processo conhecido comobiomineralização 20,21,22. Numerosas bactérias e fungos oxidantes de Mn sintetizam oxidases e peroxidases multicobre que catalisam a transferência de elétrons de Mn(II) para Mn(III) e Mn(IV) em condições aeróbicas, resultando na precipitação de minerais de óxidos de Mn(III, IV) semelhantes àbirnessita 2,23,24. Além disso, diversas bactérias oxidantes de Fe oxidam enzimaticamente Fe(II) a Fe(III) em ambientes circumneutros ou ácidos com pouca quantidade de oxigênio, produzindo óxidos de Fe(II, III), incluindo ferrihidrita emagnetita 25,26,27,28. Esses minerais biogênicos precipitam adjacentes às superfícies celulares e se acumulam em polímeros extracelulares, bainhas e outras estruturas celulares, formando conjuntos de microrganismos-minerais 2,23,25,27,29,30.

Apesar da ubiquidade da biomineralização de Mn e Fe em ambientes complexos, faltam insights em escala porosa. Os espaços porosos são estruturalmente heterogêneos, exibindo fluxo preferencial de fluidos e transporte de reagentes não uniformes que ditam a distribuição das reaçõesbiogeoquímicas 31,32,33,34,35. Além disso, a atividade microbiana pode gerar gradientes geoquímicos locais que promovem ou limitam a biomineralização, enquanto flutuações na química dos fluidos porosos (por exemplo, pH, oxigênio dissolvido, potencial redox) podem potencializar a precipitação mineral ou facilitar a dissolução34,35. Estudos de biomineralização de Mn e Fe normalmente dependem de condições de lote bem misturadas 30,36,37,38,39,40 ou nas colunas 41,42,43,44 para quantificar a cinética de oxidação ou caracterizar precipitados biominerais. No entanto, experimentos em lote carecem da heterogeneidade espacial inerente a sistemas porosos. Colunas contendo meios granulares compactados fornecem arquitetura física relevante, mas são limitadas em sua utilidade porque exigem amostragem destrutiva em pontos temporários estáticos, o que interrompe a progressão do experimento e impede observações em escala porosa não perturbadas. Portanto, são necessárias novas abordagens experimentais para investigar a precipitação microbiana de óxidos metálicos em meios porosos.

Sistemas microfluídicos são uma ferramenta para estudar reações biogeoquímicas in situ e em tempo real. Reatores microfluídicos podem ser fabricados rapidamente e a baixo custo com geometrias reprodutíveis e personalizáveis que simulam meios porosos naturais ouidealizados 45. Os dispositivos resultantes são opticamente transparentes, facilitando a visualização não destrutiva e quantificação de processos em escala de poros, incluindo formação de biofilme 46,47,48,49, desenvolvimento dehotspots 50,51, precipitação de metaisabióticos 52,53 e biomineralização decalcita 34,54,55,56 . Além disso, sistemas microfluídicos permitem que os usuários controlem e variem sistematicamente as condições de contorno, incluindo concentração de metais, presença ou ausência de oxigênio dissolvido e vazão do fluido. Por fim, dependendo do material do substrato do reator, medições diretas das interações entre microrganismos, minerais e fluidos podem ser obtidas usando espectroscopia de raios X, Raman ou infravermelho57. O desenvolvimento de uma plataforma baseada em microfluídica para estudar a precipitação microbiana de óxidos metálicos oferece assim uma via para pesquisas inovadoras sobre a formação e reatividade das fases minerais de Mn ou Fe que impulsionam o ciclo de carbono, nutrientes e contaminantes em ambientes porosos.

Este trabalho utiliza a biomineralização de Mn como estudo de caso para quantificar a precipitação microbiana de óxidos metálicos em um ambiente poroso dinâmico. O protocolo a seguir demonstra como fabricar e inocular um reator microfluídico com Pseudomonas putida GB-1, uma bactéria-modelo conhecida por oxidar Mn(II) em Mn(III, IV) em sua fase estacionária de crescimento58,59. Utilizando um sistema de controle de fluxo baseado em pressão, um meio de crescimento rico em nutrientes e uma solução de sal mínima são injetados sequencialmente para promover a formação de biofilme e induzir a precipitação de óxidos de Mn, respectivamente. Imagens de campo claro colorido de alta resolução do espaço poroso microfluídico são coletadas em intervalos regulares de tempo, capturando o contraste de cor entre os biofilmes GB-1 de P. putida e os óxidos de Mn acumulados. Ao final de cada experimento, todos os óxidos de Mn contidos no reator são digeridos, e a massa total é medida com espectrometria de massa de plasma acoplado indutivamente (ICP-MS). A taxa de precipitação de óxido de Mn é estimada em função do tempo integrando essas medições de massa no ponto final com um algoritmo de subtração de imagem. Esse fluxo de trabalho pode ser facilmente adaptado para investigar outros organismos ou processos de precipitação de óxidos metálicos sob diversas condições ambientais.

Protocolo

NOTA: Este protocolo faz várias suposições sobre o conhecimento prévio dos usuários e a instrumentação disponível. Primeiro, os usuários devem ter acesso a uma sala limpa e estar familiarizados com procedimentos de fotolitografia para fabricar um molde microfluídico ou comprar um molde comercial. Em seguida, os usuários devem estar familiarizados com métodos básicos de microbiologia, como o uso de técnicas assépticas, preparação de soluções de estoque e estriamento de placas. Os usuários também precisam de acesso a um autoclave, microcentrífuga, incubadora shaker e espectrômetro de massa. Por fim, os usuários devem ser proficientes em microscopia óptica e análise de imagens.

1. Fabricação e montagem de reatores microfluídicos

NOTA: Os reatores microfluídicos usados neste protocolo foram projetados em AutoCAD com uma geometria de grão de areia adaptada de Wang et al.55. Cada molde produz seis canais replicados com espaço poroso de 15 mm × 10 mm, porosidade de 0,41 e volume de poros de 2,3 μL. Exceto para o tratamento com plasma, os reatores são fabricados em um gabinete de fluxo laminar para manter um ambiente de baixo teor de poeira.

  1. Funda os canais microfluídicos em polidimetilsiloxano (PDMS) usando litografia suave.
    1. Em um copo plástico, pese a base do elastomero e o agente de cura em uma proporção de 10:1 (aqui, 25 g e 2,5 g, respectivamente).
    2. Usando uma faca de plástico, misture bem a base de elastomer e o agente de cura por 10 minutos.
    3. Desgasifice o PDMS no copo usando um dessecador a vácuo por 1 hora para remover bolhas de ar.
    4. Despeje o PDMS no molde e desgaseifice por 30 minutos para remover qualquer ar residual.
    5. Coloque o molde em uma placa elétrica e cure por 3 horas a 95 °C.
    6. Depois de curar e resfriar, use um bisturi para cortar o PDMS e retirá-lo do mofo.
    7. Em um tapete de corte, corte os seis canais microfluídicos com uma lâmina de barbear, deixando 2–3 mm ao redor da borda de cada canal. Perfure os furos de entrada e saída em cada canal com um furo de biópsia.
    8. Cubra ambos os lados de cada canal microfluídico com uma tira de fita transparente para evitar o acúmulo de poeira e armazene em uma placa de Petri de 100 mm.
  2. Um dia antes do experimento, montar o reator microfluídico final com plasma de ar.
    1. Remova a fita transparente de um canal microfluídico, depois enxágue o PDMS e uma capa de vidro com etanol a 70% e seque com nitrogênio comprimido.
      ATENÇÃO: Etanol é inflamável. Manuseie e armazene conforme a ficha de dados de segurança.
    2. Coloque o canal microfluídico e a cobertura virada para cima em um limpador de plasma. Evacue a câmara por 1 minuto, depois aplique plasma por 1 minuto (18 W e ~0,5 torr).
    3. Remova o canal microfluídico e o deslize de cobertura do limpador de plasma e coloque o deslize de cobertura sobre o PDMS, batendo suavemente para garantir a aderência. Armazene o reator montado em uma placa de Petri de 100 mm durante a noite.

2. Sistema de controle de fluxo microfluídico

NOTA: Um sistema modular da Elveflow é usado para facilitar a injeção sequencial de fluidos com perturbações mínimas na pressão e na vazão. Os componentes do sistema incluem compressor de ar, controlador de fluxo, válvula de distribuição, sensor de fluxo, rack de reservatório de fluido (para tubos cônicos de 15 mL) e software Elveflow Smart Interface (ESI) (Figura 1). Outros sistemas de controle de fluxo, como bombas de seringa, podem ser usados tanto em modos de infusão quanto de retirada, com seringas ou reservatórios dedicados para cada solução influente e uma válvula divisora de baixo volume morto para facilitar a injeção sequencial de fluido por uma única linha de tubo. No entanto, deve-se ter cuidado com bombas de seringa para minimizar as flutuações de pressão que possam desalojar os biofilmes.

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Figura 1: Sistema de controle de fluxo e geometria do reator microfluídico. O sistema experimental consiste em um controlador de fluxo (1) conectado por tubulação pneumática (2) a um rack de reservatório de fluido (3) uma válvula de distribuição para fornecer injeção sequencial de meio de crescimento (GMMn) e solução salina (SSMn), (4) um sensor de fluxo (5) conectado ao controlador de fluxo para fornecer feedback em tempo real e ajuste de fluxo, (6) tubo PEEK com pequeno diâmetro interno para fornecer resistência fluídica (7) uma armadilha de bolhas (8) a montante do reator microfluídico (9). Esquema do sistema não para escalar. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

  1. Configure e calibre todo o hardware conforme as instruções do fabricante.
    NOTA: O suporte do reservatório de fluido, a válvula de distribuição e o sensor de fluxo são instalados dentro de uma incubadora de microscópio feita sob medida para manter o experimento a 30 °C.
  2. Ajuste o regulador de pressão do compressor de ar para 3 bar e conecte a saída do compressor de ar à entrada do controlador de fluxo com tubos pneumáticos de poliuretano.
  3. Conecte um filtro hidrofóbico à saída do controlador de fluxo para evitar o refluxo de fluido, depois conecte o controlador de fluxo a duas portas de entrada do rack do reservatório de fluido com tubos pneumáticos de poliéter poliuretano usando um coletor e adaptadores com farpas.
  4. Conecte a cremalheira do reservatório de fluido, a válvula de distribuição e o sensor de fluxo com a tubulação da seguinte forma, usando conexões sem flange para tubos externos de 1/16 de polegada, salvo indicação em contrário.
    1. Conecte duas portas de saída do suporte do reservatório de fluido às duas primeiras portas de entrada da válvula de distribuição com 80 cm de tubo interno de politetrafluoroetileno (PTFE) de 1/32 polegada de diâmetro.
    2. Conecte a porta de saída da válvula de distribuição à entrada do sensor de fluxo com 15 cm de tubo PTFE de 500 μm de dia-divisão interior e um adaptador de conexão.
    3. Conecte 60 cm de tubo de poliéter éter cetona (PEEK) de 63,5 μm diademonias diadiaforinas na porta de saída do sensor de fluxo usando um adaptador adaptador.
      NOTA: Para experimentos que exigem diferentes vazões, ajuste o comprimento do tubo PEEK conforme necessário para fornecer resistência fluídica suficiente para a estabilidade do fluxo.
    4. Conecte o tubo PEEK a 10 cm de tubo PTFE de 500 μm de dia-divisão interior usando um encaixe de união.
    5. Fixe o tubo de PTFE na entrada de entrada de uma sifã microfluídica equipada com um filtro de membrana de PTFE (tamanho do poro ~10 μm).
    6. Conecte 75 cm de tubo de PTFE de 200 μm de diademonia interior na porta de saída do sifão de bolhas para criar contrapressão e uma remoção eficaz das bolhas. Este tubo será conectado ao orifício de entrada do microfluídico do reator.
  5. Antes de cada experimento, esterilize o sistema de controle de fluxo com todos os tubos e equipamentos conectados, lavando uma solução de água sanitária a 1% por três vezes o volume do sistema (~4 h por linha de tubo a 7,0 μL·min-1), seguida por água ultrapura estéril pelo mesmo período.
  6. Entre os experimentos, limpe o sistema de controle de fluxo da seguinte forma.
    1. Enxágue a válvula de distribuição e o sensor de fluxo lavando 100% de isopropanol e água ultrapura estéril para evitar acúmulo de resíduos ou precipitados.
      ATENÇÃO: O isopropanol é inflamável. Manuseie e armazene conforme a ficha de dados de segurança.
    2. Autoclave: a armadilha de bolhas.
    3. Substitua o filtro de membrana com armadilha de bolhas e o tubo de PTFE de 200 μm diadia-diâmetro interior após cada experimento para evitar entupimento (filtro de membrana) ou colonização bacteriana (tubulação).

3. Mídia experimental e soluções

  1. Prepare o meio líquido de Caldo Luria (LB, formulação Miller's) autoclavando 2,5% LB em pó em água ultrapura a 121 °C por 20 minutos. Para placas de ágar LB, autoclave 2,5% LB em pó e 1,5% de ágar em água ultrapura a 121 °C por 20 minutos, depois despeje em placas de Petri de 100 mm (~20 mL por prato) e deixe esfriar até ficar sólido.
  2. A partir de soluções de material esterilizadas por filtro, preparadas com a American Chemical Society (ACS) ou reagentes de grau bacteriológico em água ultrapura, produzam 30 mL de cada um dos seguintes produtos. A composição da solução salina e do meio de crescimento são adaptadas de Gehin et al.59.
    1. Prepare solução salina sem Mn(II) (SS0): 0,4 mM CaCl 2,2H2O, 0,25 mM MgSO4,7H 2O, 0,25 mM Na2HPO4,2H 2O, 0,15 mM KH2PO4, 1:2 Fe(III)-EDTA (20 μM FeCl3,6H 2O e 40 μM EDTA ajustados para pH 6,5 com 1M NaOH), 10 mM de tampão HEPES (ajustado para pH 7,0 com 1M NaOH), 5 mM (NH4)2SO4, e metais traço (40 nM CuSO 4,5H2O, 273 nM ZnSO4,7H 2O, 84 nM CoCl2,6H 2O, 53,7 nM Na2MoO4,2H 2O) em água ultrapura estéril.
    2. Prepare a solução salina com Mn(II) (SSMn): Igual à SS0 com 50 μM MnCl 2,4H2O adicionado.
    3. Prepare o meio de crescimento sem Mn(II) (GM0): Igual ao SS0 com 1,5 g· extrato de levedura L-1 e 1,5 g· Ácido casamino L-1 adicionado.
    4. Prepare o meio de crescimento com Mn(II) (GMMn): Igual ao GM0 com 50 μM MnCl 2,4H2O adicionado.
      ATENÇÃO: Soluções salinas e meios de cultivo contêm metais com riscos tanto à saúde quanto ambientais. Manuseie e armazene conforme as fichas de dados de segurança.
  3. Prepare uma solução ácida contendo 40 mM de ácido oxálico diidratado e 2% de ácido nítrico em água ultrapura para a digestão dos óxidos de Mn dentro do reator microfluídico.
    ATENÇÃO: Ácido oxálico diidratado e ácido nítrico são corrosivos, e o ácido nítrico é um oxidante forte. Manuseie e armazene conforme as fichas de dados de segurança.
  4. Prepare uma solução de ácido nítrico a 1% em água ultrapura para diluição da amostra de ICP-MS.

4. Cultivo bacteriano

NOTA: A cultura bacteriana é realizada com técnica asséptica na bancada, usando um bico Bunsen. Os materiais são estéreis, salvo indicação em contrário. As durações de incubação são específicas para P. putida GB-1 e podem precisar ser ajustadas para outros microrganismos.

  1. De um cabo a -80 °C, streak P. putida GB-1 em uma placa de ágar LB. Incube a placa por aproximadamente 20 horas a 30 °C para permitir o crescimento das colônias bacterianas.
  2. Na noite anterior ao experimento, adicione 10 mL de LB de meio a um tubo cônico de 50 mL e inocule com uma colônia de placa. Incube a pré-cultura LB em um incubador shaker a 30 °C e 180 rpm por 16 horas para alcançar a fase estacionária.
  3. Após 16 horas de incubação, aliquota 1 mL de pré-cultura LB em um tubo microcentrífuga de 1,5 mL e centrifuge por 1 minuto a 8.000 x g para pelletar as bactérias.
  4. Lave a aliquota três vezes para remover o meio LB gasto, descartando o sobrenadante, ressuspendendo a célula em 1 mL de SS0 e centrifugando por 1 minuto a 8.000 x g. Resuspenda a pastilha final em 1 mL de SS0.
  5. Meça a densidade óptica (OD600) da suspensão celular lavada em uma cuveta não estéril com um densímetro celular. O ODesperado de 600 para P. putida GB-1 é de 3,6–3,8 nesta etapa, portanto é necessária uma diluição de pelo menos 5 vezes em SS0 .
  6. Inocule 20 mL de GM0 com suspensão de célula lavada até um ODinicial de 600 de 0,01 em um frasco Erlenmeyer de 50 mL. Incube a 30 °C e 180 rpm por 6 horas para atingir a fase exponencial média.

5. Experimento de biomineralização

  1. Na manhã do experimento, ligue o sistema de controle de fluxo.
    1. Pré-aqueça a incubadora do microscópio a 30 °C.
    2. Despeje 10 mL de GMMn e SSMn em dois tubos cônicos de 15 mL e conecte os tubos ao rack do reservatório de fluido. Lave o SSMn por aproximadamente três vezes o volume do sistema (~4 h em 7,0 μL·min-1), seguido pelo GMMn pelo mesmo período.
  2. Sature o reator microfluídico preparado por 5 horas após inocular a cultura de médio exponencial.
    NOTA: A saturação e inoculação do reator são realizadas com técnica asséptica na bancada, usando um queimador Bunsen. Os materiais são estéreis, salvo indicação em contrário.
    1. Desgasifice o reator em um dessecador a vácuo por 20 minutos.
    2. Enquanto o reator está desgasejando, extraia 1–2 mL de SS0 em uma seringa plástica de 3 mL, depois anexe uma agulha de ponta romba e 20 cm de tubo Tygon de 0,02 pol. Pressione o êmbolo da seringa até que o tubo fique totalmente saturado.
    3. Remova o reator do dessecador, depois fixe o tubo no orifício de saída do reator com pinças inclinadas e sature manualmente o reator com a seringa até que uma gota se forme no orifício de entrada do reator.
    4. Conecte 20 cm de tubo Tygon de 0,02 pol. de diametro interno ao orifício de entrada do reator. Continue dispensando SSMn no reator até que todas as bolhas de ar sejam removidas (200–300 μL).
  3. Prepare o inoculo do reator e inocule o reator microfluídico.
    1. Remova a cultura de mid-exponencial do incubador shaker 6 horas após a inoculação e meça o OD600. O ODesperado 600 é de 1,6–1,8 nessa etapa, então recomenda-se uma diluição 4 vezes em SS0 .
    2. Dilua a cultura de mid-exponencial em 2 mL de SSMn até um ODinicial de 600 de 0,005 em um tubo microcentrífuga de 2 mL. Inverta o tubo várias vezes para misturar.
    3. Coloque o tubo de entrada do reator no tubo da microcentrífuga, garantindo que uma gota de fluido entre em contato com o inóculo para evitar a entrada de ar no tubo. Feche parcialmente o tubo da microcentrífuga e prenda a tampa com fita adesiva para evitar contaminação.
    4. Retire 4–5 mL de SSMn em uma seringa de vidro de 5 mL para molhar o cano, depois dispense até que restem 0,5 mL na seringa. Coloque a seringa em uma bomba de seringa.
    5. Remova a agulha da seringa plástica e prenda-a à seringa de vidro, tomando cuidado para não prender ar no cubo da agulha.
    6. Inocule o reator com a bomba de seringa retirando o inóculo para dentro do reator por 20 minutos a uma vazão de 8,33 μL·min-1 (~70 volumes de poros).
    7. Após a inoculação, desligue a bomba da seringa e permita que as bactérias se assentem e se fixem por 1 hora sem fluxo.
    8. Após 1 hora, remova a seringa da bomba da seringa, mas deixe-a conectada ao tubo de saída.
  4. Conecte o reator microfluídico inoculado ao sistema de controle de fluxo.
    1. Mova o reator e a seringa da bancada para a incubadora do microscópio.
    2. No palco do microscópio, remova o tubo de entrada do reator.
    3. Pressione suavemente o êmbolo da seringa para criar uma gota no orifício de entrada do reator.
    4. Dobre manualmente o tubo de PTFE do sistema de controle de fluxo em ângulo reto (~1 cm da extremidade do tubo) para que ele faça interface perpendicular à superfície do PDMS, minimizando forças laterais e a intrusão de ar no orifício de entrada do reator.
    5. Mergulhe a extremidade do tubo de PTFE em uma solução de diacrilato de polietilenoglicol a 1% (PEG-DA) para molhar o exterior hidrofóbico do tubo. Certifique-se de uma gota de GMMn na extremidade do tubo de PTFE e prenda o tubo ao orifício de entrada do reator.
    6. Desconecte a seringa e coloque o tubo de saída em um tubo de microcentrífuga não estéril de 5 mL para coletar o efluente do reator.
    7. Defina a vazão para 1,33 μL·min-1 no software do sistema de controle de fluxo. Estabeleceu um programa para fornecerMn GM por 15 h (~500 volumes de poros) para promover a formação de biofilmes, seguido por SSMn por 28,5 h (~1.000 volumes de poros) para induzir a biomineralização de Mn.
  5. Monte o reator microfluídico no inserto do estágio do microscópio.
    NOTA: Um sistema de irradiação ultravioleta-C (UVC) personalizado, acoplado ao inserto do estágio do microscópio, é usado para mitigar o crescimento bacteriano indesejado e a precipitação mineral fora do espaço poroso microfluídico (Figura 2). Esse projeto é adaptado de Ramos et al.60 e pode ser controlado por um programa automatizado. Veja Fadely et al.61 para detalhes.
    1. Coloque uma amostra de quadro sob o reator para maior estabilidade, depois monte rigidamente a estrutura e o reator no palco inserido, garantindo que estejam totalmente imobilizados.
    2. Fixe o tubo de PTFE ao inserto do palco com um pedaço de fita adesiva para evitar que o tubo se desprenda do orifício de entrada do reator.
    3. Alinhe os braços UVC a uma distância de 3 mm da borda do espaço poroso no lado da entrada e 2 mm no lado da saída para minimizar o espalhamento da luz ultravioleta e danos ao biofilme dentro do espaço poroso.
      NOTA: O alinhamento adequado do UVC resultará em pouca ou nenhuma acumulação de biomassa na região de entrada do reator (Figura 3A). O alinhamento dos braços UVC muito distante da borda de entrada do espaço poroso (Figura 3B) ou a ausência de irradiação (Figura 3C) resulta em precipitação mineral a montante do espaço poroso.
    4. Estabeleça um programa para irradiação de reatores. Trate as regiões de entrada e saída do reator por 5 minutos a t = 0 h para inativar as bactérias depositadas durante a inoculação, depois trate a região de saída apenas por 5 minutos a t = 17,5 h para inativar quaisquer biofilmes restantes.

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Figura 2: Sistema de irradiação ultravioleta-C (UVC) personalizado para reatores microfluídicos. (A). Vista superior do sistema montada no encarte do palco do microscópio mostrando braços articuláveis (azuis) com matrizes de diodos emissores de luz UVC (LED) acoplados (retângulos amarelos) e um reator microfluídico montado em uma moldura de amostra (pequeno retângulo cinza). (B). Vista inferior do sistema mostrando LEDs UVC (quadrados bege) embutidos nos braços articulados. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3: Efeito da irradiação UVC na região de entrada do reator microfluídico. (A). Região de entrada do reator com tratamento UVC de 5 minutos em t = 0 h mostrando alinhamento adequado para remoção completa de biofilmes indesejados. (B). Região de entrada do reator com um arranjo UVC mal alinhado, que deixou biofilmes residuais no orifício de entrada e fora do espaço poroso, permitindo que óxidos de Mn precipitassem a montante. (C). Região de entrada do reator sem tratamento UVC, levando ao crescimento extensivo de biofilmes e precipitação mineral. Sombreamento cinza delimita o espaço poroso. A barra de escala é de 2 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Microscopia óptica de time-lapse

NOTA: Um microscópio de epifluorescência invertida Nikon Ti2 Eclipse equipado com câmera digital (2304 x 2304 pixels por campo de visão), motor de luz branca, objetivo 4x (1,62 μm·pixel-1) e software NIS Elements é usado para imagens de campo claro colorido. Outros microscópios ópticos capazes de imagem colorida também são adequados. O uso de imagens coloridas melhora a sensibilidade a baixa massa de óxido de Mn. Se a automação em time-lapse não for uma opção, os usuários podem coletar imagens manualmente e processá-las como uma série temporal.

  1. Para imagens de alta qualidade, execute os seguintes passos de alinhamento e correção:
    1. Para garantir uma iluminação uniforme, ajuste manualmente o alinhamento de Köhler seguindo as instruções do fabricante.
    2. Otimize a iluminação do campo claro para evitar subsaturação ou supersaturação da imagem (Fusion Pad > Color > Auto Brightness e Fusion Pad > Color > Auto White).
      NOTA: É melhor otimizar a iluminação do campo claro apenas uma vez em um reator que já contenha biofilmes e óxidos de Mn, e então aplicar o mesmo tempo de exposição e equilíbrio de cor em todos os experimentos subsequentes para uma iluminação consistente. Aqui, é usada uma iluminação de 5 ms com vermelho a 97,58%, verde a 44,76% e azul a 100%.
    3. Para evitar artefatos de quilting ao adquirir imagens bordadas do espaço poroso microfluídico, aplique uma correção de sombreamento (Adquirir > Painel de Correção de Sombreamento).
  2. Defina a coordenada central da imagem costurada (Aquisição ND > XY).
  3. Configure a área de varredura de imagem costurada (aqui, 5 x 4 campos de visão) e aplique uma sobreposição de 1% (Aquisição ND > Imagem Grande).
  4. Configure a aquisição de imagens coloridas em campo claro com o objetivo 4x (Aquisição ND > λ).
  5. Configure a frequência de imagem com intervalos de 1 h para 15 h (fase de crescimento) e 0,5 h para 28,5 h (fase de mineralização) (Aquisição > ND Tempo), e então execute o programa de time-lapse.
    NOTA: A duração das fases de crescimento e mineralização é específica para P. putida GB-1 e pode ser ajustada conforme necessário para outros microrganismos.
  6. Quando o experimento estiver concluído, exporte as imagens como Formato de Arquivo de Imagem Marcado (TIFF) (Painel Macro > Exportar Imagens para TIFF).

7. Digestão ácida e medição de massa de Mn

NOTA: Um ICP-MS é usado para medir a massa de Mn retida no reator microfluídico, mas outros instrumentos, como espectrômetros ópticos de emissão (ICP-OES), também são aceitos. Se não houver instrumentação analítica disponível, amostras digeridas em ácido podem ser enviadas para um laboratório comercial.

  1. Ao final do experimento, remova o reator do inserto do palco do microscópio e desconecte os tubos de entrada e saída.
  2. Retire 1,5 mL de solução ácida em uma seringa estanque de 5 mL de vidro (separada da seringa de inoculação). Prenda uma agulha de ponta romba e 20 cm de tubo de PTFE de 1/32 polegada de diafragma interior à seringa e dispense ácido manualmente até que uma gota se forme na extremidade do tubo.
  3. Na bancada, coloque a seringa em uma bomba de seringa e conecte o tubo ao orifício de entrada do reator, tomando cuidado para não prender bolhas de ar, que podem impedir que a solução ácida penetre em todos os poros. Conecte 30 cm de tubo PTFE de 1/32 pol de diametro interno ao orifício de saída do reator e coloque a extremidade do tubo de saída em um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
  4. Injete solução ácida no reator por 10 minutos a uma vazão de 100 μL·min-1.
  5. Após a injeção da solução ácida, desconecte a agulha de ponta romba da seringa de vidro. Encha uma seringa plástica de 10 mL com ar e conecte-a à agulha de ponta romba, depois dispense manualmente todo o ar da seringa para drenar o ácido restante do reator e do tubo para o tubo da microcentrífuga de 2 mL.
    NOTA: Embora um pequeno volume de solução ácida possa permanecer preso no espaço poroso após a injeção de ar, ele é negligenciável em relação ao volume total injetado. Usuários que trabalham com geometrias de menor porosidade podem considerar lavar volumes adicionais de ar para remover filmes de fluido e ácido residual de poros mal conectados.
  6. Dilua a amostra digerida em 1% de ácido nítrico de acordo com a faixa de calibração ICP-MS. Aqui, prepare uma diluição 100x (volume total de 5 mL) em um tubo cônico de 15 mL.
  7. Meça a concentração de Mn na amostra diluída com ICP-MS. Corrija a concentração medida com o fator de diluição e o volume total da amostra para determinar a massa de Mn retida no reator.

8. Análise de imagem

NOTA: O MATLAB é recomendado devido às suas funções integradas para análise de imagens, que estão incluídas no texto. No entanto, outras ferramentas, como as bibliotecas de análise de imagens do ImageJ ou do Python, também podem ser usadas para realizar análises comparáveis. Passos-chave da análise de imagem são mostrados na Figura 4. Todos os scripts de análise de imagem são fornecidos como Arquivos Suplementares (Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 3).

figure-protocol-4
Figura 4: Fluxo de trabalho de subtração de imagens para isolar precipitados de óxidos de Mn. A partir de imagens de campo claro colorido em time-lapse, uma imagem de referência (tref) (1) foi identificada para remover a intensidade dos biofilmes de fase estacionária subjacente de todas as imagens subsequentes de pontos de tempo (tn) (2) Máscaras binárias de todo o tn foram geradas (3) e multiplicadas tanto pelo tref (4) quanto pelo correspondente tn (5) para capturar a extensão biofilme-biomineral. Finalmente, os tn mascarados foram subtraídos do tref mascarado (6). As matrizes corrigidas pela intensidade resultantes quantificam a diminuição da intensidade (u.a.) devido ao acúmulo de óxido de Mn em cada pixel. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

  1. Carregue um TIFF de alta resolução da geometria do espaço poroso microfluídico (exportado do AutoCAD) no espaço de trabalho para usar como uma máscara de grãos (imread).
  2. Endireitar e registrar as imagens coloridas do campo claro para aplicar efetivamente a máscara de grão.
    1. Gerar um binário de registro da primeira imagem de ponto de tempo (t = 0 h).
      1. Carregue o TIFF de campo claro colorido no espaço de trabalho (imread).
      2. Recorte a imagem um pouco maior que o tamanho do espaço poroso (recroque).
      3. Afie a imagem para melhorar a resolução dos limites de grão (nitidizado).
      4. Binarize a imagem usando um limiar adaptativo que priorize características escuras (rgb2gray, adaptthresh com polaridade em primeiro plano = "escuro" e sensibilidade ajustada conforme necessário, imbinarize, imcomplement).
      5. Preencha os grãos do binário de registro resultante para criar características sólidas (preenchimento com "furos" especificados). Note que nem todos os grãos podem ser preenchidos.
      6. Eroda o binário de registro conforme necessário para remover ruído de fundo, depois dilate para substituir os pixels perdidos nas bordas do grão (ierodar, imdilatar).
    2. Use um algoritmo de registro de transformação de características invariante à escala (SIFT) para calcular a matriz de transformação necessária para alinhar o binário de registro à máscara de grão (detectSIFTFeatures, extractFeatures, matchFeatures, estgeotform2d com tipo de transformação = "afim").
    3. Aplique essa matriz de transformação ao binário de registro e à primeira imagem do ponto de tempo, depois sobreponha-os com a máscara de grão para avaliar o ajuste (imwarp, imshowpair).
    4. Se o mau alinhamento persistir após o registro SIFT, aplique o registro local conforme necessário (cpselect, fitgeotform2d com tipo de transformação = "lwm", imwarp).
    5. Recorte a imagem registrada e a máscara de grão conforme necessário para remover artefatos de registro nas bordas da matriz, depois redimensione para as dimensões do espaço poroso (15 mm x 10 mm) (corte e redimensionamento).
    6. Passe por todas as imagens coloridas de campo claro para aplicar o mesmo registro (imwarp).
  3. Identifique visualmente uma imagem de referência (referência t, Painel 1 na Figura 4) quando os biofilmes entram pela primeira vez na fase estacionária, determinada como falta de movimento ou crescimento contínuo (aqui, t = 18,5 h).
  4. Binarize cada imagem de ponto temporal (tn, Painel 2 na Figura 4) (rgb2gray, adaptthresh com polaridade em primeiro plano = "escuro" e ajuste de sensibilidade conforme necessário, imbinarize, imcomplemente) de modo que conjuntos biofilme-biominerais = 1 e grãos e poros vazios = 0. Multiplique cada máscara de ponto de tempo pela máscara de grão invertido (imcomplemento) para remover limites residuais de grão.
  5. Multiplique tn por sua correspondente máscara de pontos de tempo (Painel 3 na Figura 4) para isolar a região biofilme-biomineral de interesse (Painel 5 na Figura 4), depois multiplique tref por cada máscara de ponto temporal para isolar a mesma região (Painel 4 na Figura 4).
  6. Subtraia todo o tn mascarado dareferência t mascarada para quantificar a diminuição da intensidade do pixel associada ao acúmulo de óxido de Mn em cada ponto de tempo (subtrair), depois converta para matrizes compostas corrigidas por intensidade (rgb2gray, Painel 6 na Figura 4).
  7. Para avaliar a distribuição espacial dos minerais através do espaço poroso (u.a.), soma ao longo das colunas (soma com dimensão = 1) de cada matriz corrigida por intensidade.
  8. Para estimar a taxa de precipitação de óxidos de Mn ao longo do tempo (μg·h-1):
    1. Soma-se cada matriz corrigida pela intensidade (soma com dimensão = "todos") para quantificar a intensidade total corrigida em cada ponto de tempo.
    2. Divida a intensidade total corrigida em cada ponto de tempo pela intensidade total corrigida no ponto final, de modo que o ponto final = 1 e todos os valores anteriores sejam fracionários. Reescalar para μg multiplicando pela massa Mn medida com ICP-MS.
    3. Considere a derivada em relação ao tempo dividindo o aumento de massa (μg) entre pontos de tempo sequenciais (diff) pelo intervalo de tempo entre imagens (0,5 h).

Resultados

Este protocolo fornece uma plataforma experimental para imagens espaço-temporais resolvidas da formação de biofilmes e biomineralização de Mn. Imagens coloridas em campo claro demonstraram que os biofilmes GB-1 de P. putida estavam uniformemente distribuídos pelo espaço poroso microfluídico em t = 18,5 h antes do início da precipitação de óxidos de Mn (Figura 5A). Subsequentemente, os óxidos de Mn se acumularam preferencialmente no lado de entrada do espaço poroso mais próximo da fonte influente de Mn(II) (Figura 5B). A diferença entre a imagem de referência e os pontos de tempo subsequentes revelou a contribuição isolada dos precipitados de óxido de Mn para a intensidade total da imagem (Figura 5C) e permitiu quantificar o gradiente observado na escala do reator na acumulação de minerais (Figura 5D). Na escala de biofilme, essa abordagem de subtração de imagem capturou a precipitação gradual de óxidos de Mn nas superfícies do biofilme e o acúmulo de minerais nas bordas dos biofilmes em contato com o fluido dos poros (Figura 6).

O protocolo também oferece um fluxo de trabalho para estimar a cinética da precipitação de óxidos de Mn a partir de medições de subtração de imagem e ICP-MS. Reatores microfluídicos triplicados continham 4,29 ± 0,22 μg Mn no ponto final do tempo experimental. A digestão ácida do conteúdo do reator foi validada anteriormente usando medições baseadas em sincrotron da massa de óxido de Mn e resultou em erro61 inferior a 18%. Portanto, as matrizes corrigidas pela intensidade foram reescaladas para essa massa final. A taxa estimada resultante de precipitação de óxidos de Mn foi não monotônica, aumentando acentuadamente entre t = 19,5 h e t = 21 h, antes de atingir o pico de 0,29 ± 0,04 μg·h-1 e desacelerar gradualmente até t = 43,5 h (Figura 7). Deve-se notar que esse cálculo de taxa não considera nenhum óxido de Mn nanoparticulado abaixo da resolução do microscópio óptico nem qualquer massa de óxido perdida devido ao transporte durante a duração do experimento, que se espera ser mínima. Portanto, essa abordagem aproveita técnicas acessíveis de microscopia para avaliar semi-quantitativamente tendências temporais na cinética da biomineralização.

figure-results-1
Figura 5: Distribuição em escala de reator de biofilmes e óxidos de Mn. (A). Imagem colorida em campo claro dos biofilmes GB-1 de P. putida no espaço poroso microfluídico no início da fase estacionária (t = 18,5 h,t ref). (B). Imagem colorida em campo claro do óxido de Mn precipita sobre e ao redor dos biofilmes GB-1 de P. putida no último ponto experimental (t = 43,5 h). (C). Matriz de acúmulo mineral corrigida por intensidade no ponto experimental final (t = 43,5 h), com grãos mostrados em cinza e poros em branco. A barra de escala é de 1 mm (D). Distribuição espacial unidimensional da intensidade total corrigida da entrada (esquerda) até o lado de saída (direito) do espaço poroso (t = 43,5 h). A linha contínua representa uma média móvel de 1 mm ao longo do espaço poroso da entrada até a saída, média em experimentos triplicados, e a sombra representa o desvio padrão. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 6: Acúmulo de óxido de Mn em escala de biofilme. (A). Selecione imagens coloridas em campo claro dos biofilmes representativos P. putida GB-1. Óxidos de manganês foram detectados primeiro como uma mudança de cor de cinza para marrom nas superfícies do biofilme (mostrado em t = 20 h e t = 21 h) e depois como acúmulo de precipitados marrom-escuros nas bordas do biofilme (mostrado em t = 33 h e t = 43 h). (B). Matrizes de acúmulo mineral corrigidas pela intensidade com grãos em cinza escuro, poros brancos e biofilmes subjacentes em cinza claro. A barra da escala é 150 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Estimativa da taxa de precipitação de óxido de Mn ao longo do tempo. A taxa (μg·h-1) foi quantificada reescalando a intensidade total corrigida em cada ponto de tempo para a massa Mn final medida com ICP-MS, e então tomando a derivada em relação ao tempo. Marcadores representam a média dos experimentos triplicados, e a sombreação representa o desvio padrão. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Step1_ImageRegistration.m.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Step2_ImageSubtraction.m.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Step3_Figures.m.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Esta plataforma experimental oferece oportunidades únicas para investigar a dinâmica espaço-temporal de processos biogeoquímicos em ambientes porosos livres de artefatos que impedem a aquisição de dados de alta fidelidade. Essa abordagem é particularmente adequada para biomineralização de Mn e Fe, que produzem precipitados minerais com tons característicos de ocre, marrom e preto, que podem ser facilmente segmentados com microscopia óptica e análise de imagem. Usando a biomineralização de Mn como estudo de caso, é possível avaliar padrões e taxas de precipitação mineral in situ com alta resolução espacial e temporal.

Vários aspectos desse protocolo permitiram a coleta de medições reprodutíveis de transformações biogeoquímicas. Primeiro, o uso de uma válvula de injeção sequencial com baixo volume morto facilitou experimentos com múltiplos fluidos sem perturbar os biofilmes dentro do espaço poroso microfluídico. Essa configuração preservou a distribuição espacial inicial do biofilme ao evitar picos de pressão que podem levar ao descamamento ou deslocamento dos biofilmes ao trocar fluidos injetados, o que pode ocorrer com outros instrumentos como bombas de seringas. Esse componente ainda oferece ao usuário a flexibilidade de personalizar as condições geoquímicas impostas aos microrganismos residentes. Por fim, por preservar a distribuição inicial do biofilme, esse sistema permite ao usuário testar sistematicamente como diferentes morfologias de biofilme ou quantidades de biomassa influenciam a distribuição e a taxa de precipitação de óxidos de Mn.

Segundo, mitigar a formação e intrusão de bolhas no espaço poroso microfluídico permitiu experimentos de vários dias que capturaram os prazos ambientalmente relevantes da biomineralização Mn. Bolhas, um problema comum e frequentemente inevitável em experimentos longos acima da temperaturaambiente 62,63, podem fragmentar e bloquear poros individuais, redirecionar o fluxo de fluido e interromper o progresso da reação. Para evitar o aprisionamento de bolhas no espaço poroso, o reator estava totalmente saturado antes da inoculação. Para minimizar a introdução de bolhas pelo sistema de controle de fluxo, a incubadora do microscópio foi ajustada a 30 °C bem antes do experimento, e múltiplos volumes de solução influente foram lavados antes da fixação do reator inoculado. Essa etapa removeu o ar aprisionado dos tubos e conexões e minimizou o risco de liberação de fluido durante o experimento. Uma armadilha de bolhas também foi integrada ao sistema de controle de fluxo para capturar quaisquer bolhas residuais, com um comprimento de tubo de PTFE de 200 μm de dia-diâmetro interno acoplado à saída do sifão para aumentar a resistência e melhorar a eficiência da remoção de bolhas. Por fim, para evitar que o ar fique aprisionado ou vaze na interface entre o tubo influente e o orifício de entrada do reator, todas as conexões foram feitas com gotículas de fluido em ambas as extremidades do tubo e do furo perfurado, o tubo hidrofóbico de PTFE foi revestido com 1% de PEG-DA, e a extremidade do tubo inserido foi mantida perpendicular à superfície do PDMS durante todo o experimento.

Terceiro, incorporar um sistema de irradiação UVC construído sob medida na plataforma experimental manteve uma condição de contorno geoquímica definida e uma biomineralização de Mn reprodutivelmente restrita no espaço poroso microfluídico. Experimentos piloto mostraram que biofilmes extrínfluos na região de entrada do reator precipitavam óxidos de Mn a montante do espaço poroso, restringindo a disponibilidade a jusante de Mn(II). Irradiar brevemente as regiões de entrada e saída do reator com alinhamento adequado após o período sem decantação impediu o desenvolvimento de biofilme a partir de qualquer bactéria inicialmente depositada. O fluxo contínuo unidirecional de fluido impediu a recolonização da região de entrada do reator após esse tratamento inicial com UVC. Irradiar a região de saída do reator em t = 17,5 h antes do início da fase estacionária e da precipitação visível de óxido de Mn minimizou a quantidade de acúmulo mineral a jusante do espaço poroso. Isso facilitou a comparação direta dos dados de imagens em campo claro colorido com massa de Mn digerida e medida com ICP-MS.

A combinação de subtração de imagem e medições de massa no ponto final forneceu um método semi-quantitativo para avaliar a cinética da precipitação de óxidos de Mn in situ. No entanto, é importante notar que a intensidade dos pixels deixa de ser diretamente proporcional à massa de óxido de Mn em densidade mineral muito alta devido à sensibilidade limitada da câmera a coresescuras 61. A avaliação desse comportamento não linear poderia ser aprimorada digerindo amostras ácidas em pontos de tempo definidos e comparando a massa digerida com a massa original escalada pelo ponto final do tempo experimental. Se for necessária quantificação exata da massa mineral, os usuários podem desenvolver uma curva de calibração usando amostras minerais de intensidade e massa conhecidas, o que já foi demonstrado anteriormente em Fadely et al.61, ou fazer medições diretas com fluorescência de raios X baseada em sincrotron.

A plataforma microfluídica apresentada aqui pode ser aplicada para investigar processos de biomineralização sob uma ampla gama de condições ambientais. Embora experimentos representativos tenham sido otimizados para P. putida GB-1, essa configuração pode ser usada para testar sistematicamente uma variedade de químicas de soluções influentes (por exemplo, concentração de Mn ou Fe, fonte de carbono, presença de metais coexistentes), vazões, temperaturas ou a presença de um consórcio microbiano. Condições ácidas ou suboxicas específicas, como aquelas favoráveis às bactérias oxidadoras de Fe, podem ser simuladas diminuindo o pH influente ou revestindo o PDMS com um polímero impermeável ao oxigênio. Insights sobre os controles microbianos da biomineralização podem ser obtidos implementando cepas de fusão gênica repórter e acompanhando a fluorescência ópticaresultante 59,64. Reatores microfluídicos podem ser redesenhados para simular uma variedade de ambientes porosos, alterando a distribuição do tamanho das partículas, o formato ou a porosidade, ou funcionalizando o PDMS para imitar a carga superficial de partículas de argila ou matéria orgânica natural. Com modificações adicionais (por exemplo, substituindo o substrato do reator de vidro por plástico), os reatores podem suportar medições espectroscópicas diretas do estado de oxidação do metal, mineralogia, associações organo-minerais ou a sorção ou co-precipitação de metais secundários. Por fim, essa plataforma experimental pode ser expandida para investigar a precipitação de outros biominerais metálicos (por exemplo, fosfatos, carbonatos, sulfetos), desde que suas propriedades ópticas sejam suficientemente distintas para permitir a segmentação de imagem. Esse protocolo, portanto, oferece uma estrutura para investigar de forma abrangente a biomineralização e as interações entre microrganismos, minerais e fluidos em ambientes porosos relevantes.

Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este projeto foi apoiado pelo Centro da Fundação Nacional de Ciências dos EUA para Geotecnia Biomediada e Bioinspirada (ERC-1449501), pela Fundação Nacional Suíça de Ciência (200021_188546) e pela Fundação Nacional de Ciência dos EUA (MCA-2322428, EAR-1847689, DMR-2003849). Parte deste estudo foi realizada no Centro de Nano e Micro Manufatura da UC Davis (CNM2). Agradecemos a Steven Lucero e à UC Davis Tech Foundry pelo design e fabricação do incubador de microscópios e do sistema de irradiação UVC. Também agradecemos ao Dr. Yuze Wang e ao Dr. Jason DeJong por fornecerem a geometria do meio poroso usada para a fabricação de reatores microfluídicos, e ao Dr. Arunima Bhattacharjee, Dr. Noah Goshi, Dr. Gregory Girardi e Dr. Hyehyun Kim por discussões úteis e/ou por oferecer treinamento em fotolitografia e litografia suave. Por fim, agradecemos ao Dr. Gaitan Gehin, Dra. Tonya Kuhl, Dr. Filippo Miele e Dr. Charles Graddy pelas valiosas discussões sobre desenho experimental e análise de imagens.

Materiais

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Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Adapter fitting (Elveflow, 6-40 to 1/4-28)Darwin MicrofluidicsLVF-KFI-08Used to interface between flow sensor and flangeless fittings.
Agar (Fisher BioReagents)Fisher ScientificBP9744Used to pour plates for streaking frozen stocks.
Air compressor (Jun-Air)ElveflowKCP-110Used to pressurize flow controller.
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4, CAS: 7783-20-2)Sigma-AldrichA4915Used for experimental media and solutions.
Angled tweezersTDI International7-SAUsed to attach tubing to microfluidic reactor.
AutoCAD softwareAutodesk --Used to design microfluidic reactor geometry.
AutoclaveSteris--Used to sterilize materials and liquids. 
BalanceMettler ToledoME2002TUsed to weigh PDMS elastomer base and curing agent.
Barbed adapter (1/4-28 swivel to 3/32-in barbed)ElveflowKFI-06Used to connect polyether polyurethane tubing to manifold and fluid reservoir rack.
Biopsy punch (Rapid-Core, 1.2-mm diameter)Darwin MicrofluidicsPT-T983-12-25Used to punch inlet/outlet holes in PDMS microfluidic channels. 
Bleach (Chlorox)ULINES-19719Used to sterilize flow control system. Dilute to 1% in ultrapure water.
Blunt-tip needle (Jensen Global, 21-gauge)QSourceJG21-10HPX-J004Used to connect tubing to syringes. Sterilized by autoclaving for 30 min.
Bunsen burnerHumboldtH-5970Used to maintain a sterile experimental workspace.
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O, Fisher Chemical, CAS: 10035-04-8)Fisher ScientificC79Used for experimental media and solutions.
Casamino acid (Fisher BioReagents, acid casein peptone)Fisher ScientificBP1424Used for experimental media.
Cell density meter (WPA Biowave CO8000)Avantor490005-906Used to measure OD600 of bacterial cultures. 
Clear tape (Scotch Magic)ULINES-10223Used to keep dust from sticking to PDMS microfluidic channels.
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2·6H2O, CAS: 7791-13-1)Sigma-Aldrich255599Used for experimental media and solutions.
Compressed nitrogenAirgasNIUHP300Used to dry microfluidic reactor components.
Conical tube (Falcon, 15-mL volume, polypropylene)Fisher Scientific14-959-49BUsed for influent solutions and ICP-MS samples. Pre-sterilized.
Conical tube (Falcon, 50-mL volume, polypropylene)Fisher Scientific14-432-22Used for LB preculture. Pre-sterilized.
Copper(II) sulfate pentahydrate (CuSO4·5H2O, CAS: 7758-99-8)Sigma-AldrichC8027Used for experimental media and solutions.
Cutting matULINES-18543Used to cut apart PDMS microfluidic channels and punch inlet/outlet holes.
Cuvette (Fisherbrand, 1.5-mL volume, polystyrene)Fisher Scientific 14-955-127Used to measure OD600 of bacterial cultures. 
Digital camera (Hamamatsu ORCA-Fusion)Nikon77054115Used for time-lapse color brightfield imaging of microfluidic experiments.
Distribution valve (MUX)ElveflowMUX-D-12Used to sequentially inject multiple fluids.
Elveflow Smart Interface (ESI) softwareElveflow --Used to control flow rate/pressure feedback between flow controller and flow sensor and perform distribution valve switching.
Erlenmeyer flask (Fisherbrand, 50-mL volume)Fisher ScientificFB50050Used for mid-exponential culture. Sterilized by autoclaving for 30 min.
Ethanol (Fisher Chemical, reagent alcohol, 90% purity, CAS: 64-17-5)Fisher ScientificA962P-4Used to clean PDMS and cover slips for reactor fabrication. Diluted to 70% in ultrapure water.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, CAS: 60-00-4)Sigma-AldrichEDSUsed for experimental media and solutions.
Flangeless fitting (1/4-28 for 1/16-in OD tubing)ElveflowKFI-17Used to connect tubing to Elveflow hardware components. Kit includes ferrules and threaded nuts.
Flow controller (OB1 MK3+)ElveflowOB1-2000Used to provide flow rate/pressure feedback for controlled fluid injection.
Flow sensor (MFS2)ElveflowMFS-D-2Used to maintain stable flow for microfluidic experiments using pressure feedback from flow controller.
Fluid reservoir rack ElveflowKPT-4SUsed to pressurize influent fluids. Compatible with 15-mL Falcon conical tubes.
Glass cover slip (1.42-in x 2.36-in, #1 thickness)Ted Pella260460-100Plasma bonded to PDMS channel as a substrate for microfluidic reactors. 
Glass gas-tight syringe (5-mL volume, Luer-Lock)Hamilton81520Used for reactor inoculation and acid digestion (separate syringes). Inoculation syringe sterilized by autoclaving for 30 min.
HEPES buffer (CAS: 7365-45-9)Sigma-AldrichH3375Used for experimental media and solutions.
Hot plateCorning6795-420DUsed to cure PDMS.
Hydrophobic filter (Elveflow, 0.2-µm)Darwin MicrofluidicsLVF-KXX-14Used to prevent liquid backflow into the flow controller.
Inductively coupled plasma mass spectrometer (ICP-MS, 7900)Agilent--Used to measure Mn concentration in microfluidic reactor digest.
Inverted epifluorescence microscope (Nikon Ti2 Eclipse)NikonMEA54000, MEE59925, MEL51920, MEP59394, MEC56130Used for time-lapse color brightfield imaging of microfluidic experiments. Basic setup includes body, diascopic pillar, condenser turret, nosepiece, and stage.

Referências

  1. Scheinost, A. C., Singh, B., Goss, M. J., Oliver, M. Metal oxides. Encyclopedia of soils in the environment. , (2023).
  2. Tebo, B. M., et al. Biogenic manganese oxides: properties and mechanisms of formation. Annu Rev Earth Planet Sci. 32, 287-328 (2004).
  3. Droz, B., Dumas, N., Duckworth, O. W., Peña, J. A comparison of the sorption reactivity of bacteriogenic and mycogenic Mn oxide nanoparticles. Environ Sci Technol. 49, 4200-4208 (2015).
  4. Holguera, J. G., Etui, I. D., Jensen, L. H. S., Peña, J. Contaminant loading and competitive access of Pb, Zn and Mn(III) to vacancy sites in biogenic MnO₂. Chem Geol. 502, 76-87 (2018).
  5. Peña, J., et al. Mechanisms of nickel sorption by a bacteriogenic birnessite. Geochim Cosmochim Acta. 74, 3076-3089 (2010).
  6. Toner, B., Manceau, A., Webb, S. M., Sposito, G. Zinc sorption to biogenic hexagonal-birnessite particles within a hydrated bacterial biofilm. Geochim Cosmochim Acta. 70, 27-43 (2006).
  7. Castro, L., Blázquez, M. L., González, F., Muñoz, J. A., Ballester, A. Heavy metal adsorption using biogenic iron compounds. Hydrometallurgy. 179, 44-51 (2018).
  8. Whitaker, A. H., Duckworth, O. W. Cu, Pb, and Zn sorption to biogenic iron (oxyhydr)oxides formed in circumneutral environments. Soil Syst. 2, 18 (2018).
  9. Brüggenwirth, L., et al. Interactions of manganese oxides with natural dissolved organic matter: implications for soil organic carbon cycling. Geochim Cosmochim Acta. 366, 182-200 (2024).
  10. Li, H., Santos, F., Butler, K., Herndon, E. A critical review on the multiple roles of manganese in stabilizing and destabilizing soil organic matter. Environ Sci Technol. 55, 12136-12152 (2021).
  11. Li, Q., Hu, W., Li, L., Li, Y. Interactions between organic matter and Fe oxides at soil micro-interfaces: quantification, associations, and influencing factors. Sci Total Environ. 855, 158710 (2023).
  12. Song, X., et al. Towards a better understanding of the role of Fe cycling in soil for carbon stabilization and degradation. Carbon Res. 1, 5 (2022).
  13. Hennebel, T., De Gusseme, B., Boon, N., Verstraete, W. Biogenic metals in advanced water treatment. Trends Biotechnol. 27, 90-98 (2009).
  14. Marsidi, N., Abu Hasan, H., Sheikh Abdullah, S. R. A review of biological aerated filters for iron and manganese ions removal in water treatment. J Water Process Eng. 23, 1-12 (2018).
  15. Li, Y., Xu, Z., Ma, H., Hursthouse, A. S. Removal of manganese(II) from acid mine wastewater: a review. Water. 11, 2493 (2019).
  16. Li, S., et al. Biomineralization mediated by iron-oxidizing microorganisms. Minerals. 15, 868 (2025).
  17. Skousen, J., et al. Review of passive systems for acid mine drainage treatment. Mine Water Environ. 36, 133-153 (2017).
  18. Post, J. E. Manganese oxide minerals: crystal structures and economic and environmental significance. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 3447-3454 (1999).
  19. Cornell, R. M., Schwertmann, U. . The iron oxides: structure, properties, reactions, occurrences and uses. , (2003).
  20. Cosmidis, J., Benzerara, K. Why do microbes make minerals?. C R Geosci. 354, 1-39 (2022).
  21. Ehrlich, H., Bailey, E., Wysokowski, M., Jesionowski, T. Forced biomineralization: a review. Biomimetics. 6, 46 (2021).
  22. Hoffmann, T. D., Reeksting, B. J., Gebhard, S. Bacteria-induced mineral precipitation: a mechanistic review. Microbiology. 167, 001049 (2021).
  23. Hansel, C. M., Learman, D. R., Ehrlich, H. L., Newman, D. K., Kappler, A. Geomicrobiology of manganese. Ehrlich's geomicrobiology. , (2015).
  24. Tebo, B. M., Johnson, H. A., McCarthy, J. K., Templeton, A. S. Geomicrobiology of manganese(II) oxidation. Trends Microbiol. 13, 421-428 (2005).
  25. Kappler, A., Emerson, D., Gralnick, J. A., Roden, E. E., Muehe, E. M., Ehrlich, H. L., Newman, D. K., Kappler, A. Geomicrobiology of iron. Ehrlich's geomicrobiology. , (2015).
  26. Emerson, D., Fleming, E. J., McBeth, J. M. Iron-oxidizing bacteria: an environmental and genomic perspective. Annu Rev Microbiol. 64, 561-583 (2010).
  27. Fortin, D., Langley, S. Formation and occurrence of biogenic iron-rich minerals. Earth Sci Rev. 72, 1-19 (2005).
  28. Konhauser, K. O. Bacterial iron biomineralisation in nature. FEMS Microbiol Rev. 20, 315-326 (1997).
  29. Toner, B., et al. Spatially resolved characterization of biogenic manganese oxide production. Appl Environ Microbiol. 71, 1300-1310 (2005).
  30. Miot, J., et al. Extracellular iron biomineralization by photoautotrophic bacteria. Appl Environ Microbiol. 75, 5586-5591 (2009).
  31. Bottero, S., Storck, T., Heimovaara, T. J., van Loosdrecht, M. C. M., Enzien, M. V., et al. Biofilm development and the dynamics of preferential flow paths in porous media. Biofouling. 29, 1069-1086 (2013).
  32. Dentz, M., Le Borgne, T., Englert, A., Bijeljic, B. Mixing, spreading and reaction in heterogeneous media: a brief review. J Contam Hydrol. 120-121, 1-17 (2011).
  33. Gerke, H. H. Preferential flow descriptions for structured soils. J Plant Nutr Soil Sci. 169, 382-400 (2006).
  34. Jimenez-Martinez, J., Nguyen, J., Or, D. Controlling pore-scale processes to tame subsurface biomineralization. Rev Environ Sci Biotechnol. 21, 27-52 (2022).
  35. Or, D., Smets, B. F., Wraith, J. M., Dechesne, A., Friedman, S. P. Physical constraints affecting bacterial habitats and activity in unsaturated porous media: a review. Adv Water Resour. 30, 1505-1527 (2007).
  36. Toyoda, K., Tebo, B. M. The effect of Ca2+ ions and ionic strength on Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. SG-1. Geochim Cosmochim Acta. 101, 1-11 (2013).
  37. Toyoda, K., Tebo, B. M. Kinetics of Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. SG-1. Geochim Cosmochim Acta. 189, 58-69 (2016).
  38. Learman, D. R., Wankel, S. D., Webb, S. M., Martinez, N., Madden, A. S., et al. Coupled biotic–abiotic Mn(II) oxidation pathway mediates the formation and structural evolution of biogenic Mn oxides. Geochim Cosmochim Acta. 75, 6048-6063 (2011).
  39. Bargar, J. R., et al. Biotic and abiotic products of Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. strain SG-1. Am Mineral. 90, 143-154 (2005).
  40. Mao, Q., Qin, W., Yan, B., Luo, L. Ferrous iron oxidation efficiency and kinetics by indigenous iron-oxidizing bacteria in acid mine drainage. Environ Technol Innov. 36, 103785 (2024).
  41. Farnsworth, C. E., Voegelin, A., Hering, J. G. Manganese oxidation induced by water table fluctuations in a sand column. Environ Sci Technol. 46, 277-284 (2012).
  42. Haukelidsaeter, S., et al. Efficient chemical and microbial removal of iron and manganese in a rapid sand filter and impact of regular backwash. Appl Geochem. 162, 105904 (2024).
  43. Li, C., et al. Immobilization of iron- and manganese-oxidizing bacteria with a biofilm-forming bacterium for effective removal of iron and manganese from groundwater. Bioresour Technol. 220, 76-84 (2016).
  44. Breda, I. L., Søborg, D. A., Ramsay, L., Roslev, P. Manganese removal processes during start-up of inoculated and non-inoculated drinking water biofilters. Water Qual Res J. 54, 47-56 (2019).
  45. Zhu, X., Wang, K., Yan, H., Liu, C., Zhu, X., et al. Microfluidics as an emerging platform for exploring soil environmental processes: a critical review. Environ Sci Technol. 56, 711-731 (2022).
  46. Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., de Anna, P., Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. ISME J. 13, 1700-1710 (2019).
  47. Aufrecht, J. A., Fowlkes, J. D., Bible, A. N., Morrell-Falvey, J., Doktycz, M. J., et al. Pore-scale hydrodynamics influence the spatial evolution of bacterial biofilms in a microfluidic porous network. PLoS ONE. 14, e0218316 (2019).
  48. Kurz, D. L., et al. Competition between growth and shear stress drives intermittency in preferential flow paths in porous medium biofilms. Proc Natl Acad Sci U S A. 119, e2122202119 (2022).
  49. Kurz, D. L., Secchi, E., Stocker, R., Jimenez-Martinez, J. Morphogenesis of biofilms in porous media and control on hydrodynamics. Environ Sci Technol. 57, 5666-5677 (2023).
  50. Borer, B., Tecon, R., Or, D. Spatial organization of bacterial populations in response to oxygen and carbon counter-gradients in pore networks. Nat Commun. 9, 769 (2018).
  51. Ceriotti, G., Borisov, S. M., Berg, J. S., de Anna, P. Morphology and size of bacterial colonies control anoxic microenvironment formation in porous media. Environ Sci Technol. 56, 17471-17480 (2022).
  52. Park, S., Anggraini, T. M., Chung, J., Kang, P. K., Lee, S. Microfluidic pore model study of precipitates induced by pore-scale mixing of an iron sulfate solution with simulated groundwater. Chemosphere. 271, 129857 (2021).
  53. Wielinski, J., et al. Spatiotemporal mineral phase evolution and arsenic retention in microfluidic models of zerovalent iron-based water treatment. Environ Sci Technol. 56, 13696-13708 (2022).
  54. Elmaloglou, A., et al. Microfluidic study in a meter-long reactive path reveals how structural heterogeneity shapes MICP-induced biocementation. Sci Rep. 12, 19553 (2022).
  55. Wang, Y., Soga, K., DeJong, J. T., Kabla, A. J. A microfluidic chip and its use in characterising particle-scale behaviour of microbial-induced calcium carbonate precipitation. Géotechnique. 69, 1086-1094 (2019).
  56. Wang, Y., et al. Microscale investigations of temperature-dependent microbially induced carbonate precipitation in the range 4–50 °C. Acta Geotech. 18, 2239-2261 (2023).
  57. Pucetaite, M., Ohlsson, P., Persson, P., Hammer, E. Shining new light into soil systems: spectroscopy in microfluidic soil chips reveals microbial biogeochemistry. Soil Biol Biochem. 153, 108078 (2021).
  58. Geszvain, K., McCarthy, J. K., Tebo, B. M. Elimination of manganese(II,III) oxidation in Pseudomonas putida GB-1 by a double knockout of two putative multicopper oxidase genes. Appl Environ Microbiol. 79, 357-366 (2013).
  59. Gehin, G., et al. Population-level control of two manganese oxidases expands the niche for bacterial manganese biomineralization. NPJ Biofilms Microbiomes. 11, 1-12 (2025).
  60. Ramos, G., Toulouze, C., Rima, M., Liot, O., Duru, P., et al. Ultraviolet control of bacterial biofilms in microfluidic chips. Biomicrofluidics. 17, 024107 (2023).
  61. Fadely, E. C., et al. Enhanced manganese oxidation at the biofilm–fluid interface drives pore-scale patterns in mineral precipitation. Environ Sci Technol. 60, 654-663 (2026).
  62. Lochovsky, C., Yasotharan, S., Günther, A. Bubbles no more: in-plane trapping and removal of bubbles in microfluidic devices. Lab Chip. 12, 595-601 (2012).
  63. Pereiro, I., Khartchenko, A. F., Petrini, L., Kaigala, G. V. Nip the bubble in the bud: a guide to avoid gas nucleation in microfluidics. Lab Chip. 19, 2296-2314 (2019).
  64. Gehin, G., et al. Pseudomonas putida coordinates the expression of two manganese oxidases and optimizes manganese oxide precipitation in response to aqueous Mn(II). Environ Sci Technol. 59, 13777-13786 (2025).

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