Maturação in vitro, fertilização e cultura de embriões pré-implantacionais em ovocitos de camundongos

Resumo

Este protocolo descreve procedimentos para maturação in vitro de oócitos de camundongo, fertilização in vitro e subsequente cultura embrionária até o estágio de blastocisto.

Resumo

A maturação in vitro de ovocitos de camundongo, combinada com fertilização in vitro e subsequente cultura embrionária, possibilita a geração de embriões pré-implantacionais sob condições definidas. Esses procedimentos facilitam a investigação das funções biológicas e dos mecanismos moleculares subjacentes à maturação dos oócitos, fertilização e desenvolvimento embrionário precoce. No entanto, a aplicação bem-sucedida dessa abordagem depende do manuseio cuidadoso dos óvulos e espermatozoides, das condições adequadas de cultura e da avaliação precisa da progressão do desenvolvimento em cada etapa. Aqui, descrevemos métodos para isolar complexos cúmulos–oócitos (COCs) imaturos de ovários de camundongo, maturação in vitro de oócitos, fertilização in vitro e cultivo in vitro de embriões até o estágio de blastocisto. Esses procedimentos incluem preparar e equilibrar meios e pratos de cultura, isolar e selecionar COCs após dissecação ovariana, coleta e capacitação de espermatozoides, realização de inseminação sob condições padronizadas e, posteriormente, cultivo de embriões para avaliação do desenvolvimento. A progressão do desenvolvimento é avaliada usando critérios morfológicos, incluindo a formação de pronúcleos masculinos e femininos, clivagem para o estágio bicelular e formação de blastocistos. Esse protocolo pode ser integrado a estudos sobre maturação de oócitos e função dos fatores maternos, fornecendo uma ferramenta valiosa para pesquisas básicas em biologia reprodutiva de mamíferos.

Introdução

Compreender a qualidade dos oócitos e a competência no desenvolvimento é essencial para a fertilização bem-sucedida e o subsequente desenvolvimento^{embrionário 1,2}. A maturação dos oócitos requer não apenas uma segregação cromossômica precisa durante a maturação nuclear, mas também a maturação citoplasmática, incluindo redistribuição de organelos e o acúmulo de mRNAs e proteínas^{maternas 3}. O desenvolvimento embrionário inicial depende de mRNAs e proteínas fornecidos pela mãe, e as reservas maternas no oócito sustentam o desenvolvimento pré-implantacional. No entanto, as identidades e funções de muitos reguladores maternos da embriogênese dos mamíferos permanecem incompletamente^{compreendidas 4}. Portanto, são necessários estudos sistemáticos adicionais para elucidar os mecanismos subjacentes à maturação, fertilização e desenvolvimento embrionário dos oócitos.

O camundongo é um sistema modelo amplamente utilizado para investigar o desenvolvimento embrionário pré-implantacional. Maturação in vitro (IVM) refere-se à coleta de oócitos imaturos do ovário e sua maturação sob condições laboratoriais^{controladas 5}. Subsequentemente, a fertilização in vitro (FIV) permite que oócitos maduros sejam co-incubados com espermatozoides capacitados para gerar zigotos para estudos de desenvolvimento embrionário precoce. No entanto, em comparação com a FIV convencional que utiliza ovocitos maturados in vivo, os oócitos derivados de MIV frequentemente apresentam taxas de maturação e fertilização mais baixas e menor competência no^{desenvolvimento 6}. Essas limitações são amplamente atribuídas à assincronia entre a maturação nuclear e citoplasmática sob condições de cultivo in vitro . Além disso, a estabilidade do fuso meiótico nos ovocitos de camundongos é sensível a mudanças de pH e temperatura durante a IVM, e a perturbação do fuso pode contribuir para a parada da^{maturação 7}. Consequentemente, a menor competência dos óócitos derivados de IVM permanece uma grande barreira, limitando a produção eficiente de embriões para estudos de desenvolvimento e mecanicistas.

Embriões pré-implantacionais de camundongos também podem ser obtidos coletando zigotos derivados in vivo e cultivando-os in vitro (IVC). Zigotos derivados in vivo coletados dos ovidutos fornecem um ponto de partida relativamente sincronizado para experimentos focados em eventos^{pós-fertilização 8}. No entanto, a maturação dos oócitos e o acúmulo de fatores maternos ocorrem antes da fertilização in vivo; assim, os zigotos derivados in vivo são menos suscetíveis à manipulação experimental das condições de maturação ou reservas maternas para avaliar seus efeitos no desenvolvimento embrionário^{subsequente 4}. Portanto, otimizar os protocolos de MIV e FIV e adotar procedimentos operacionais padronizados com rigoroso controle de qualidade (por exemplo, manejo rigoroso de temperatura, pH e práticas de manuseio) são essenciais para minimizar a variabilidade relacionada ao procedimento e proteger a competência no desenvolvimento de óvulos e embriões.

Aqui, descrevemos um protocolo IVM–IVF–IVC detalhando a preparação do meio, isolamento e seleção de COCs, procedimentos de MIV e FIV, e cultura embrionária in vitro (Figura 1). O protocolo incorpora pontos de verificação práticos e específicos para cada estágio para controle de qualidade rotineiro, incluindo extrusão do primeiro corpo polar (PB1), formação de pronúcleos masculinos e femininos (2PN), clivagem em duas células e formação de blastocisto. Esse protocolo permite a geração reprodutível e eficiente de embriões pré-implantacionais sob condições definidas, apoiando estudos mecanicistas, otimização de culturas e aplicações posteriores em biologia do desenvolvimento e reprodutiva.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal da Northwest A&F University, China (número da licença: 20230503).

1. Manutenção animal

1. Adquira fêmeas selvagens C57BL/6 e machos DBA/2 e mantenha-as em condições específicas livres de patógenos (SPF), com um ciclo claro e escuro de 12 horas a temperatura de 20–22 °C e 55% ± 10% de umidade. Forneça uma dieta reprodutiva e água ad libitum. Camundongos machos domésticos individualmente (um macho por gaiola).

2. Preparação de mídias

1. Para preparar uma solução de trabalho PMSG de 50 IU/mL, dissolva 5.000 UI de gonadotrofina do soro de égua grávida (PMSG) em 100 mL de soro salino estéril tamponado com fosfato (PBS).
   NOTA: Aliquota a solução em porções descartáveis de 1 mL e armazene-as a –20 °C. Descongele cada alíquota em temperatura ambiente imediatamente antes do uso.
2. Para preparar o meio de cultivo IVM, adicione os ingredientes listados na Tabela 1 a 100 mL do meio base Medium 199 (M199). Ajuste o pH para 7,3–7,4, depois filtre o meio estéril através de um filtro de 0,22 μm em frascos de meio estéril. Rotule o frasco como "IVM" com iniciais, data de fabricação e data de validade, e armazene a 4 °C por até 1 mês.
3. Para preparar uma solução de hialuronidase a 0,1% (p/v), dissolva 10 mg de hialuronidase em 10 mL de meio M2.
   NOTA: Armazene em alíquotas descartáveis de 1 mL a –20 °C e aqueça até 37 °C antes do uso.

3. Preparação de pratos (Figura 2)

NOTA: Ajuste o número de gotas de IVM, FIV e IVC de acordo com o número esperado de COCs e embriões, usando 20–30 COCs por gota de 100 μL para IVM e FIV e 20–30 embriões por gota de 100 μL para cultura embrionária.

1. Prepare um número apropriado de recipientes coletores de ovocitos de 35 mm, cada um contendo 2 mL de meio M2 suplementado com 0,2 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX). Use um prato para punção de ovário e coleta de COC (um prato para cada duas mulheres) e outro para lavar COCs. Pré-aqueça os pratos a 37 °C antes do uso.
2. Prepare pratos de IVM.
   1. Em um recipiente de 60 mm, prepare cinco gotas de 100 μL de meio IVM para lavagem (rotule o recipiente como "lavagem IVM").
   2. Em um recipiente separado de 60 mm, prepare várias gotas de 100 μL de meio IVM para maturação (rotule o recipiente como "IVM").
   3. Adicione cuidadosamente óleo mineral suficiente para cobrir as gotas e equilibre os pratos a 37 °C em uma incubadora de_CO2 a 5% por pelo menos 2 horas antes de iniciar a coleta de oócitos.
3. Prepare pratos para FIV.
   1. Em um recipiente de 60 mm, prepare uma ou duas gotas de 300 μL de meio de cultura embrionária pré-equilibrada para liberação e capacitação do esperma (rotule o recipiente como "Capacitação do espermatozoide").
      NOTA: A segunda queda de capacitação é preparada como reserva para casos em que a motilidade do esperma na primeira gota é insuficiente, uma nova amostra de espermatozoide epididimal deve ser coletada e capacitada, ou a concentração de esperma precisa ser ajustada antes da inseminação.
   2. Prepare dois pratos separados de 60 mm, cada um contendo cinco gotas de 100 μL de meio de cultura pré-equilibrado para lavagem (rotule o prato como "lavagem por FIV").
      NOTA: Use um recipiente "lavado para FIV" para lavar COCs maduros em FIV antes da inseminação, e use o outro recipiente "lavagem para FIV" para lavar zigotos presumidos após a co-incubação para remover células cúmulo e espermatozoides residuais.
   3. Em um recipiente separado de 60 mm, prepare múltiplas gotas de 100 μL de meio de cultura embrionária pré-equilibrada para inseminação (rotule o prato como "FIV").
      NOTA: O meio de cultura embrionária pré-equilibrado é usado tanto para capacitação quanto para inseminação do espermatozoide, a fim de manter condições consistentes durante a preparação e fertilização do espermatozoide.
   4. Adicione cuidadosamente óleo mineral suficiente para cobrir as gotas e equilibre os pratos a 37 °C em uma incubadora de 5% de_CO2 por pelo menos 12 horas antes de iniciar o procedimento de capacitação espermática.
4. Prepare pratos de IVC.
   1. Em um recipiente de 60 mm, prepare cinco gotas de 100 μL de meio de cultura embrionária pré-equilibrada para lavagem dos embriões (rotule o recipiente como "lavagem IVC").
   2. Em um recipiente separado de 60 mm, prepare várias gotas de 100 μL de meio de cultura embrionária pré-equilibrada para cultura embrionária (rotule o recipiente como "IVC").
   3. Adicione cuidadosamente óleo mineral suficiente para cobrir as gotas e equilibre os recipientes a 37 °C em uma incubadora de 5% de_CO2 por pelo menos 12 horas antes de iniciar a cultura embrionária.

4. Coleção de ovários

1. Administrar 10 UI de PMSG intraperitonealmente em fêmeas de 8 a 10 semanas de C57BL/6 camundongos.
2. Às 48 horas após a injeção de PMSG, eutanasie o camundongo por luxação cervical e posicione-o de costas. Borrife o abdômen com etanol a 70% para molhar o pelo e evitar que ele entre na cavidade abdominal.
3. Usando tesouras finas de dissecação, faça uma pequena incisão na parte inferior da pele abdominal e abra suavemente a pele com as mãos enluvadas para expor a membrana peritoneal.
4. Abra a membrana peritoneal e afaste suavemente os intestinos. Localize o chifre uterino e siga em direção ao ovário. Identifique o ovário próximo ao rim, normalmente cercado por uma almofada de gordura.
5. Use tesouras finas de dissecação para separar o ovário do chifre uterino e corte o excesso de tecido conjuntivo e gordura.
6. Transfira imediatamente os ovários para um meio M2 pré-aquecido suplementado com IBMX. Repita o procedimento para coletar o ovário contralateral e transferi-lo para o mesmo prato.
7. Coloque o prato sob um estereomicroscópio e prossiga com a punção folicular e a coleta dos COCs.

5. Coleção e cultura de COCs

1. Sob um estereomicroscópio, perfure suavemente os folículos antrais visíveis com uma agulha de seringa estéril para liberar os COCs no meio M2.
   NOTA: Ao coletar ovocitos do estágio GV do camundongo, preferencialmente punção dos folículos antrais visivelmente grandes na superfície ovariana, que normalmente parecem protuberantes e semi-translúcidos com cavidade antral clara.
2. Usando uma pipeta pasteura de vidro finamente puxado, colete os COCs liberados e transfira-os para uma taça limpa de 35 mm contendo meio M2 pré-aquecido suplementado com IBMX.
3. Lave os COCs por transferência serial para uma área limpa do recipiente de 35 mm conforme necessário para remover células de granulosa e detritos de tecido descolados, deixando detritos a cada transferência (Figura 3).
   NOTA: Use apenas COCs com três ou mais camadas compactas de células cúmulas e citoplasma uniformemente granulado, sem espaços livres, para os passos^{seguintes 9,10}. Ovócitos GV desnudados e ovócitos GV parcialmente envoltos em cúmulo são excluídos deste protocolo. Em nossas condições experimentais, uma média de 26 COCs imaturos foi obtida por fêmea de camundongo.
4. Após a remoção dos detritos, transfira os COCs para a taça de lavagem IVM e lave-os por transferência sequencial através de cinco gotas de 100 μL de meio de lavagem IVM.
   NOTA: Durante as transferências, minimize o volume de transferência para evitar contaminação cruzada entre as gotas.
5. Transfira os COCs lavados em gotas de 100 μL de meio IVM (20–30 COCs por gota) e cultive a 37 °C em 5% de_CO2 por 14 horas.
   NOTA: Colete, lave e transfira os COCs para o meio IVM com atraso mínimo para ajudar a manter o potencial de desenvolvimento.
6. (Opcional) Após a MIV, incube brevemente os COCs em 1 mg/mL de hialuronidase e pipete-os suavemente repetidamente com uma micropipeta até que as células cúmulo sejam completamente removidas.
   NOTA: Limite a exposição à hialuronidase a no máximo 3 minutos, pois exposição prolongada pode danificar os óócitos.
7. (Opcional) Lave os óvulos desnudados em meio M2 fresco em um estágio aquecido, depois avalie a maturação dos óvulos sob um estereoscópio.
8. (Opcional) Oócitos com um primeiro corpo polar extrudido são considerados maduros e no estágio de metafase II (MII). Calcule a taxa de maturação como o número de óócitos com um primeiro corpo polar extrudido dividido pelo número total de oócitos cultivados.
   NOTA: Os passos 5.6–5.8 são usados para avaliar a maturação dos oócitos após a MIV, desnudando uma coorte designada antes da pontuação PB1. Essas etapas não são exigidas para COCs que avançam diretamente para FIV.

6. Coleta e preparação do esperma

NOTA: Esta seção descreve a coleta e capacitação de espermatozoides frescos. Antes da inseminação, os espermatozoides recém-liberados devem ser incubados em meio de cultura embrionária pré-equilibrada a 37 °C por 1 hora para permitir a capacitação.

1. Eutanasie um macho maduro DBA/2 camundongos (10–16 semanas de idade) e remova seus epidídimios da cauda, evitando o máximo possível de gordura, sangue e fluido tecidular (Figura 4).
2. Para cada homem, transfira ambos os epidídimidos da cauda para uma queda de 300 μL de meio G-IVF pré-equilibrado para liberação e capacitação do espermatozoide.
3. Imobilize o epidídimo da cauda usando um par de pinças, faça de cinco a sete cortes no epidídimo da cauda com uma agulha de seringa estéril e esprema suavemente o tecido para liberar espermatozoides concentrados.
   NOTA: Avalie a motilidade dos espermatozoides e prossiga somente quando a maioria dos espermatozoides apresentar motilidade progressiva (PR), definida como movimento ativo para frente, em vez de motilidade não progressiva (NP) ou^{imobilidade 11}.
4. Incube o prato a 37 °C em 5% de CO₂ por 1 hora para permitir a capacitação dos espermatozoides.

7. Fertilização in vitro

1. Após 14 horas de MIV, lave os COCs por transferência sequencial através de cinco gotas de 100 μL de meio de lavagem para FIV e, em seguida, transfira os COCs lavados para as gotas de inseminação da FIV (20–30 COCs por gota de 100 μL).
2. Pré-incube o recipiente de fertilização contendo COCs a 37 °C em 5% de CO₂ por 30 minutos antes da inseminação.
3. Após a capacitação, determine a concentração de espermatozoides usando um hemocitômetro.
4. Com base na concentração de espermatozoides, calcule o volume do inoculo necessário e adicione espermatozoides capacitados a cada gota de FIV para alcançar uma concentração final de 4 ×^{10 5} –1 × 10⁶ espermatozoides/mL.
   NOTA: Após a adição de espermatozoides, confirme que espermatozoides móveis estão presentes em cada gota de inseminação.
5. Incube os pratos de FIV contendo COCs e espermatozoides a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO₂ por 4–6 horas.

8. Cultura de embriões

1. Após 4–6 horas de incubação, utilize uma pipeta de vidro Pasteur finamente puxada com diâmetro interno ligeiramente maior que o oócito para aspirar os zigotos presumidos em volume mínimo e transferi-los para as gotas de lavagem da FIV.
2. Lave os zigotos presumidos por transferência sequencial através de cinco gotas de lavagem para FIV, pipetando suavemente dentro de cada gota para remover o excesso de esperma e detritos (Figura 5).
3. Transfira os zigotos presumidos lavados para a taça de lavagem da VCI e lave-os por transferência sequencial através de cinco gotas de meio de cultivo embrionário pré-aquecidas, minimizando a transferência do meio de fertilização in vitro.
4. Coloque os zigotos presumidos em gotas de cultura do meio de cultura embrionária e cultive a 37 °C em 5% de CO₂ (20–30 embriões por gota de 100 μL).
5. De 6 a 8 horas após a inseminação, avalie a fertilização sob um estereoscópio marcando a presença de pronúcleos masculinos e femininos, e descarte oócitos que retenham apenas um corpo polar e não mostrem pronúcleos visíveis.
6. Às 24 horas após a inseminação, conte o número de embriões de duas células e calcule a taxa de duas células como (embriões de duas células / óócitos inseminados).
7. Após a contagem, remova e descarte os embriões não entrecortados, e continue cultivando os embriões demais decepados.
   NOTA: Neste estágio, os embriões podem ser vitrificados, transferidos para as fêmeas receptoras ou mantidos em cultura até o estágio de blastocisto.
8. Continue cultivando os embriões sob as mesmas condições de incubação até 96 horas após a inseminação (hpi). Avalie a formação do blastocisto em 96 hpi com base em critérios morfológicos.
   NOTA: Não é necessário mais troca de meio durante esse período. Um blastocisto normal é identificado pela presença de uma cavidade visível de blastocoel, uma massa celular interna distinta e uma camada intacta de trofecctóderma.

Resultados

Usando esse protocolo, os COCs de camundongos foram processados sequencialmente por maturação in vitro , fertilização in vitro e subsequente cultura embrionária in vitro , resultando em geração reprodutível de embriões pré-implantais e desenvolvimento até o estágio de blastocista sob as condições descritas. Após 14 horas de MIV, os COCs normalmente apresentavam expansão do cúmulo e morfologia intacta dos oócitos. A maturação meiótica dos oócitos foi quantificad...

Discussão

Esse protocolo fornece um procedimento padronizado para maturação in vitro de ovocitos de camundongo, fertilização in vitro e cultura in vitro usando COCs imaturos, permitindo a geração e avaliação reprodutível de embriões pré-implantacionais durante o estágio de blastocisto, sob condições in vitro definidas. Em muitos estudos, os resultados da MIV são sensíveis a diferenças específicas de laboratório em meio, tempos de incubação e manuseio, o que pode...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
35 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	150255
60 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	150270
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A8806
Breeding diet (rodent breeder chow)	Keao Xieli (Beijing,China)	N/A
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	HERAcell 150i
D-glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Disposable Pasteur Pipet	Kimble	DWK63A53WT-1000EA
Epidermal growth factor	Gibco	PHG0313
Fine dissecting scissors	Sigma-Aldrich	S3146-1EA
Fine-tip forceps	Rhino	SW14
Follicle-stimulating hormone	Millipore	869001
G-1 PLUS	Vitrolife	10128
G-IVF PLUS	Vitrolife	10136	(preequilibriated) embryo culture medium
Hemocytometer	Millicell	MDH-4N1
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4274
IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthine)	Selleck	S5836
KnockOut Serum Replacement	Gibco	A3181501
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352
Luteinizing hormone	Millipore	869003
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
Medium 199	Gibco	11150-059
Micropipette	Gilson	F167350
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410
Phosphate-buffered saline	Gibco	20012027
Pregnant Mare Serum Gonadotropin	Ningbo Second hormone factory (Ningbo, China)	N/A
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P4562
Stereo microscope	Olympus	SZX10
Sterile medium bottles	Nalgene	46600-586
Sterile syringe needle	BD Biosciences	309623	1 mL, 27G1/2
Syringe Filter Unit	Millipore	SLGP033R
Thermo Plate	Tokai Hit	TPi-SZX2X