Um algoritmo de análise de forma quantifica a morfologia espacial e o contexto da cultura celular 2D a 3D para uma nova quantificação de fenótipos

Summary

Este artigo explica como novas características morfológicas em células e organoides podem ser quantificadas usando a transformada linear de coordenadas polares comprimidas (LCPC), um algoritmo espacial que captura propriedades que métricas tradicionais, como área, volume e área superficial, não conseguem. As melhores práticas para orientação e alinhamento da forma são discutidas.

Abstract

Numerosos estudos mostraram que o fenótipo morfológico de uma célula ou organoide está correlacionado com sua suscetibilidade a agentes anticâncer. No entanto, métodos tradicionais de medição do fenótipo dependem de métricas espaciais como área, volume, perímetro e intensidade do sinal, que funcionam, mas são limitadas. Essas abordagens não conseguem medir muitas características cruciais do contexto espacial, como a quiralidade, uma propriedade da esquerda e da destreza. O volume não pode ser usado para registrar quiralidade porque os sapatos esquerdo e direito têm o mesmo volume. Embora o contexto espacial na forma de quiralidade, direção da gravidade e eixo de polaridade seja intuitivo para os humanos, as métricas tradicionais usadas por biólogos celulares, patologistas, radiologistas e praticantes de aprendizado de máquina até hoje não conseguem capturar essas noções fundamentais. A transformada linearizada de coordenadas polares comprimidas (LCPC) é um algoritmo inovador que pode capturar contexto espacial como qualquer outra métrica. A transformada LCPC traduz um contorno bidimensional (2D) em uma onda senoidal discreta ao sobrepor um sistema de grade que acompanha os pontos de interseção entre o contorno e as linhas da grade. Ele transforma o contorno em uma sequência de pares de coordenadas discretas, sendo a coordenada independente (coordenada x) correspondendo a posições consecutivas no espaço 2D. Cada coordenada dependente (coordenada y) consiste na distância entre uma interseção do contorno e da grade até a origem ou linha de base do sistema de grade. Na forma de uma onda senoidal discreta, a Transformada Rápida de Fourier é então aplicada aos dados. Dessa forma, as formas das células em cultura celular 2D e 3D são representadas de forma sistemática e multidimensional, permitindo uma estratificação quantitativa robusta que revelará insights sobre a resistência ao tratamento.

Introduction

A cultura organoide tridimensional (3D) mostrou-se superior à cultura celular bidimensional (2D) na imitação da biologia in ^{vivo 1,2}. Os organoides tornaram-se indispensáveis na pesquisa do câncer para rastreamento de tratamentos eficazes e para obter insights sobre a progressão da ^doença 3,4,5,6. Embora seja bem conhecido na biologia do câncer que distinções morfológicas se correlacionam com comportamentos biológicos distintos de células e tecidos, o campo depende de métricas tradicionais de forma que são limitadas em escopo. Este estudo descreve um algoritmo espacial inovador que quantifica objetivamente características morfológicas sutis com precisão sem precedentes, superando abordagens tradicionais como área, volume e área superficial.

A transformada linearizada das coordenadas polares comprimidas (LCPC) foi inventada para descrever objetivamente e quantitativamente morfologias complexas observadas em histopatologia tecidual, com o objetivo de aprimorar a graduação dos pólipos^{do cólon 7}. O desejo de expandir essa abordagem para capturar características espaciais baseadas em ressonância magnética macroscópica em patologias cerebrais, como transtorno bipolar e doença de Alzheimer, levou a aumentos que a aprimoraram ainda mais. Este estudo descreve o protocolo passo a passo e as melhores práticas para aplicar duas versões da transformada LCPC: o sistema de grade paralela e o sistema de grade radial, ambos com scripts de código aberto e vídeos tutoriais.

Além dos métodos geométricos tradicionais, existem múltiplas abstrações que têm sido eficazes para medir as formas complexas de células e órgãos. Estes incluem medir excentricidade, assimetria, contraste e curtose, juntamente com momentos de Zernike para capturar circularidade, assimetria, irregularidade de arestas e estrutura global^{de contornos 8,9,10}. A análise fractal também tem sido útil para reduzir contornos complexos a valores escalares, como Dimensão Fratal, que mede quão irregular é o contorno, e lacunaridade, que mede quão heterogeneamente irregulares aparecem as lacunas no^{contorno 11,12}. Para medir textura, o método Gray Level Co-occurrence Matrix (GLCM) é popular para medir contraste, energia, homogeneidade, correlação e^{entropia 13,14}. Embora todos esses métodos sejam benéficos, nenhum deles foi projetado para capturar contexto espacial, como a direção da gravidade, a esquerda versus a direita, ou a localização da estrutura central de suporte que influencia a direção da mudança de forma. Além disso, muitos deles produzem um único valor escalar ou apenas alguns poucos valores escalares para representar informações espaciais, razão pela qual os estudos citados frequentemente os usam em combinação para avaliar formas complexas.

A transformada LCPC foi projetada para produzir muitas características a partir de uma única medição e permitir a adição de marcadores espaciais que codificam o contexto espacial na forma, como a direção da gravidade. O método mais próximo da transformada^{LCPC 7} foi publicado um ano depois de¹⁵, compartilhando a mesma ideia central como ponto de partida: aplicar a transformada de Fourier aos contornos das células para medir a forma de um espectro de frequência. No entanto, a transformada LCPC foi desenvolvida de forma independente para ser aplicada por sistemas de grade distintos que deveriam ser usados em conjunto com o conhecimento do contexto espacial fora da forma a ser medida. Além disso, o inventor da transformada LCPC explica neste manuscrito que o espectro de frequências resultante contém vastas quantidades de informações espaciais ocultas. O Arquivo Suplementar 1 contém uma discussão extensa sobre contextos espaciais em biologia que muitas vezes são negligenciados ao usar os métodos citados e como a transformada LCPC pode ser aplicada para capturar esse contexto. Para leitores cujos dados de forma não mostram diferença entre grupos controle e experimental, se seus olhos conseguem ver diferença nas formas, ou cujos dados de forma mostram pouca diferença, mesmo suspeitando que deveria haver uma diferença maior, eles devem tentar a transformada LCPC.

A transformada LCPC oferece um nível de precisão sem precedentes na medição de informações espaciais porque representa formas em múltiplas dimensões. Ao contrário dos métodos tradicionais, como área e volume, que produzem apenas um valor escalar por forma (ou seja, 25^{cm 2}), os resultados da transformada LCPC podem gerar múltiplos índices, cada um correlacionando-se com um aspecto morfológico diferente de uma forma (ou seja, arredondamento vs. nitidez dos cantos, suavidade vs. serrilhamento das arestas). A transformada LCPC descreve uma forma 2D sobreposta a uma grade de linhas retas que se cruzam com seu contorno. Cada sistema de grade possui uma origem (Figura 1) ou uma linha de base (Figura 2) a partir da qual medir distâncias lineares. Consulte as Figuras 1B e 2B para fluxogramas simplificados que descrevem o algoritmo. Cada ponto de interseção entre as linhas da grade e o contorno da forma é detectado. A distância de cada interseção é então calculada em relação a uma linha de base ou origem. Dessa forma, a transformação LCPC converte formas 2D em uma série de pares consecutivos de coordenadas x-y. A coordenada x representa a posição da grade de zero ao infinito, enquanto a coordenada y representa a distância da interseção até a linha base ou origem. Nessa forma, que é uma onda senoide discreta, a transformada rápida de Fourier (FFT) é então aplicada para converter os dados do "domínio da posição" para o domínio da frequência. Se a coordenada x representasse o tempo, então o "domínio da posição" seria equivalente ao "domínio do tempo" nas aplicações padrão da FFT.

Enquanto o sistema de grade radial mede a distância de cada interseção da origem da grade radial (Figura 1A), o sistema de grade paralela sempre mede a distância das interseções com referência a uma linha imaginária à esquerda da forma (Figura 2A). O script de código aberto determina a posição dessa linha imaginária encontrando o pixel mais à esquerda do contorno e então movendo 10 pixels para a esquerda dessa posição. Aqui, a coordenada x dessa posição torna-se a linha de referência a partir da qual todas as interseções são calculadas. Essa regra dos 10 pixels é arbitrária, mas é por isso que todos os contornos analisados pelo script open-source para o sistema de grade paralela devem ter pelo menos 15 pixels de espaço em branco em todos os quatro lados.

Para formas 2D com dobras ou múltiplas camadas, as linhas de grade podem intersectar o contorno mais de uma vez. Nesse caso, as distâncias de todas as interseções ao longo de uma grade são somadas a um único valor. Assim, cada grade tem apenas uma coordenada x e uma coordenada y. Essa soma é representada pelo termo "comprimido" no nome transformada LCPC. A renderização de uma forma 2D não linear em uma onda senoidal discreta é representada pelo termo "linearizada" no nome do algoritmo. Por fim, o termo "coordenadas polares" está no nome do algoritmo porque o primeiro sistema de grade concebido foi uma grade radial de 180 graus de coordenadas^{polares 7}. Mesmo após perceber que as coordenadas polar e cartesiana são intercambiáveis, o nome do algoritmo foi mantido como está. A seção de agradecimentos descreve as razões pessoais que motivaram a invenção e ampliação da transformação LCPC.

O Protocolo 1 era a sequência para obter os dados mostrados na Figura 3B, enquanto o Protocolo 2 era a sequência para obter os dados mostrados na Figura 3C–D. As etapas desses protocolos são implementadas em scripts Python individuais disponíveis no repositório do GitHub "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶. O Protocolo 1 é um exemplo das etapas de pré-processamento para derivar a "forma pura" em preparação para a transformada LCPC. O Protocolo 2 é um exemplo de etapas de pré-processamento para medir formas "em escala", ou seja, em suas escalas originais em relação umas às outras.

A segmentação pode ser feita manualmente em softwares de processamento de imagem, como o Preview do Mac ou o Paint da Microsoft, ou usando métodos baseados em limiar. Se feito manualmente, uma das quatro cores seguintes deve ser escolhida: azul, verde, rosa/magenta ou vermelho. O repositório do GitHub chamado "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶ contém uma pasta chamada "script de extração de cor". Esta pasta contém quatro arquivos Jupyter Notebook com código Python que extraem as quatro cores mencionadas e as convertem em máscaras azuis sobre um fundo branco. Esse processo também pode ser realizado aplicando um limiar da cor do contorno em um software de processamento de imagem como o Fiji/ImageJ. Para imagens que contêm contornos com bordas tocando ou bordas sobrepostas (por exemplo, um Diagrama de Venn), elas precisarão ser separadas usando software de processamento de imagem, tornando-se objetos independentes na imagem composta de máscara contendo múltiplos contornos organoides. Isso não se aplica a imagens que contêm apenas um organoide ou múltiplos organoides que não se tocam.

Protocol

As células humanas primárias usadas neste estudo foram obtidas e cultivadas sob aprovações éticas e procedimentos de consentimento informado previamente^{relatados 17}. As imagens apresentadas aqui foram geradas a partir dessas culturas celulares aprovadas e são publicadas pela primeira vez. Amostras de tecido foram coletadas no Brigham and Women's Hospital e na Universidade da Califórnia, San Francisco, sob protocolos aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB), de pacientes que forneceram consentimento informado para o uso de seus tecidos em pesquisa, conforme descrito^{anteriormente 17}. Nenhuma coleta adicional de espécimes humanos foi realizada para este estudo.

1. Extração da forma pura dos contornos organoides 2D para a transformada LCPC

1. Segmente a borda externa de cada organoide usando qualquer software de processamento de imagem, como o Paint da Microsoft, o Preview do MacOS ou o Fiji/ImageJ.
2. Extraia os contornos dos organoides como máscaras abertas que são linhas azuis sobre fundo branco.
3. Isole cada contorno azul em sua própria tela branca.
   NOTA: Esta etapa só é necessária se uma imagem contiver mais de um contorno.
4. Recorte cada contorno para ter uma margem de um pixel em todos os quatro lados do objeto azul.
5. Adicione 100 pixels de espaço em branco em todos os quatro lados para criar novas margens.
6. Gire os objetos de modo que o maior comprimento interno fique horizontal.
   NOTA: Este passo transforma a linha interna mais longa dentro de cada objeto na largura do objeto. Existem dois roteiros disponíveis para esse propósito. Para formas fechadas, use o Jupyter Notebook chamado "Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length_v2.ipynb". Para formas abertas ou formas com múltiplos componentes, use o Jupyter Notebook chamado "Rotate Green Line_v3.ipynb". A ferramenta Rotate Green Line tem um tutorial em vídeo que está vinculado ao arquivo ReadMe, contido na mesma pasta do arquivo .ipynb.
7. Recorte cada imagem para ter uma margem de um pixel em todos os quatro lados do objeto azul.
   NOTA: Isso é o mesmo que o Passo 1.4. O objetivo do corte desta vez, no entanto, é que a etapa de redimensionamento que vem a seguir redimensiona toda a tela, não apenas o objeto azul nela. Assim, ao tornar o objeto azul quase com a mesma largura e altura da própria tela, redimensionar a tela para 400 pixels de largura também redimensiona o objeto para quase 400 pixels de largura. Existe um Jupyter Notebook chamado "Trim margin to 1-pixel border.ipynb".
8. Redimensione a largura da tela de cada imagem para 400 pixels, ao mesmo tempo em que restringe a proporção de aspecto.
   NOTA: Esta etapa faz com que cada objeto tenha a mesma largura. Restringir a proporção de aspecto impede que o objeto seja distorcido durante o redimensionamento. Existe um Jupyter Notebook chamado "Redimensione a largura para 400 pixels, mas restringa a proporção de aspecto.ipynb".
9. Adicione 100 pixels de espaço em branco em todos os quatro lados para criar novas margens.
10. Gire cada imagem 90 graus no sentido horário ou anti-horário para tornar o maior comprimento interno vertical, sendo consistente com a escolha para todas as imagens.
    NOTA: Na sequência acima, a forma pura é obtida implementando sequencialmente os Passos 1.6, 1.7, 1.8 e 1.9. Adicionar espaço de margem no Passo 1.9 é necessário para evitar erros nos scripts de transformação LCPC que serão feitos em seguida, mas não envolve extração da forma pura. Usuários que desejam medir formas "em escala" não precisam realizar as etapas 1.6, 1.7 e 1.8 na sequência acima, embora ainda devam pré-processar suas imagens de máscara para alcançar a orientação ideal antes de aplicar a transformada LCPC.
11. Realize a transformada LCPC em cada curva de contorno. Use scripts em Python fornecidos para o método¹⁸ da grade radial ou para o método¹⁹ da grade paralela.

2. Extração de forma em escala de contornos organoides 2D para a transformada LCPC

NOTA: O método passo a passo para extrair a forma em escala de objetos é semelhante ao de extração da forma pura no Protocolo 1 acima. Os passos são nomeados idênticos em ambos os protocolos para facilitar o emparelhamento. Por favor, consulte as notas no Protocolo 1 para cada etapa. A principal diferença entre forma pura e forma em escala é que a forma em escala não requer os passos 1.6, 1.7 e 1.8, que são os passos de redimensionamento.

1. Segmente a borda externa de cada organoide. Use uma abordagem computacional ou faça isso manualmente por meio de um software básico de edição de imagens, como o Paint da Microsoft, o Preview do MacOS ou o Fiji/ImageJ.
2. Extraia os contornos dos organoides como máscaras abertas que são linhas azuis sobre uma tela branca. Use Fiji/ImageJ para extrair máscaras ou o script Python^{fornecido 16}.
3. Isole cada contorno azul em sua própria tela branca. Use Fiji/ImageJ para extrair máscaras ou o script Python^{fornecido 16}.
4. Recorte cada contorno para ter uma margem de um pixel em todos os quatro lados do objeto azul. Use Fiji/ImageJ ou o script Python^{fornecido 16}.
5. Adicione 100 pixels de espaço em branco em todos os quatro lados para criar novas margens. Use Fiji/ImageJ ou o script Python^{fornecido 16}.
6. Gire cada contorno de modo que sua linha interna mais longa fique vertical. Use Fiji/ImageJ ou o script Python^{fornecido 16}.
7. Realize a transformada LCPC em cada curva de contorno. Use scripts em Python fornecidos para o método¹⁸ da grade radial ou para o método¹⁹ da grade paralela.

Results

A transformada LCPC de grade radial aplicada a organoides de câncer de mama

Organoides e tumores 3D podem adotar uma variedade de formatos, alguns dos quais são obviamente diferentes para o olho humano, mesmo que métricas tradicionais apresentem diferenças estatisticamente insignificantes. Por outro lado, organoides também podem exibir formas que parecem heterogêneas e, portanto, insignificantes ao olho humano, mascarando morfologias sutis recorrentes que representam subtipos distintos. Organoides primários humanos da mama foram extraídos de pacientes e cultivados em 3D seguindo um protocolo^{previamente publicado 17,20,21}. A Figura 3A mostra três categorias morfológicas acessíveis com base na inspeção visual: um fenótipo cístico, um fenótipo policístico e um fenótipo policístico denso. A Figura 3B mostra que os contornos externos desses organoides eram segmentados manualmente e sua forma pura era extraída, o que elimina o efeito do tamanho em suas formas. Como os contornos eram circulares, a transformada radial da grade LCPC foi aplicada às formas puras, seguida pela PCA. Note que os contornos sobrepostos na Figura 3B foram rotacionados de modo que a linha interna mais longa seja vertical, ou seja, suas orientações não são as mesmas das imagens de origem. A Figura 3B mostra um gráfico de pontos dos dois primeiros componentes principais (PCs), e o agrupamento K-means identificou três clusters: 0, 1 e 2. As Pontuações Silhuetas (SS) confirmaram a provável existência de dois clusters separados entre os Clusters 0 vs. 1 (SS = 0,68) e os Clusters 1 vs. 2 (SS = 0,69), ao mesmo tempo em que indicam uma fraca separação entre os Clusters 0 vs 2 (SS = 0,27). Apesar da fraca Pontuação de Silhueta entre os Clusters 0 e 2, rotular os pontos de dados com a forma pura de cada ponto justifica que o Cluster 2 representa o fenótipo mais distinto: contornos altamente assimétricos e não circulares (a espessura dos contornos não importa neste caso).

Embora a forma pura remova o efeito do tamanho na forma, o que é impossível ao medir área e volume, medir os contornos organoides em escala também revela insights interessantes. A Figura 3C mostra um gráfico de pontos 3D dos três primeiros PCs resultante da transformada LCPC da grade radial realizada nos contornos enquanto eram segmentados das imagens sem qualquer redimensionamento. Essa abordagem significa que a transformada LCPC mede simultaneamente tanto a forma quanto o tamanho dos organoides. A Figura 3C mostra que os organoides policísticos e policísticos densos são menos densamente compactados em comparação aos organoides císticos. Para quantificar essa expansão, a Figura 3D mostra a dispersão de cada fenótipo em seu espaço compartilhado de PCA. A Distância Média K-Vizinho Mais Próximo (KNND) é calculada para cada fenótipo, o que apoia a avaliação visual da densidade decrescente dos pontos indo de organoides císticos (KNND = 1,061) a organoides policísticos (KNND = 1,575) e organoides policísticos densos (KNND = 2,247); Essa diminuição da densidade de pontos também pode ser interpretada como um aumento da heterogeneidade morfológica dos contornos externos. Por fim, para uma comparação da transformada LCPC com a métrica tradicional de área, a Figura 3E mostra que, embora haja uma significância estatística entre a área de organoides císticos e organoides policísticos densos (p = 0,016, Teste de Soma de Ranks de Wilcoxon), não há indicação, com base na área, de que existam três grupos morfológicos distintos entre os fenótipos, conforme identificados pelo Agrupamento K-means após análise LCPC puramente em forma (Figura 3B) ou que há uma heterogeneidade morfológica crescente, como mostrado pela análise LCPC em escala (Figura 3C–D). A Figura 3E mostra uma dispersão decrescente dos pontos de dados indo de organoides císticos para policísticos e depois policísticos densos, o que é o oposto do que é observado pela análise LCPC em escala (Figura 3C), destacando que a informação espacial capturada pela transformada LCPC é diferente da área capturada.

A mesma abordagem aplicada a formas 2D individuais na Figura 3, e a Figura Suplementar 1 também se aplica ao contorno das células em culturas celulares 2D: células únicas (como glóbulos vermelhos) ou agrupamentos de células (como nos exames de Papanicolau cervical). Estudos piloto para cada um desses casos são descritos em vídeos: análise de forma de organoides cerebrais que apresentam graus variados de dobramento em seu contorno^{externo 22}; análise de forma de alvéolos pulmonares in situ, os mesmos princípios podem ser aplicados à análise de cultura celular^{2D 23}; análise de forma do tecido cervical a partir de exames de Papanicolaou, nos quais tanto o contorno do núcleo quanto da membrana celular são quantificados simultaneamente via a grade radial LCPC^{transformada 24}; análise de forma de glóbulos vermelhos infectados por malária e células adjacentes a células infectadas, mas que não estão infectadas^{por si mesmas 25}; análise de forma dos glóbulos vermelhos afetados pela Doença^{Falciforme 26}.

O sistema de grade paralela para medir densidade ou textura como um índice de informação espacial

A informação espacial envolve mais do que as noções usuais de forma, como quadratura, arredondamento e curvatura, pois abrange conceitos como textura e densidade. Redes tubulares complexas, como vasos sanguíneos, ou redes ramificadas, como filamentos do citoesqueleto, não se encaixam na noção de forma no mesmo sentido que nossa intuição geométrica de formas, como círculos e polígonos. No entanto, densidade e textura são noções muito úteis da informação espacial para entender a estrutura e a função de células, organoides e tumores. Ao lidar com como quantificar redes complexas em imagens de fluorescência, biólogos celulares medem características como a intensidade média do sinal dentro de uma imagem ou a porcentagem da área total de uma imagem que contém um sinal. Essas abordagens reconhecem que há mais na informação espacial do que aquilo descrito em termos de motivos geométricos.

O padrão das redes vasculares dentro de tecidos, tumores e órgãos em um chip não é facilmente definido pelos motivos geométricos tradicionais, mas se beneficia dessa interpretação como textura e densidade. A remodelação vascular no desenvolvimento tumoral e resistência ao tratamento é uma característica bem estabelecida do câncer (revisada em²⁷). Seções histopatológicas de 458 tumores neuroblásticos primários foram^{analisadas em 28}, caracterizando a densidade, tamanho e formato do total dos vasos sanguíneos e dos segmentos vasculares. Eles descobriram que os vasos sanguíneos eram maiores, mais abundantes e com formatos mais irregulares em tumores de pacientes com fatores prognósticos pobres em comparação com os tumores da coorte favorável. Curiosamente, um termo chamado "vasos que encapsulam aglomerados tumorais" (VETC)²⁹ foi cunhado para descrever um padrão de vasos sanguíneos que cercam agrupamentos de pequenos tumores dentro de um carcinoma hepatocelular maior e estão associados a taxas mais altas de metástase e recidiva. O mesmo grupo que cunhou o termo posteriormente descobriu que o carcinoma hepatocelular positivo para VETC correlaciona-se com uma resposta positiva ao tratamento com o inibidor da quinase^{Sorafenibe 30}. Assim, a capacidade de quantificar padrões vasculares é crucial para o prognóstico e para entender os mecanismos de resistência.

Para quantificar redes densas de tubos, ilhas e ramificações, o sistema de grade paralela da transformada LCPC é útil para medir o que pode ser chamado de densidade de textura, em vez de forma. Como exemplo de como a transformada LCPC em grade paralela pode fazer isso, a Figura 4A mostra padrões de microvasculatura cardíaca de um estudo da vasculatura cardíaca³¹: a olho nu, distinguir objetivamente e quantitativamente os padrões entre as áreas infartadas e as áreas em uma região distante do local da lesão é muito difícil. Ao extrair a máscara dos vasos sanguíneos (Figura 4A Passo 1) e aplicar a transformada LCPC em grade paralela, podem ser observadas diferenças quantitativas. Primeiro, para melhorar a limpeza dos dados, cada imagem foi cortada com um círculo de diâmetro uniforme, centralizado no meio da imagem quadrada (Figura 4A Passo 2), o que garante que cada imagem tenha a mesma altura e largura independentemente das rotações. Em seguida, as imagens recortadas são rotadas de modo que o eixo principal dos vasos (setas duplas vermelhas na Figura 4A Passo 1) fique vertical (Figura 4A Passo 3). Em seguida, uma linha azul é aplicada à circunferência da imagem para garantir que mesmo imagens com padrões vasculares esparsos tenham o mesmo diâmetro em termos de pixels azuis (Figura 4A Passo 4). As etapas 3 e 4 foram realizadas usando o software Fiji/ImageJ (v2.14.0). Por fim, aplica-se a transformada LCPC da grade paralela (Figura 4A Passo 5). Analisando os resultados via PCA e plotando os três primeiros PCs, revelam que as regiões infartadas se agrupam separadamente das regiões remotas (Figura 4B). Cálculos da Distância Chanfrada (CD) quantificam os padrões visuais exibidos pelos gráficos. Um dia após a lesão, o local infarto apresenta um padrão vascular mais distante da condição basal (Basal vs. 1Day_infarct: CD = 83,89) do que o local não lesionado (Basal vs 1Day_remote: CD = 53,95). Um dia após a lesão, o local remoto não lesionado está mais próximo do local lesionado (1Day_remote vs 1Day_infarcxt: CD = 34,48) do que da condição basal. Três dias após a lesão, os padrões vasculares do local lesionado e do local remoto não lesionado apresentam desvio drástico da condição basal e entre si (Basal vs. 3Days_Infarct: CD = 240,63; Basal vs. 3Days_Remote: CD = 67,28; 3Days_Remote vs. 3Days_Infarct: CD = 168,35). Muito interessante, 7 dias após a lesão, os padrões vasculares do local lesionado e do local remoto não lesionado ocupam um espaço 3D aproximadamente ortogonal à condição basal, alinhados entre si a uma distância mais próxima do que em 1 dia após a lesão (CD = 24,76 no dia 7 comparado a 34,48 no dia 1). Os dados sugerem duas coisas: (1) à medida que a cicatrização avança, o padrão vascular do local lesionado e do local remoto não lesionado adota padrões distintos da condição basal; (2) o programa de reconstrução ativado no local lesionado também desencadeia mudanças morfológicas semelhantes em seus locais remotos não lesionados associados.

Como referência para a versatilidade da transformada LCPC, foram calculadas as métricas tradicionais de área percentual (Figura 5A) e perímetro total (Figura 5B) dos vasos sanguíneos. Embora área e perímetro revelem mudanças entre pontos no curso temporal, eles não fornecem uma quantificação coerente de arranjos espaciais distintos de embarcações. Área e perímetro são abstrações que podem representar muitos arranjos vasculares diferentes e, portanto, não são informativos sobre como a disposição espacial dos vasos está mudando ao longo das condições de tratamento e do curso do tempo. Com n = 3 para cada grupo, o teste t e o teste de Wilcoxon são pouco confiáveis. O Delta de Cliff é não paramétrico e funciona bem para mostrar uma mudança no tamanho do efeito. A principal diferença revelada ao medir a porcentagem de área dos vasos sanguíneos é entre a condição basal e os pontos de tempo de 7 dias; Para o perímetro total dos vasos sanguíneos, as diferenças são entre a condição basal vs. 1-day e a condição basal vs. 7-day. No entanto, a área e o perímetro não indicam diferenças entre os locais com infarto e seus locais remotos não feridos, o que é muito surpreendente dado que o local do infarto foi intencionalmente ferido. É aqui que a versatilidade da transformada LCPC emerge em comparação com métricas tradicionais. Para cada amostra, os resultados da FFT como parte da transformada LCPC produzem um conjunto de magnitudes associadas a um conjunto de frequências. As magnitudes de cada bina de frequência podem ser médias e depois comparadas entre os grupos de tratamento (Figura Suplementar 1). Isso permite uma avaliação simples de quais bins de frequência apresentam as maiores diferenças entre os grupos de tratamento. A Figura 5C mostra seis caixas que apresentam diferenças claras no tamanho do efeito entre vários grupos de tratamento, especialmente entre os locais enfartados e seus locais remotos não lesionados associados, cuja área e perímetro indicaram não apresentar diferença. Os valores independentes nesses seis compartimentos fornecem múltiplos índices que mostram diferenças quantitativas entre as condições de tratamento. Curiosamente, o padrão entre os grupos para o Bin 1 dos resultados da transformada LCPC é semelhante ao resultado obtido ao medir o perímetro total. Os outros índices, no entanto, revelam diferenças quantitativas que estão ocultas tanto na área quanto no perímetro. Índices únicos para a condição basal: Bin 49, Bin 56, Bin 21. Índices únicos entre os grupos do Dia 1: Bin 1, Bin 6, Bin 49. Índices exclusivos dos grupos do Dia 3: Bin 6, Bin 112, Bin 49. Índices exclusivos dos grupos do Dia 7: Bin 6, Bin 49, Bin 112. Esses dados destacam a versatilidade e precisão da transformação LCPC em relação às abordagens tradicionais de área e perímetro.

Figura 1: Descrição do sistema de grade radial da transformada LCPC. (A) Passo 1: A forma de interesse é segmentada e extraída como uma máscara azul. Passo 2: Uma caixa delimitadora (também conhecida como o menor retângulo que envolve e toca o objeto em todos os quatro lados) é determinada para a máscara. Um sistema de linhas de grade radial originadas no centro da caixa delimitadora é sobreposto à máscara. A decisão de escolher o centro da caixa delimitadora em vez do centroide do objeto como origem foi arbitrária. Passo 3: A distância de cada interseção entre uma grade e a forma é calculada em relação à origem. Linhas de grade que têm mais de uma interseção somam todas essas distâncias de interseção em um valor para essa linha de grade. Passo 4: A FFT é aplicada para converter os dados do Passo 3 em um gráfico de frequência, uma representação multidimensional estática (Passo 5) da forma no Passo 1. Passo 6: Um valor escalar pode ser criado a partir do Passo 5 via um índice. Veja a Figura 10 para uma discussão sobre tipos de índices a serem calculados. (B) Um fluxograma mostrando uma descrição simplificada dos passos da transformada LCPC para o sistema de grade radial. (C) Exemplos de temas de forma para os quais o sistema de grade radial é ótimo. As formas foram desenhadas no Microsoft PowerPoint. Essas imagens são criadas por autores e não requerem nenhuma licença de publicação ou permissões de direitos autorais. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Descrição do sistema de grade paralela da transformada LCPC. (A) Passo 1: A forma de interesse é segmentada manualmente e extraída como uma máscara binária. Passo 2: Um sistema de grade paralela é sobreposto à forma, que é rotacionada de modo que a base fique horizontal. Passo 3: A distância de cada interseção entre uma grade e a forma é calculada em relação à linha base. Linhas de grade que têm mais de uma interseção somam todas essas distâncias de interseção em um valor para essa linha de grade. Passo 4: A FFT é aplicada para converter os dados do Passo 3 em um gráfico de frequência, uma representação multidimensional estática da forma do Passo 1. Passo 6: Um valor escalar pode ser criado a partir do Passo 5 via um índice. Veja a Figura 10 para uma discussão sobre tipos de índices a serem calculados. (B) Um fluxograma que forneça uma descrição simplificada dos passos da transformada LCPC para o sistema de grade paralela. (C) Exemplos de temas de moldagem para os quais o sistema de grade paralela é ótimo. As formas foram desenhadas no Microsoft PowerPoint. Essas imagens são criadas por autores e não requerem nenhuma licença de publicação ou permissões de direitos autorais. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: A transformada LCPC identifica objetivamente subtipos morfológicos de organoides do câncer de mama. (A) Organoides primários da mama humana foram derivados conforme relatado^{anteriormente 17, 20, 21}e conforme descrito no Arquivo Suplementar 1. Três fenótipos puderam ser observados e classificados com base na inspeção visual: cístico, policístico e policístico denso. Barra de escala = 50 μm. (B) Os contornos externos dos organoides foram segmentados manualmente (Figura Suplementar 2; critérios descritos no Arquivo Suplementar 1), e a forma pura desses contornos foi obtida. Note que os contornos no diagrama são todos girados de modo que a linha interna mais longa seja vertical; assim, eles não correspondem às suas orientações originais. A transformada LCPC da grade radial foi então aplicada, e os resultados foram analisados via PCA. O agrupamento K-means identificou três agrupamentos (0, 1 e 2), e as Escores de Silhueta (SS) foram calculadas para confirmar sua existência. Cluster 0 vs 1, SS: 0,68; Cluster 0 vs 2, SS: 0,27; Cluster 1 vs 2, SS: 0,69. (C) Os contornos externos dos organoides também foram medidos usando a transformada LCPC da grade radial em suas formas em escala, ou seja, as formas como aparecem nas imagens em relação umas às outras, sem qualquer redimensionamento. O encaixe é ampliado para mostrar o empacotamento mais solto dos organoides policísticos e densos em comparação com os organoides císticos. Para B e C: Verde = cístico, Roxo = policístico, Amarelo = policístico denso. (D) Os três primeiros valores de PC são plotados para cada fenótipo separadamente, e a média de KNND é calculada para mostrar que o fenótipo cístico é mais densamente empacotado, enquanto os fenótipos policísticos e policísticos densos exibem menor densidade (ou seja, mais heterogeneidade). Embora representados separadamente, os três fenótipos compartilham o mesmo espaço de PCA. Para o fenótipo cístico, a média de KNND foi calculada a partir do conjunto porque valores atípicos presentes apenas nesse fenótipo distorcem o cálculo. Níveis médios de KNND: Cístico, 1,061; Policístico, 1,575; Policístico denso, 2,247. (E) Gráficos de caixa da área dos organoides mostram uma dispersão decrescente dos pontos de dados de organoides císticos para policísticos e policísticos densos, o que é o oposto do que é observado na análise em escala do LCPC (Figura 3C), destacando que a informação espacial capturada pela transformada do LCPC difere do que a área captura. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Medição da densidade de textura com a transformada LCPC em grade paralela. (A) Fotomicrografias de microvasculatura em tecido cardíaco foram obtidas anteriormente em outro estudo^31,32. As imagens não são reproduzidas desses estudos propriamente ditas; em vez disso, representam novas visualizações geradas a partir do mesmo conjunto de dados original de imagens 3D^{relatado como 31} e fornecido pela Gkontra. Embora o conjunto de dados já tenha sido publicado anteriormente, as imagens específicas apresentadas aqui são publicadas pela primeira vez. Imagens dos locais remotos que não sofreram ferimentos em cada momento não são mostradas. Passo 1: Uma máscara 2D é gerada, e o eixo geral de alinhamento dos vasos é determinado (seta dupla vermelha). Passo 2: Uma região circular centrada no ponto médio da imagem é obtida para forçar cada imagem a ter a mesma altura após as imagens serem rotacionadas em graus variados na etapa seguinte (girar imagens quadradas em graus variados alterará a altura da imagem dependendo do grau de rotação). Passo 3: Cada imagem é rotacionada de modo que o eixo geral de alinhamento determinado no Passo 1 seja vertical. Passo 4: Uma borda azul uniforme é aplicada ao redor de cada imagem para garantir que cada imagem tenha o mesmo diâmetro, pois imagens com densidades mais esparsas podem ser mais curtas (exemplo: veja "7 Dias Pós-Infarto do Miocárdio" no Passo 3). Passo 5: A transformada LCPC em grade paralela é aplicada. (B) Gráficos de pontos dos três primeiros PCs da saída da transformada LCPC em grade paralela (Roxo: condição basal, Verde: local infarto, Amarelo: local não lesionado remoto ao local infarto). Veja a seção de resultados para cálculos de distância chanfrada em cada ponto de tempo entre as três condições. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: A transformada LCPC mede características ocultas na área e no perímetro. Para comparação com métricas tradicionais de forma, (A) a área percentual e (B) o perímetro total das redes vasculares foram medidos. (C) Para mostrar a precisão que pode ser obtida a partir do resultado da transformada LCPC, o valor dos bins de frequência individuais resultantes da FFT foi comparado (Figura Suplementar 1). Seis bins de frequência foram escolhidos como índices para quantificar objetivamente as diferenças entre os grupos de tratamento. Para todos os painéis, devido ao tamanho limitado da amostra de cada grupo (n = 3), o Delta de Cliff não paramétrico para o tamanho do efeito foi calculado em vez de um valor p do Teste de Soma de Rank de Wilcoxon. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: A importância de orientar as formas sistematicamente para extrair dados limpos. (A) Um exemplo de formas idênticas que são imagens espelhadas umas das outras, e como o sistema de grade paralela determina sua orientação distinta, produzindo assim resultados diferentes. (B) Um exemplo de como inverter a Forma 2 horizontalmente, de modo que sua orientação agora corresponda à Forma 1 e se torne uma comparação mais justa com a Forma 1. Nessa configuração, a transformada LCPC em grade paralela produz os mesmos resultados tanto para a Forma 1 quanto para a Forma 2. Essa alteração de orientação só deve ser feita se não houver contexto espacial que sugira que a Forma 2 não deva ser modificada. (C) Um exemplo de quatro variações de objetos que se parecem com o número "3", com alguns voltados na direção errada. (D) Um exemplo de como orientar cada objeto para maximizar a limpeza dos dados que resultarão da transformada LCPC da grade paralela. (E) Um exemplo de medir a protuberância mais larga dos itens no Painel C com base nas mesmas regras de orientação do Painel D. (F) Um exemplo de medir as lâmpadas grandes dos itens no Painel C, mas mantendo seu contexto de alinhamento, como no Painel D. A motivação de manter as regras de alinhamento no Painel D é dissecar a contribuição da informação espacial no volume mais amplo em relação à contribuição do abaulho mais estreito dentro dessas regras. Veja a Figura Suplementar 3 para os espectros FFT associados a C–F. As imagens de A a B são ícones do Microsoft PowerPoint. As formas em C-F foram desenhadas no Microsoft PowerPoint. Essas imagens são criadas por autores e não requerem nenhuma licença de publicação ou permissões de direitos autorais. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 7: A incapacidade das métricas tradicionais de forma de registrar o contexto óbvio. (A) A série de marcas de verificação tem o mesmo formato, mas aumenta de tamanho da esquerda para a direita. Nesta série, a área de cada marca de verificação é diferente, enquanto o conceito de forma permanece o mesmo: ou seja, eles permanecem com o mesmo estilo de marcas. (B) Um quadrado é girado em torno do seu centro em 45 graus até que seu conceito de forma se torne o que os humanos chamam de diamante. Embora o conceito de forma de um quadrado seja muito distinto do de um losango, as rotações intermediárias são subjetivamente interpretadas como "quadrados inclinados" ou "losangos inclinados". A transformada LCPC pode medir objetivamente e com precisão a diferença em cada etapa desta série. As formas foram desenhadas no Microsoft PowerPoint. Essas imagens são criadas por autores e não requerem nenhuma licença de publicação ou permissões de direitos autorais. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 8: Explicação da forma pura versus forma em escala. Medir objetos "Em Escala" significa medir a forma dos objetos de acordo com seus tamanhos originais em relação uns aos outros. "Forma Pura", por outro lado, significa medir a forma de diferentes objetos em escala semelhante, o que remove o efeito do tamanho na forma. É importante encontrar uma maneira objetiva de redimensionar os objetos que estão sendo comparados. A linha interna mais longa geralmente é uma escolha ótima (Passo 1). Ambos os objetos são rotacionados de modo que a linha interna mais longa fique horizontal (Passo 2). Nesse caso, os dois objetos também são girados de modo que o lado recuado fique voltado para baixo. Em seguida, a largura de cada objeto, que agora é a mesma magnitude da linha interna mais longa de cada objeto, é redimensionada para 400 pixels de largura, enquanto também restringe a proporção de aspecto para evitar distorção dos objetos (Passo 3). Por fim, é opcional girar os objetos redimensionados 90 graus (Passo 4) (neste caso, no sentido anti-horário) antes de aplicar a transformação LCPC. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 9: Exemplo de marcadores espaciais para pesquisa sobre câncer. (A) Um exemplo hipotético de células migrando em cultura 2D expandindo seus lamelipódios na direção da migração. No contexto da morfologia migratória das células epiteliais, orientar o contorno de cada célula de modo que a linha interna mais longa que se alinha com o eixo de migração seja vertical faz mais sentido para capturar o contexto espacial. (B) Exemplos hipotéticos de tumores ou lesões pré-cancerosas que crescem dentro de uma carcaça que não muda de forma. A lesão cresce a partir de um pedúnculo, que é a estrutura central de suporte. À medida que a lesão cresce ou encolhe, seu contorno se move em direção ou para longe da parede interna da envolvente. As linhas pontilhadas representam uma forma racional e objetiva de definir quanto da carcaça deve ser traçada (linha laranja), de modo que não seja adicionada informação extra nem muito pouca ou demais. (C) A opção 1 mostra a transformada LCPC em grade paralela aplicada ao contorno das lesões sem contexto de onde a invólucro está localizada. A opção 2 mostra o mesmo, mas incluindo o contexto espacial de onde a carcaça está localizada. Por exemplo, os pontos vermelhos representam interseções entre a linha da grade (seta preta, linha verde) e o contorno. A Opção 2 resulta em cada grade fazendo uma quarta interseção que não existe na Opção 1, o que adiciona quantitativamente contexto espacial ao resultado da Opção 2, que está completamente ausente na Opção 1. As formas foram desenhadas no Microsoft PowerPoint. Essas imagens são criadas por autores e não requerem nenhuma licença de publicação ou permissões de direitos autorais. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 10: Resultados hipotéticos da FFT e índices comuns que podem ser derivados deles. (A) O gráfico de frequência resultante da FFT de duas formas hipotéticas é exibido. Como as magnitudes nos Bins 3 e 4 apresentam tendências opostas, uma razão entre esses dois compartimentos será um bom índice representando uma diferença entre essas duas formas. As linhas pontilhadas vermelha e verde representam outros bins de frequência que poderiam ser usados para obter bons índices. (B) Um histograma de duas formas hipotéticas cujos perfis FFT exibem uma tendência decrescente passo a passo como representação de suas diferenças morfológicas. (C) Um histograma de duas formas hipotéticas cujos perfis FFT diferem mais na região central ao longo do vão dos bins de frequência. (D) Exemplos de características morfológicas hipotéticas que podem fornecer índices que se correlacionam com sua presença. As formas foram desenhadas no Microsoft PowerPoint. Essas imagens são criadas por autores e não requerem nenhuma licença de publicação ou permissões de direitos autorais. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura suplementar 1: Gráficos em forma de caixa comparando as magnitudes de várias bins de frequência através dos resultados da transformada LCPC de redes vasculares. A transformada LCPC das redes vasculares mostrada nas Figuras 4 e 5 fornece um conjunto de bins de frequência e suas magnitudes que representam cada imagem. Gráficos caixa-bigode das magnitudes em cada bin são usados para comparar todos os grupos de tratamento, identificando qual bin serve melhor como índice para estratificar a densidade de textura medida via transformada LCPC. Cada gráfico caixa-bigode consiste em n = 3 imagens independentes. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Exemplo de organoides segmentados de tumores de mama. Os organoides eram segmentados manualmente por um especialista que rotineiramente os cultivava e os observava sob microscopia. Esta figura mostra exemplos de contornos organoides segmentados. A barra de escala para todas as imagens microscópicas é de 50 μm. As células humanas primárias usadas neste estudo foram obtidas e cultivadas sob aprovações éticas e procedimentos de consentimento informado,^{relatados 21}. As imagens apresentadas aqui derivam dessas culturas celulares aprovadas e são publicadas pela primeira vez. Nenhuma coleta adicional de espécimes humanos foi realizada. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Espectros FFT para formas na Figura 6. Os resultados das FFTs para as formas na Figura 6 são fornecidos aqui para que os leitores possam entender o efeito da alteração da orientação da forma em suas informações espaciais. A coluna esquerda dos grafos possui eixos y inalterados, enquanto a coluna direita tem eixos truncados de modo que os valores menores dos bins podem ser visualizados. (A) Espectros da transformada LCPC em grade paralela das quatro formas na Figura 6C conforme exibidas, o que significa que não há reorientação. (B) Espectros da transformada LCPC em grade paralela das formas na Figura 6D, que foram reorientadas conforme descrito no texto. (C) Espectros da transformada LCPC em grade paralela das formas na Figura 6E. (D) Espectros da transformada LCPC da grade paralela das formas na Figura 6F para comparação com os da Figura 6E. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Detalhes extensos sobre as melhores práticas para a transformação LCPC. Este arquivo suplementar oferece discussões extensas sobre melhores práticas e notas metodológicas adicionais. O esboço do documento é o seguinte: Seção 1 - Contexto espacial que área, volume, perímetro e aspereza não podem capturar. Seção 2 - Melhores práticas para usar a transformada LCPC e interpretar resultados. Seção 3 - Compreender a polaridade inerente da natureza para maximizar a transformada LCPC. Seção 4 - Interpretação dos espectros FFT resultantes da transformada LCPC. Seção 5 - Como orientar formas antes de medi-las com a transformada LCPC. Seção 6 - O que é "Forma Pura" vs. "Em Forma Em Escala"? Seção 7 - Notas metodológicas sobre métodos estatísticos. Seção 8 - Notas metodológicas sobre cultura celular e segmentação de organoides. Seção 9 - Parâmetros da FFT para aqueles que codificam sua própria transformação LCPC. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Como em qualquer ferramenta computacional, a qualidade da saída depende se as entradas seguem as regras esperadas em torno das quais a ferramenta foi projetada. As seguintes regras devem ser seguidas e usadas como verificação de controle de qualidade ao utilizar os scripts Python fornecidos. Primeiro, certifique-se de que as máscaras abertas sejam linhas azuis sobre fundo branco. Azul foi uma decisão arbitrária e não tem significado, mas os scripts que realizam a transformação LCPC foram escritos para buscar pixels azuis em fundo branco. Segundo, não execute os scripts de transformação LCPC em imagens que tenham menos de 10 pixels de espaço em branco em todos os quatro lados. Veja este vídeo para uma explicação do porquê: "O Parâmetro de Espessura da Margem - Como Preparar Contornos de Forma"³³. Terceiro, esse script assume que os contornos do seu objeto são pixels azuis sobre um fundo branco. A espessura da linha deve estar entre 5 e 10 pixels. Veja este vídeo para uma explicação do porquê: "O Parâmetro de Espessura da Linha - Como Preparar Contornos de Forma"³⁴. Quarto, não execute os scripts de transformação LCPC em imagens em branco. Isso causará um erro no script. Quinto, não execute os scripts de transformação LCPC em imagens que consistam apenas de um ponto de detritos. Isso causará um erro porque o sistema de grade pode não detectar o ponto e, portanto, tentar analisar uma imagem em branco. Sexto, não execute os scripts de transformação LCPC em imagens que contenham partículas indesejadas de detritos. Os detritos alteram a altura e a largura do objeto da máscara aberta e, assim, causam resultados imprecisos. Sétimo, assista a este vídeo para entender por que é importante entender a escala dos seus objetos antes de analisá-los com a transformada LCPC: "O Parâmetro de Escala - Como Preparar Contornos de Forma"³⁵.

Um dos aspectos mais impressionantes da transformada LCPC é sua capacidade de capturar o contexto espacial. A biologia é cheia de contexto espacial crucial para entender a natureza. Por exemplo, células epiteliais possuem polaridade apical-basal 36,37,38,39. Além disso, a direção da gravidade, que é alterada em condições de microgravidade, tem efeitos significativos tanto na fisiologia dos astronautas^40,41 quanto na morfologia das células^{cancerígenas} 42,43,44. Por fim, préneoplásia e neoplasia in situ podem crescer em lúmens por meio de um caule que serve como estrutura central de suporte, fornecendo acesso ao suprimento sanguíneo. Assim, quando essas lesões regredissem, elas regrediam tanto para longe da cavidade luminal quanto em direção ao caule^45,46. Por ter sido projetada para isso, a transformada LCPC é altamente sensível ao contexto espacial e, portanto, pode introduzir heterogeneidade extra se o usuário não tomar cuidado. A Figura 6 descreve como orientar sistematicamente as formas antes de aplicar a transformada LCPC. A Figura 7 descreve como a geometria tradicional não pode medir conceitos de forma que são óbvios para os humanos. A Figura 8 apresenta um diagrama que visualiza a diferença entre medir forma pura e forma em escala. A Figura 9 descreve que o contexto espacial é frequentemente negligenciado ao quantificar formas em cultura 2D, histologia e fatias 2D a partir de imagens 3D. Note que, devido a limitações de espaço, o Arquivo Suplementar 1 contém uma discussão extensa sobre a Figura 6 e a Figura 7 na Seção 5, e as Figuras 8 e Figura 9 na Seção 6.

Como a FFT produz dados espectrais multidimensionais, é importante que o usuário se sinta confortável em derivar índices a partir de padrões recorrentes nos espectros. Embora este manuscrito se refira à transformação LCPC como incluindo a etapa de aplicação da FFT, a transformação real da LCPC ocorre antes da etapa da FFT (Figura 1A–B Passo 4, Figura 2A–B Passo 3). No entanto, a aplicação da FFT revela insights objetivos e sistemáticos do domínio da frequência da saída da transformada LCPC. Assim, a transformada LCPC não seria tão eficaz sem incluir a FFT como etapa final. Na transformada LCPC, a FFT resulta em uma série de bins e suas magnitudes, todos representando multidimensionalmente a entrada de contorno no Passo 1. Uma analogia de uma representação multidimensional estática da informação é o número de telefone de nove dígitos que representa o canal de comunicação telefônica de uma pessoa nos Estados Unidos. Embora sejam complicados em comparação com representações escalares de formas (como 85 cm de comprimento, 56 graus de largura, etc.), dados multidimensionais armazenam muito mais informações para extrair insights. A Figura 10 mostra vários padrões espectrais observados ao aplicar a transformada LCPC e como derivar índices a partir deles. A Seção 4 do Arquivo Suplementar 1 discute a Figura 10 de forma mais aprofundada.

O domínio da frequência da transformada LCPC revela características objetivas e quantitativas de uma forma 2D que o olho nu não consegue perceber facilmente. Diferenças muito sutis em curvatura, irregularidade e tortuosidade podem ser quantificadas de forma robusta. No entanto, uma vez identificados subtipos morfológicos por esse método, podem ser observados temas visualmente distintos que se correlacionam com as diferenças quantitativas. Essa característica torna a transformada LCPC interpretável como um método de extração de informações espaciais para modelos de aprendizado de máquina (ML) e torna os próprios modelos de ML resultantes mais interpretáveis. Embora as redes neurais sejam um método poderoso de ML, seus resultados frequentemente não são interpretáveis para humanos, o que representa um problema significativo para o campo da inteligência artificial médica (IA). Os médicos relutam em empregar um modelo de ML para decisões clínicas se não entenderem por que o modelo toma decisões ruins. Além disso, se nenhum humano entender por que ou como um modelo tomou uma decisão tendenciosa, então corrigir isso se torna intratável.

Vale acrescentar à discussão sobre a medição da densidade de textura (Figuras 4 e 5) que o olho humano é facilmente confundido por ilusões ópticas ou padrões desordenados. Arranjos aleatórios de padrões complexos são frequentemente interpretados como aleatórios, não mensuráveis ou que não valem a pena medir. A transformada LCPC pode medir diferenças quantitativas, objetivas e reprodutíveis em padrões aparentemente aleatórios. No entanto, a menos que o usuário seja treinado para não se deixar enganar por padrões caóticos e desordenados na natureza que se disfarçam de aleatoriedade, nenhuma tentativa será feita para medir o transtorno e descobrir padrões previsíveis. Padrões previsíveis são uma indicação clara de que o sistema não é completamente aleatório. A transformada LCPC foi inventada com o propósito de medir formas que são sutilmente diferentes ou inconcebivelmente diferentes a olho nu. Como muitas morfologias na natureza exibem pequenas diferenças que parecem mais heterogeneidade caótica sem sentido do que subtipos previsíveis de desordem – que cada um se correlaciona com funções biológicas distintas – o seguinte arcabouço conceitual "Quatro Passos" foi desenvolvido para ser usado em conjunto com a transformada LCPC. Primeiro, resista à ideia de que um sistema com aparência complicada é aleatório. Segundo, chame a heterogeneidade caótica de "desordem" e então encontre um tipo de ordem que possa servir como uma condição de referência racional. Hipotese que o transtorno está se desviando da referência. Terceiro, encontre uma forma objetiva de medir o padrão que é a referência, como a transformada LCPC. Quarto, aplicar esse mesmo método objetivo para medir o que é considerado a desordem no sistema.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Add 100 pixels to margins.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	Used the NearestNeighbors function within the sklearn.neighbors package
BLUE_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	Used cKDTree function within scipy.spatial package
Cliff's Delta	Tissue Spatial Geometrics Lab	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	Created an implementation of Cliff's Delta via the Python language
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Flip images VERTically.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
GREEN_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
MacOS Preview Version 11.0	Apple Inc	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Microsoft Paint	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	Was mentinoed as a potential useful tool for manual segmentation, but not used in this study
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	Used the PCA function with the sklearn.decomposition package
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate Green Line_v3.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CCW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Thicken Blue Lines.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Trim margin to 1-pixel border.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook