Identificação de constituintes anti-paralisia cerebral que visam AChE em Coptis chinensis usando ultrafiltração por afinidade e validação experimental

Resumo

O objetivo deste estudo foi identificar os principais componentes ativos do Coptis chinensis e elucidar sua ação na intervenção da paralisia cerebral (PC) por meio de ultrafiltração de afinidade e verificação experimental.

Resumo

O objetivo deste estudo foi identificar os principais componentes ativos do Coptis chinensis e elucidar seus mecanismos de ação na intervenção da paralisia cerebral (PC) por meio da ultrafiltração por afinidade. Usando acetilcolinesterase (AChE) como alvo, a coptisina foi selecionada do extrato de C. chinensis como o componente com maior capacidade de ligação, que apresentou taxa de ligação de 21,9% e atividade inibitória significativa in vitro (IC₅₀ = 3,24 μg/mL). Acoplamento molecular e simulações de dinâmica molecular demonstraram que a coptisina poderia se ligar de forma estável ao bolsão ativo de AChE. Posteriormente, experimentos de verificação foram realizados em um modelo neonatal de rato de dano cerebral hipóxico-isquêmico (HIBD). Os resultados mostraram que a intervenção com coptisina (10 mg/kg) melhorou significativamente o aprendizado espacial e os déficits de memória nos animais modelo, aumentou o fluxo sanguíneo cerebral no hemisfério lesionado, aliviou danos patológicos aos tecidos cerebrais e inibiu a ativação anormal da AChE no cérebro. Em resumo, este estudo combinou tecnologia de ultrafiltração por afinidade e confirmou que a coptisina, identificada a partir do extrato de C. chinensis, pode inibir a AChE e exercer efeitos neuroprotetores e efeitos de melhoria do fluxo sanguíneo cerebral. Ela serve como base material chave para o C. chinensis para atenuar déficits neurológicos semelhantes ao CP, fornecendo moléculas candidatas e evidências científicas para o desenvolvimento de medicamentos relacionados.

Introdução

Paralisia cerebral (PC) é uma síndrome permanente causada por danos não progressivos ao cérebro em desenvolvimento de fetos ou bebês, caracterizada principalmente por disfunção motora e anormalidades posturais. Embora atualmente existam múltiplas abordagens clínicas de tratamento para a PC, ainda falta medicamentos ideais que possam reparar fundamentalmente déficits neurológicos com efeitos colaterais mínimos. Em contraste com medicamentos sintetizados quimicamente, que geralmente atuam em alvos únicos e carregam potencial de toxicidade relativamente alto, as medicinas tradicionais chinesas (MTC), com suas vantagens de regulação multicomponente, multi-alvo e holística, bem como os perfis de segurança favoráveis demonstrados na prática clínica de longo prazo, fornecem novos insights e um reservatório de candidatos a medicamentos para o tratamento de distúrbios cerebrais^{complexos 1,} 2,3,4,5,6. Portanto, explorar componentes químicos altamente eficazes e de baixa toxicidade a partir das MTC possui significativa importância científica e valor^{clínico 7}.

Entre os complexos mecanismos patológicos da paralisia cerebral, a disfunção do sistema nervoso colinérgico desempenha um papel fundamental ^8,9. A acetilcolinesterase (AChE) é uma enzima-chave que hidrolisa o neurotransmissor acetilcolina (ACh). A atividade excessivamente alta dessa enzima leva à depleção de ACh, prejudica a transmissão do sinal colinérgico e, consequentemente, agrava o controle motor e as disfunções cognitivas. Portanto, a AChE emergiu como um alvo importante e bem estabelecido para o desenvolvimento de agentes neuroprotetores. Inibir a atividade da AChE para elevar os níveis de ACh na fenda sináptica é reconhecido como uma das estratégias eficazes para melhorar déficits neurológicos relacionados à PC. No contexto da lesão cerebral hipóxico-isquêmica, a interrupção da neurotransmissão colinérgica pode agravar ainda mais a disfunção neuronal, contribuindo assim para défices motores e cognitivos relevantes para a PC. Portanto, a AChE foi selecionada neste estudo não apenas como um alvo neurofuncional clássico, mas também como um ponto de entrada mecanicamente relevante para a triagem de compostos bioativos com potenciais efeitos anti-CP.

Pesquisas modernas mostraram que plantas medicinais possuem uma ampla gama de valores de atividade farmacológica. Como uma medicina tradicional clássica chinesa para eliminar o calor e secar a umidade, a Coptis chinensis constitui um sistema complexo abundante em vários alcaloides isoquinolínicos. Além da conhecida berberina, ela também contém uma série de componentes com estruturas semelhantes e diversas atividades farmacológicas, como coptisina, epiberberina, palmatina e^{jatrorrrizina 10}. Esses alcaloides formam coletivamente a base material para os efeitos farmacológicos de C. chinensis. Estudos anteriores demonstraram que C. chinensis e seus alcaloides possuem propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes e potenciais propriedades neuroprotetoras. No entanto, dado um sistema de componentes tão complexo, os métodos tradicionais de pesquisa são difíceis de identificar rápida e com precisão os principais componentes ativos que têm como alvo direto a AChE, o que limita muito a elucidação aprofundada dos mecanismos subjacentes aos efeitos de C. chinensis na lesão^{cerebral 11}.

Comparado ao isolamento convencional guiado por atividade, que geralmente requer fracionamento repetido, testes de bioatividade e purificação e pode levar à perda ou negligência de compostos de baixa abundância, mas alta afinidade, a ultrafiltração por afinidade permite a triagem rápida de ligantes de ligação ao alvo diretamente a partir de misturas complexas. Essa técnica permite a "pesca" eficiente e rápida de ligantes ativos que se ligam a alvos específicos (por exemplo, AChE) diretamente a partir dos extratos de crude multicomponente dos MTC. É particularmente adequado para sistemas com múltiplos componentes alcaloides, como C. chinensis, permitindo a identificação precisa de componentes efetivos que interagem diretamente com o alvo a partir da mistura^{complexa 12}. Combinado com abordagens computacionais incluindo acoplamento molecular e simulações de dinâmica molecular, ele pode prever intuitivamente o modo de ligação, os tipos de interação e a estabilidade complexa entre componentes e proteínas-alvo no nível atômico, fornecendo assim evidências teóricas robustas e explicações mecanicistas para os resultados da triagem^{experimental 13}.

Com base no contexto acima, este estudo propõe a seguinte hipótese científica: entre os diversos alcaloides presentes em C. chinensis, existem componentes ativos que podem inibir especificamente a AChE, e esses componentes são a base material para seus potenciais efeitos anti-paralisia cerebral. Para verificar essa hipótese, integramos técnicas modernas de triagem com métodos de validação farmacológica: primeiro, usando AChE como alvo, foi empregada tecnologia de ultrafiltração por afinidade para triar rapidamente potenciais inibidores do extrato multi-alcaloide de C. chinensis; Além disso, simulações de acoplamento molecular e dinâmica molecular foram utilizadas para esclarecer o mecanismo de ligação em nível atômico; por fim, experimentos in vivo em animais foram realizados para verificar os efeitos aprimoradores dos componentes triados no comportamento, patologia do tecido cerebral e atividade de AChE em ratos com PC.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais e de bem-estar animal foram aprovados pelo Comitê de Ética do Bem-Estar Animal de Laboratório do Primeiro Hospital Popular de Zunyi (Ética nº 2025-2-362). Durante o período de modelagem e tratamento, a condição corporal e a sobrevivência dos animais foram registradas diariamente.

Preparação do extrato de C. chinensis
Neste estudo, um Extrator Acelerado de Solventes foi utilizado para a extração acelerada da fração de n-butanol de materiais medicinais de C. chinensis . Um total de 1 g de pó seco de C. chinensis foi cuidadosamente pesado e colocado em células de extração de 40 mL, respectivamente. Juntas metálicas e membranas filtrantes de fibra de vidro eram colocadas sequencialmente acima e abaixo da célula de extração para filtrar a amostra, e a amostra era envolta com areia de quartzo. Durante o processo de extração, a temperatura e a pressão foram ajustadas para 90 °C e 100 bar, respectivamente. O extrato acelerado era coletado, e o solvente de extração era evaporado até secar usando um evaporador rotativo para obter extratos secos de diferentes frações polares. Metanol:água (50:50, v/v) foi selecionado como solvente para a reconstituição. O extrato foi filtrado através de uma membrana microporosa de 0,45 μm e armazenado a 4 °C. Antes da detecção da amostra, foi investigada a atividade inibitória do solvente de reconstituição em branco no AChE. Os resultados mostraram que seu efeito inibitório era desprezível, indicando que a seleção do solvente de reconstituição neste experimento não afetaria os resultados experimentais.

Ensaio de inibição da acetilcolinesterase
O experimento foi realizado em uma placa de 96 poços. Primeiro, foi adicionado PBS, seguido por amostras de AChE (0,1 U/mL) e C. chinensis sequencialmente. Após a incubação a 37 °C por 10 minutos, foram adicionados 5,5′-Dithiobis (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), solução cromogênica (2,5 mmol/mL) e substrato ATChI (10 mmol/mL). A mistura foi incubada a 37 °C por mais 10 minutos, e a reação foi encerrada com a adição de 60 μL de dodecilsulfato de sódio (SDS) a 1%. A absorvância foi medida em 405 nm. Cada amostra de C. chinensis foi organizada com 4 grupos: Grupo controle a: PBS (120 μL), solução AChE (20 μL), solução DTNB (40 μL), solução ATChI (40 μL) e solução SDS (60 μL) foram adicionadas sequencialmente; Grupo controle em branco b: PBS (120 μL), solução DTNB (40 μL), solução ATChI (40 μL) e solução SDS (80 μL); Grupo amostral c: PBS (80 μL), extrato de C. chinensis (20 μL), solução de AChE (20 μL), solução DTNB (40 μL), solução de ATChI (40 μL) e solução SDS (60 μL); Grupo em branco da amostra d: PBS (100 μL), extrato de C. chinensis (20 μL), solução DTNB (40 μL), solução ATChI (40 μL) e solução SDS (60 μL). A Huperzina A foi usada como controle positivo com uma concentração inicial de aproximadamente 2,5 mg/mL. A concentração inicial do extrato de fração de n-butanol foi de cerca de 1 mg/mL. Tanto a huperzina A quanto as amostras foram diluídas com um gradiente de 60%. A taxa de inibição foi calculada usando a seguinte fórmula: Taxa de inibição (%) = [1 - (c - d)/(a - b)] × 100%, onde a, b, c e d representam respectivamente os valores de absorvância do grupo controle a, grupo controle em branco b, grupo amostral c e grupo em branco d.

A taxa inibitória em cada concentração testada foi calculada usando a fórmula descrita acima. Curvas concentração–inibição foram então construídas graficando a taxa inibitória em relação ao logaritmo da concentração do composto. Os valores de IC20, IC50 e IC80 foram calculados por ajuste de regressão não linear usando o software GraphPad Prism com base nas curvas concentração–resposta ajustadas, e foram definidos como as concentrações necessárias para produzir 20%, 50% e 80% de inibição da atividade AChE, respectivamente.

Ensaio de ultrafiltração por afinidade
Foi realizada ultrafiltração de afinidade para triagem de compostos que se ligam a AChE do extrato de C. chinensis . Resumidamente, a solução AChE (0,1 U/mL em PBS, pH 7,4) foi usada como enzima ativa. O controle enzimático inativado foi preparado aquecendo a mesma solução de AChE em um banho-maria fervente por 10 minutos. Para cada reação, 200 μL de solução de extrato de C. chinensis foram misturados com 200 μL de solução ativa ou inativada de AChE e incubados a 37 °C por 30 minutos. Após a incubação, a mistura foi transferida para um tubo de centrífuga de ultrafiltração de 30 kDa e centrifugada a 12.000 × g por 10 minutos a 4 °C. O complexo enzima-ligante retido foi lavado três vezes com 200 μL de PBS sob as mesmas condições de centrifugação para remover componentes não ligados. Subsequentemente, 200 μL de metanol 90% foram adicionados para dissociar e eluir os ligantes ligados ao AChE, seguidos por incubação por 10 minutos e centrifugação a 12.000 × g por 10 minutos. O eluato foi coletado, filtrado e analisado por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Compostos enriquecidos no grupo enzimático ativo em relação ao controle enzimático inativado foram considerados componentes potenciais de ligação^{à AChE 14}.

Análise HPLC dos principais metabólitos alcaloides
A análise cromatográfica foi realizada usando um sistema HPLC equipado com bomba quaternária, autoamostrador, forno de coluna e detector ultravioleta–visível (UV-Vis). A separação foi alcançada em uma coluna cromatográfica C18 (250 × 4,6 mm, 5 μm) mantida a 25 °C. A fase móvel consistia em acetonitrila (A) e solução de bicarbonato de amônio de 30 mmol/L contendo 0,7% de amônia e 0,25% de trietilamina (B), entregues com uma vazão de 1,0 mL/min. O programa de elução em gradiente foi o seguinte: 0–15 min, 90%–75% B; 15–25 min, 75%–70% B; 25–50 min, 70%–55% B. O volume de injeção era de 5 μL, e a detecção UV era realizada a 270 nm.

Para análise quantitativa dos principais alcaloides em C. chinensis, cada amostra (0,02 g) foi pesada com precisão e extraída ultrassônicamente com 10 mL de solução de ácido clorídrico–metanol (1:100, v/v) por 30 minutos. Após a filtração, a perda de peso foi compensada com o mesmo solvente de extração do peso original, e a solução final foi filtrada através de uma membrana de 0,45 μm antes da análise HPLC. Oito padrões de referência autênticos, incluindo magnoflorina, glaucina, jatrorrhizina, columbamina, epiberberina, coptisina, palmatina e berberina, foram analisados sob as mesmas condições cromatográficas. Curvas de calibração foram construídas para esses analitos usando soluções de referência. Como os níveis de abundância e as respostas dos detectores dos oito alcaloides diferiam consideravelmente, a faixa de calibração de cada analito foi otimizada individualmente com base em relatórios da literatura e experimentos preliminares, em vez de aplicar um esquema idêntico de dobra-diluição a todos os compostos. Portanto, as razões de concentração alta para baixa das faixas lineares não eram esperadas como idênticas entre os oito analitos. Os limites de detecção (LOD) e limites de quantificação (LOQ) foram estimados em razões sinal-ruído de aproximadamente 3 e 10, respectivamente.

Para análise dos eluados de ultrafiltração de afinidade, os ligantes dissociados do AChE após a ultrafiltração foram coletados em experimentos repetidos e concentrados antes da análise HPLC para garantir uma intensidade adequada do sinal para a detecção. Os eluados concentrados foram então analisados usando as mesmas condições HPLC descritas acima. Os picos cromatográficos nos eluados foram atribuídos por comparação direcionada com os oito padrões de referência autênticos e com o perfil cromatográfico do extrato de C. chinensis obtido sob condições analíticas idênticas. Portanto, a presente análise não foi destinada à elucidação estrutural de novo de compostos desconhecidos, mas à determinação direcionada de se os alcaloides principais conhecidos em C. chinensis estavam enriquecidos na enzima ativa eluada em relação ao controle da enzima inativada.

Ensaio de acoplamento molecular
No presente estudo, a análise de acoplamento foi focada na coptisina porque ela foi identificada como o constituinte de ligação a AChE mais bem classificada por ultrafiltração de afinidade e também mostrou a maior atividade inibitória in vitro entre os principais alcaloides. Cristais de proteína foram recuperados do Banco de Dados de Proteínas (PDB). Cristais proteicos com ligantes co-cristalizados foram selecionados como receptores finais de acoplamento, e todos os cristais proteicos alvo foram derivados de humanos. O arquivo receptor foi aberto usando o software PyMOL, e os arquivos de receptor e ligando foram separados e salvos; o receptor foi aberto com o software MGLTools, seguido pela remoção de moléculas de água, adição de átomos e cargas de hidrogênio, fusão de átomos de hidrogênio não polares, cálculo de cargas atômicas locais, etc., e então salvo no formato pdbqt; o arquivo ligando era aberto com o software MGLTools, átomos e cargas de hidrogênio eram adicionados e salvos como um arquivo no formato pdbqt; a grade box foi aberta, o espaçamento foi definido para 1,000, o número de pontos da grade foi definido, as coordenadas centrais da caixa foram selecionadas de acordo com o ligando co-cristalizado e salvas como um arquivo^{GPF 15,16}.

As estruturas componentes químicas foram inicialmente coletadas do banco de dados SciFinder e salvas em formato cdx; cada estrutura molecular tridimensional era exibida usando o módulo ChemBio3D Ultra, a otimização de energia era realizada com o campo de força MM2, salva no formato mol2, e os parâmetros de carga eram removidos. Usando o AutoDock, o arquivo no formato mol2 era aberto com o software MGLTools, átomos e cargas de hidrogênio eram adicionados ao ligante, ligações químicas rotativas eram observadas e salvos como um arquivo no formato pdbqt. O modelo AutoDock Vina (versão 1.2.5) foi aplicado para realizar a avaliação de acoplamento molecular.

Ensaio de simulação de dinâmica molecular
Os softwares Gaussian 16 e GaussView 6 foram usados para otimização da estrutura dos ligantes. Após importar o arquivo mol2 da estrutura do ligando para o GaussView 6, o tipo de tarefa foi definido como Otimização, o estado da molécula alvo foi selecionado como Estado Fundamental, o método de cálculo foi teoria da função da densidade (DFT), a multiplicidade de spin foi padrão para Spin Padrão, o funcional usado foi B3LYP, o modelo solvente foi IEFPCM, E o solvente era água. Após a conclusão da otimização da estrutura molecular, a Gaussian 16 foi usada para converter o arquivo chk gerado em um arquivo fch, que foi então importado para o software Multiwfn para calcular a carga RESP do ligante.

Após o cálculo da carga do RESP, o arquivo chg gerado era importado para o software sobtop_1.0 (dev5) para gerar o arquivo de topologia de ligantes necessário para a simulação de dinâmica molecular. A simulação da dinâmica molecular foi realizada usando o software GROMACS 2019.6 com o campo de força AMBER99. Os arquivos estruturais da molécula proteica e da pequena molécula foram importados para o software, uma caixa triclínica com um limite periódico de 1,0 nm foi estabelecida, e o modelo de água TIP3P foi usado para preenchimento. O método Particle Mesh Ewald (PME) foi empregado para calcular interações eletrostáticas de longo alcance, e o comando gmx geion foi usado para introduzir um número apropriado de íons de sódio e íons cloreto para neutralizar a carga de todo o sistema. A simulação foi realizada a uma temperatura constante de 298 K e uma pressão atmosférica padrão de 100 kPa. Para minimização de energia, foi implementado o método da descida mais íngreme (íngreme). Os comandos gmx grompp e mdrun gmx foram usados para executar 10.000 passos do equilíbrio NVT (conjunto isotérmico-isocórico) e NPT (conjunto isotérmico-isobárico), com a constante de acoplamento de temperatura e a constante de acoplamento de pressão definidas para 0,1 ps e 0,5 ps, respectivamente, e a duração da simulação de equilíbrio foi de 100 ps. Após o sistema atingir o equilíbrio, o passo de tempo era definido para 2 fs, e uma simulação de dinâmica molecular de 10 ns era realizada no complexo, com dados de trajetória salvos a cada 2 ps. A produção de 10 ns foi selecionada como um comprimento de simulação exploratória para fornecer uma avaliação dinâmica em escala de tempo curto do complexo coptisino–AChE acoplado, em vez de amostragem conformacional exaustiva. Essa configuração foi usada para avaliar se o complexo acoplado poderia manter um modo de binding relativamente estável ao longo do tempo. Os comandos gmx rms, gmx rmsf, gyrate gmx e gmx hbonds foram ainda usados para calcular o desvio quadrático médio (RMSD), flutuação quadrática média (RMSF), raio de giro da proteína, ligações de hidrogênio e área superficial acessível ao solvente. QTgrace foi usado para visualização de resultados.

Verificação de experimentos em animais
Dezoito filhotes saudáveis de rato Sprague-Dawley (SD) neonatal (7 dias pós-natal) de ambos os sexos foram selecionados. Todos os animais experimentais foram alojados em uma instalação experimental específica livre de patógenos (FPS). Essa instalação estava equipada com um sistema rigoroso de barreira, que podia prevenir efetivamente a invasão de microrganismos e parasitas. Os parâmetros ambientais da sala de alojamento eram automaticamente monitorados e regulados por um sistema central de controle: temperatura 22 ± 2 °C, umidade relativa 55% ± 10%, e ciclo de luz de 12 horas de luz/12 horas de escuridão. Um modelo neonatal de rato de dano cerebral hipóxico-isquêmico (HIBD) modificado pelo método clássico de Rice-Vannucci foi usado para simular as características patológicas e comportamentais da PC.

Brevemente, os filhotes de rato pós-natal do sétimo dia foram anestesiados com 2–3% de isoflurano para indução e 1–2% para manutenção. Após anestesia adequada, foi feita uma incisão cervical na linha média, e a artéria carótida comum esquerda foi cuidadosamente isolada e ligada permanentemente. A incisão foi então suturada, e os filhotes foram deixados se recuperar em um tapete térmico por 1 hora. Posteriormente, os filhotes dos grupos modelo e coptisina foram expostos à hipóxia em uma câmara contendo 8% de O₂ equilibrado com 92% de N₂ por 2 horas a 37 °C, induzindo lesão cerebral hipóxico-isquêmica. Animais operados por simulação passaram pela mesma anestesia e exposição cirúrgica sem ligadura carotídica ou tratamento hipóxico. Após a hipóxia, os filhotes foram devolvidos às suas mães e monitorados diariamente quanto à condição geral, sobrevivência e comportamento alimentar durante todo o período experimental.

Os ratos experimentais foram divididos aleatoriamente em 3 grupos: Grupo simulado: apenas a artéria carótida comum esquerda foi separada sem ligadura ou tratamento para hipóxia, e um volume igual de solvente foi administrado pós-operatório; Grupo modelo: cirurgia de modelagem de dano cerebral hipóxico-isquêmico foi realizada e um volume igual de solvente foi administrado pós-operatório; Grupo coptisina: após a modelagem, coptisina (10 mg/kg) foi administrada por gavage. A dose de coptisina (10 mg/kg) foi selecionada como dose in vivo com base em estudos in vivo/farmacocinéticos previamente relatados de^{coptisina 17}. Os medicamentos foram administrados uma vez por dia em um horário fixo durante 14 dias consecutivos de intervenção.

Detecção de indicadores animais
O equipamento de teste do labirinto aquático Morris (MWM) consistia em uma grande piscina circular (diâmetro de aproximadamente 150 cm) com sinais visuais óbvios na parede da piscina. A água da piscina foi estratificada em branco opaco leitoso, e a temperatura da água foi controlada em 23 ± 1 °C. Uma plataforma transparente foi colocada no quadrante alvo, submersa 1–2 cm abaixo da superfície da água. O treinamento era realizado 4 vezes ao dia: os animais eram colocados na água voltados para a parede da piscina a partir de quatro pontos de entrada diferentes na parede, e o tempo necessário para os animais encontrarem e subirem na plataforma oculta a partir da entrada na água, ou seja, a "latência de fuga", era registrado. Cada sessão de treinamento era limitada a 60 segundos. Se o animal encontrasse a plataforma em até 60 segundos, ele podia permanecer nela por 15 segundos para consolidar a memória. Se não fosse encontrado, o animal era gentilmente guiado até a plataforma e autorizado a ficar por 15 segundos. Após 7 dias de treinamento, a plataforma oculta foi removida. Os animais eram colocados na água pelo ponto de entrada oposto à plataforma original e permitidos nadar livremente por 60 segundos, e a trajetória de natação dos animais era registrada por um sistema de vídeo. Por meio do teste MWM, indicadores como latência média de escape, tempo gasto no quadrante alvo e número de cruzamentos sobre a posição original da plataforma foram registrados.

Para detecção por imagem de contraste de manchas a laser (LSCI): Após anestesia, os ratos foram fixados em um instrumento estereotáxico, e o crânio foi exposto e mantido úmido. Um sistema de imagem de fluxo sanguíneo a laser de speckle foi usado para coletar continuamente imagens brutas de speckles por 30 segundos diretamente acima do crânio. Software profissional foi utilizado para converter o contraste de speckles que varia espaçotemporalmente em um mapa de distribuição da unidade de perfusão do fluxo sanguíneo cerebral (PU). Para análise quantitativa, um ROI cortical manualmente delineado dentro do hemisfério ipsilateral exposto em cada imagem foi selecionado de acordo com a área de perfusão cortical relevante para a lesão e os pontos de referência anatômicos visíveis, e o valor médio de perfusão dentro desse ROI foi usado para comparação entre grupos.

Tecidos cerebrais foram coletados e PBS pré-resfriado foi adicionado de acordo com a relação peso-volume. A homogeneização mecânica foi realizada no gelo, seguida pela centrifugação a 8000 × g a 4 °C por 10–15 minutos, e o sobrenadante foi coletado para testes. Os tecidos cerebrais foram rapidamente colocados em paraformaldeído a 4% para fixação por mais de 24 horas, mantendo a morfologia tecidual. A coloração por hematoxilina-eosina (HE) foi realizada por meio de operações como desidratação, limpeza e embutição de parafina, e o grau de lesão cerebral foi observado sob um microscópio óptico.

Para a medição da atividade do AChE, o córtex cerebral do hemisfério lesionado (ipsilateral) foi coletado e homogeneizado conforme as instruções do fabricante. As amostras de tecido foram homogeneizadas em tampão de extração e centrifugadas a 8000 × g por 10 minutos a 4 °C, e o sobrenadante foi coletado para análise. A atividade da AChE foi determinada usando um kit comercial de ensaio de atividade de acetilcolinesterase (método microplaca/colorimétrico). Este ensaio é baseado na hidrólise da acetilcolina por AChE, seguida da reação com DTNB para gerar um produto cromogênico, e a absorvância foi medida em 412 nm para o cálculo da atividade enzimática. Como este kit é um ensaio colorimétrico baseado em atividade enzimática, e não um kit convencional de imunossorvio enzimático (ELISA) para quantificar antígenos, o fabricante não forneceu um padrão de faixa de detecção e sensibilidade analítica. No presente estudo, os valores medidos de atividade AChE no tecido cortical estavam aproximadamente na faixa de 25–80 nmol/min/mg de proteína.

Análise estatística
Todos os dados experimentais foram expressos como média ± desvio padrão (SD) e analisados usando o software GraphPad Prism. As comparações entre os grupos foram realizadas usando análise unidirecional da variância (ANOVA), seguidas pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. Para o teste do labirinto aquático de Morris, o resultado final do treinamento e os parâmetros do teste da sonda foram analisados usando ANOVA unidirecional, seguido pelo teste de comparação múltipla de Tukey. Um valor de P < 0,05 foi considerado estatisticamente^{significativo 18}. A correlação entre a perfusão do fluxo sanguíneo cerebral no ROI e a atividade AChE no córtex cerebral ipsilateral foi analisada usando análise de correlação de Pearson. Um valor de P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Análise de componentes químicos no extrato de C. chinensis
Alcaloides são os principais componentes acumulados e também os principais componentes ativos dos materiais medicinais C. chinensis . Neste estudo, a tecnologia cromatográfica foi usada para analisar os principais componentes químicos em C. chinensis (Figura 1A). Como mostrado na Tabela 1, todos os oito analitos apresentaram boa linearid...

Discussão

Atualmente, diversos métodos e tecnologias foram desenvolvidos para a prevenção e tratamento de doenças^cerebrais 20,21,22^. Neste estudo, foi adotada uma estratégia integrada de triagem in vitro, simulação computacional e verificação in vivo para esclarecer sistematicamente a base material e o mecanismo multi-alvo de C. chinensis na melhoria dos sintomas semelhantes à p...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)	CATO Research Chemicals Inc.	416046844	Ensaio de inibição de acetilcolinesterase
Acetilcolinesterase (AChE)	Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd	C1682	Ensaio de inibição de acetilcolinesterase
Acetiltiocolina ioduro (ATChI)	Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd	1037408	Ensaio de inibição de acetilcolinesterase
Aetonitril	Thermo Fisher Scientific Inc	1162577	Fase móvel de cromatografia líquida
AutoDock Vina	AutoDock	Versão 1.2.5
Padrão de Berberina	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	110713-201814	Análise de composição química
Padrão de Columbamina	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180712	Análise de composição química
Padrão de Coptisina	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180309	Análise de composição química
Extrator de solvente acelerado E-916	Büchi Labortechnik AG, Switzerland	E916-008	Extração de fração de n-butanol
Padrão de Epiberberina	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180309	Análise de composição química
Ácido fórmico	Thermo Fisher Scientific Inc	1270563	Fase móvel de cromatografia líquida
GaussView 6	Gaussian	https://gaussian.com/gaussview6/
Padrão de Glaucina	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180615	Análise de composição química
Padrão de Jatrorrizina	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180607	Análise de composição química
Padrão de Magnoflorina	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180205	Análise de composição química
Metanol	Thermo Fisher Scientific Inc	1162578	Fase móvel de cromatografia líquida
Membrana microporosa	Millipore Filter Company	2139547	Filtração de extratos
Padrão de Palmatina	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180226	Análise de composição química
Prism	GraphPad	https://www.graphpad.com/
PyMOL	PyMOL	https://pymol.org/
Carbonato de sódio	Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd	15138805	Ensaio de inibição de acetilcolinesterase
Dodecil sulfato de sódio (SDS)	Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd	11019349	Ensaio de inibição de acetilcolinesterase