Produção e purificação recombinante da hidrofobina SC16 a partir de Escherichia coli e monitoramento de sua auto-montagem usando ensaios de fluorescência

Resumo

Este protocolo descreve a produção e purificação recombinante da hidrofofina SC16 de Escherichia coli e fornece ensaios baseados em fluorescência para monitorar sua auto-montagem.

Resumo

Hidrofobinas são pequenas proteínas anfipáticas que se auto-montam em interfaces hidrofóbicos–hidrofílicas para formar revestimentos estáveis e impermeáveis sobre esporos fúngicos. Hidrofofinas de Classe I formam "rodlets" particularmente estáveis contendo estruturas ordenadas semelhantes a amiloides que revestem as superfícies. Essa química de superfícies incomum lhes oferece aplicações potenciais na administração de fármacos, estabilização de espuma, emulsificação e modificação de superfícies. Para produzir hidrofobinas, há necessidade de protocolos abrangentes e de alto rendimento provenientes de sistemas de expressão simples. Além disso, é necessário fornecer métodos simples para caracterizar a função da hidrofobina após a produção e purificação de recombinantes. Aqui, descrevemos protocolos para a produção e caracterização do SC16, uma hidrofobina da classe IB produzida pelo fungo Schizophyllum commune, que pode ser expressa recombinantemente em Escherichia coli e posteriormente purificada sob condições nativas não redutoras. Isso envolve a transformação de um plasmídeo de expressão codificando SC16 fundido a uma proteína de fusão N-terminal em E. coli, indução da expressão proteica, lise celular sob condições nativas, cromatografia de afinidade e clivagem de protease para isolar a hidrofobina com rendimentos de ≥5 mg. A auto-montagem do SC16 pode então ser monitorada por ensaios baseados em pontos finais ou em fluorescência cinética usando tioflavina T. Ambos os ensaios envolvem incubação de SC16 com mistura prolongada para promover a auto-montagem nas interfaces ar–água e são monitorados por medições de fluorescência. Juntas, essas abordagens fornecem protocolos simplificados para purificar o SC16 e monitorar sua auto-montagem, podendo ser estendidas para outros sistemas que envolvam auto-montagem de proteínas semelhantes.

Introdução

Hidrofobinas são proteínas anfipáticas ativas em superfície secretadas por fungos que se auto-montam em interfaces hidrofóbicas–hidrofílicas (por exemplo, interfaces ar–água em estruturas fúngicas). Na natureza, suas funções são revestir esporos e corpos^{frutíferos 1,2}, tornando-os resistentes à água, prevenindo o encharcamento dos canais de ar e facilitando^{a dispersão 1}. Devido à sua química superficial incomum, as hidrofobinas têm diversas aplicações industriais, incluindo revestimentos para aumentar a biocompatibilidade de implantes e^{próteses 3,4,5}, surfactantes biocompatíveis para administração de medicamentos e tratamentos^médicos 6,7,8,9,10, e candidatos para captura de ^{nanoplásticos 11}.

As hidrofobinas podem ser subdivididas em classes I e classe II, ambas auto-assembladas em interfaces hidrofóbicas-hidrofílicas, incluindo interfaces ar–água, óleo–^água 12,13,14 e plástico–^água 15,16,17. Uma característica definidora das hidrofobinas classe I é que elas formam estruturas altamente estáveis em forma de "rodlet" em interfaces, contendo características ordenadas semelhantes a amiloides (ricas em folhas^β), tornando-as particularmente adequadas para aplicações que envolvem modificação ou proteção de superfícies. Em contraste, hidrofobinas de classe II não formam estruturas semelhantes a amiloides, mas formam filmes que podem ser facilmente^{dissociados 1,18}. Curiosamente, existe também uma terceira classe de hidrofobias, com características estruturais mantidas das classes I e II^18,19. Por causa dessas diferenças, o monitoramento da auto-montagem da hidrofobina é importante para classificação e avaliação do dobramento e função adequados das hidrofobinas produzidas recombinantemente.

A auto-montagem das hidrofobinas pode ser facilmente monitorada por métodos fluorométricos usando corantes de ligação ao amiloide, como a tioflavina T (ThT), que se liga a estruturas de β cruzadas presentes nos^{amiloides 20}. O ThT contém uma única ligação covalente que separa dois anéis aromáticos que normalmente giram livremente. Ao se ligar a estruturas de β cruzadas, essa rotação se torna restrita, resultando em fluorescência²⁰. Devido à sua fluorescência seletiva, o ThT é amplamente utilizado para monitorar a auto-montagem da hidrofobina em interfaces ar–^água 21,22,23,24,25,26,27,28. Os ensaios ThT fornecem informações cinéticas dependentes do tempo sobre a auto-montagem da^hidrofobina 23,27,28, oferecendo vantagens em relação a técnicas como microscopia de força atômica (AFM) e medições de ângulo de contato, que têm menor rendimento e são menos adequadas para análises dependentes do tempo. Além disso, o ThT apresenta forte intensificação de fluorescência ao se ligar a estruturas de β cruzadas, com fluorescência mínima em sua forma^{livre 20}. Essas propriedades tornam os ensaios ThT métodos simples e sensíveis para monitorar a auto-montagem da hidrofobia, que podem ser complementados por técnicas estruturais mais intensivas.

Dadas as diversas aplicações das hidrofofinas, há necessidade de protocolos acessíveis para monitorar sua auto-montagem. Especificamente, o atual protocolo fornece uma estrutura para otimizar a purificação e caracterização funcional das hidrofobinas recombinantes. Anteriormente, Morris e Sunde (2013) delinearam protocolos para expressão recombinante em Escherichia coli, purificação e monitoramento baseado em ThT da auto-montagem^{de hidrofobina 21}. Este trabalho estende esses métodos descrevendo um procedimento modificado para purificar a hidrofobina SC16. SC16 é uma hidrofofina classe I (de Schizophyllum commune) que pode ser facilmente purificada de E. coli sem exigir desnaturação, redução ou reoxidação das ligações dissulfeto. A proteína SC16 resultante é funcional, como demonstrado por ensaios de automontagem baseados em ThT em pontos finais e cinéticos que monitoram a formação de rodlets. O objetivo deste artigo é detalhar um protocolo abrangente e simplificado para a produção recombinante, purificação e ensaios funcionais baseados em ThT da hidrofobina classe IB SC16.

Protocolo

Este estudo não envolve participantes humanos, animais vertebrados ou amostragem de tecidos. Portanto, não era necessária aprovação ética.

1. Expressão da hidrofobina SC16 em E. coli

1. Transforme as células de E. coli expressas SHuffle T7 por choque térmico a 42°C durante 45 s usando um plasmídeo de expressão de pET-21 que codifica um domínio B1 marcado com hexahistidina da proteína G fundido à SC16 (H-GB1-SC16).
   NOTA: As células expressas SHuffle T7 foram selecionadas por sua capacidade de promover a formação correta de ligações^{dissulfeto 29}. O plasmídeo H-GB1-SC16 pode ser gerado por clonagem enzimática de restrição, conforme descrito^{anteriormente 30}.
2. Inocule 2 mL de caldo de lisógena (LB) contendo 100 μg ^mL−1 de ampicilina com uma única colônia. Incube durante a noite a 37°C com tremores.
3. Inocule 1 L de LB (em um frasco de fundo arredondado com 2,8 L) com 1 mL da cultura durante a noite. Cultive a cultura a 37°C com agitação (~120–135 rpm, órbita circular de 19 mm) até que a densidade óptica a 600 nm atinja 0,6 ± 0,1.
4. Adicione isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido a uma concentração final de 0,5 mM para induzir a expressão de H-GB1-SC16. Incube durante a noite a 20°C com tremores.
   NOTA: Essa temperatura foi escolhida para reduzir o risco de formação de corpos de inclusão e dobramento inadequado^{de 31}.
5. Colhe as células por centrifugação a 4000 × g por 20 minutos. Despeje o sobrenadante.
   PONTO DE PAUSA: Armazene a célula a −20°C por até 3 semanas antes de prosseguir para a purificação. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.

2. Purificação da Hidrofobina SC16

1. Ressuspenda o pellet celular em 30 mL de tampão de lise (20 mM tris(hidroximetil)aminometano [Tris], pH 8, 250 mM NaCl).
2. Lise as células incubando a suspensão em um banho-maria a 80°C por 15 minutos. Misture suavemente a cada 5 minutos durante a incubação.
   NOTA: Essa etapa depende da estabilidade térmica do SC16 e pode não ser adequada para outras proteínas.
   ATENÇÃO: Use luvas resistentes ao calor ao manusear tubos e banhos-maria a 80°C. Evite respingar líquido quente durante a mistura e a remoção do tubo.
3. Centrifuge o lisado celular a 25.000 × g por 20 minutos a 4°C. Carregue o sobrenadante em uma coluna gravitacional contendo 2–3 mL resina de cromatografia metálica imobilizada (IMAC) carregada^com 2+.
4. Lave a coluna com tampão de lise contendo 30 mM de imidazol. Proteína elutada usando 10 mL de tampão de lise contendo 300 mM de imidazol.
5. Dialise a fração eluída contra 1 L de tampão contendo Tris (pH 8; 20 mM) e NaCl (50 mM) por 3 h usando tubos de diálise de corte molecular de 3500 kD, agitando a 100 rpm.
   NOTA: A velocidade de agitação durante a diálise pode variar dependendo da configuração (por exemplo, volume do tubo e geometria do béquer). Mexa na rotação mínima necessária para induzir a rotação suave da bolsa de diálise.
6. Adicione a trombombina protease (proteína de fusão 20 U mg⁻¹ ) diretamente à bolsa de diálise (10 mL de volume total de reação) para clivagar a proteína de fusão. Troque o buffer.
   PONTO DE PAUSA: Após a adição de protease e a substituição do tampão, continue a diálise durante a noite a 4°C. Retome a purificação no dia seguinte. Verifique a completude da clivagem pelo SDS-PAGE (espere o desaparecimento da banda de ~18 kDa e o aparecimento das bandas em ~10 e ~8 kDa).
7. Recarregue a amostra diálisa na coluna IMAC carregada por Ni²⁺. Lavar e eluar com aproximadamente 12 mL cada de tampão contendo 30 mM e 300 mM de imidazol, respectivamente.
8. Analisar frações coletadas por eletroforese em gel de dodecilo sulfato de sódio–poliacrilamida (SDS-PAGE) sob condições redutoras (usando β-mercaptoetanol no tampão de carga). Identifique o SC16 pela presença de uma faixa na fração de lavagem no peso molecular esperado (~10 kDa). Dialise a fração de lavagem contendo SC16 em sua totalidade contra 1 L de tampão contendo Tris (pH 8; 20 mM) e NaCl (50 mM) por 3 horas para remover o imidazol residual.
   NOTA: SC16 é tipicamente detectado na fração de lavagem, enquanto H-GB1 é tipicamente enriquecido no eluato. Uma pequena quantidade de SC16 residual também pode estar presente no eluato.
9. Quantifique o SC16 por um método de escolha (por exemplo, análise de aminoácidos por cromatografia líquida de alta performance, ensaio de Bradford ou absorção a 280 nm). Com esse método, espera-se rendimento de ≥5 mg de SC16 por litro de cultura.
   NOTA: Nosso grupo quantifica rotineiramente SC16 por absorção a 280 nm usando um coeficiente de extinção previsto de 3480 M⁻¹ cm^{−1 32} Este é o método preferido de quantificação de SC16 devido à sua simplicidade.
10. Colete amostras durante a purificação para análise SDS-PAGE.

3. Ensaio de Fluorescência Terminal da Auto-Montagem SC16

1. Prepare misturas de reação triplicadas contendo 50 μg ^mL−1 de SC16, 50 mM de NaCl e 20 mM cada de ácido 2-(N-morfolino)etanolsulfônico (MES), Tris e fosfato de sódio. Prepare antecipadamente um tampão de estoque contendo MES, Tris e fosfato de sódio ajustados para pH final de 6,5 por adição gota a gota de HCl concentrado ou 1 M NaOH. Adicione proteína e NaCl imediatamente antes de começar o ensaio.
   NOTA: Os controles podem ser preparados nessa etapa. Por exemplo, inclua controles positivos contendo SC16 que não passam por rotação de ponta a ponta e controles negativos contendo apenas buffer. Concentrações de SC16 de 25–100 μg ^mL−1 foram testadas, com resultados mais consistentes em 50 μg ^mL−1. Otimize esse parâmetro conforme necessário.
2. Transfira as misturas para tubos de 2 a 5 mL.
   NOTA: Certifique-se de que o tubo da amostra esteja cheio a 50% da capacidade para permitir a mistura adequada na inversão.
3. Gire os tubos de ponta para frente a 20 rpm por 2 horas. Transfira 100 μL de cada amostra para uma placa preta opaca de fundo de 96 poços com poços redondos em estilo chaminé.
4. Adicione ThT filtrado a uma concentração final de 20 μM em todas as amostras.
5. Ajuste o leitor de microplacas para comprimentos de onda de excitação e emissão dentro da faixa apropriada para a fluorescência^ThT 33,34,35,36. Ajuste o ganho para 55 e o tempo de integração para 20 μs. Meça a intensidade de fluorescência de cada amostra imediatamente após o período de rotação de 2 h.
   NOTA: Os máximos de excitação e emissão relatados de ThT são 450 nm e 490^{nm 37}, respectivamente. Este experimento utilizou valores de excitação e emissão de 438 e 494 nm, respectivamente, baseados na disponibilidade do filtro óptico. A rotação de ponta a ponta era realizada usando um dispositivo de rotação fabricado.

4. Ensaio de Fluorescência Cinética da Auto-Montagem SC16

1. Prepare misturas de reação triplicadas de 100 μL em uma placa preta de 96 poços.
2. Inclua 50 μg mL⁻¹ SC16, 50 mM de NaCl, 20 μM de ThT filtrado e 20 mM de cada MES, Tris e fosfato de sódio. Prepare controles negativos contendo apenas ThT e buffer (sem SC16).
3. Ajuste o pH do tampão (contendo Tris, MES e fosfato de sódio) para 5,5, 6,5, 7,5 ou 8,5 usando HCl concentrado ou 1 M NaOH antes da adição de SC16 e ThT. O sistema de buffer misto permite ajuste do pH sem alterar a identidade do buffer.
4. Coloque a placa no leitor de microplacas.
5. Ajuste os comprimentos de onda de excitação e emissão dentro da faixa apropriada para a fluorescência^ThT 33,34,35,36.
6. Programe o leitor para medições cíclicas a cada 70 s.
7. Inclua 60 segundos de tremores orbitais a 432 rpm, seguidos por um período de descanso de 10 segundos por ciclo.
8. Ajuste o tempo de integração para 20 μs e ganho para 55.
9. Execute o ensaio por 120 ciclos para monitorar as mudanças de fluorescência em 2 horas de agitação.
   NOTA: Certifique-se de que a oscilação orbital seja selecionada; O sacudir linear pode resultar em resultados de auto-montagem inconsistentes ou subótimos.

Resultados

A Figura 1 apresenta um gel SDS-PAGE colorido com Coomassie monitorando a purificação do SC16. Os códigos representam marcador (M), antes da indução (B), após a indução (A), fração solúvel (S), fluxo contínuo (F), lavagem (W), eluado (E) e diálisis (D). No primeiro eluado IMAC, uma faixa com peso molecular estimado de ~18 kDa corresponde à proteína H-GB1-SC16 antes da clivagem da trombina. Após a clivagem com trombina, não há proteína na segunda fração de fluxo contínuo do IMAC, e uma faixa de ~10 kDa correspondente ao SC16 na lavagem. No segundo eluato IMAC, há algum resíduo de SC16 e uma proteína menor de ~8 kDa correspondente à H-GB1. O SC16 purificado foi então usado para ensaios de automontagem de pontos finais e cinéticos. Esses resultados confirmam a purificação bem-sucedida do SC16, indicada pela presença da faixa de peso molecular esperada e pela separação do parceiro de fusão H-GB1 após a clivagem da trombona.

Figura 1. Análise SDS-PAGE da purificação de SC16 para a primeira (antes da clivagem da trombona) e a segunda (após a clivagem da trombona) separações IMAC. Um marcador de peso molecular (M) é mostrado, juntamente com amostras coletadas antes da indução (B), após a indução (A), o sobrenadante de lise celular (S), o fluxo contínuo (F), o wash (W) e as frações eluadas (E), assim como a amostra dializada (D). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

O ensaio ThT no ponto final da auto-montagem do SC16 apresentado na Tabela 1 revela um aumento de 11 vezes na intensidade da fluorescência do ThT após 2 horas de rotação no banco em comparação com controles contendo proteínas que não foram rotacionados. Da mesma forma, não observamos mudança significativa na intensidade da fluorescência ao rodar as amostras tampão. Esse aumento na fluorescência de ThT após a agitação de SC16 representa a formação de folhas β semelhantes a amiloides, indicativas da auto-montagem de^{SC16 24,25}. Esses resultados demonstram que o ensaio baseado em fluorescência descrito monitora efetivamente a auto-montagem do SC16 sob as condições testadas.

Exemplo	Fluorescência ThT (Conta ± SD)
SC16 sem rotação	2679 ± 177
SC16 após a rotação	30315 ± 2141
Buffer após rotação	665 ± 888

Tabela 1. Medições de fluorescência ThT coletadas após a rotação ponta a ponta das amostras SC16. Amostras de SC16 (50 μg ^mL−1) foram incubadas sem agitação ou submetidas a rotação por 2 horas. ThT (20 μM) foi adicionado antes das medições de fluorescência. A fluorescência foi medida nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 438 e 494 nm, respectivamente, e é reportada como contagens brutas. Os valores são apresentados como média ± desvio padrão (DS).

O ensaio cinético de auto-montagem do SC16, quando agitado em tampões variados por várias horas, é apresentado na Figura 2. Curvas cinéticas típicas de auto-montagem em formato de S para fibrilação amiloide incluem períodos característicos de atraso, crescimento e platô³⁸. Para o SC16, não há período de atraso substancial observado durante as leituras iniciais, embora esse comportamento tenha sido documentado para outras hidrofobias, como EAS^21,23. As curvas de auto-montagem para cada pH são comparáveis, com fortes inclinações positivas correspondentes à formação de rodas. Após aproximadamente 20 minutos de agitação, a intensidade da fluorescência estabiliza e depois diminui lentamente. Em amostras controle que não possuem SC16, não há mudanças substanciais na fluorescência durante todo o experimento.

Figura 2. Curvas de auto-montagem do SC16 medidas usando um ensaio cinético de fluorescência ThT. O SC16 foi preparado a 50 μg ^mL−1 em um tampão multicomponente contendo 20 μM de ThT, 50 mM de NaCl, 20 mM fosfato de sódio, 20 mM de MES e 20 mM Tris. As medições foram feitas após 60 segundos de tremores orbitais e um período de repouso de 10 segundos. O eixo x representa o tempo de agitação (total de 2 horas). A fluorescência foi medida usando comprimentos de onda de excitação e emissão de 438 nm e 494 nm, respectivamente, e é reportada como contagens × 10⁻³. Barras de erro representam desvio padrão (n = 3). Os painéis correspondem a pH 5,5 (canto superior esquerdo), 6,5 (canto superior direito), 7,5 (canto inferior esquerdo) e 8,5 (canto inferior direito). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

A Figura 3 mostra um exemplo de resultados subótimos para o ensaio de auto-montagem cinética. Neste caso, o ensaio foi realizado conforme descrito na seção do protocolo, exceto usando uma configuração de tremor "linear" em vez da configuração de tremor "orbital".

Figura 3. Exemplo de dados de auto-montagem cinética subótimos do SC16 obtidos usando o ensaio cinético de fluorescência ThT. Neste caso, a agitação foi realizada usando uma configuração linear em vez da agitação orbital. As amostras foram preparadas conforme descrito para a Figura 2. As medições foram feitas após 60 segundos de tremores lineares e um período de repouso de 10 segundos. O eixo x representa o tempo de agitação (total de 2 horas). A fluorescência foi medida usando comprimentos de onda de excitação e emissão de 438 nm e 494 nm, respectivamente, e é reportada como contagens × 10⁻³. Barras de erro representam desvio padrão (n = 3). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

Aqui, resumimos protocolos para expressão e purificação da hidrofobina SC16, bem como para ensaios de fluorescência de baixa e alta capacidade de auto-montagem do SC16, cada um com vantagens e desvantagens distintas. Esses fluxos de trabalho podem ser aplicados a sistemas relacionados para monitorar a auto-montagem das proteínas. Neste protocolo, o calor é usado para lisar células antes da purificação por SC16, ao contrário da maioria dos protocolos que usam métodos mais tradicionais para lisar E. coli. Descobrimos que H-GB1-SC16 é solúvel e calorificamente estável até 80°C, e que a lise térmica serve como uma etapa inicial de limpeza da amostra, precipitando proteases não estáveis ao calor e outras proteínas contaminantes dentro do lisato^{celular 39}. No entanto, o SC16 representa um caso especial, pois as hidrofobinas são frequentemente expressas insoluvelmente em corpos^{de inclusão 12, 21, 40}. Quando expressas como corpos de inclusão, normalmente são necessárias condições de desnaturação, seguidas por redobragem usando os protocolos^{estabelecidos 21, 40 e 41}.

Neste protocolo, o SDS-PAGE é usado para avaliar a purificação do SC16 em cada etapa, incluindo a pastilha celular antes e depois da indução, a fração solúvel após a lise celular e todas as frações colunares subsequentes. Isso é ilustrado na Figura 1; no entanto, comparada ao H-GB1, a faixa correspondente ao SC16 é relativamente fraca. Descobrimos que, para muitas hidrofobinas, incluindo o SC16, alcançar uma coloração consistente e intensa com Coomassie é um desafio. O SC16 normalmente aparece como uma faixa de intensidade média quando o β-mercaptoetanol é usado como agente redutor (Figura 1). Em alguns casos, pode ser necessário tingimento de prata para visualizar as hidrofobicas com mais clareza.

Ensaios de fluorescência em ponto final e cinética podem ser usados para monitorar a auto-montagem do SC16. O ensaio ThT do ponto final é vantajoso porque fornece uma avaliação rápida e simples da auto-montagem. Além do aumento da fluorescência após 2 horas de rotação no topo da bancada, a automontagem frequentemente é acompanhada de uma opacidade branca visível no tubo de reação. Esse ensaio utiliza um rotador simples de bancada para mistura, que minimiza o desgaste dos componentes do leitor de microplacas. Em nossa experiência, esse ensaio é relativamente insensível a parâmetros instrumentais, como ajustes de agitação em um leitor de microplaca.

O ensaio cinético ThT fornece informações mais detalhadas sobre auto-montagem. Por exemplo, a auto-montagem do SC16 não depende significativamente das condições de^{tampão 24}, embora maior variação entre réplicas seja observada em valores de pH mais altos. No entanto, esse comportamento não é universal entre as hidrofobinas, e fatores como concentração de sal, pH 24,27,42 e aditivos (por exemplo, detergentes ou álcoois) são conhecidos por influenciar a auto-montagem da ^{hidrofobina 27,28}. Por exemplo, a hidrofobina SLH4 apresenta auto-montagem mais eficiente em baixa força iônica e baixo pH²⁴, enquanto a auto-montagem do HFBII foi relatada como independente do pH e da concentração^{de eletrólitos 42}, semelhante à SC16. Outros estudos correlacionaram os efeitos dos aditivos na formação de rodas com mudanças na tensão^{superficial 27,28}. Dadas essas diferenças, é importante considerar a composição do tampão e o pH de cada sistema e monitorar sua influência na curva de auto-montagem, incluindo fase de atraso, crescimento e regiões de platô.

Uma limitação importante é que o ensaio cinético ThT é altamente sensível aos parâmetros instrumentais do leitor de microplacas e pode variar entre os instrumentos. Por exemplo, uma diferença substancial na auto-montagem do SC16 é observada entre as configurações orbitais (movimento circular) e lineares (de frente e para trás) (Figura 2 e Figura 3, respectivamente). Embora os ensaios baseados em ThT forneçam um método eficaz para modelar a auto-montagem da hidrofobia, eles apresentam limitações inerentes devido à seletividade variável, o que pode levar a sinais falsos positivos ou falsos^{negativos 43}. Além disso, o espalhamento da luz proveniente de agregados de hidrofobina pode influenciar a intensidade de fluorescência^{medida 44}, reduzindo a precisão da medição. Diluição da amostra e redução do comprimento do caminho podem ajudar a mitigar esses efeitos.

Os protocolos resumidos aqui fornecem métodos eficazes para purificar e monitorar a auto-montagem do SC16. O ensaio final é simples e menos dependente da instrumentação, enquanto o ensaio cinético fornece informações detalhadas e resolvidas no tempo, embora com maior sensibilidade aos parâmetros instrumentais. Este protocolo apresenta uma abordagem simples para purificar o SC16 e pode ser aplicável a outras hidrofobinas devidamente dobradas expressas em E. coli. Embora os ensaios ThT descritos tenham limitações inerentes, eles fornecem informações acessíveis de automontagem dependentes do tempo em comparação com técnicas como AFM ou medições de ângulos de contato isoladas. Esses fluxos de trabalho podem ser adaptados para proteínas relacionadas e são particularmente relevantes para aplicações no desenvolvimento de biomateriais, entrega de fármacos e outras áreas onde entender a auto-montagem de proteínas é importante.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	145224-94-8	Componente de buffer para ensaios de automontagem
5 mL round bottom polystyrene tube	Falcon	352054	Usado para ensaios de automontagem de baixo rendimento
96-well black polystyrene microplate	Grenier	655076	Usado para medições de fluorescência em leitor de microplacas
Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) solution (40%)	BioShop	ACR004.500	Usado para preparar géis de SDS-PAGE
Agar	BioShop	AGR002.1	Ágar usado para fazer placas LB resistentes a ampicilina
Ampicillin	IBI Scientific	IB02040	Antibiótico usado em placas LB-ágar
Baffled 2.8 L Fernbach flasks	Fisher Scientific	955239	Usado para crescimento de cultura bacteriana em grande volume
β-mercaptoethanol	TCI Chemicals	60-24-2	Agente redutor usado na preparação de amostras para SDS-PAGE
Column (1.5 cm diameter gravity column)	Bio-Rad	7371522	Usado para purificação por afinidade com níquel
Dialysis tubing (3500 kDa MWCO)	BioDesign	D302	Usado para troca de buffer durante a purificação
Emission filter	Edmund Optics	84080	Usado para ensaios de ThT (494 nm, bandpass 20 nm)
Excitation filter	Edmund Optics	67012	Usado para ensaios de ThT (438 nm, bandpass 24 nm)
Fluorescence microplate reader	Tecan	Infinite F200 Pro	Usado para medir a intensidade de fluorescência ThT
Hotplate	Lab Fish	HS5C	Usado para configuração de banho de água com monitoramento de temperatura
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Chemical	A144-212	Usado para ajuste de pH dos buffers
Imidazole	TCI Chemicals	288-32-4	Usado na purificação IMAC (buffers de lavagem e eluição)
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	367-93-1	Induz expressão de proteína em E. coli
LB broth (Lennox)	BioShop	LBL405.5	Meio de crescimento para cultura bacteriana
Low-speed refrigerated centrifuge	Beckman Coulter	360291	Usado para peletagem de células antes do armazenamento
Nickel NTA agarose beads	GoldBio	H-350-50	Resina usada para purificação por afinidade de proteínas com tag His
SC16 plasmid	BioBasic	N/A	Construção de DNA personalizada codificando a proteína de fusão H-GB1-SC16
SHuffle T7 Express competent E. coli	New England Biolabs	C3029J	Cepa hospedeira usada para expressão de proteína recombinante
Sodium chloride (NaCl)	BioShop	SOD001.5	Componente de buffer e regulador de força iônica
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Chemical	SS255-1	Usado para ajuste de pH dos buffers
Sodium phosphate	BioShop	SPD579.1	Componente de buffer para manutenção do pH
Spectrophotometer	Pharmacia Biotech	5096	Usado para quantificação de SC16
Thioflavin T (ThT)	Acros Organics	2390-54-7	Corante fluorescente usado para monitorar automontagem de proteínas
Thrombin protease	Sigma-Aldrich	04-04-9002	Usado para clivagem da proteína de fusão H-GB1-SC16
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	BioShop	TRS001.5	Buffer usado em soluções de purificação e ensaio
High-speed refrigerated centrifuge	Sorvall	46915	Usado para esclarecimento do lisado após lise celular
SDS-PAGE setup	Bio-Rad	1658000EDU	Usado para preparar e executar géis de SDS-PAGE