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Artigo de investigação
* These authors contributed equally
A proteína 1 contendo domínios SAM e SH3 (SASH1) é identificada como um regulador chave da apoptose e inflamação de trofoblastos na pré-eclâmpsia (PE). Exossomos derivados da placenta (P-EXOS) atenuam lesões induzidas por hipóxia por meio da supressão da expressão de SASH1. Esses achados revelam um mecanismo inédito subjacente à patogênese da PE e sugerem SASH1 como um alvo terapêutico potencial.
A SASH1 é uma proteína adaptadora de sinal envolvida no crescimento celular, apoptose e regulação imune, e tem sido cada vez mais estudada em células tumorais e imunes. Evidências emergentes sugerem que a SASH1 desempenha um papel importante nas respostas inflamatórias e na homeostase celular, processos estreitamente associados ao desenvolvimento da PE. Este estudo teve como objetivo determinar se a SASH1 contribui para a apoptose de trofoblastos e respostas inflamatórias na PE e se os P-EXOS exercem efeitos protetores por meio da regulação da SASH1. Neste estudo, três conjuntos de dados transcriptômicos relacionados à PE (GSE75010, GSE10588 e GSE60438) foram analisados para identificar genes diferencialmente expressos (DEGs) comuns, seguidos por análises de enriquecimento da Ontologia Genética (GO) e da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG). Algoritmos de aprendizado de máquina foram aplicados para selecionar genes candidatos-chave, e dados de sequenciamento de RNA em única célula foram utilizados para caracterizar a heterogeneidade celular no tecido placentário e determinar padrões de expressão específicos de tipo celular. A SASH1 foi identificada como um gene candidato consenso e apresentou significativa superexpressão em células de trofoblasto de amostras de PE. In vitro, foi estabelecido um modelo celular de trofoblasto HTR-8/SVneo submetido à hipóxia, combinado com silenciamento da SASH1, superexpressão da SASH1 e co-cultivo com P-EXOS. Experimentos funcionais mostraram que o silenciamento da SASH1 suprimiu significativamente a apoptose de trofoblastos induzida pela hipóxia e reduziu a secreção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-6, IL-1β e TNF-α, enquanto a superexpressão da SASH1 promoveu apoptose e respostas inflamatórias. Além disso, o tratamento com P-EXOS reduziu marcadamente a expressão da SASH1 nos níveis de mRNA e proteína e atenuou a lesão de trofoblastos induzida pela hipóxia, enquanto a superexpressão da SASH1 anulou em grande parte esses efeitos protetores. Em conjunto, esses achados indicam que a SASH1 desempenha um papel fundamental na apoptose de trofoblastos e nas respostas inflamatórias na PE. Os P-EXOS podem aliviar a lesão trofoblástica induzida pela hipóxia por meio da supressão da expressão da SASH1, fornecendo novas perspectivas sobre os mecanismos moleculares e potenciais alvos terapêuticos para a PE.
A PE é uma desordem multissistêmica específica da gravidez que geralmente ocorre após 20 semanas de gestação e é clinicamente caracterizada por hipertensão, proteinúria e disfunção multissistêmica. Ela continua sendo uma das principais causas de morbidade e mortalidade materna e perinatal em todo o mundo1. Apesar dos avanços contínuos no manejo clínico, o tratamento definitivo para a PE ainda é a eliminação da placenta, o que ressalta a compreensão incompleta de sua patogênese e a necessidade urgente de identificar novos mecanismos moleculares e celulares, bem como potenciais alvos terapêuticos2,3.
A invasão adequada do trofoblasto e a promoção do desenvolvimento placentário normal são mecanismos críticos subjacentes à patogênese da PE4. Durante a gestação normal, as células trofoblásticas invadem a decídua uterina e remodelam as artérias espiraladas para estabelecer uma circulação de baixa resistência e alta capacidade. A invasão e migração prejudicadas das células trofoblásticas levam à redução da perfusão placentária, resultando em um ambiente persistente de estresse hipóxico e oxidativo. A hipóxia impacta diretamente a apoptose celular, e a liberação anômala de mediadores pró-inflamatórios rompe a homeostase na interface materno-fetal, agravando ainda mais a disfunção placentária5. A inflamação também é um importante fator desencadeador da PE. IL-17, IL-6 e TNF-α foram encontradas significativamente elevadas na placenta e no sangue periférico de pacientes com PE6. Hipóxia e inflamação se reforçam mutuamente, formando um ciclo vicioso que amplifica a inflamação sistêmica, causa danos endoteliais e contribui para anormalidades placentárias. As redes moleculares subjacentes que regulam a apoptose do trofoblasto e as respostas inflamatórias permanecem amplamente desconhecidas.
A SASH1 é um membro da família de proteínas-estrutura intracelulares SLy/SASH1 que atua como adaptadora de sinalização7. A SASH1 tem sido principalmente caracterizada como uma supressora tumoral que inibe a transição epitélio-mesenquimal (EMT), a migração celular e a invasão por meio de interações com parceiros de sinalização, como a CRKL e a via PI3K-Akt-mTOR8,9. Além de seus papéis supressores de tumor, evidências emergentes sugerem que a SASH1 participa da sinalização inflamatória e da regulação imunológica7. No entanto, a expressão e função da SASH1 na placenta, particularmente no contexto da biologia dos trofoblastos e da PE, ainda não foram investigadas.
Os exossomos surgiram como importantes mediadores celulares e estão sendo cada vez mais estudados no contexto da gravidez10. Os exossomos transportam diversos conteúdos bioativos, incluindo proteínas, lipídios e RNAs não codificantes, para modular a função das células receptoras. Evidências crescentes sugerem que os P-EXOS desempenham um papel crítico na regulação imunológica durante a gravidez e que sua atividade e conteúdo são significativamente alterados na PE, potencialmente intensificando o estado inflamatório11. Os exossomos também estão implicados na regulação do estresse oxidativo12 e na angiogênese13, podendo exercer efeitos benéficos em complicações relacionadas à gravidez. No entanto, seus alvos moleculares e mecanismos de ação na PE ainda não são completamente compreendidos.
Hipotetizou-se que a SASH1 está desregulada na placenta de PE e atua como um fator chave na indução da apoptose de trofoblastos e nas respostas inflamatórias, e que os P-EXOS podem exercer efeitos protetores contra lesão dos trofoblastos mediante a modulação da expressão da SASH1. Para testar essa hipótese, foram integrados múltiplos conjuntos de dados transcriptômicos de PE e utilizados dados de sequenciamento de RNA de célula única com aprendizado de máquina baseado em múltiplos algoritmos para identificar genes candidatos principais. Utilizando um modelo celular de trofoblasto HTR-8/SVneo tratado com hipóxia e experimentos de intervenção baseados em exossomos, investigou-se o papel funcional da SASH1 na disfunção dos trofoblastos e o potencial terapêutico dos P-EXOS na PE.
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Declaração de ética
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Quarto Hospital de Shijiazhuang (Número de Aprovação: 20200031). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os doadores de tecido placentário antes da coleta das amostras. Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados de acordo com a Declaração de Helsinque. Uma lista completa dos reagentes, consumíveis, equipamentos e softwares utilizados neste protocolo está fornecida na Tabela de Materiais.
Coleta de dados
Os dados de RNA-seq foram obtidos do banco de dados GEO. Os conjuntos de dados incluíram GSE75010, que contém dados de expressão gênica de 157 placentas com PE e 173 placentas sem PE (N = 330). GSE10588 contém dados de expressão gênica de 26 placentas normais e 17 placentas com PE grave (N = 43). GSE60438 contém dados de perfilamento do transcriptoma da decídua basal de pacientes com pré-eclâmpsia e gestações normotensas (N = 125). Dados de transcriptoma de célula única foram obtidos do conjunto de dados GEO GSE183338. Ele inclui amostras de núcleos únicos dos vilos coriônicos/da interface materno-fetal de gestações com PE e saudáveis.
Análise de DEGs
Os DEGs associados à PE foram pré-processados e normalizados a partir dos conjuntos de dados GSE75010, GSE10588 e GSE60438. Em seguida, foi realizada análise diferencial utilizando o pacote R “limma”14 com base nas informações de agrupamento das amostras. Foram selecionados genes com p < 0,05 e |log2FC| > 0,5. Os gráficos de vulcão dos DEGs foram gerados utilizando o pacote R ggplot2. Os mapas de calor dos 20 principais DEGs foram elaborados utilizando o pacote R pheatmap. Posteriormente, foi obtida a intersecção dos DEGs selecionados a partir dos três conjuntos de dados, e uma rede de interação proteína-proteína (PPI) foi construída para os genes candidatos utilizando a plataforma online STRING, com pontuação de interação ≥0,15. Os 20 principais genes centrais foram identificados nesta rede PPI com base em seu grau de conectividade, classificados utilizando o software Cytoscape. Os resultados da rede PPI foram visualizados utilizando o software Cytoscape ou o STRING.
Análise de enriquecimento
A análise de enriquecimento gênico foi realizada utilizando os pacotes ClusterProfiler e DOSE em combinação com o site Metascape. Os bancos de dados foram obtidos dos repositórios GO e KEGG. A análise de enriquecimento foi conduzida com a função “EnrichGO”. Rotas metabólicas com p < 0,05 foram consideradas significativamente enriquecidas. Os resultados do enriquecimento foram visualizados utilizando os pacotes “ggplot2” e “ggpubr”.
Aprendizado de máquina
Para identificar DEGs robustos e biologicamente significativos associados à PE, foi realizada uma análise de seleção de características por aprendizado de máquina com múltiplos modelos com base no conjunto de dados de transcriptoma publicamente disponível GSE60438 (plataforma: GPL6884). Este conjunto de dados contém o perfil de expressão de amostras de decídua basal coletadas de gestações com pré-eclâmpsia e gestações normotensas durante cesariana. Os DEGs pré-filtrados foram padronizados, e a matriz de expressão, juntamente com as informações correspondentes de agrupamento clínico, foi utilizada como entrada para quatro algoritmos distintos de aprendizado de máquina, com o objetivo de reduzir o viés do modelo e aumentar a estabilidade da seleção de características.
Os quatro algoritmos foram aplicados simultaneamente, sem uma ordem específica. O LASSO foi realizado utilizando o pacote “glmnet” para conduzir análise de regressão e selecionar genes importantes. Um termo de regularização L1 foi adicionado à função de perda, o qual reduz os coeficientes das características menos importantes a zero, alcançando assim a seleção de características. O SVM-RFE foi implementado utilizando o pacote “e1071” para construir uma máquina de vetores de suporte com eliminação recursiva de características. Um classificador foi inicialmente treinado usando SVM, e as características menos informativas foram removidas iterativamente com base nos pesos das características, resultando em um subconjunto ótimo de características. O XGBoost foi aplicado utilizando o pacote “xgboost” para construir múltiplas árvores de decisão. Cada árvore ajustava os resíduos da árvore anterior, e as saídas ponderadas foram acumuladas para obter a predição final. O Boruta foi realizado utilizando o pacote “randomForest”, gerando características sombra que competiram com as características reais no treinamento de uma floresta aleatória. Características cujos valores de importância foram significativamente superiores ao ruído aleatório foram mantidas.
Análise de dados de transcriptoma de célula única
Os dados do transcriptoma de célula única foram obtidos do banco de dados GEO, e a matriz de contagem bruta foi recuperada de GSE183338. A matriz de contagem foi importada usando a função “Read10X” do pacote Seurat e convertida para o formato dgCMatrix. Objetos individuais foram mesclados em um único objeto agregado usando a função “merge”, e os rótulos das células foram tornados únicos usando “RenameCells”. Células de baixa qualidade foram filtradas com base nos seguintes critérios: genes expressos em menos de três células foram removidos, e células que expressavam menos de 200 genes foram excluídas. As células com controle de qualidade foram normalizadas e os genes altamente variáveis foram identificados. A normalização por escalonamento global foi aplicada usando “LogNormalize” (fator de escala = 10.000), genes altamente variáveis (n = 2.000) foram selecionados usando “FindVariableFeatures” e os dados foram escalonados usando “ScaleData”. A análise de componentes principais foi realizada nas características altamente variáveis, e as 30 principais componentes principais foram mantidas. Os efeitos de lote entre amostras foram corrigidos usando o método Harmony. As células foram visualizadas e reduzidas dimensionalmente usando UMAP. Grafos de vizinhos mais próximos compartilhados foram construídos usando “FindNeighbors” e “FindClusters” com base no algoritmo Louvain. O parâmetro de resolução em “FindClusters” foi otimizado entre 0,1 e 1. A árvore de agrupamento foi visualizada usando a função “clustree”, e uma resolução de 0,9 foi selecionada para definir os agrupamentos celulares. Dupletos potenciais foram removidos usando o algoritmo Scrublet. Os agrupamentos celulares foram anotados identificando genes marcadores diferencialmente expressos usando a função “FindAllMarkers”. O teste não paramétrico de soma de postos de Wilcoxon foi aplicado com correção de Bonferroni. As identidades celulares foram atribuídas com base em marcadores de superfície, literatura relevante e o Cell Classification Database15.
Cultura celular
As células da linhagem de trofoblasto HTR-8/SVneo foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina/estreptomicina. As condições hipóxicas foram estabelecidas cultivando as células a 1% de O₂, 5% de CO₂ e 94% de N₂ durante 24 h; os controles normóxicos foram mantidos a 20% de O₂ e 5% de CO₂16. Todos os procedimentos de cultura celular devem ser realizados em uma cabine de segurança biológica Classe II utilizando técnica asséptica. Os meios de cultura, reagentes de transfeção e resíduos celulares devem ser descartados de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança.
Transfeção de células
Plasmídeos contendo sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 e OE-NC foram sintetizados. Células HTR-8/SVneo foram semeadas numa densidade de 5 × 105 células por poço em placas de seis poços. Posteriormente, as células foram transfectadas com 2 µg do plasmídeo sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 ou OE-NC por poço, utilizando um reagente de transfeção de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, o DNA plasmidial e o Reagente P3000 foram diluídos em Opti-MEM, misturados com Lipofectamina 3000 diluída separadamente em Opti-MEM, incubados por 15 minutos à temperatura ambiente e adicionados às células com confluência de 70–80%. Quarenta e oito horas após a transfeção, a expressão de SASH1 foi avaliada por RT-qPCR e Western blot. As sequências-alvo do shRNA utilizadas para o silenciamento de SASH1 estão listadas na Supplementary Table 1.
PCR quantitativa em tempo real
O RNA total foi extraído de células HTR-8/SVneo e transcrito reversamente em cDNA utilizando um kit de transcrição reversa a 42 °C por 30 min, seguido de 85 °C por 5 min. A PCR quantitativa em tempo real (qPCR) foi realizada utilizando mix mestre SYBR Green com as seguintes condições de ciclagem: 95 °C por 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 °C por 15 s e 60 °C por 1 min. A expressão relativa de mRNA foi calculada utilizando o método ΔΔCt, com β-actina como referência interna. As sequências dos primers utilizadas neste experimento estão listadas na Tabela Suplementar 2.
Ensaio de Western blot
As proteínas totais foram extraídas de células HTR-8/SVneo utilizando o tampão de lise. Os lisados celulares foram coletados, incubados em gelo e centrifugados a 12.000 × g durante 30 min a 4 °C para remoção de detritos insolúveis. A concentração proteica foi determinada utilizando um espectrofotômetro. Quantidades iguais de proteína (50 µg) foram separadas por eletroforese em gel de SDS-PAGE e posteriormente transferidas para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% e incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 °C. Após lavagem, as membranas foram incubadas com os anticorpos secundários correspondentes e as bandas proteicas foram visualizadas utilizando um sistema de detecção por quimioluminescência aprimorada.
Para a detecção de proteínas, os anticorpos primários incluíram anti-SASH1 e β-actina. Foram empregados anticorpos secundários conjugados à peroxidase do rabo-de-cavalo (HRP) apropriados — anti-coelho e anti-rato de origem caprina. A β-actina foi utilizada como controle interno de carregamento para garantir quantidade igual de proteína. A intensidade das bandas proteicas foi medida e quantificada utilizando o software ImageJ.
Isolamento de P-EXOS
P-EXOS foram isolados de tecido viloso placentário obtido de placentas a termo de mulheres saudáveis submetidas a cesariana eletiva. O tecido viloso placentário foi lavado cuidadosamente com PBS estéril, picado em fragmentos de aproximadamente 1 mm3 fragmentos, e cultivados em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS livre de exossomos a 37 °C em 5% CO₂2 por 48 h. O meio condicionado foi submetido à centrifugação diferencial da seguinte forma: 300 × g por 10 min para remover células e debris tecidual; 2.000 × g por 20 min para remover debris celular; e 10.000 × g por 30 min para remover microvesículas, tudo a 4 °C. O sobrenadante resultante foi ultracentrifugado a 120.000 × g por 70 min a 4 °C para pelotizar exossomos. O pellet foi lavado uma vez com PBS e submetido novamente à ultracentrifugação a 120.000 × g por 70 min a 4 °C. O pellet final foi ressuspenso em PBS. Os exossomos isolados foram caracterizados por análise de Western blot para marcadores de exossomos (PLAP, CD63 e TSG101, com GM130 como controle negativo) e posteriormente examinados por microscopia eletrônica de transmissão para observação morfológica.
Experimento de Captação Celular de P-EXOS
Para confirmar a internalização celular de P-EXOS, os exossomos foram marcados fluorescentemente com o corante lipofílico de membrana PKH67 de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, os P-EXOS foram incubados com PKH67 (4 µM) em Diluente C durante 5 min a temperatura ambiente, e a reação foi interrompida com um volume igual de albumina sérica bovina (BSA) a 1%. Os exossomos marcados foram reisolados por ultracentrifugação (120.000 × g, 70 min, 4 °C) para remover o corante não ligado. Os P-EXOS marcados com PKH67 (50 µg/mL) foram então adicionados às células HTR-8/SVneo e co-incubados por 24 h sob condições normóxicas ou hipóxicas (1% O₂). As células foram subsequentemente lavadas três vezes com PBS, fixadas com paraformaldeído a 4% por 15 min e os núcleos foram contra-estainados com DAPI (1 µg/mL). A internalização dos exossomos marcados com PKH67 foi visualizada por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM; excitação 490 nm, emissão 502 nm). Para experimentos funcionais de co-cultivo, as células HTR-8/SVneo foram tratadas com P-EXOS numa concentração de 50 µg/mL (equivalente em proteína) em meio RPMI-1640 completo suplementado com 10% de FBS livre de exossomos sob condições hipóxicas (1% O₂) por 24 h.
Ensaio imunoenzimático (ELISA)
Os sobrenadantes de cultivo celular foram coletados e os níveis de IL-6, IL-1β e TNF-α foram medidos utilizando o kit de ELISA para IL-6, kit de ELISA para IL-1β e kit de ELISA para TNF-α, respectivamente, de acordo com as instruções dos fabricantes. A absorbância em 450 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas, e as concentrações reais foram calculadas a partir das curvas-padrão.
Rotulagem de extremidades de quebra por dUTP mediada por TdT (TUNEL)
As células apoptóticas foram detectadas utilizando o kit de ensaio TUNEL de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 15 minutos à temperatura ambiente, permeabilizadas com Triton X-100 a 0,1% em PBS por 5 minutos em gelo e incubadas com a mistura de reação TUNEL por 60 minutos a 37 °C no escuro. Os núcleos foram contra-coloridos com DAPI, e as células positivas para TUNEL foram visualizadas usando um microscópio de fluorescência e quantificadas pela contagem da porcentagem de células positivas para TUNEL em pelo menos cinco campos selecionados aleatoriamente por amostra.
Análise estatística
Todos os dados foram analisados usando R e GraphPad Prism. As variáveis contínuas são apresentadas como média ±DP. Comparações entre dois grupos foram realizadas utilizando o teste t de Student, enquanto comparações entre múltiplos grupos foram conduzidas utilizando ANOVA unidirecional seguida pelo teste post hoc de Tukey. A significância estatística para variáveis categóricas foi avaliada pelo teste qui-quadrado ou pelo teste exato de Fisher. Salvo indicação em contrário, as correlações entre moléculas foram calculadas utilizando análise de correlação de Spearman. Os experimentos de caracterização de exossomos foram realizados usando P-EXOS isolados de três doadores placentários independentes. Os experimentos com células foram realizados em três réplicas biológicas independentes, representando experimentos independentes conduzidos em ocasiões distintas com células HTR-8/SVneo de diferentes passagens, sendo que cada réplica utilizou P-EXOS isolados de um doador placentário diferente. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
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Análise transcriptômica de pacientes saudáveis e com PE
Para identificar as diferenças de expressão gênica entre o grupo normal (Normal) e pacientes com PE, a expressão diferencial nos conjuntos de dados combinados foi analisada utilizando o pacote R limma. Um total de 89 genes diferencialmente expressos (GDEs) foi identificado (p < 0,05 e |log2FC| > 0,5), sendo 69 genes superexpressos e 20 genes subexpressos para o conjunto GSE75010 (
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Neste estudo, SASH1 foi identificado como um gene-chave desregulado na PE por meio de análise transcriptômica integrada, sequenciamento de célula única e aprendizado de máquina com múltiplos algoritmos, uma abordagem particularmente relevante dado que terapias direcionadas para a PE ainda não estão disponíveis17. Demonstrou-se que SASH1 está significativamente superexpresso em células trofoblásticas hipóxicas e especificamente elevado no compartimento trofoblástico de placentas com PE, com resoluç...
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Não há conflito de interesses neste estudo.
Este estudo foi financiado pelo Programa-Chave de Pesquisa Científica em Ciências Médicas da Comissão de Saúde da Província de Hebei, China (n.º 20210075).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Meio RPMI-1640 | Gibco | 11875085 | |
| Soro bovino fetal (FBS) | Gibco | 16140071 | |
| FBS livre de exossomos | System Biosciences | EXO-FBS-50A-1 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Thermo Fisher Scientific, CN | 15140122 | |
| Reagente de transfeção Lipofectamine 3000 (com Reagente P3000) | Thermo Fisher Scientific, CN | L3000150 | |
| Meio reduzido de soro Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific, CN | 31985070 | |
| Plasmídeo de shRNA para SASH1 (HuSH) | origene | TL301836 | |
| Plasmídeo de expressão de ORF de SASH1 | origene | RC218866 | |
| Controle de vetor vazio | origene | PS100001 | |
| Kit de transcrição reversa | Thermo Fisher Scientific, CN | 4368814 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific, CN | A46110 | |
| Primeres para SASH1 | Sangon Biotech | Sintetizados sob encomenda | |
| β-actina primeres | Sangon Biotech | Sintetizados sob encomenda | |
| Tampão de lise celular | Beyotime | P0013B | |
| Espectrofotômetro NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, CN | NanoDrop Ultra | |
| Membrana PVDF | Thermo Fisher Scientific, CN | 88518 | |
| Anticorpo anti-SASH1 | ABclonal | A15248 | |
| Anticorpo anti-β-actina | Abcam | ab6276 | |
| Anticorpo secundário conjugado com HRP, anti-coelho/anti-rato de cabra | Beyotime | A0208 | |
| Software ImageJ | NIH (domínio público) | ImageJ | |
| Kit PKH67 Green Fluorescent Cell Linker (incluindo Diluente C) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | MINI67 | |
| Albumina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | 10711454001 | |
| DAPI | Beyotime | C1002 | |
| Microscópio confocal a laser de varredura (CLSM) | Leica | Leica TCS SP8 | |
| Kit ELISA Quantikine para IL-6 humana | R&D Systems | D6050B | |
| Kit ELISA DuoSet para IL-1β/IL-1F2 humana | R&D Systems | DY201 | |
| Kit ELISA Quantikine para TNF-α humana | R&D Systems | DTA00D | |
| Leitor de microplacas | Thermo Scientific | Multiskan FC | |
| Kit de detecção de morte celular in situ (Kit de ensaio TUNEL) | Roche | 11684795910 | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096 | |
| Paraformaldeído (4%) | Beyotime | P0099 | |
| Microscópio de fluorescência | Olympus | BX53 | |
| Centrífuga refrigerada (capacidade de 12.000 × g) | Eppendorf | Eppendorf 5430 R | |
| Ultracentrífuga (capacidade de 120.000 × g) | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| Software R | The R Foundation | v4.2.1 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v10.0 | |
| Seurat (pacote R) | Satija Lab (código aberto) | v4.0.4 | |
| Harmony (pacote R, correção de lote) | Código aberto | v1.2.0 | |
| Scrublet (pacote Python, detecção de dupletos) | Código aberto | v0.2.3 | |
| clustree (pacote R) | Código aberto | v0.5.1 | |
| glmnet (pacote R, LASSO) | Código aberto | v4.1.8 | |
| e1071 (pacote R, SVM-RFE) | Código aberto | v1.7-14 | |
| xgboost (pacote R) | Código aberto | v1.7.7.1 | |
| randomForest (pacote R, Boruta) | Código aberto | v4.7-1.1 | |
| Banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO) | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | |
| Banco de dados STRING | string-db.org | https://www.string-db.org/ | |
| Metascape | metascape.org | https://metascape.org/ | |
| Software Cytoscape | Consortium Cytoscape | v3.10.4 | |
| ggplot2 (pacote R) | Código aberto | v3.5.1 | |
| limma (pacote R) | Código aberto | v3.58.1 | |
| pheatmap (pacote R) | Código aberto | v1.0.12 | |
| ClusterProfiler (pacote R) | Código aberto | v4.8.3 | |
| DOSE (pacote R) | Código aberto | v3.28.2 | |
| ggpubr (pacote R) | Código aberto | v0.6.0 |
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