A proteína 1 contendo domínios SAM e SH3 (SASH1) é identificada como um regulador chave da apoptose e inflamação de trofoblastos na pré-eclâmpsia (PE). Exossomos derivados da placenta (P-EXOS) atenuam lesões induzidas por hipóxia por meio da supressão da expressão de SASH1. Esses achados revelam um mecanismo inédito subjacente à patogênese da PE e sugerem SASH1 como um alvo terapêutico potencial.
Artigo de investigação
Exossomos derivados da placenta mitigam a apoptose de trofoblastos induzida por hipóxia e a progressão inflamatória via SASH1
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A SASH1 é uma proteína adaptadora de sinal envolvida no crescimento celular, apoptose e regulação imune, e tem sido cada vez mais estudada em células tumorais e imunes. Evidências emergentes sugerem que a SASH1 desempenha um papel importante nas respostas inflamatórias e na homeostase celular, processos estreitamente associados ao desenvolvimento da PE. Este estudo teve como objetivo determinar se a SASH1 contribui para a apoptose de trofoblastos e respostas inflamatórias na PE e se os P-EXOS exercem efeitos protetores por meio da regulação da SASH1. Neste estudo, três conjuntos de dados transcriptômicos relacionados à PE (GSE75010, GSE10588 e GSE60438) foram analisados para identificar genes diferencialmente expressos (DEGs) comuns, seguidos por análises de enriquecimento da Ontologia Genética (GO) e da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG). Algoritmos de aprendizado de máquina foram aplicados para selecionar genes candidatos-chave, e dados de sequenciamento de RNA em única célula foram utilizados para caracterizar a heterogeneidade celular no tecido placentário e determinar padrões de expressão específicos de tipo celular. A SASH1 foi identificada como um gene candidato consenso e apresentou significativa superexpressão em células de trofoblasto de amostras de PE. In vitro, foi estabelecido um modelo celular de trofoblasto HTR-8/SVneo submetido à hipóxia, combinado com silenciamento da SASH1, superexpressão da SASH1 e co-cultivo com P-EXOS. Experimentos funcionais mostraram que o silenciamento da SASH1 suprimiu significativamente a apoptose de trofoblastos induzida pela hipóxia e reduziu a secreção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-6, IL-1β e TNF-α, enquanto a superexpressão da SASH1 promoveu apoptose e respostas inflamatórias. Além disso, o tratamento com P-EXOS reduziu marcadamente a expressão da SASH1 nos níveis de mRNA e proteína e atenuou a lesão de trofoblastos induzida pela hipóxia, enquanto a superexpressão da SASH1 anulou em grande parte esses efeitos protetores. Em conjunto, esses achados indicam que a SASH1 desempenha um papel fundamental na apoptose de trofoblastos e nas respostas inflamatórias na PE. Os P-EXOS podem aliviar a lesão trofoblástica induzida pela hipóxia por meio da supressão da expressão da SASH1, fornecendo novas perspectivas sobre os mecanismos moleculares e potenciais alvos terapêuticos para a PE.
Introdução
A PE é uma desordem multissistêmica específica da gravidez que geralmente ocorre após 20 semanas de gestação e é clinicamente caracterizada por hipertensão, proteinúria e disfunção multissistêmica. Ela continua sendo uma das principais causas de morbidade e mortalidade materna e perinatal em todo o mundo1. Apesar dos avanços contínuos no manejo clínico, o tratamento definitivo para a PE ainda é a eliminação da placenta, o que ressalta a compreensão incompleta de sua patogênese e a necessidade urgente de identificar novos mecanismos moleculares e celulares, bem como potenciais alvos terapêuticos2,3.
A invasão adequada do trofoblasto e a promoção do desenvolvimento placentário normal são mecanismos críticos subjacentes à patogênese da PE4. Durante a gestação normal, as células trofoblásticas invadem a decídua uterina e remodelam as artérias espiraladas para estabelecer uma circulação de baixa resistência e alta capacidade. A invasão e migração prejudicadas das células trofoblásticas levam à redução da perfusão placentária, resultando em um ambiente persistente de estresse hipóxico e oxidativo. A hipóxia impacta diretamente a apoptose celular, e a liberação anômala de mediadores pró-inflamatórios rompe a homeostase na interface materno-fetal, agravando ainda mais a disfunção placentária5. A inflamação também é um importante fator desencadeador da PE. IL-17, IL-6 e TNF-α foram encontradas significativamente elevadas na placenta e no sangue periférico de pacientes com PE6. Hipóxia e inflamação se reforçam mutuamente, formando um ciclo vicioso que amplifica a inflamação sistêmica, causa danos endoteliais e contribui para anormalidades placentárias. As redes moleculares subjacentes que regulam a apoptose do trofoblasto e as respostas inflamatórias permanecem amplamente desconhecidas.
A SASH1 é um membro da família de proteínas-estrutura intracelulares SLy/SASH1 que atua como adaptadora de sinalização7. A SASH1 tem sido principalmente caracterizada como uma supressora tumoral que inibe a transição epitélio-mesenquimal (EMT), a migração celular e a invasão por meio de interações com parceiros de sinalização, como a CRKL e a via PI3K-Akt-mTOR8,9. Além de seus papéis supressores de tumor, evidências emergentes sugerem que a SASH1 participa da sinalização inflamatória e da regulação imunológica7. No entanto, a expressão e função da SASH1 na placenta, particularmente no contexto da biologia dos trofoblastos e da PE, ainda não foram investigadas.
Os exossomos surgiram como importantes mediadores celulares e estão sendo cada vez mais estudados no contexto da gravidez10. Os exossomos transportam diversos conteúdos bioativos, incluindo proteínas, lipídios e RNAs não codificantes, para modular a função das células receptoras. Evidências crescentes sugerem que os P-EXOS desempenham um papel crítico na regulação imunológica durante a gravidez e que sua atividade e conteúdo são significativamente alterados na PE, potencialmente intensificando o estado inflamatório11. Os exossomos também estão implicados na regulação do estresse oxidativo12 e na angiogênese13, podendo exercer efeitos benéficos em complicações relacionadas à gravidez. No entanto, seus alvos moleculares e mecanismos de ação na PE ainda não são completamente compreendidos.
Hipotetizou-se que a SASH1 está desregulada na placenta de PE e atua como um fator chave na indução da apoptose de trofoblastos e nas respostas inflamatórias, e que os P-EXOS podem exercer efeitos protetores contra lesão dos trofoblastos mediante a modulação da expressão da SASH1. Para testar essa hipótese, foram integrados múltiplos conjuntos de dados transcriptômicos de PE e utilizados dados de sequenciamento de RNA de célula única com aprendizado de máquina baseado em múltiplos algoritmos para identificar genes candidatos principais. Utilizando um modelo celular de trofoblasto HTR-8/SVneo tratado com hipóxia e experimentos de intervenção baseados em exossomos, investigou-se o papel funcional da SASH1 na disfunção dos trofoblastos e o potencial terapêutico dos P-EXOS na PE.
Protocolo
Declaração de ética
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Quarto Hospital de Shijiazhuang (Número de Aprovação: 20200031). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os doadores de tecido placentário antes da coleta das amostras. Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados de acordo com a Declaração de Helsinque. Uma lista completa dos reagentes, consumíveis, equipamentos e softwares utilizados neste protocolo está fornecida na Tabela de Materiais.
Coleta de dados
Os dados de RNA-seq foram obtidos do banco de dados GEO. Os conjuntos de dados incluíram GSE75010, que contém dados de expressão gênica de 157 placentas com PE e 173 placentas sem PE (N = 330). GSE10588 contém dados de expressão gênica de 26 placentas normais e 17 placentas com PE grave (N = 43). GSE60438 contém dados de perfilamento do transcriptoma da decídua basal de pacientes com pré-eclâmpsia e gestações normotensas (N = 125). Dados de transcriptoma de célula única foram obtidos do conjunto de dados GEO GSE183338. Ele inclui amostras de núcleos únicos dos vilos coriônicos/da interface materno-fetal de gestações com PE e saudáveis.
Análise de DEGs
Os DEGs associados à PE foram pré-processados e normalizados a partir dos conjuntos de dados GSE75010, GSE10588 e GSE60438. Em seguida, foi realizada análise diferencial utilizando o pacote R “limma”14 com base nas informações de agrupamento das amostras. Foram selecionados genes com p < 0,05 e |log2FC| > 0,5. Os gráficos de vulcão dos DEGs foram gerados utilizando o pacote R ggplot2. Os mapas de calor dos 20 principais DEGs foram elaborados utilizando o pacote R pheatmap. Posteriormente, foi obtida a intersecção dos DEGs selecionados a partir dos três conjuntos de dados, e uma rede de interação proteína-proteína (PPI) foi construída para os genes candidatos utilizando a plataforma online STRING, com pontuação de interação ≥0,15. Os 20 principais genes centrais foram identificados nesta rede PPI com base em seu grau de conectividade, classificados utilizando o software Cytoscape. Os resultados da rede PPI foram visualizados utilizando o software Cytoscape ou o STRING.
Análise de enriquecimento
A análise de enriquecimento gênico foi realizada utilizando os pacotes ClusterProfiler e DOSE em combinação com o site Metascape. Os bancos de dados foram obtidos dos repositórios GO e KEGG. A análise de enriquecimento foi conduzida com a função “EnrichGO”. Rotas metabólicas com p < 0,05 foram consideradas significativamente enriquecidas. Os resultados do enriquecimento foram visualizados utilizando os pacotes “ggplot2” e “ggpubr”.
Aprendizado de máquina
Para identificar DEGs robustos e biologicamente significativos associados à PE, foi realizada uma análise de seleção de características por aprendizado de máquina com múltiplos modelos com base no conjunto de dados de transcriptoma publicamente disponível GSE60438 (plataforma: GPL6884). Este conjunto de dados contém o perfil de expressão de amostras de decídua basal coletadas de gestações com pré-eclâmpsia e gestações normotensas durante cesariana. Os DEGs pré-filtrados foram padronizados, e a matriz de expressão, juntamente com as informações correspondentes de agrupamento clínico, foi utilizada como entrada para quatro algoritmos distintos de aprendizado de máquina, com o objetivo de reduzir o viés do modelo e aumentar a estabilidade da seleção de características.
Os quatro algoritmos foram aplicados simultaneamente, sem uma ordem específica. O LASSO foi realizado utilizando o pacote “glmnet” para conduzir análise de regressão e selecionar genes importantes. Um termo de regularização L1 foi adicionado à função de perda, o qual reduz os coeficientes das características menos importantes a zero, alcançando assim a seleção de características. O SVM-RFE foi implementado utilizando o pacote “e1071” para construir uma máquina de vetores de suporte com eliminação recursiva de características. Um classificador foi inicialmente treinado usando SVM, e as características menos informativas foram removidas iterativamente com base nos pesos das características, resultando em um subconjunto ótimo de características. O XGBoost foi aplicado utilizando o pacote “xgboost” para construir múltiplas árvores de decisão. Cada árvore ajustava os resíduos da árvore anterior, e as saídas ponderadas foram acumuladas para obter a predição final. O Boruta foi realizado utilizando o pacote “randomForest”, gerando características sombra que competiram com as características reais no treinamento de uma floresta aleatória. Características cujos valores de importância foram significativamente superiores ao ruído aleatório foram mantidas.
Análise de dados de transcriptoma de célula única
Os dados do transcriptoma de célula única foram obtidos do banco de dados GEO, e a matriz de contagem bruta foi recuperada de GSE183338. A matriz de contagem foi importada usando a função “Read10X” do pacote Seurat e convertida para o formato dgCMatrix. Objetos individuais foram mesclados em um único objeto agregado usando a função “merge”, e os rótulos das células foram tornados únicos usando “RenameCells”. Células de baixa qualidade foram filtradas com base nos seguintes critérios: genes expressos em menos de três células foram removidos, e células que expressavam menos de 200 genes foram excluídas. As células com controle de qualidade foram normalizadas e os genes altamente variáveis foram identificados. A normalização por escalonamento global foi aplicada usando “LogNormalize” (fator de escala = 10.000), genes altamente variáveis (n = 2.000) foram selecionados usando “FindVariableFeatures” e os dados foram escalonados usando “ScaleData”. A análise de componentes principais foi realizada nas características altamente variáveis, e as 30 principais componentes principais foram mantidas. Os efeitos de lote entre amostras foram corrigidos usando o método Harmony. As células foram visualizadas e reduzidas dimensionalmente usando UMAP. Grafos de vizinhos mais próximos compartilhados foram construídos usando “FindNeighbors” e “FindClusters” com base no algoritmo Louvain. O parâmetro de resolução em “FindClusters” foi otimizado entre 0,1 e 1. A árvore de agrupamento foi visualizada usando a função “clustree”, e uma resolução de 0,9 foi selecionada para definir os agrupamentos celulares. Dupletos potenciais foram removidos usando o algoritmo Scrublet. Os agrupamentos celulares foram anotados identificando genes marcadores diferencialmente expressos usando a função “FindAllMarkers”. O teste não paramétrico de soma de postos de Wilcoxon foi aplicado com correção de Bonferroni. As identidades celulares foram atribuídas com base em marcadores de superfície, literatura relevante e o Cell Classification Database15.
Cultura celular
As células da linhagem de trofoblasto HTR-8/SVneo foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina/estreptomicina. As condições hipóxicas foram estabelecidas cultivando as células a 1% de O₂, 5% de CO₂ e 94% de N₂ durante 24 h; os controles normóxicos foram mantidos a 20% de O₂ e 5% de CO₂16. Todos os procedimentos de cultura celular devem ser realizados em uma cabine de segurança biológica Classe II utilizando técnica asséptica. Os meios de cultura, reagentes de transfeção e resíduos celulares devem ser descartados de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança.
Transfeção de células
Plasmídeos contendo sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 e OE-NC foram sintetizados. Células HTR-8/SVneo foram semeadas numa densidade de 5 × 105 células por poço em placas de seis poços. Posteriormente, as células foram transfectadas com 2 µg do plasmídeo sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 ou OE-NC por poço, utilizando um reagente de transfeção de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, o DNA plasmidial e o Reagente P3000 foram diluídos em Opti-MEM, misturados com Lipofectamina 3000 diluída separadamente em Opti-MEM, incubados por 15 minutos à temperatura ambiente e adicionados às células com confluência de 70–80%. Quarenta e oito horas após a transfeção, a expressão de SASH1 foi avaliada por RT-qPCR e Western blot. As sequências-alvo do shRNA utilizadas para o silenciamento de SASH1 estão listadas na Supplementary Table 1.
PCR quantitativa em tempo real
O RNA total foi extraído de células HTR-8/SVneo e transcrito reversamente em cDNA utilizando um kit de transcrição reversa a 42 °C por 30 min, seguido de 85 °C por 5 min. A PCR quantitativa em tempo real (qPCR) foi realizada utilizando mix mestre SYBR Green com as seguintes condições de ciclagem: 95 °C por 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 °C por 15 s e 60 °C por 1 min. A expressão relativa de mRNA foi calculada utilizando o método ΔΔCt, com β-actina como referência interna. As sequências dos primers utilizadas neste experimento estão listadas na Tabela Suplementar 2.
Ensaio de Western blot
As proteínas totais foram extraídas de células HTR-8/SVneo utilizando o tampão de lise. Os lisados celulares foram coletados, incubados em gelo e centrifugados a 12.000 × g durante 30 min a 4 °C para remoção de detritos insolúveis. A concentração proteica foi determinada utilizando um espectrofotômetro. Quantidades iguais de proteína (50 µg) foram separadas por eletroforese em gel de SDS-PAGE e posteriormente transferidas para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% e incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 °C. Após lavagem, as membranas foram incubadas com os anticorpos secundários correspondentes e as bandas proteicas foram visualizadas utilizando um sistema de detecção por quimioluminescência aprimorada.
Para a detecção de proteínas, os anticorpos primários incluíram anti-SASH1 e β-actina. Foram empregados anticorpos secundários conjugados à peroxidase do rabo-de-cavalo (HRP) apropriados — anti-coelho e anti-rato de origem caprina. A β-actina foi utilizada como controle interno de carregamento para garantir quantidade igual de proteína. A intensidade das bandas proteicas foi medida e quantificada utilizando o software ImageJ.
Isolamento de P-EXOS
P-EXOS foram isolados de tecido viloso placentário obtido de placentas a termo de mulheres saudáveis submetidas a cesariana eletiva. O tecido viloso placentário foi lavado cuidadosamente com PBS estéril, picado em fragmentos de aproximadamente 1 mm3 fragmentos, e cultivados em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS livre de exossomos a 37 °C em 5% CO₂2 por 48 h. O meio condicionado foi submetido à centrifugação diferencial da seguinte forma: 300 × g por 10 min para remover células e debris tecidual; 2.000 × g por 20 min para remover debris celular; e 10.000 × g por 30 min para remover microvesículas, tudo a 4 °C. O sobrenadante resultante foi ultracentrifugado a 120.000 × g por 70 min a 4 °C para pelotizar exossomos. O pellet foi lavado uma vez com PBS e submetido novamente à ultracentrifugação a 120.000 × g por 70 min a 4 °C. O pellet final foi ressuspenso em PBS. Os exossomos isolados foram caracterizados por análise de Western blot para marcadores de exossomos (PLAP, CD63 e TSG101, com GM130 como controle negativo) e posteriormente examinados por microscopia eletrônica de transmissão para observação morfológica.
Experimento de Captação Celular de P-EXOS
Para confirmar a internalização celular de P-EXOS, os exossomos foram marcados fluorescentemente com o corante lipofílico de membrana PKH67 de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, os P-EXOS foram incubados com PKH67 (4 µM) em Diluente C durante 5 min a temperatura ambiente, e a reação foi interrompida com um volume igual de albumina sérica bovina (BSA) a 1%. Os exossomos marcados foram reisolados por ultracentrifugação (120.000 × g, 70 min, 4 °C) para remover o corante não ligado. Os P-EXOS marcados com PKH67 (50 µg/mL) foram então adicionados às células HTR-8/SVneo e co-incubados por 24 h sob condições normóxicas ou hipóxicas (1% O₂). As células foram subsequentemente lavadas três vezes com PBS, fixadas com paraformaldeído a 4% por 15 min e os núcleos foram contra-estainados com DAPI (1 µg/mL). A internalização dos exossomos marcados com PKH67 foi visualizada por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM; excitação 490 nm, emissão 502 nm). Para experimentos funcionais de co-cultivo, as células HTR-8/SVneo foram tratadas com P-EXOS numa concentração de 50 µg/mL (equivalente em proteína) em meio RPMI-1640 completo suplementado com 10% de FBS livre de exossomos sob condições hipóxicas (1% O₂) por 24 h.
Ensaio imunoenzimático (ELISA)
Os sobrenadantes de cultivo celular foram coletados e os níveis de IL-6, IL-1β e TNF-α foram medidos utilizando o kit de ELISA para IL-6, kit de ELISA para IL-1β e kit de ELISA para TNF-α, respectivamente, de acordo com as instruções dos fabricantes. A absorbância em 450 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas, e as concentrações reais foram calculadas a partir das curvas-padrão.
Rotulagem de extremidades de quebra por dUTP mediada por TdT (TUNEL)
As células apoptóticas foram detectadas utilizando o kit de ensaio TUNEL de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 15 minutos à temperatura ambiente, permeabilizadas com Triton X-100 a 0,1% em PBS por 5 minutos em gelo e incubadas com a mistura de reação TUNEL por 60 minutos a 37 °C no escuro. Os núcleos foram contra-coloridos com DAPI, e as células positivas para TUNEL foram visualizadas usando um microscópio de fluorescência e quantificadas pela contagem da porcentagem de células positivas para TUNEL em pelo menos cinco campos selecionados aleatoriamente por amostra.
Análise estatística
Todos os dados foram analisados usando R e GraphPad Prism. As variáveis contínuas são apresentadas como média ±DP. Comparações entre dois grupos foram realizadas utilizando o teste t de Student, enquanto comparações entre múltiplos grupos foram conduzidas utilizando ANOVA unidirecional seguida pelo teste post hoc de Tukey. A significância estatística para variáveis categóricas foi avaliada pelo teste qui-quadrado ou pelo teste exato de Fisher. Salvo indicação em contrário, as correlações entre moléculas foram calculadas utilizando análise de correlação de Spearman. Os experimentos de caracterização de exossomos foram realizados usando P-EXOS isolados de três doadores placentários independentes. Os experimentos com células foram realizados em três réplicas biológicas independentes, representando experimentos independentes conduzidos em ocasiões distintas com células HTR-8/SVneo de diferentes passagens, sendo que cada réplica utilizou P-EXOS isolados de um doador placentário diferente. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
Análise transcriptômica de pacientes saudáveis e com PE
Para identificar as diferenças de expressão gênica entre o grupo normal (Normal) e pacientes com PE, a expressão diferencial nos conjuntos de dados combinados foi analisada utilizando o pacote R limma. Um total de 89 genes diferencialmente expressos (GDEs) foi identificado (p < 0,05 e |log2FC| > 0,5), sendo 69 genes superexpressos e 20 genes subexpressos para o conjunto GSE75010 (Figura 1A). Foram encontrados 2.097 genes diferencialmente expressos, dos quais 1.121 foram superexpressos e 976 subexpressos (Figura 1B). No conjunto de dados GSE60438, foram identificados 7.633 GDEs, com 3.371 genes superexpressos e 4.262 genes subexpressos (Figura 1C). As grandes diferenças no número de GDEs entre os três conjuntos de dados provavelmente refletem variações no tamanho da amostra, na origem tecidual (vilosidades placentárias versus decidua basal) e na classificação da gravidade da PE, o que reforça ainda mais a importância de considerar a intersecção entre os conjuntos de dados para identificar GDEs comuns e robustos.
Análise de enriquecimento funcional de genes diferencialmente expressos
Para a identificação sistemática de DEGs-chave associados à PE, foi realizada uma análise de Venn com os DEGs dos conjuntos de dados de PE GSE75010, GSE10588 e GSE60438, identificando-se, por fim, 56 DEGs comuns (Figura 2A). Uma rede de interação proteína-proteína (PPI) foi construída para esses 56 DEGs comuns utilizando a plataforma online STRING (pontuação de interação ≥0,15), e os 20 principais genes centrais foram posteriormente identificados com base em seu grau de conectividade na rede, classificados com o auxílio do software Cytoscape (Figura 2B). Com base nesses genes, também foi realizada a análise de enriquecimento GO para explorar funcionalidades potenciais em BP, CC e MF (Figura 2C). Os DEGs provavelmente estiveram enriquecidos em secreção hormonal e regulação da sinalização de receptores transmembrana serina/treonina quinase. Em termos celulares, os genes localizaram-se principalmente em adesões focais, junções célula-substrato e uma variedade de genes relacionados a vesículas e lisossomos. Em funções moleculares, os termos enriquecidos foram atividade de prolil hidroxilase, atividade hormonal e transporte transmembrana de moléculas relacionadas a lipídios. Esses resultados sugerem que os DEGs podem desempenhar papéis importantes na sinalização celular placentária, na interação célula-matriz e na manutenção de funções relacionadas ao sistema endócrino. Ao mesmo tempo, verificou-se que o enriquecimento de vias KEGG indicou que os DEGs provavelmente estiveram mais enriquecidos na interação citocina-receptor de citocina, interação de moléculas de adesão celular e nas vias de sinalização TGF-β e HIF-1 (Figura 2D). O enriquecimento de certos termos relacionados a vírus (por exemplo, vírus da hepatite, Ebolavirus) provavelmente reflete uma sobreposição inespecífica com genes imunorreguladores compartilhados, e não uma associação biológica direta com a PE; portanto, o foco interpretativo permanece nas vias relacionadas à inflamação, adesão e hipóxia. Essas vias estão relacionadas à resposta inflamatória, sinalização mediada por adesão celular e hipóxia, e podem influenciar a progressão da PE ao alterar o estado imuno-inflamatório e a comunicação entre células no microambiente placentário.
Aprendizado de máquina identifica SASH1 como um gene chave na PE
Para identificar genes prognósticos-chave, foram aplicados quatro métodos de aprendizado de máquina para seleção de características. A regressão LASSO com validação cruzada mostrou que o modelo atingiu o erro mínimo de validação cruzada quando log(λ.min) = -3,8075. Os genes com coeficientes não nulos nesse valor de λ foram selecionados como características principais identificadas pelo LASSO (Figura 3A–B). O algoritmo Boruta avalia a importância da característica comparando-a com características sombra. Genes com valores de importância superiores a shadowMax foram rotulados como Confirmados e considerados genes candidatos principais, enquanto aqueles com valores de importância inferiores a shadowMin foram rotulados como Rejeitados e considerados sem contribuição significativa. Genes entre esses dois limiares foram rotulados como Tímidos, indicando importância potencial, mas incerta (Figura 3C). A análise SVM-RFE demonstrou que, ao manter 40–50 características, a acurácia da validação cruzada atingiu o nível mais alto ou próximo ao mais alto, sugerindo desempenho preditivo ótimo nessa escala de características (Figura 3D). A acurácia moderada da validação cruzada (~0,6) indica que nenhum único algoritmo apresentou desempenho ideal para este conjunto de dados; portanto, adotou-se uma estratégia de interseção multi-algoritmo para aumentar a robustez da seleção de características. O XGBoost quantificou a importância relativa dos genes usando valores de Gain, identificando assim características com maior contribuição para a predição do modelo (Figura 3E). A análise de interseção de Venn dos resultados dos quatro métodos identificou SASH1 como o único gene com sobreposição. Embora SASH1 tenha sido classificado como Tímidos pelo algoritmo Boruta, sua seleção consistente nos outros três algoritmos apoia sua designação como gene candidato por consenso (Figura 3F).
Análise de célula única
A heterogeneidade celular e os processos moleculares nos tecidos placentários de PE foram investigados. As células foram filtradas por qualidade com base no número de genes detectados, no número de contagens de RNA e na porcentagem de expressão de genes mitocondriais. Células de baixa qualidade (com menos de 200 genes detectados ou com mais de 20% de conteúdo de genes mitocondriais) foram removidas para obter uma amostra de célula única de alta qualidade para análises posteriores. As métricas de controle de qualidade e a identificação de genes altamente variáveis são mostradas na Figura Suplementar 1A–B. Após a normalização e a identificação de genes altamente variáveis, foi realizada uma análise de componentes principais (PCA) utilizando os 2.000 principais genes altamente variáveis e os componentes principais significativos foram determinados por meio da análise JackStraw e da análise ElbowPlot (Figura Suplementar 2A–B).
Com base nos componentes principais, a aproximação de variedade uniforme e projeção (UMAP) foi utilizada para reduzir a dimensionalidade e realizar agrupamento não supervisionado, no qual todas as células foram classificadas em 22 agrupamentos, destacando a alta heterogeneidade celular no tecido placentário (Figura 4A). Ao estudar a expressão de genes marcadores específicos de cada agrupamento e visualizar os genes diferencialmente expressos (DEGs) em um mapa de calor (Figura 4B), cada agrupamento foi anotado com base em um marcador canônico e projetado novamente na representação UMAP (Figura 4C). Com base nesses principais agrupamentos celulares placentários, identificaram-se populações celulares incluindo células B/células plasmáticas, células endoteliais, fibroblastos/células estromais, macrófagos/células dendríticas, células natural killer, células T e células trofoblásticas. As comparações entre os grupos controle e PE revelam que diversos tipos celulares apresentam distribuição relativa substancial nas placentas com PE, sugerindo remodelação do microambiente placentário (Figura 4D).
A origem do tecido e o estado da doença foram utilizados para rastrear as células no mesmo agrupamento UMAP com base na fonte tecidual (decídua versus vilosidades) e no agrupamento por doença (controle versus PE) (Figura 4E). A distribuição do número de células foi parcialmente separada pela origem tecidual, enquanto as células de diferentes grupos de doença estavam altamente interconectadas. Isso sugere que a PE não reorganiza substancialmente toda a estrutura transcriptômica, mas pode ter efeitos sobre populações celulares individuais ou sobre características moleculares específicas. A expressão de SASH1 foi mapeada no UMAP para explorar sua distribuição entre as populações celulares placentárias (Figura 4F–G). SASH1 mostra expressão fortemente específica do tipo celular, com diferenças notáveis entre as populações celulares decíduas e vilosas. A comparação estatística da expressão de SASH1 entre os grupos PE e controle ao longo dos tipos celulares (teste de soma de postos de Wilcoxon) revelou diferenças significativas em múltiplas populações celulares placentárias, com a elevação mais acentuada observada nas células trofoblásticas de amostras de PE (Figura 4H). Essa descoberta fornece evidência em nível de célula única de que a desregulação de SASH1 é particularmente acentuada no compartimento trofoblástico, apoiando o uso da linhagem celular trofoblástica HTR-8/SVneo para experimentos funcionais subsequentes.
A diminuição de SASH1 inibe a apoptose de trofoblastos induzida por hipóxia e as respostas inflamatórias
Para validar as previsões bioinformáticas, estabeleceu-se um modelo celular de trofoblasto relacionado à PE em condições hipóxicas (1% O2). Realizaram-se análises de qPCR e Western blot para avaliar a expressão de SASH1 (Figura 5A–B). Em comparação com células HTR-8/SVneo normóxicas, as células tratadas com hipóxia apresentaram níveis significativamente aumentados de expressão de mRNA e proteína SASH1, fornecendo uma validação experimental preliminar dos resultados bioinformáticos. Para avaliar o efeito do silenciamento de SASH1 sobre processos patológicos relacionados à PE, realizou-se o silenciamento de SASH1 em células HTR-8/SVneo tratadas com hipóxia. As análises de PCR quantitativa e Western blot (Figura 5C–D) mostraram que a expressão de SASH1 foi significativamente reduzida em todos os grupos sh-SASH1 em comparação com o grupo sh-NC. Dentre eles, o sh-SASH1#3 apresentou a maior eficiência de silenciamento e, portanto, foi selecionado para os experimentos subsequentes. Realizaram-se coloração TUNEL e ELISA em três condições: controle normóxico (Normal), hipóxia com shRNA controle negativo (Hipóxia + sh-NC) e hipóxia com silenciamento de SASH1 (Hipóxia + sh-SASH1). Em comparação com o grupo Normal, o grupo Hipóxia + sh-NC exibiu apoptose significativamente aumentada e secreção elevada de citocinas pró-inflamatórias IL-1β, IL-6 e TNF-α, confirmando a lesão do trofoblasto induzida por hipóxia. O silenciamento de SASH1 atenuou acentuadamente esses efeitos, reduzindo a apoptose (Figura 5E) e os níveis de citocinas (Figura 5F) a valores próximos aos do grupo Normal, sugerindo que o silenciamento de SASH1 pode em grande parte reverter a apoptose do trofoblasto e as respostas inflamatórias induzidas por hipóxia. Para estabelecer mais firmemente o papel causal de SASH1, realizaram-se experimentos de ganho de função. A qPCR e o Western blot confirmaram a superexpressão bem-sucedida de SASH1 em células HTR-8/SVneo (Figura 5G–H). Em condições normóxicas, a superexpressão de SASH1 (OE-SASH1) aumentou significativamente a apoptose do trofoblasto e a secreção de citocinas pró-inflamatórias em comparação com o grupo OE-NC, recapitulando o fenótipo induzido por hipóxia (Figura 5I–J). Em conjunto, os dados de perda e ganho de função estabelecem que SASH1 é necessário e suficiente para induzir a apoptose do trofoblasto e as respostas inflamatórias, confirmando seu papel causal na patologia relacionada à PE.
Os P-EXOS suprimem a apoptose dos trofoblastos induzida pela hipóxia e as respostas inflamatórias por meio da modulação de SASH1
Considera-se que o P-EXOS possui valor terapêutico potencial na PE. Neste estudo, a análise de bioinformática sugeriu que SASH1 está associado a vias de sinalização relacionadas a exossomos (conforme indicado pelo enriquecimento GO e KEGG, Figura 2C–D), levando-nos a formular a hipótese de que o P-EXOS pode exercer um efeito protetor na PE por meio da regulação de SASH1. Antes dos estudos funcionais, os P-EXOS isolados foram primeiramente caracterizados. A análise por Western blot confirmou a presença das proteínas marcadoras de exossomos PLAP, CD63 e TSG101, sem expressão detectável do marcador do complexo de Golgi GM130, indicando alta pureza das vesículas isoladas. A microscopia eletrônica de transmissão revelou ainda estruturas vesiculares típicas em forma de taça (Figura 6A–B). Para verificar se os P-EXOS poderiam ser eficientemente internalizados por células-alvo, foi realizada coloração por imunofluorescência para avaliar a captação celular dos P-EXOS. Em comparação com o grupo controle, as células HTR-8/SVneo tratadas com P-EXOS exibiram sinais proeminentes de co-localização nas imagens sobrepostas, indicando que os P-EXOS foram efetivamente internalizados pelas células HTR-8/SVneo (Figura 6C).
Posteriormente, células HTR-8/SVneo foram co-cultivadas com P-EXOS sob condições hipóxicas. Tanto a PCR quantitativa quanto os ensaios de Western blot mostraram uma redução acentuada nos níveis de mRNA e proteína de SASH1 no grupo tratado com P-EXOS em comparação com os controles (Figura 6D–E), fornecendo evidências iniciais de uma interação regulatória entre P-EXOS e SASH1. De acordo com essas alterações moleculares, a coloração TUNEL revelou uma atenuação substancial da apoptose induzida por hipóxia em células HTR-8/SVneo após o tratamento com P-EXOS (Figura 6F). Ao mesmo tempo, ensaios de ELISA demonstraram diminuição acentuada na secreção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-6, IL-1β e TNF-α (Figura 6G).
Para determinar se os efeitos protetores dos P-EXOS são mecanicamente dependentes da supressão de SASH1, um experimento de resgate foi realizado sob condições hipóxicas. Células superexpressando SASH1 (OE-SASH1 + P-EXOS) foram comparadas com células controle negativo (OE-NC + P-EXOS). A superexpressão de SASH1 aboliu significativamente os efeitos protetores dos P-EXOS, como evidenciado pelo aumento da apoptose (Figura 6H) e pela secreção elevada de citocinas pró-inflamatórias (Figura 6I) em comparação com o grupo OE-NC + P-EXOS. Esses resultados demonstram que o efeito protetor dos P-EXOS é mediado especificamente pela supressão de SASH1, e não por vias paralelas, destacando o potencial terapêutico dos P-EXOS na PE.
DISPONIBILIDADE DE DADOS:
Os conjuntos de dados que apoiam as descobertas deste estudo estão disponíveis publicamente e foram obtidos do banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), com os números de acesso GSE75010, GSE10588, GSE60438 e GSE183338. A anotação dos tipos celulares foi realizada com referência ao Banco de Dados de Classificação Celular (https://ngdc.cncb.ac.cn/celltaxonomy/). As imagens não recortadas de Western blot e todos os demais dados experimentais brutos que apoiam as descobertas deste estudo estão disponíveis na pasta Dados Brutos Suplementares.
Figura 1: Identificação de genes diferencialmente expressos (GDEs) em tecidos placentários e deciduais na pré-eclâmpsia (PE) em três conjuntos de dados independentes. (A) Gráfico de vulcão dos GDEs entre 157 amostras placentárias de PE e 173 amostras placentárias sem PE do conjunto de dados combinado GSE75010. (B) Gráfico de vulcão dos GDEs entre amostras placentárias de PE grave (n = 17) e amostras placentárias normais (n = 26) do conjunto de dados GSE10588. (C) Gráfico de vulcão dos GDEs entre amostras deciduais de PE e amostras deciduais de controles normotensos do conjunto de dados GSE60438. Os GDEs foram identificados utilizando p < 0,05 e |log2FC| > 0,5. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise funcional de enriquecimento e de interações proteína-proteína (PPI) dos DEGs comuns associados à pré-eclâmpsia. (A) Diagrama de Venn dos DEGs identificados a partir dos conjuntos de dados relacionados à PE GSE75010, GSE10588 e GSE60438. (B) Rede PPI dos 20 principais genes centrais selecionados entre os 56 DEGs comuns com base no grau de conectividade, classificados utilizando o software Cytoscape (pontuação de interação STRING ≥0,15). (C) As análises de enriquecimento GO e KEGG dos DEGs comuns são apresentadas como gráficos de barras. (D) As análises de enriquecimento GO e KEGG dos DEGs comuns, apresentadas como diagramas de acordes. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3: Triagem baseada em aprendizado de máquina de genes centrais candidatos associados à pré-eclâmpsia. (A) Análise de regressão LASSO mostrando os perfis de coeficientes dos genes candidatos. (B) Seleção do parâmetro de regularização ótimo (λ) pela regressão LASSO utilizando validação cruzada. (C) Algoritmo Boruta. (D) Análise SVM-RFE. (E) Algoritmo XGBoost. (F) Diagrama de Venn mostrando a interseção dos genes candidatos identificados pelos algoritmos LASSO, Boruta, SVM-RFE e XGBoost. Abreviações: LASSO = operador de seleção e redução absoluta mínima; SVM-RFE = eliminação recursiva de características por máquina de vetores de suporte. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4: A análise transcriptômica de célula única revela padrões específicos de expressão de SASH1 por tipo celular na pré-eclâmpsia. (A) Agrupamento UMAP do conjunto de dados de célula única. (B) Análise dos cinco principais marcadores do conjunto de dados transcriptômicos de célula única da pré-eclâmpsia GSE183338. (C) Anotação das subpopulações celulares. (D) Gráfico de barras mostrando a distribuição das proporções celulares nas amostras controle e pré-eclâmpsia (PE). (E) Gráfico UMAP colorido por origem tecidual (decídua e vilosidades) e estado da doença (controle e PE). (F) Gráfico UMAP mostrando a expressão de SASH1 nas populações celulares placentárias agrupadas por origem tecidual (decídua e vilosidades). (G) Gráfico UMAP mostrando a expressão de SASH1 nas populações celulares placentárias agrupadas por estado da doença (controle e PE). (H) Gráfico de violino mostrando a distribuição da expressão de SASH1 em diferentes tipos celulares placentários. ns p > 0,05; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. Abreviações: UMAP = aproximação uniforme e projeção de variedades; ns = não significativo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 5: SASH1 regula a apoptose e a inflamação em trofoblastos induzidas pela hipóxia. (A) Análise por qPCR da expressão de mRNA de SASH1 e quantificação densitométrica dos níveis proteicos de SASH1 em células HTR-8/SVneo sob condições normais e hipóxicas. (B) Imagens representativas de western blot correspondentes aos dados densitométricos mostrados em (A). (C) Análise por qPCR da expressão de mRNA de SASH1 e quantificação densitométrica dos níveis proteicos de SASH1 em células HTR-8/SVneo tratadas com hipóxia e transfectadas com construtos sh-NC ou sh-SASH1 (sh-SASH1#1, sh-SASH1#2 e sh-SASH1#3). (D) Imagens representativas de western blot correspondentes aos dados densitométricos mostrados em (C). (E) Coloração TUNEL em células HTR-8/SVneo nos grupos Normal, Hipóxia + sh-NC e Hipóxia + sh-SASH1(#3). Barra de escala = 20 µm. (F) Análise por ELISA de citocinas inflamatórias (IL-1β, IL-6 e TNF-α) nos grupos Normal, Hipóxia + sh-NC e Hipóxia + sh-SASH1(#3). (G) Análise por qPCR da expressão de mRNA de SASH1 e quantificação densitométrica dos níveis proteicos de SASH1 em células HTR-8/SVneo transfectadas com construtos OE-NC ou OE-SASH1. (H) Imagens representativas de western blot correspondentes aos dados densitométricos mostrados em (G). (I) Coloração TUNEL em células HTR-8/SVneo nos grupos Normal + OE-NC e Normal + OE-SASH1. Barra de escala = 20 µm. (J) Análise por ELISA de citocinas inflamatórias (IL-1β, IL-6 e TNF-α) nos grupos Normal + OE-NC e Normal + OE-SASH1. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. Os dados são apresentados como média ± DP de três réplicas biológicas independentes (n = 3). Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.
Figura 6: Os P-EXOS atenuam a lesão de trofoblastos induzida por hipóxia por meio da supressão de SASH1. (A) Análise por western blot das proteínas marcadoras de P-EXOS PLAP, CD63 e TSG101, com GM130 servindo como controle negativo. (B) Análise por microscopia eletrônica de transmissão (MET) da morfologia dos P-EXOS. Barra de escala = 1,0 µm. (C) Imagens de microscopia confocal de varredura a laser mostrando a captação de P-EXOS marcados com PKH67 (verde) em células HTR-8/SVneo (vermelho). Os núcleos foram contra-coloridos com DAPI (azul). Barra de escala = 20 µm. (D) Análise por qPCR da expressão de mRNA de SASH1 e quantificação densitométrica dos níveis proteicos de SASH1 em células HTR-8/SVneo nos grupos Controle e P-EXOS. (E) Imagens representativas de western blot correspondentes aos dados densitométricos mostrados em (D). (F) Coloração TUNEL em células HTR-8/SVneo nos grupos Controle e P-EXOS. Barra de escala = 20 µm. (G) Análise por ELISA de citocinas inflamatórias (IL-1β, IL-6 e TNF-α) em células HTR-8/SVneo tratadas com hipóxia nos grupos Controle e P-EXOS. (H) Coloração TUNEL em células HTR-8/SVneo nos grupos OE-NC + P-EXOS e OE-SASH1 + P-EXOS. Barra de escala = 20 µm. (I) Análise por ELISA de citocinas inflamatórias (IL-1β, IL-6 e TNF-α) em células HTR-8/SVneo tratadas com hipóxia nos grupos OE-NC + P-EXOS e OE-SASH1 + P-EXOS. Abreviações: P-EXOS = exossomos derivados da placenta; MET = microscopia eletrônica de transmissão; PLAP = fosfatase alcalina placentária; TSG101 = gene de suscetibilidade tumoral 101. *p < 0,05; **p < 0,01. Os dados são apresentados como média ± DP de três réplicas biológicas independentes (n = 3). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura Suplementar 1: Controle de qualidade dos dados de RNA-seq de célula única. (A) Gráfico de violino dos níveis de expressão gênica após o controle de qualidade. (B) Gráfico de características variáveis mostrando os genes altamente variáveis identificados após o controle de qualidade.Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 2: Determinação dos componentes principais estatisticamente significativos para agrupamento de células individuais. (A) Gráfico de pontos JackStraw utilizado para identificar componentes principais estatisticamente significativos. (B) Gráfico de cotovelo mostrando a variância explicada pelos componentes principais.Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar 1: sequências alvo de shRNA utilizadas para o silenciamento de SASH1. Sequências alvo de shRNA (5′–3′) para o controle negativo (sh-NC) e três construtos direcionados ao SASH1 (sh-SASH1#1, sh-SASH1#2 e sh-SASH1#3) utilizados para o silenciamento gênico.Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar 2: Sequências de iniciadores utilizadas para PCR quantitativa. Sequências dos iniciadores direto e reverso (5′–3′) para SASH1 e β-actina (controle interno de referência) utilizadas na análise de qPCR.Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
Neste estudo, SASH1 foi identificado como um gene-chave desregulado na PE por meio de análise transcriptômica integrada, sequenciamento de célula única e aprendizado de máquina com múltiplos algoritmos, uma abordagem particularmente relevante dado que terapias direcionadas para a PE ainda não estão disponíveis17. Demonstrou-se que SASH1 está significativamente superexpresso em células trofoblásticas hipóxicas e especificamente elevado no compartimento trofoblástico de placentas com PE, com resolução de célula única. Por meio de experimentos de perda e ganho de função, estabeleceu-se que SASH1 é necessário e suficiente para induzir apoptose trofoblástica e secreção de citocinas pró-inflamatórias. Além disso, o tratamento com P-EXOS atenuou a lesão trofoblástica induzida por hipóxia, e esse efeito protetor foi abolido pela superexpressão de SASH1, confirmando que a citoproteção mediada por P-EXOS é mecanicamente dependente da supressão de SASH1.
Além disso, foram observadas alterações nas proporções de múltiplos tipos celulares placentários na PE, incluindo células B/células plasmáticas, células endoteliais, fibroblastos/células estromais, macrófagos/células dendríticas, células NK, células T e células trofoblásticas. Esses achados sugerem que o microambiente placentário sofre remodelamento substancial durante a PE. Tal microambiente inflamatório não apenas exacerba a disfunção trofoblástica, mas também pode acelerar a progressão da doença por meio de interações entre o sistema imunológico e a matriz extracelular18. Além disso, recentemente foram implicadas armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) na exacerbação da inflamação placentária na PE19. Acredita-se que SASH1 desempenhe um papel significativo no desenvolvimento da PE por meio de sua participação em sinalização inflamatória, adesão celular e processos relacionados à hipóxia. Neste estudo, perfis de expressão gênica foram extraídos de amostras placentárias de pacientes com PE e gestações normotensas utilizando o pacote limma, e múltiplos algoritmos de aprendizado de máquina — regressão LASSO, SVM-RFE, XGBoost e Boruta — foram aplicados para seleção de características. Em todos os algoritmos, SASH1 emergiu consistentemente como um gene candidato consensual. Ao nível de célula única, SASH1 mostrou expressão específica de tipo celular em diversas populações celulares placentárias e manteve expressão elevada nas amostras de PE, com a diferença mais acentuada observada nas células trofoblásticas, sugerindo que pode exercer efeitos funcionais distintos em diferentes contextos celulares placentários.
A SASH1 é uma proteína adaptadora de sinalização que já foi relatada como participante de diversos processos biológicos, incluindo migração e invasão celular, transição epitélio-mesênquima e regulação de sinalização em resposta ao estresse8,9. Para investigar o papel funcional da SASH1 na patologia relacionada à PE, foi estabelecido um modelo de trofoblasto induzido por hipóxia utilizando células HTR-8/SVneo. Nossos resultados demonstraram que a exposição à hipóxia aumentou significativamente a expressão da SASH1, enquanto o silenciamento da SASH1 atenuou acentuadamente a apoptose induzida por hipóxia e reduziu a secreção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-1β, IL-6 e TNF-α. Por outro lado, a superexpressão da SASH1 em condições normóxicas foi suficiente para reproduzir o fenótipo induzido por hipóxia, estabelecendo o papel causal da SASH1 na indução de lesão trofoblástica. Esses achados sugerem que a SASH1 pode regular negativamente o estado funcional do trofoblasto por meio da modulação das respostas inflamatórias. Considerando que os trofoblastos representam uma fonte principal de mediadores inflamatórios placentários20, a expressão anormal da SASH1 pode constituir uma base molecular crítica para a amplificação da inflamação na PE. Notavelmente, as funções pró-apoptótica e pró-inflamatória da SASH1 observadas em células trofoblásticas contrastam com seu papel canônico de supressão tumoral em células cancerosas, onde normalmente inibe a EMT e a migração8,9. Essa dualidade funcional dependente do contexto pode refletir diferenças específicas do tipo celular nos parceiros interagentes com a SASH1 e nas redes de sinalização downstream, e exige investigação adicional.
Exossomos são reconhecidos como importantes mediadores da comunicação intercelular e estão implicados na patogênese da PE21. Em particular, os P-EXOS podem desempenhar um papel importante na regulação imune durante a gravidez normal, como a manutenção da tolerância imune materno-fetal, o que pode conferir proteção contra a PE22. Neste estudo, a análise bioinformática revelou uma associação entre SASH1 e vias de sinalização relacionadas a exossomos, levando a uma investigação mais aprofundada sobre o papel dos P-EXOS na regulação da função dos trofoblastos. Experimentos de cocultura demonstraram que o tratamento com P-EXOS reduziu significativamente os níveis de mRNA e proteína de SASH1 em células trofoblastos submetidas à hipóxia, e atenuou acentuadamente a apoptose e as respostas inflamatórias induzidas pela hipóxia. Importante, a superexpressão de SASH1 anulou esses efeitos protetores, confirmando que a citoproteção mediada pelos P-EXOS é mecanicamente dependente da supressão de SASH1, e não de vias paralelas.
Os mecanismos moleculares pelos quais os P-EXOS suprimem a expressão de SASH1 permanecem por ser elucidados. Sabe-se que os P-EXOS carregam cargas bioativas diversas, incluindo microRNAs, proteínas e lipídios, que podem modular a expressão gênica em células receptoras10. Uma possibilidade é que os P-EXOS entreguem microRNAs específicos que direta ou indiretamente visem SASH1. Alternativamente, os P-EXOS podem modular vias de sinalização upstream—como NF-κB ou PI3K-Akt—que convergem para a regulação transcricional de SASH1. Considerando que SASH1 já foi implicado na via PI3K-Akt-mTOR em células cancerígenas8, é plausível que a modulação mediada por exossomos desse eixo possa contribuir para a downregulação de SASH1 em células trofoblásticas. Estudos futuros que empreguem sequenciamento do conteúdo exossomal e inibidores específicos de vias serão necessários para dissecar a cascata molecular exata pela qual os P-EXOS regulam a expressão de SASH1.
Neste estudo, o perfil transcriptômico foi integrado com sequenciamento de RNA de célula única para investigar as alterações moleculares no tecido placentário na PE. Demonstrou-se que SASH1 desempenha um papel fundamental na apoptose de trofoblastos induzida por hipóxia e nas respostas inflamatórias, e que os P-EXOS podem exercer um efeito protetor por meio da supressão da expressão de SASH1, oferecendo novas perspectivas sobre os mecanismos moleculares subjacentes à PE e sugerindo uma possível estratégia terapêutica. No entanto, este estudo apresenta várias limitações. Primeiro, os achados funcionais foram obtidos principalmente a partir da linhagem celular de trofoblasto imortalizada HTR-8/SVneo; a validação em células de trofoblasto primárias é necessária. Segundo, a expressão da proteína SASH1 não foi validada em tecidos placentários clínicos de PE por meio de imuno-histoquímica, o que limita a interpretação translacional dos achados e deve ser abordado em estudos futuros. Terceiro, o classificador SVM-RFE apresentou precisão moderada na validação cruzada (~0,6), refletindo a heterogeneidade inerente ao conjunto de dados; coortes independentes maiores serão necessários para desenvolver modelos diagnósticos mais robustos. Quarto, o mecanismo molecular exato pelo qual os P-EXOS suprimem a expressão de SASH1 permanece obscuro. Quinto, bandas de coloração inespecíficas foram observadas na detecção de SASH1 por Western blot, o que pode ser devido à especificidade subótima do anticorpo. O anticorpo utilizado neste experimento é um anticorpo policlonal, que geralmente apresenta menor especificidade na imunodetecção em comparação com anticorpos monoclonais. Apesar disso, essas bandas inespecíficas não afetam os achados sobre a proteína SASH1 nem as conclusões deste estudo. Estudos futuros que incluam experimentos in vivo, análise de amostras clínicas e caracterização do conteúdo exossomal serão necessários para elucidar ainda mais o papel funcional do eixo P-EXOS-SASH1 na PE e para avaliar seu potencial translacional.
Divulgações
Não há conflito de interesses neste estudo.
Agradecimentos
Este estudo foi financiado pelo Programa-Chave de Pesquisa Científica em Ciências Médicas da Comissão de Saúde da Província de Hebei, China (n.º 20210075).
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Meio RPMI-1640 | Gibco | 11875085 | |
| Soro bovino fetal (FBS) | Gibco | 16140071 | |
| FBS livre de exossomos | System Biosciences | EXO-FBS-50A-1 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Thermo Fisher Scientific, CN | 15140122 | |
| Reagente de transfeção Lipofectamine 3000 (com Reagente P3000) | Thermo Fisher Scientific, CN | L3000150 | |
| Meio reduzido de soro Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific, CN | 31985070 | |
| Plasmídeo de shRNA para SASH1 (HuSH) | origene | TL301836 | |
| Plasmídeo de expressão de ORF de SASH1 | origene | RC218866 | |
| Controle de vetor vazio | origene | PS100001 | |
| Kit de transcrição reversa | Thermo Fisher Scientific, CN | 4368814 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific, CN | A46110 | |
| Primeres para SASH1 | Sangon Biotech | Sintetizados sob encomenda | |
| β-actina primeres | Sangon Biotech | Sintetizados sob encomenda | |
| Tampão de lise celular | Beyotime | P0013B | |
| Espectrofotômetro NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, CN | NanoDrop Ultra | |
| Membrana PVDF | Thermo Fisher Scientific, CN | 88518 | |
| Anticorpo anti-SASH1 | ABclonal | A15248 | |
| Anticorpo anti-β-actina | Abcam | ab6276 | |
| Anticorpo secundário conjugado com HRP, anti-coelho/anti-rato de cabra | Beyotime | A0208 | |
| Software ImageJ | NIH (domínio público) | ImageJ | |
| Kit PKH67 Green Fluorescent Cell Linker (incluindo Diluente C) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | MINI67 | |
| Albumina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | 10711454001 | |
| DAPI | Beyotime | C1002 | |
| Microscópio confocal a laser de varredura (CLSM) | Leica | Leica TCS SP8 | |
| Kit ELISA Quantikine para IL-6 humana | R&D Systems | D6050B | |
| Kit ELISA DuoSet para IL-1β/IL-1F2 humana | R&D Systems | DY201 | |
| Kit ELISA Quantikine para TNF-α humana | R&D Systems | DTA00D | |
| Leitor de microplacas | Thermo Scientific | Multiskan FC | |
| Kit de detecção de morte celular in situ (Kit de ensaio TUNEL) | Roche | 11684795910 | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096 | |
| Paraformaldeído (4%) | Beyotime | P0099 | |
| Microscópio de fluorescência | Olympus | BX53 | |
| Centrífuga refrigerada (capacidade de 12.000 × g) | Eppendorf | Eppendorf 5430 R | |
| Ultracentrífuga (capacidade de 120.000 × g) | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| Software R | The R Foundation | v4.2.1 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v10.0 | |
| Seurat (pacote R) | Satija Lab (código aberto) | v4.0.4 | |
| Harmony (pacote R, correção de lote) | Código aberto | v1.2.0 | |
| Scrublet (pacote Python, detecção de dupletos) | Código aberto | v0.2.3 | |
| clustree (pacote R) | Código aberto | v0.5.1 | |
| glmnet (pacote R, LASSO) | Código aberto | v4.1.8 | |
| e1071 (pacote R, SVM-RFE) | Código aberto | v1.7-14 | |
| xgboost (pacote R) | Código aberto | v1.7.7.1 | |
| randomForest (pacote R, Boruta) | Código aberto | v4.7-1.1 | |
| Banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO) | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | |
| Banco de dados STRING | string-db.org | https://www.string-db.org/ | |
| Metascape | metascape.org | https://metascape.org/ | |
| Software Cytoscape | Consortium Cytoscape | v3.10.4 | |
| ggplot2 (pacote R) | Código aberto | v3.5.1 | |
| limma (pacote R) | Código aberto | v3.58.1 | |
| pheatmap (pacote R) | Código aberto | v1.0.12 | |
| ClusterProfiler (pacote R) | Código aberto | v4.8.3 | |
| DOSE (pacote R) | Código aberto | v3.28.2 | |
| ggpubr (pacote R) | Código aberto | v0.6.0 |
Referências
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