O extrato de ZeLan melhorou os fenótipos endócrinos e metabólicos em ratas com PCOS induzido por DHEA. A integração do sequenciamento de 16S rRNA e metabolômica sérica mostrou restauração parcial da diversidade alfa microbiana intestinal, alterações na composição microbiana e mudanças nos metabólitos envolvendo hormônios esteroides, ácidos biliares e ácidos graxos de cadeia curta.
Artigo de investigação
Lycopus lucidus Melhora o Síndrome do Ovário Policístico Experimental com Remodelação da Microbiota Intestinal e do Metaboloma
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este estudo investigou os efeitos terapêuticos do extrato de ZeLan na síndrome dos ovários policísticos (SOP) e avaliou sua associação com a remodelação do microbioma intestinal e do metaboloma. Vinte e quatro ratas Sprague-Dawley foram divididas aleatoriamente em grupos Controle, Modelo de SOP induzido pela desidroepiandrosterona (DHEA) e tratamento com ZeLan (n = 8 cada). Após 28 dias de intervenção, os níveis séricos de hormônios foram medidos por ELISA; a composição do microbioma intestinal foi analisada por meio de sequenciamento do gene 16S rRNA, e os perfis metabólicos séricos foram caracterizados por UHPLC-Q-TOF-MS. Foi realizada análise de correlação de Spearman com controle de múltiplos testes para explorar as associações entre microbioma e metaboloma. O ZeLan melhorou significativamente os fenótipos associados à SOP, reduzindo o peso corporal, os níveis de testosterona (0,92 versus 1,85 ng/mL, P < 0,05), a razão LH/FSH e os níveis de insulina em comparação com o grupo Modelo. O sequenciamento mostrou que o ZeLan restaurou parcialmente a diversidade alfa microbiana (índice de Shannon: 5,79 versus 4,19) e reduziu a razão Firmicutes/Bacteroidetes. O ZeLan foi associado ao enriquecimento de Lactobacillus e Ruminococcus e menor abundância de Bacteroides, Prevotella e Escherichia. A metabolômica identificou 52 características de metabólitos alteradas, com mudanças-chave envolvendo hormônios esteroides, ácidos biliares como o ácido litocólico e ácidos graxos de cadeia curta como o ácido butírico. Esses achados sugerem que o ZeLan atenua distúrbios endócrinos e metabólicos relacionados à SOP e está associado à remodelação dos perfis microbianos intestinais e metabólicos séricos.
Introdução
A síndrome dos ovários policísticos (SOP) representa um dos distúrbios endócrinos mais prevalentes que afetam mulheres em idade reprodutiva, com uma prevalência global estimada entre 6% e 20%, dependendo dos critérios diagnósticos utilizados1. Este distúrbio metabólico e reprodutivo complexo caracteriza-se por um conjunto de manifestações clínicas, incluindo hiperandrogenismo, disfunção ovulatória e morfologia ovariana policística, que conjuntamente contribuem para consequências reprodutivas, metabólicas e psicológicas significativas2. Além do seu impacto imediato na fertilidade, a SOP é cada vez mais reconhecida como uma condição sistêmica associada a complicações crônicas de saúde, incluindo diabetes melito tipo 2, doenças cardiovasculares e carcinoma de endométrio, impondo, assim, encargos substanciais tanto para pacientes individuais quanto para os sistemas de saúde em todo o mundo3. A fisiopatologia da SOP ainda não é completamente compreendida, embora seja amplamente aceito que envolva interações complexas entre predisposição genética, fatores ambientais e determinantes do estilo de vida, que culminam nas alterações hormonais e metabólicas características observadas nos indivíduos afetados4.
As abordagens terapêuticas contemporâneas para a SOP concentram-se principalmente no manejo sintomático por meio de intervenções farmacológicas, incluindo contraceptivos orais para regulação menstrual, metformina para sensibilização à insulina e antiandrogênicos para controle da hirsutismo5. No entanto, esses tratamentos convencionais frequentemente proporcionam alívio incompleto dos sintomas e estão comumente associados a efeitos adversos que limitam sua aplicabilidade a longo prazo, especialmente em mulheres com desejo de fertilidade6. Consequentemente, tem havido um crescente interesse na exploração de abordagens de medicina complementar e alternativa, particularmente a medicina tradicional chinesa (MTC), que acumulou séculos de experiência empírica no tratamento de distúrbios ginecológicos por meio de mecanismos regulatórios holísticos7. Entre as inúmeras plantas medicinais investigadas para o manejo da SOP, Lycopus lucidus Turcz. (conhecida vulgarmente como ZeLan na medicina chinesa) tem atraído considerável atenção devido às suas aplicações tradicionais na promoção da circulação sanguínea, resolução de estase e regulação da menstruação8. Estudos fitoquímicos publicados indicam que L. lucidus contém frações ricas em polifenóis e flavonoides com atividade antioxidante e anti-inflamatória8,9. Portanto, o teor total padronizado de flavonoides foi utilizado como índice de controle de qualidade química do extrato no presente estudo, embora a identificação dos monômeros ativos específicos responsáveis pela regulação da microbiota e do metabolismo exija análise fitoquímica direcionada no futuro.
A microbiota intestinal emergiu como um regulador crítico do metabolismo e da função endócrina do hospedeiro, com evidências crescentes apoiando seu envolvimento na patogênese de diversas doenças metabólicas, incluindo a SOP10. O conceito do eixo intestino-ovário foi proposto para descrever a comunicação bidirecional entre microrganismos intestinais e a função ovariana, mediada por metabólitos microbianos, sinalização imunológica e vias neuroendócrinas11. Mulheres com SOP demonstraram consistentemente apresentar disbiose intestinal caracterizada por redução da diversidade microbiana, alterações nas proporções de Firmicutes para Bacteroidetes e diminuição da abundância de bactérias benéficas, como espécies de Lactobacillus e Bifidobacterium12. Acredita-se que essas perturbações microbianas contribuam para a fisiopatologia da SOP por meio de múltiplos mecanismos, incluindo aumento da permeabilidade intestinal, inflamação sistêmica de baixo grau e alterações no metabolismo de ácidos biliares e ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), que subsequentemente influenciam a sensibilidade à insulina e a biossíntese de androgênios13. Importante ressaltar que intervenções direcionadas à microbiota intestinal, incluindo probióticos, prebióticos e modificações dietéticas, têm demonstrado resultados promissores na melhora dos sintomas da SOP, reforçando o eixo intestino-ovário como alvo terapêutico14.
A metabolômica, a análise abrangente de metabólitos de pequenas moléculas em sistemas biológicos, fornece uma abordagem poderosa para caracterizar as perturbações metabólicas associadas a estados patológicos e para avaliar os efeitos bioquímicos de intervenções terapêuticas15. A integração do sequenciamento do gene 16S rRNA para perfilagem do microbioma com metabolômica não direcionada permite a investigação sistemática das relações entre comunidades microbianas intestinais e o metabolismo do hospedeiro, oferecendo insights sobre as interações entre microbiota e metaboloma que podem acompanhar tanto a patogênese da doença quanto as respostas ao tratamento. Apesar da justificativa teórica para o alvo no eixo intestino-ovário no manejo da SOP e das indicações tradicionais do ZeLan para distúrbios ginecológicos, nenhum estudo até o momento investigou sistematicamente se o extrato de ZeLan modula a interface entre microbiota intestinal e metaboloma na SOP. Essa lacuna de conhecimento limita nossa compreensão das respostas biológicas associadas ao ZeLan e dificulta a otimização racional dessa intervenção botânica para o tratamento da SOP.
O presente estudo foi planejado para investigar a eficácia terapêutica do extrato de ZeLan em um modelo de rato com PCOS induzido por DHEA e para avaliar as alterações associadas no microbiota intestinal e no metaboloma por meio da integração de sequenciamento de 16S rRNA e análise de metabolômica não direcionada. Especificamente, avaliamos os efeitos do extrato de ZeLan em fenótipos relacionados ao PCOS, incluindo peso corporal, testosterona sérica, razão entre hormônio luteinizante e hormônio folículo-estimulante (LH/FSH) e níveis de insulina; caracterizamos alterações na composição da microbiota intestinal e na diversidade alfa após o tratamento com ZeLan; identificamos características diferenciais de metabólitos séricos e vias metabólicas enriquecidas associadas à intervenção com ZeLan; e exploramos correlações entre táxons microbianos intestinais específicos e metabólitos-chave. Ao abordar esses objetivos, buscamos fornecer evidências associativas de múltiplos ômicas para a modulação relacionada ao ZeLan no eixo intestino-ovário no PCOS.
Protocolo
Todos os procedimentos experimentais do presente estudo foram conduzidos de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (Número de Aprovação IACUC-2023-0156).
Animais
Ratos fêmeas Sprague-Dawley (n = 24, com 6 semanas de idade, peso corporal de 180–200 g) foram obtidos do Centro de Animais de Laboratório da instituição afiliada e mantidos em condições ambientais controladas (temperatura de 22 ± 2°C, umidade de 50 ± 10%, ciclo claro/escuro de 12 horas) com acesso ad libitum a ração padrão para roedores e água purificada. Após um período de aclimatação de uma semana, os animais foram aleatoriamente distribuídos em três grupos experimentais (n = 8 por grupo): Controle, Modelo de SOP e Tratamento com ZeLan. O tamanho da amostra foi determinado com base em estudos anteriores que investigaram alterações na microbiota intestinal em modelos de SOP, sendo que a análise de poder indicou que 8 animais por grupo proporcionariam 80% de poder para detectar uma diferença de 1,5 vez nos índices de diversidade alfa em α = 0,05.
Estabelecimento do modelo de SOP e protocolo de tratamento
O modelo de SOP foi estabelecido utilizando um protocolo bem validado que envolve injeção subcutânea de dehidroepiandrosterona (DHEA; Sigma-Aldrich, EUA) dissolvida em óleo de gergelim na região dorsal do pescoço, na dose de 6 mg/100 g de peso corporal diariamente por 21 dias consecutivos. Os animais controle receberam volumes equivalentes de veículo de óleo de gergelim. A linha do tempo experimental completa compreendeu 7 dias de aclimatação, 21 dias de indução do modelo e 28 dias de intervenção, com coleta final no dia 56 do protocolo, incluindo o período de aclimatação (Figura 1). O extrato ZeLan foi preparado a partir da planta autenticada Lycopus lucidus Turcz. por extração aquosa e foi padronizado para conter flavonoides totais em quantidade não inferior a 2,5%, conforme determinado por cromatografia líquida de alta eficiência, que serviu como critério de controle de qualidade química do extrato botânico. Após a conclusão do estabelecimento do modelo induzido por DHEA, os ratos do grupo ZeLan receberam por gavagem oral o extrato ZeLan na dose de 200 mg/kg de peso corporal diariamente por 28 dias consecutivos, enquanto os grupos Controle e Modelo receberam volumes equivalentes de água destilada. A dose de 200 mg/kg foi escolhida como uma dose farmacológica exploratória com base em experiências prévias com extratos botânicos em animais e considerações preliminares de tolerabilidade; uma avaliação formal da resposta à dose não fez parte do presente desenho experimental. O peso corporal foi registrado semanalmente ao longo do período experimental. Neste desenho experimental, o sucesso do estabelecimento do modelo de SOP foi avaliado com base no protocolo de indução com DHEA, juntamente com fenótipos endócrinos e metabólicos no ponto final, incluindo peso corporal, testosterona sérica, razão LH/FSH e insulina em jejum. Exame histopatológico ovariano, contagem de folículos, quantificação de corpos lúteos e monitoramento serial do ciclo estral não foram incluídos como pontos finais de confirmação do modelo, e, portanto, a interpretação da disfunção ovariana baseou-se em indicadores endócrinos e metabólicos, e não em avaliação direta ao nível tecidual.
Coleta e processamento de amostras
Amostras (soro e fezes) foram coletadas dos três grupos (n = 8 por grupo) para análises bioquímicas, de microbiota e de metabolômica subsequentes. As coletas terminais foram realizadas pela manhã, após jejum noturno, para reduzir a variabilidade relacionada ao ciclo circadiano e à alimentação. As amostras de sangue foram coletadas da aorta abdominal sob anestesia e centrifugadas a 3.000 × g durante 15 minutos a 4°C para obtenção do soro, que foi fracionado e armazenado a -80°C até as análises hormonais e metabolômicas. Amostras frescas de fezes foram coletadas diretamente do ceco em condições assépticas em criotubos estéreis, mantidas sobre gelo seco durante o transporte, congeladas rapidamente em nitrogênio líquido dentro de 10 minutos após a coleta e armazenadas a -80°C até o sequenciamento do gene 16S rRNA.
Medições hormonais no soro
As concentrações séricas de testosterona, hormônio luteinizante (LH), hormônio folículo-estimulante (FSH) e insulina foram quantificadas utilizando kits comerciais de ensaio imunoenzimático (ELISA) (Cusabio Biotech, Wuhan, China), conforme as instruções do fabricante. A razão LH/FSH foi calculada como um índice composto de desequilíbrio gonadotrófico característico da SOP. Todas as amostras foram analisadas em duplicata, e as medições cujos coeficientes de variação em duplicata fossem superiores a 15% foram repetidas. Exigia-se que os coeficientes de variação intraensaio e interensaio permanecessem abaixo de 10% e 15%, respectivamente. Possíveis valores aberrantes foram verificados com base nos registros originais e nas informações de desempenho do ensaio, e nenhum valor foi excluído unicamente por critérios estatísticos sem uma justificativa técnica documentada.
Sequenciamento do gene do RNA ribossomal 16S e análise bioinformática
O DNA genômico bacteriano total foi extraído do conteúdo cecal utilizando o QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Alemanha), seguindo o protocolo do fabricante. A qualidade e a quantidade do DNA foram avaliadas por espectrofotometria NanoDrop e eletroforese em gel de agarose, e os extratos de DNA foram armazenados a -80°C antes da construção da biblioteca. As regiões hipervariáveis V3-V4 do gene 16S rRNA foram amplificadas usando os primers universais 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') e 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') com sequências adaptadoras Illumina. As bibliotecas de amplicons foram construídas, purificadas, quantificadas, reunidas em concentrações equimolares e sequenciadas na plataforma Illumina NovaSeq 6000 (Novogene, Pequim, China) utilizando leituras pareadas de 250 pb.
As leituras brutas de sequenciamento foram processadas usando o pipeline QIIME2 (versão 2022.2). As leituras pareadas foram desmultiplexadas, unidas, filtradas por qualidade utilizando um limiar de pontuação Phred de pelo menos 20 e processadas com o DADA2 para remover sequências quiméricas e gerar variantes de sequência de amplicon (ASVs). A classificação taxonômica foi realizada contra a base de dados de referência SILVA 138 utilizando um classificador bayesiano ingênuo. Métricas de diversidade alfa, incluindo índice de Shannon, índice de Simpson e estimador Chao1, foram calculadas para avaliar a diversidade e riqueza intra-amostra. Os resultados de profundidade de sequenciamento, incluindo resumos de leituras, tabelas de abundância de ASVs, cobertura de Good e arquivos de curvas de rarefação, foram tratados como parte do conjunto de dados do microbioma descrito na seção Disponibilidade de Dados. A análise linear de tamanho do efeito (LEfSe) foi utilizada para identificar táxons associados à doença na comparação Controle versus Modelo, utilizando um limiar de pontuação LDA maior que 2,0 e P < 0,05; a reversão associada ao ZeLan foi avaliada comparando a direção das alterações na abundância taxonômica no grupo ZeLan em relação ao grupo Modelo.
Análise de metabolômica não direcionada
O perfil metabólomico do soro foi realizado utilizando cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas com analisador quadrupolo e tempo de voo (UHPLC-Q-TOF-MS; Agilent 1290 Infinity II/6550, EUA). Amostras de soro (100 μL) foram misturadas com 400 μL de metanol frio:acetonitrila (1:1, v/v) contendo padrões internos, agitadas em vórtex e incubadas a -20°C por 1 hora para precipitar as proteínas. Após centrifugação a 14.000 × g durante 15 minutos, os sobrenadantes foram secos sob fluxo de nitrogênio e reconstituídos em 100 μL de acetonitrila:água (1:1, v/v) para análise. A separação cromatográfica foi realizada em coluna ACQUITY UPLC HSS T3 (2,1 × 100 mm, 1,8 μm) mantida a 40°C, utilizando água contendo 0,1% de ácido fórmico como fase móvel A e acetonitrila contendo 0,1% de ácido fórmico como fase móvel B, com vazão de 0,30 mL/min. Um programa em gradiente com aumento da fase orgânica de 5% a 95%, seguido de lavagem e reequilíbrio da coluna, foi utilizado para separação dos metabólitos. Os dados espectrométricos de massas foram adquiridos nos modos de ionização por eletrospray positivo e negativo, com faixa de varredura de m/z 50–1200; os parâmetros da fonte incluíram tensão de capilar de 3,5 kV, fluxo de gás de secagem de 10 L/min, temperatura do gás de secagem de 325°C, pressão do nebulizador de 35 psi e tensão do fragmentador de 120 V.
Os arquivos de dados brutos foram convertidos para o formato mzXML e processados usando o pacote XCMS no R para detecção de picos, alinhamento do tempo de retenção e integração da área dos picos. Amostras de controle de qualidade, preparadas pela combinação de alíquotas iguais de todos os extratos séricos, foram inseridas ao longo da sequência analítica para monitorar a estabilidade do instrumento. Características com ausência excessiva ou reprodutibilidade instável no controle de qualidade foram removidas antes da modelagem estatística. A identificação dos metabólitos foi realizada comparando a massa exata, o tempo de retenção e os padrões de fragmentação em MS/MS com os bancos de dados Human Metabolome Database (HMDB), METLIN e bibliotecas espectrais internas. Análises estatísticas multivariadas foram conduzidas usando o MetaboAnalyst 5.0. As características de metabólitos mantidas para relatórios posteriores foram priorizadas usando um critério combinado que incluiu contribuição discriminatória multivariada, direção da variação, e evidência estatística; os valores de P foram ajustados utilizando o método de Benjamini-Hochberg para levar em conta testes múltiplos. A tabela completa de relatório anotada, contendo 52 características de metabólitos, está disponível como Tabela Suplementar 1. A análise de enriquecimento de vias metabólicas foi realizada utilizando o banco de dados Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).
Análise estatística
Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o SPSS versão 26.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, EUA) e o software R (versão 4.2.1). Os dados contínuos foram expressos como média ± desvio padrão (DP) e avaliados quanto à normalidade utilizando o teste de Shapiro-Wilk antes dos testes inferenciais. Para dados com distribuição normal, foi utilizada a análise de variância de um fator (ANOVA) seguida pelo teste post hoc de Tukey para comparações entre múltiplos grupos; para dados com distribuição não normal, foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis com teste post hoc de Dunn. As correlações entre táxons microbianos intestinais e metabólitos séricos foram avaliadas utilizando o coeficiente de correlação de postos de Spearman e visualizadas como mapas de calor agrupados hierarquicamente. Os valores-P das correlações foram ajustados para múltiplos testes utilizando o método da taxa de falsas descobertas de Benjamini-Hochberg, e somente as correlações que foram consistentes em direção e estatisticamente significativas foram interpretadas. Um valor-P bicaudal < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo, salvo quando um limiar de valor-P ajustado foi especificado.
Resultados
Efeitos do extrato de ZeLan nos fenótipos clínicos da SOP
A administração de DHEA induziu fenótipos endócrinos e metabólicos semelhantes ao PCOS em ratas, conforme evidenciado por elevações significativas no peso corporal, concentração sérica de testosterona, razão LH/FSH e níveis de insulina em jejum em comparação com o grupo Controle (todos P < 0,05). A avaliação da distribuição pelo teste de Shapiro-Wilk apoiou a análise paramétrica para os principais desfechos de peso corporal e hormônios resumidos na Tabela 1. O tratamento com extrato de ZeLan durante 28 dias melhorou significativamente essas alterações metabólicas e hormonais. O peso corporal foi registrado ao final do período de tratamento no dia 56 do protocolo, incluindo o período de aclimatação de 7 dias. Conforme apresentado na Tabela 1, o peso corporal no grupo Modelo (291,12 ± 15,35 g) foi substancialmente maior do que no grupo Controle (227,45 ± 10,12 g, P < 0,05), enquanto o tratamento com ZeLan reduziu significativamente o peso corporal para 245,25 ± 10,21 g (P < 0,05 versus Modelo). Os níveis séricos de testosterona foram marcadamente elevados nas ratas modelo de PCOS (1,85 ± 0,21 ng/mL) em comparação com os controles (0,51 ± 0,05 ng/mL), e a intervenção com ZeLan reduziu a testosterona para 0,92 ± 0,12 ng/mL. A razão LH/FSH foi significativamente aumentada no grupo Modelo (3,28 ± 0,25) em relação ao grupo Controle (1,25 ± 0,11) e foi parcialmente normalizada pelo tratamento com ZeLan (1,85 ± 0,15). Os níveis de insulina em jejum estavam elevados nos animais modelo (28,95 ± 2,35 mIU/L versus 12,55 ± 1,12 mIU/L nos controles) e foram significativamente reduzidos após a administração de ZeLan (18,82 ± 1,55 mIU/L) (Figura 2). Esses achados confirmaram o estabelecimento bem-sucedido de um fenótipo semelhante ao PCOS com alterações endócrino-metabólicas; no entanto, a histopatologia ovariana, contagem de folículos, análise de corpo lúteo e monitoramento do ciclo estral não foram realizados neste estudo.
O extrato de ZeLan restaurou a diversidade alfa do microbiota intestinal
A análise dos índices de diversidade alfa revelou alterações substanciais na estrutura da comunidade microbiana intestinal associada à SOP e seu tratamento. Conforme mostrado na Tabela 2 e na Figura 3, o índice de diversidade de Shannon foi significativamente menor em ratos modelo de SOP (4,19 ± 0,35) do que nos controles saudáveis (6,51 ± 0,28; P < 0,05), indicando uma diminuição da diversidade alfa microbiana no estado da doença. O tratamento com ZeLan restaurou parcialmente a diversidade microbiana, com o índice de Shannon aumentando para 5,79 ± 0,26 (P < 0,05 versus Modelo). Resultados consistentes foram observados para o índice de Simpson, que diminuiu de 0,98 ± 0,01 nos controles para 0,82 ± 0,03 nos animais modelo e recuperou-se para 0,93 ± 0,02 após a intervenção com ZeLan. O estimador Chao1, que reflete a riqueza de espécies, mostrou um padrão semelhante: a indução da SOP reduziu substancialmente o Chao1 de 1215,3 ± 45,4 para 665,8 ± 52,1, enquanto o tratamento com ZeLan aumentou a riqueza para 963,5 ± 38,6. Esses achados indicam coletivamente que a SOP está associada à disbiose microbiana intestinal caracterizada por redução da diversidade alfa e da riqueza, e que o extrato de ZeLan pode restaurar parcialmente a estrutura da comunidade microbiana em direção ao perfil do Controle.
Alterações na composição da microbiota intestinal
O perfilamento taxonômico no nível de filo revelou diferenças composicionais distintas entre os grupos experimentais. Conforme ilustrado na Figura 4, Firmicutes e Bacteroidetes foram os filos dominantes em todos os grupos, representando conjuntamente mais de 85% da comunidade bacteriana total. O grupo Modelo apresentou uma abundância substancialmente elevada de Firmicutes (aproximadamente 75%) associada a uma proporção reduzida de Bacteroidetes (aproximadamente 15%), em comparação com o grupo Controle (Firmicutes aproximadamente 40%, Bacteroidetes aproximadamente 45%), resultando em uma razão Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) marcadamente aumentada, característica de disbiose metabólica. O tratamento com ZeLan modulou esse desequilíbrio, reduzindo a abundância de Firmicutes para aproximadamente 52% e aumentando Bacteroidetes para aproximadamente 35%, normalizando parcialmente a razão F/B em direção aos níveis do controle.
A análise LEfSe foi utilizada para identificar os táxons bacterianos que distinguiram os grupos Controle e Modelo, definindo assim a assinatura microbiana associada à doença. Conforme mostrado na Figura 5, ao nível de gênero, o grupo Modelo PCOS apresentou abundâncias significativamente elevadas de Bacteroides (pontuação LDA > 3,5), Prevotella (pontuação LDA > 3,0) e Escherichia (pontuação LDA > 2,5), todos geralmente associados previamente a disfunção metabólica e inflamação. Por outro lado, o grupo Controle exibiu enriquecimento de gêneros benéficos, incluindo Lactobacillus (pontuação LDA > 3,0) e Ruminococcus (pontuação LDA > 2,5), ambos reconhecidos por seu papel na manutenção da integridade da barreira intestinal e na produção de metabólitos benéficos, como ácidos graxos de cadeia curta. O grupo ZeLan não foi exibido como uma classe LEfSe separada na Figura 5, porque esta análise focou-se nos táxons que distinguem doença de saúde; os efeitos relacionados ao ZeLan foram interpretados a partir das alterações na abundância em direção ao perfil do grupo Controle e das correlações entre microbioma e metaboloma.
Perfilagem metabolômica e identificação de metabólitos diferenciais
A análise de metabolômica não direcionada identificou perturbações metabólicas substanciais associadas à SOP e ao seu tratamento com extrato de ZeLan. O gráfico de vulcão na Figura 6 mostra a distribuição das características dos metabólitos entre os grupos Modelo e Controle, com características reguladas para cima e para baixo destacadas pela direção da razão de variação e significância estatística. Um total de 52 características de metabólitos anotados foi mantido na tabela completa de relatório de metabolômica para a comparação entre Modelo e Controle. A lista completa, incluindo nome do metabólito, identificador HMDB, classe bioquímica, razão de variação log2, valor P e direção da regulação, está fornecida como Tabela Suplementar 1. Tabela 3 apresenta metabólitos anotados representativos com alta relevância biológica para SOP.
Tabela 3 resume os principais metabólitos diferenciais representativos com altos escores VIP e relevância biológica para a fisiopatologia da SOP. Hormônios esteroides, incluindo testosterona (VIP = 2,56, P < 0,001) e androstenediona (VIP = 2,34, P < 0,001), estavam significativamente elevados em animais modelo de SOP, consistente com o estado de hiperandrogenismo característico dessa condição. O metabolismo de ácidos graxos também foi alterado, com aumentos significativos de ácido palmítico (VIP = 2,12) e ácido araquidônico (VIP = 1,89), enquanto o mediador lipídico pró-inflamatório prostaglandina E2 também foi aumentado (VIP = 2,05). Por outro lado, metabólitos associados à atividade benéfica da microbiota intestinal foram reduzidos em animais com SOP: o ácido litocólico, um ácido biliar secundário produzido por biotransformação microbiana, diminuiu substancialmente (VIP = 2,45), assim como o ácido graxo de cadeia curta ácido butírico (VIP = 2,21). Além disso, o ácido succínico e o aminoácido essencial L-triptofano apresentaram reduções no grupo Modelo, sugerindo fermentação microbiana prejudicada e metabolismo alterado de aminoácidos.
Análise de enriquecimento de vias KEGG
A análise de enriquecimento de vias metabólicas utilizando o banco de dados KEGG revelou várias vias metabólicas séricas significativamente alteradas na SOP e moduladas pelo tratamento com ZeLan. Conforme ilustrado na Figura 7, a biossíntese de hormônios esteroides emergiu como a via mais significativamente enriquecida (Fator de Enriquecimento = 0,80, P < 0,01), compatível com o fenótipo hiperandrogênico da SOP. A via de esteroidogênese ovariana também apresentou alto enriquecimento (Fator de Enriquecimento = 0,75, P < 0,01), refletindo o envolvimento da síntese alterada de androgênios na disfunção ovariana. A biossíntese de ácidos biliares primários mostrou enriquecimento significativo (Fator de Enriquecimento = 0,62, P < 0,02), indicando uma circulação entero-hepática de ácidos biliares perturbada, possivelmente relacionada a alterações na microbiota intestinal. O metabolismo do ácido araquidônico (Fator de Enriquecimento = 0,56, P < 0,03) e a via de resistência à insulina (Fator de Enriquecimento = 0,40, P < 0,04) também foram significativamente enriquecidos, corroborando a presença de distúrbios inflamatórios e metabólicos característicos da SOP. A via de biossíntese de ácidos graxos apresentou enriquecimento moderado (Fator de Enriquecimento = 0,30), sugerindo o envolvimento da desregulação metabólica lipídica.
Análise de correlação entre microrganismos e metabólitos
Para avaliar as relações funcionais entre a composição da microbiota intestinal e alterações metabólicas, foi realizada uma análise de correlação de Spearman com controle da taxa de falsas descobertas entre gêneros bacterianos diferencialmente abundantes e metabólitos-chave. O mapa térmico de correlação agrupado hierarquicamente apresentado na Figura 8 revela padrões distintos de associações entre microbiota e metaboloma. Bactérias benéficas, incluindo *Lactobacillus* e *Ruminococcus*, exibiram fortes correlações positivas com o ácido litocólico (r = 0,72 e 0,68, respectivamente) e com o ácido butírico (r = 0,65 e 0,60, respectivamente), enquanto mostraram correlações negativas com testosterona (r = -0,75 e -0,80) e androstenediona (r = -0,68 e -0,72). Esses achados sugerem que as bactérias benéficas identificadas na análise taxonômica estavam associadas a metabólitos relacionados a andrógenos e à atividade metabólica relacionada a ácidos graxos de cadeia curta (AGCC).
Por outro lado, os gêneros associados à SOP, Bacteroides, Prevotella e Escherichia, demonstraram padrões de correlação opostos. Essas bactérias apresentaram correlação positiva com testosterona (r = 0,85, 0,82 e 0,60, respectivamente), androstenediona (r = 0,78, 0,75 e 0,55) e ácido palmítico (r = 0,65, 0,60 e 0,45), enquanto mostraram correlações negativas com metabólitos benéficos, incluindo ácido litocólico e ácido butírico. Esses padrões de correlação sustentam associações funcionais entre táxons microbianos intestinais específicos e as perturbações metabólicas características da SOP, mas não estabelecem uma causalidade direta.
Disponibilidade de Dados:
Os conjuntos de dados gerados e analisados durante este estudo incluem metadados das amostras, dados brutos de fenótipo, índices de alfa-diversidade de 16S, resumos de abundância no nível de filo, resultados de táxons bacterianos diferenciais, tabelas de análise diferencial de metabolômica, resultados representativos de metabólitos, resultados de enriquecimento de vias KEGG e a matriz de correlação entre microbiota e metabólitos. Esses dados brutos subjacentes são fornecidos como o Arquivo Suplementar 1 acompanhante. O conjunto de dados processado de metabólitos diferenciais é fornecido como a Tabela Suplementar 1.
Figura 1: Cronograma do desenho experimental e tratamento. Ilustração esquemática do fluxo experimental, mostrando o período de aclimatação de 7 dias, o período de injeção de DHEA ou veículo de 21 dias, o tratamento com extrato ZeLan ou veículo por 28 dias e a coleta final de amostras de soro e fecais no dia 56 do protocolo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeitos do extrato de ZeLan sobre parâmetros endócrinos e metabólicos. Gráficos de caixa mostrando (A) a concentração sérica de testosterona, (B) a razão LH/FSH e (C) o peso corporal nos grupos Controle, Modelo e Tratamento com ZeLan após o período de intervenção. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3: Diversidade alfa microbiana intestinal. Comparação do índice de diversidade de Shannon entre os grupos tratamento Controle, Modelo e ZeLan, ilustrando as diferenças na diversidade alfa microbiana intestinal. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4: Composição da microbiota intestinal no nível de filo. Gráfico de barras empilhadas mostrando a abundância relativa dos principais filos bacterianos na microbiota intestinal dos grupos Controle, Modelo e tratamento com ZeLan. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 5: Táxons bacterianos diferenciais identificados pela análise LEfSe. Análise de tamanho do efeito por discriminante linear (LEfSe) identificando gêneros bacterianos que distinguem os grupos Controle e Modelo. As pontuações LDA indicam o tamanho do efeito dos táxons diferencialmente abundantes. As alterações associadas ao ZeLan são descritas nos Resultados com base nas mudanças de abundância em relação ao grupo Modelo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 6: Perfilhamento diferencial de metabólitos. Gráfico de vulcão mostrando características metabólitas diferencialmente expressas entre os grupos Modelo e Controle. Pontos vermelhos e azuis representam características de metabólitos significativamente superexpressos e subexpressos, respectivamente, com base na razão de expressão e na significância estatística. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 7: Análise de enriquecimento de vias metabólicas KEGG. Gráfico de bolhas mostrando as vias metabólicas significativamente enriquecidas identificadas a partir dos metabólitos diferenciais. O tamanho da bolha representa o número de metabólitos mapeados, e a cor da bolha indica a significância estatística (valor de P) do enriquecimento da via metabólica. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 8: Correlação entre microbiota intestinal e metabólitos séricos. Mapa de calor agrupado hierarquicamente mostrando os coeficientes de correlação de Spearman entre gêneros bacterianos diferencialmente abundantes e metabólitos séricos representativos. Vermelho indica correlações positivas, enquanto azul indica correlações negativas. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
| Grupo | N | Peso Corporal (g) | Testosterona (ng/mL) | Razão LH/FSH | Insulina (mIU/L) |
| Controle | 8 | 227,45 ± 10,12 | 0,51 ± 0,05 | 1,25 ± 0,11 | 12,55 ± 1,12 |
| Modelo | 8 | 291,12 ± 15,35a | 1,85 ± 0,21a | 3,28 ± 0,25a | 28,95 ± 2,35a |
| ZeLan | 8 | 245,25 ± 10,21b | 0,92 ± 0,12b | 1,85 ± 0,15b | 18,82 ± 1,55b |
| Nota: Os dados são apresentados como Média ± DP. a = p < 0,05 em comparação com o grupo Controle; b = p < 0,05 em comparação com o grupo Modelo. | |||||
Tabela 1: Parâmetros endócrinos e metabólicos em ratos com SOP. O peso corporal, a testosterona sérica, a relação LH/FSH e os níveis de insulina em jejum foram medidos nos grupos Controle, Modelo e Tratamento com ZeLan. Os dados são apresentados como média ± DP.
| Grupo | Índice de Shannon | Índice de Simpson | Estimador Chao1 |
| Controle | 6,51 ± 0,28 | 0,98 ± 0,01 | 1215,3 ± 45,4 |
| Modelo | 4,19 ± 0,35a | 0,82 ± 0,03a | 665,8 ± 52,1a |
| ZeLan | 5,79 ± 0,26b | 0,93 ± 0,02b | 963,5 ± 38,6b |
| Nota: Os dados são apresentados como média ± DP. a = p < 0,05 em comparação com o grupo Controle; b = p < 0,05 em comparação com o grupo Modelo. | |||
Tabela 2: Índices de diversidade alfa microbiana intestinal. Comparação do índice de Shannon, índice de Simpson e estimador Chao1 entre os grupos Controle, Modelo e tratamento com ZeLan. Os dados são apresentados como média ± DP.
| Nome do Metabólito | ID HMDB | Classe | Tendência (Modelo vs Controle) | valor de p | Pontuação VIP |
| Testosterona | HMDB0000286 | Esteróide | Para cima ↑ | < 0,001 | 2,56 |
| Androstenediona | HMDB0000055 | Esteróide | Para cima ↑ | < 0,001 | 2,34 |
| Ácido palmítico | HMDB0000220 | Ácido graxo | Para cima ↑ | < 0,001 | 2,12 |
| Ácido araquidônico | HMDB0001043 | Ácido graxo | Para cima ↑ | 0,003 | 1,89 |
| Prostaglandina E2 | HMDB0001036 | Lipídio | Para cima ↑ | < 0,001 | 2,05 |
| Ácido litocólico | HMDB0000752 | Ácido biliar | Para baixo ↓ | < 0,001 | 2,45 |
| Ácido butírico | HMDB0000039 | ACGL | Para baixo ↓ | < 0,001 | 2,21 |
| Ácido succínico | HMDB0000254 | Ácido orgânico | Para baixo ↓ | 0,021 | 1,65 |
| L-Triptofano | HMDB0000929 | Ácido aminoácido | Para baixo ↓ | 0,015 | 1,58 |
| Nota: VIP = Importância Variável na Projeção (VIP > 1 considerado significativo). | |||||
Tabela 3: Metabólitos séricos diferenciais representativos. Metabólitos anotados representativos associados ao PCOS e regulados pelo extrato de ZeLan, incluindo identificadores HMDB, classe do metabólito, tendência de regulação, valor de P e pontuação VIP. A lista completa de 52 características de metabólitos anotados está fornecida na Tabela Suplementar 1.
Tabela Suplementar 1: Conjunto completo de dados de metabólitos anotados. Lista completa das 52 características de metabólitos anotados mantidas para o relatório de metabolômica, incluindo nome do metabólito, identificador HMDB, classe bioquímica, razão de variação, valor P e direção da regulação.Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 1: Dados de origem que apoiam as análises experimentais, de microbioma e de metabolômica. Esta pasta de trabalho contém as informações das amostras, medidas de fenótipo clínico, índices de diversidade de sequenciamento de rRNA 16S, abundância relativa microbiana no nível de filo, análise de táxons diferenciais LEfSe, análise diferencial de metabolômica, metabólitos representativos, análise de enriquecimento de vias KEGG, matriz de dados de correlação e resumo da verificação de dados utilizados para gerar as figuras e tabelas apresentadas no manuscrito.Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
O presente estudo fornece evidências de que o extrato de ZeLan melhora os fenótipos endócrinos e metabólicos relacionados à SOP em um modelo de rato induzido por DHEA e que esses efeitos estão associados a alterações favoráveis na composição da microbiota intestinal e nos perfis metabólicos séricos. A abordagem integrada de multi-ômica mostrou que o tratamento com ZeLan melhorou a hiperandrogenemia, a elevada relação LH/FSH e a resistência à insulina, além de restaurar parcialmente a diversidade alfa microbiana intestinal, reequilibrar a composição microbiana e normalizar diversas vias metabólicas implicadas na fisiopatologia da SOP. Esses achados ampliam o entendimento atual sobre as respostas biológicas às medicinas botânicas tradicionais chinesas e apoiam investigações adicionais sobre o eixo intestino-ovário como um possível alvo para intervenção na SOP.
A redução nos níveis séricos de testosterona e na razão LH/FSH após o tratamento com ZeLan está de acordo com investigações anteriores que demonstram as propriedades antiandrogênicas de extratos botânicos contendo flavonoides e compostos fenólicos16. Uma revisão abrangente de estudos clínicos com medicina herbal em PCOS resumiu melhorias endócrinas e metabólicas observadas em diversas intervenções botânicas17. O mecanismo pelo qual o ZeLan modula a biossíntese de androgênios pode envolver efeitos diretos sobre as vias esteroidogênicas ovarianas, efeitos anti-inflamatórios sistêmicos e sensibilizadores da insulina, ou efeitos indiretos associados aos metabólitos microbianos intestinais, e o presente delineamento não permite separar plenamente essas possibilidades. A melhora na razão LH/FSH indica uma restauração parcial da função do eixo hipotálamo-hipófise-gônadas, que comumente está disregulado no PCOS18. Revisões sistemáticas de experimentos em animais com fórmulas de medicina tradicional chinesa para PCOS também relataram melhorias nos índices reprodutivos e endócrinos19. A melhora concomitante nos índices relacionados à insulina sugere que o ZeLan pode exercer benefícios metabólicos para além da regulação endócrina, potencialmente por meio de sinalização periférica da insulina aprimorada ou redução de mediadores inflamatórios que prejudicam a função do receptor de insulina20.
A restauração da diversidade alfa microbiana intestinal após o tratamento com ZeLan é compatível com uma resposta associada ao microbioma. A redução da diversidade alfa observada em ratos modelo de SOP é consistente com o crescente corpo de literatura que documenta a disbiose intestinal em modelos experimentais de SOP e em populações clínicas21. Insenser et al. relataram ainda que os perfis da microbiota intestinal na SOP são influenciados pelo sexo, pelos hormônios sexuais e pela obesidade22. Nossa observação de que o tratamento com ZeLan restaurou parcialmente o índice de Shannon de 4,19 para 5,79 sugere que este extrato botânico pode apoiar a estrutura da comunidade microbiana. Efeitos semelhantes de restauração da diversidade já foram relatados para outros extratos vegetais ricos em polifenóis, que podem promover seletivamente populações bacterianas benéficas enquanto suprimem táxons potencialmente patogênicos23. As alterações taxonômicas observadas no nível de filo, particularmente a redução na razão Firmicutes/Bacteroidetes após o tratamento com ZeLan, são relevantes dada a associação estabelecida entre razões F/B elevadas e disfunção metabólica, incluindo obesidade e resistência à insulina24. Estudos adicionais, incluindo o trabalho de Jobira et al. em adolescentes com SOP, relataram alterações na biodiversidade microbiana gastrointestinal, reforçando a relevância biológica da composição microbiana para o metabolismo do hospedeiro25.
A identificação de gêneros bacterianos específicos associados diferencialmente à SOP e ao tratamento com ZeLan fornece um contexto biológico para as associações entre microbiota e metaboloma observadas neste estudo. O enriquecimento de Lactobacillus e Ruminococcus nos controles saudáveis e sua redução nos animais com SOP são consistentes com relatos anteriores que destacam os papéis protetores desses gêneros.26. As espécies de Lactobacillus são reconhecidas pela produção de ácido lático e peptídeos antimicrobianos que mantêm a integridade da barreira intestinal e suprimem bactérias patogênicas, enquanto as espécies de Ruminococcus são importantes produtoras de ácidos graxos de cadeia curta por meio da fermentação de fibras dietéticas27A restauração desses gêneros benéficos após o tratamento com ZeLan pode melhorar a função da barreira intestinal e potencializar a atividade metabólica relacionada aos ácidos graxos de cadeia curta, conforme indicado pelo aumento nos níveis de ácido butírico observado na análise metabolômica. Por outro lado, a abundância elevada de Bacteroides, Prevotella e Escherichia em animais com SOP está de acordo com estudos que implicam esses gêneros em distúrbios inflamatórios e metabólicos.28Espécies de Escherichia, particularmente Escherichia coli, podem produzir lipopolissacarídeo, que pode desencadear inflamação sistêmica e resistência à insulina por meio da sinalização do receptor tipo Toll 4, representando uma ligação plausível entre a disbiose intestinal e a disfunção metabólica associada à SOP29.
Os achados metabolômicos fornecem evidências de associações metabólicas entre o microbiota intestinal e o hospedeiro acompanhando o tratamento com ZeLan. Alterações em ácidos biliares secundários, como o ácido litocólico, são biologicamente relevantes porque esses metabólitos são gerados por meio da atividade enzimática bacteriana30. Os ácidos biliares desempenham funções não apenas na absorção de lipídios, mas também como moléculas sinalizadoras que regulam o metabolismo da glicose e dos lipídios por meio do receptor X farnesoide e do receptor acoplado à proteína G Takeda 5, sugerindo que a normalização dos perfis de ácidos biliares pode contribuir para uma melhora na homeostase metabólica. Da mesma forma, a restauração dos níveis de ácido butírico é relevante dada a sua múltipla gama de efeitos benéficos, incluindo a melhoria da função da barreira intestinal, propriedades anti-inflamatórias e promoção da sensibilidade à insulina. As correlações observadas entre bactérias benéficas e metabólitos protetores, em contraste com as associações entre bactérias patogênicas e metabólitos prejudiciais, fornecem apoio associativo à hipótese do eixo intestino-ovário, ao mesmo tempo que destacam a necessidade de validação mecanicista direta.
As implicações clínicas desses achados devem ser interpretadas dentro dos limites do desenho exploratório pré-clínico. Os resultados apoiam a avaliação adicional do extrato de ZeLan como uma abordagem complementar para o manejo da SOP, particularmente no contexto de intervenções botânicas que possam afetar tanto os índices endócrino-metabólicos quanto o microambiente intestinal. A identificação de biomarcadores microbianos e metabólicos associados à resposta ao tratamento pode ajudar a orientar futuros estudos mecanicistas e translacionais. Além disso, o eixo intestino-ovário pode eventualmente apoiar estratégias combinadas integrando ZeLan com probióticos ou modificações dietéticas, mas tais estratégias requerem validação controlada antes da aplicação clínica.
Várias limitações do presente estudo merecem reconhecimento. Primeiramente, embora o modelo de rato induzido por DHEA recapitule várias características do PCOS humano, ele não captura plenamente a heterogeneidade dos fenótipos do PCOS humano, incluindo subtipos magros, obesos, resistentes à insulina e inflamatórios; portanto, a tradução clínica exige validação em populações de pacientes bem caracterizadas. Em segundo lugar, o estudo utilizou uma única dose de ZeLan, sem um gradiente de dose-resposta ou um controle positivo farmacológico, como a metformina, de modo que a faixa de dose eficaz, a eficácia comparativa e o ciclo ótimo de administração permanecem a ser determinados. Em terceiro lugar, a coleta de amostras foi realizada apenas no ponto final, limitando a interpretação das mudanças temporais dinâmicas na microbiota, nos metabólitos e nos perfis hormonais durante o período de intervenção. Em quarto lugar, a histopatologia ovariana, a contagem de folículos, a quantificação do corpo lúteo e o monitoramento serial do ciclo estral não foram incluídos neste delineamento experimental; portanto, a recuperação da função ovariana foi inferida a partir de índices endócrinos e metabólicos, e não de avaliações diretas ao nível tecidual e do ciclo. Em quinto lugar, o estudo identificou correlações entre táxons microbianos e metabólitos, mas não incluiu transplante de microbiota fecal, experimentos com animais livres de germes, suplementação direcionada de metabólitos, ensaios de marcadores inflamatórios ou medidas de enzimas esteroidogênicas ovarianas, como CYP17A1, CYP19A1 e StAR; consequentemente, mecanismos causais não podem ser confirmados com base nos dados atuais. Em sexto lugar, a metabolômica não direcionada fornece evidências em nível de descoberta, sendo necessária, em trabalhos futuros, a validação quantitativa direcionada de metabólitos-chave, como o ácido litocólico, o ácido butírico e a testosterona. Em sétimo lugar, a visualização da beta-diversidade, a predição funcional microbiana e a modelagem integrada de vias microbiota-metabólito-gene não estavam disponíveis para a submissão atual, limitando a capacidade de construir uma rede regulatória completa. Por fim, o extrato de ZeLan foi padronizado pelo teor total de flavonoides, mas caracterização fitoquímica qualitativa e quantitativa abrangente dos monômeros ativos ainda é necessária.
Em conclusão, o extrato de ZeLan melhorou os fenótipos endócrinos e metabólicos relacionados à SOP em um modelo de rato e esteve associado à restauração parcial da diversidade alfa microbiana intestinal, alteração na composição microbiana e modulação de vias metabólicas séricas, incluindo a biossíntese de hormônios esteroides, o metabolismo de ácidos biliares e o metabolismo relacionado a ácidos graxos de cadeia curta. As correlações observadas entre bactérias benéficas e metabólitos protetores, em contraste com as associações entre bactérias enriquecidas na SOP e metabólitos prejudiciais, apoiam uma associação biologicamente plausível no eixo intestino-ovário. Esses achados fornecem uma base para futuros estudos mecanicistas e translacionais do extrato de ZeLan no manejo da SOP, ao mesmo tempo que enfatizam a necessidade de validação causal e de uma caracterização fitoquímica mais ampla.
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Este estudo foi financiado pelo Projeto de Planejamento de Pesquisa Científica da Administração Provincial de Medicina Tradicional Chinesa de Hebei (Concessão nº 2021316).
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Acrilonitrila | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A955-4 | Grado Optima LC-MS, 4 L; fase móvel e reconstrução da amostra |
| Coluna ACQUITY UPLC HSS T3 | Waters Corporation | 186003539 | 100 Å, 1,8 μm, 2,1 × 100 mm; separação UHPLC |
| Sistema de eletroforese em gel de agarose | Bio-Rad Laboratories | 1704486 | Sistema de eletroforese horizontal Mini-Sub Cell GT; avaliação da qualidade do DNA |
| Agilent 1290 Infinity II/6550 UHPLC-Q-TOF-MS | Agilent Technologies | G7120A/G7167B/G7116B/G6550B | Módulo UHPLC 1290 Infinity II acoplado ao MS Q-TOF 6550 iFunnel; plataforma de metabolômica não direcionada em soro |
| Algoritmo DADA2 | Bioconductor | Versão 1.24.0 | Geração de ASV e remoção de quimeras; versão inferida para corresponder ao fluxo de trabalho R 4.2.1/Bioconductor 3.15 |
| Deidroepiandrosterona (DHEA) | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | D4000 | Indução do modelo de SOP; 6 mg/100 g de peso corporal; CAS 53-43-0 |
| Água destilada | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | 10977015 | Água destilada UltraPure livre de DNase/RNase; veículo para gavagem oral nos grupos Controle e Modelo |
| Ácido fórmico | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A117-50 | Grado Optima LC-MS, 50 mL; aditivo 0,1% para fases móveis de LC-MS |
| Banco de Dados do Metaboloma Humano | University of Alberta / HMDB | HMDB 5.0 | Banco de dados de anotação de metabólitos |
| Plataforma Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | 20012850 | Sistema de sequenciamento utilizado pelo provedor de serviço de sequenciamento para sequenciamento de 16S rRNA em pareamento de 250 pb |
| Erva Lycopus lucidus Turcz. | Beijing Tongrentang Chinese Medicine Co., Ltd. | Lote ZL-20230315 | Matéria-prima botânica autenticada para extrato aquoso de ZeLan |
| Metanol | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A456-4 | Grado Optima LC-MS, 4 L; precipitação de proteínas para metabolômica de soro |
| Banco de dados METLIN | Scripps Research | METLIN Classic 2023 | Banco de dados de anotação de espectros de massa de metabólitos |
| Espectrofotômetro NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Espectrofotômetro microvolume NanoDrop One UV-Vis; avaliação da quantidade e pureza do DNA |
| QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit | Qiagen | 51604 | Extração de DNA de conteúdos cegais; kit de DNA fecal para 50 preparações |
| QIIME2 | Equipe de desenvolvimento QIIME2 | Versão 2022.2 | Processamento de sequências de 16S rRNA |
| Software R | R Foundation | Versão 4.2.1 | Análise estatística e processamento XCMS |
| Kits ELISA de soro para testosterona, LH, FSH e insulina | Cusabio Biotech | CSB-E05100r; CSB-E12654r; CSB-E06869r; CSB-E05070r | Kits ELISA de ratos para testosterona, LH, FSH e insulina para quantificação de hormônios e insulina em soro |
| Óleo de gergelim | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | S3547 | Veículo para injeção de DHEA |
| Pentobarbital de sódio | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | P3761 | Anestesia; 50 mg/kg intraperitoneal |
| Software SPSS | IBM Corporation | Versão 26.0 | Análise estatística |
| Primer universal de 16S rRNA 338F/806R | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Síntese personalizada: 338F/806R | Amplificação das regiões V3-V4; 338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG, 806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT |
| Pacote XCMS | Bioconductor / R | Versão 3.18.0 | Detecção de picos, alinhamento de tempo de retenção e integração |
| Extrato ZeLan | Extrato aquoso produzido internamente | Lote ZLE-20230402 | Tratamento por gavagem oral; flavonoides totais padronizados ≥2,5% |
Referências
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