É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de investigação
O extrato de ZeLan melhorou os fenótipos endócrinos e metabólicos em ratas com PCOS induzido por DHEA. A integração do sequenciamento de 16S rRNA e metabolômica sérica mostrou restauração parcial da diversidade alfa microbiana intestinal, alterações na composição microbiana e mudanças nos metabólitos envolvendo hormônios esteroides, ácidos biliares e ácidos graxos de cadeia curta.
Este estudo investigou os efeitos terapêuticos do extrato de ZeLan na síndrome dos ovários policísticos (SOP) e avaliou sua associação com a remodelação do microbioma intestinal e do metaboloma. Vinte e quatro ratas Sprague-Dawley foram divididas aleatoriamente em grupos Controle, Modelo de SOP induzido pela desidroepiandrosterona (DHEA) e tratamento com ZeLan (n = 8 cada). Após 28 dias de intervenção, os níveis séricos de hormônios foram medidos por ELISA; a composição do microbioma intestinal foi analisada por meio de sequenciamento do gene 16S rRNA, e os perfis metabólicos séricos foram caracterizados por UHPLC-Q-TOF-MS. Foi realizada análise de correlação de Spearman com controle de múltiplos testes para explorar as associações entre microbioma e metaboloma. O ZeLan melhorou significativamente os fenótipos associados à SOP, reduzindo o peso corporal, os níveis de testosterona (0,92 versus 1,85 ng/mL, P < 0,05), a razão LH/FSH e os níveis de insulina em comparação com o grupo Modelo. O sequenciamento mostrou que o ZeLan restaurou parcialmente a diversidade alfa microbiana (índice de Shannon: 5,79 versus 4,19) e reduziu a razão Firmicutes/Bacteroidetes. O ZeLan foi associado ao enriquecimento de Lactobacillus e Ruminococcus e menor abundância de Bacteroides, Prevotella e Escherichia. A metabolômica identificou 52 características de metabólitos alteradas, com mudanças-chave envolvendo hormônios esteroides, ácidos biliares como o ácido litocólico e ácidos graxos de cadeia curta como o ácido butírico. Esses achados sugerem que o ZeLan atenua distúrbios endócrinos e metabólicos relacionados à SOP e está associado à remodelação dos perfis microbianos intestinais e metabólicos séricos.
A síndrome dos ovários policísticos (SOP) representa um dos distúrbios endócrinos mais prevalentes que afetam mulheres em idade reprodutiva, com uma prevalência global estimada entre 6% e 20%, dependendo dos critérios diagnósticos utilizados1. Este distúrbio metabólico e reprodutivo complexo caracteriza-se por um conjunto de manifestações clínicas, incluindo hiperandrogenismo, disfunção ovulatória e morfologia ovariana policística, que conjuntamente contribuem para consequências reprodutivas, metabólicas e psicológicas significativas2. Além do seu impacto imediato na fertilidade, a SOP é cada vez mais reconhecida como uma condição sistêmica associada a complicações crônicas de saúde, incluindo diabetes melito tipo 2, doenças cardiovasculares e carcinoma de endométrio, impondo, assim, encargos substanciais tanto para pacientes individuais quanto para os sistemas de saúde em todo o mundo3. A fisiopatologia da SOP ainda não é completamente compreendida, embora seja amplamente aceito que envolva interações complexas entre predisposição genética, fatores ambientais e determinantes do estilo de vida, que culminam nas alterações hormonais e metabólicas características observadas nos indivíduos afetados4.
As abordagens terapêuticas contemporâneas para a SOP concentram-se principalmente no manejo sintomático por meio de intervenções farmacológicas, incluindo contraceptivos orais para regulação menstrual, metformina para sensibilização à insulina e antiandrogênicos para controle da hirsutismo5. No entanto, esses tratamentos convencionais frequentemente proporcionam alívio incompleto dos sintomas e estão comumente associados a efeitos adversos que limitam sua aplicabilidade a longo prazo, especialmente em mulheres com desejo de fertilidade6. Consequentemente, tem havido um crescente interesse na exploração de abordagens de medicina complementar e alternativa, particularmente a medicina tradicional chinesa (MTC), que acumulou séculos de experiência empírica no tratamento de distúrbios ginecológicos por meio de mecanismos regulatórios holísticos7. Entre as inúmeras plantas medicinais investigadas para o manejo da SOP, Lycopus lucidus Turcz. (conhecida vulgarmente como ZeLan na medicina chinesa) tem atraído considerável atenção devido às suas aplicações tradicionais na promoção da circulação sanguínea, resolução de estase e regulação da menstruação8. Estudos fitoquímicos publicados indicam que L. lucidus contém frações ricas em polifenóis e flavonoides com atividade antioxidante e anti-inflamatória8,9. Portanto, o teor total padronizado de flavonoides foi utilizado como índice de controle de qualidade química do extrato no presente estudo, embora a identificação dos monômeros ativos específicos responsáveis pela regulação da microbiota e do metabolismo exija análise fitoquímica direcionada no futuro.
A microbiota intestinal emergiu como um regulador crítico do metabolismo e da função endócrina do hospedeiro, com evidências crescentes apoiando seu envolvimento na patogênese de diversas doenças metabólicas, incluindo a SOP10. O conceito do eixo intestino-ovário foi proposto para descrever a comunicação bidirecional entre microrganismos intestinais e a função ovariana, mediada por metabólitos microbianos, sinalização imunológica e vias neuroendócrinas11. Mulheres com SOP demonstraram consistentemente apresentar disbiose intestinal caracterizada por redução da diversidade microbiana, alterações nas proporções de Firmicutes para Bacteroidetes e diminuição da abundância de bactérias benéficas, como espécies de Lactobacillus e Bifidobacterium12. Acredita-se que essas perturbações microbianas contribuam para a fisiopatologia da SOP por meio de múltiplos mecanismos, incluindo aumento da permeabilidade intestinal, inflamação sistêmica de baixo grau e alterações no metabolismo de ácidos biliares e ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), que subsequentemente influenciam a sensibilidade à insulina e a biossíntese de androgênios13. Importante ressaltar que intervenções direcionadas à microbiota intestinal, incluindo probióticos, prebióticos e modificações dietéticas, têm demonstrado resultados promissores na melhora dos sintomas da SOP, reforçando o eixo intestino-ovário como alvo terapêutico14.
A metabolômica, a análise abrangente de metabólitos de pequenas moléculas em sistemas biológicos, fornece uma abordagem poderosa para caracterizar as perturbações metabólicas associadas a estados patológicos e para avaliar os efeitos bioquímicos de intervenções terapêuticas15. A integração do sequenciamento do gene 16S rRNA para perfilagem do microbioma com metabolômica não direcionada permite a investigação sistemática das relações entre comunidades microbianas intestinais e o metabolismo do hospedeiro, oferecendo insights sobre as interações entre microbiota e metaboloma que podem acompanhar tanto a patogênese da doença quanto as respostas ao tratamento. Apesar da justificativa teórica para o alvo no eixo intestino-ovário no manejo da SOP e das indicações tradicionais do ZeLan para distúrbios ginecológicos, nenhum estudo até o momento investigou sistematicamente se o extrato de ZeLan modula a interface entre microbiota intestinal e metaboloma na SOP. Essa lacuna de conhecimento limita nossa compreensão das respostas biológicas associadas ao ZeLan e dificulta a otimização racional dessa intervenção botânica para o tratamento da SOP.
O presente estudo foi planejado para investigar a eficácia terapêutica do extrato de ZeLan em um modelo de rato com PCOS induzido por DHEA e para avaliar as alterações associadas no microbiota intestinal e no metaboloma por meio da integração de sequenciamento de 16S rRNA e análise de metabolômica não direcionada. Especificamente, avaliamos os efeitos do extrato de ZeLan em fenótipos relacionados ao PCOS, incluindo peso corporal, testosterona sérica, razão entre hormônio luteinizante e hormônio folículo-estimulante (LH/FSH) e níveis de insulina; caracterizamos alterações na composição da microbiota intestinal e na diversidade alfa após o tratamento com ZeLan; identificamos características diferenciais de metabólitos séricos e vias metabólicas enriquecidas associadas à intervenção com ZeLan; e exploramos correlações entre táxons microbianos intestinais específicos e metabólitos-chave. Ao abordar esses objetivos, buscamos fornecer evidências associativas de múltiplos ômicas para a modulação relacionada ao ZeLan no eixo intestino-ovário no PCOS.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Todos os procedimentos experimentais do presente estudo foram conduzidos de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (Número de Aprovação IACUC-2023-0156).
Animais
Ratos fêmeas Sprague-Dawley (n = 24, com 6 semanas de idade, peso corporal de 180–200 g) foram obtidos do Centro de Animais de Laboratório da instituição afiliada e mantidos em condições ambientais controladas (temperatura de 22 ± 2°C, umidade de 50 ± 10%, ciclo claro/escuro de 12 horas) com acesso ad libitum a ração padrão para roedores e água purificada. Após um período de aclimatação de uma semana, os animais foram aleatoriamente distribuídos em três grupos experimentais (n = 8 por grupo): Controle, Modelo de SOP e Tratamento com ZeLan. O tamanho da amostra foi determinado com base em estudos anteriores que investigaram alterações na microbiota intestinal em modelos de SOP, sendo que a análise de poder indicou que 8 animais por grupo proporcionariam 80% de poder para detectar uma diferença de 1,5 vez nos índices de diversidade alfa em α = 0,05.
Estabelecimento do modelo de SOP e protocolo de tratamento
O modelo de SOP foi estabelecido utilizando um protocolo bem validado que envolve injeção subcutânea de dehidroepiandrosterona (DHEA; Sigma-Aldrich, EUA) dissolvida em óleo de gergelim na região dorsal do pescoço, na dose de 6 mg/100 g de peso corporal diariamente por 21 dias consecutivos. Os animais controle receberam volumes equivalentes de veículo de óleo de gergelim. A linha do tempo experimental completa compreendeu 7 dias de aclimatação, 21 dias de indução do modelo e 28 dias de intervenção, com coleta final no dia 56 do protocolo, incluindo o período de aclimatação (Figura 1). O extrato ZeLan foi preparado a partir da planta autenticada Lycopus lucidus Turcz. por extração aquosa e foi padronizado para conter flavonoides totais em quantidade não inferior a 2,5%, conforme determinado por cromatografia líquida de alta eficiência, que serviu como critério de controle de qualidade química do extrato botânico. Após a conclusão do estabelecimento do modelo induzido por DHEA, os ratos do grupo ZeLan receberam por gavagem oral o extrato ZeLan na dose de 200 mg/kg de peso corporal diariamente por 28 dias consecutivos, enquanto os grupos Controle e Modelo receberam volumes equivalentes de água destilada. A dose de 200 mg/kg foi escolhida como uma dose farmacológica exploratória com base em experiências prévias com extratos botânicos em animais e considerações preliminares de tolerabilidade; uma avaliação formal da resposta à dose não fez parte do presente desenho experimental. O peso corporal foi registrado semanalmente ao longo do período experimental. Neste desenho experimental, o sucesso do estabelecimento do modelo de SOP foi avaliado com base no protocolo de indução com DHEA, juntamente com fenótipos endócrinos e metabólicos no ponto final, incluindo peso corporal, testosterona sérica, razão LH/FSH e insulina em jejum. Exame histopatológico ovariano, contagem de folículos, quantificação de corpos lúteos e monitoramento serial do ciclo estral não foram incluídos como pontos finais de confirmação do modelo, e, portanto, a interpretação da disfunção ovariana baseou-se em indicadores endócrinos e metabólicos, e não em avaliação direta ao nível tecidual.
Coleta e processamento de amostras
Amostras (soro e fezes) foram coletadas dos três grupos (n = 8 por grupo) para análises bioquímicas, de microbiota e de metabolômica subsequentes. As coletas terminais foram realizadas pela manhã, após jejum noturno, para reduzir a variabilidade relacionada ao ciclo circadiano e à alimentação. As amostras de sangue foram coletadas da aorta abdominal sob anestesia e centrifugadas a 3.000 × g durante 15 minutos a 4°C para obtenção do soro, que foi fracionado e armazenado a -80°C até as análises hormonais e metabolômicas. Amostras frescas de fezes foram coletadas diretamente do ceco em condições assépticas em criotubos estéreis, mantidas sobre gelo seco durante o transporte, congeladas rapidamente em nitrogênio líquido dentro de 10 minutos após a coleta e armazenadas a -80°C até o sequenciamento do gene 16S rRNA.
Medições hormonais no soro
As concentrações séricas de testosterona, hormônio luteinizante (LH), hormônio folículo-estimulante (FSH) e insulina foram quantificadas utilizando kits comerciais de ensaio imunoenzimático (ELISA) (Cusabio Biotech, Wuhan, China), conforme as instruções do fabricante. A razão LH/FSH foi calculada como um índice composto de desequilíbrio gonadotrófico característico da SOP. Todas as amostras foram analisadas em duplicata, e as medições cujos coeficientes de variação em duplicata fossem superiores a 15% foram repetidas. Exigia-se que os coeficientes de variação intraensaio e interensaio permanecessem abaixo de 10% e 15%, respectivamente. Possíveis valores aberrantes foram verificados com base nos registros originais e nas informações de desempenho do ensaio, e nenhum valor foi excluído unicamente por critérios estatísticos sem uma justificativa técnica documentada.
Sequenciamento do gene do RNA ribossomal 16S e análise bioinformática
O DNA genômico bacteriano total foi extraído do conteúdo cecal utilizando o QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Alemanha), seguindo o protocolo do fabricante. A qualidade e a quantidade do DNA foram avaliadas por espectrofotometria NanoDrop e eletroforese em gel de agarose, e os extratos de DNA foram armazenados a -80°C antes da construção da biblioteca. As regiões hipervariáveis V3-V4 do gene 16S rRNA foram amplificadas usando os primers universais 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') e 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') com sequências adaptadoras Illumina. As bibliotecas de amplicons foram construídas, purificadas, quantificadas, reunidas em concentrações equimolares e sequenciadas na plataforma Illumina NovaSeq 6000 (Novogene, Pequim, China) utilizando leituras pareadas de 250 pb.
As leituras brutas de sequenciamento foram processadas usando o pipeline QIIME2 (versão 2022.2). As leituras pareadas foram desmultiplexadas, unidas, filtradas por qualidade utilizando um limiar de pontuação Phred de pelo menos 20 e processadas com o DADA2 para remover sequências quiméricas e gerar variantes de sequência de amplicon (ASVs). A classificação taxonômica foi realizada contra a base de dados de referência SILVA 138 utilizando um classificador bayesiano ingênuo. Métricas de diversidade alfa, incluindo índice de Shannon, índice de Simpson e estimador Chao1, foram calculadas para avaliar a diversidade e riqueza intra-amostra. Os resultados de profundidade de sequenciamento, incluindo resumos de leituras, tabelas de abundância de ASVs, cobertura de Good e arquivos de curvas de rarefação, foram tratados como parte do conjunto de dados do microbioma descrito na seção Disponibilidade de Dados. A análise linear de tamanho do efeito (LEfSe) foi utilizada para identificar táxons associados à doença na comparação Controle versus Modelo, utilizando um limiar de pontuação LDA maior que 2,0 e P < 0,05; a reversão associada ao ZeLan foi avaliada comparando a direção das alterações na abundância taxonômica no grupo ZeLan em relação ao grupo Modelo.
Análise de metabolômica não direcionada
O perfil metabólomico do soro foi realizado utilizando cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas com analisador quadrupolo e tempo de voo (UHPLC-Q-TOF-MS; Agilent 1290 Infinity II/6550, EUA). Amostras de soro (100 μL) foram misturadas com 400 μL de metanol frio:acetonitrila (1:1, v/v) contendo padrões internos, agitadas em vórtex e incubadas a -20°C por 1 hora para precipitar as proteínas. Após centrifugação a 14.000 × g durante 15 minutos, os sobrenadantes foram secos sob fluxo de nitrogênio e reconstituídos em 100 μL de acetonitrila:água (1:1, v/v) para análise. A separação cromatográfica foi realizada em coluna ACQUITY UPLC HSS T3 (2,1 × 100 mm, 1,8 μm) mantida a 40°C, utilizando água contendo 0,1% de ácido fórmico como fase móvel A e acetonitrila contendo 0,1% de ácido fórmico como fase móvel B, com vazão de 0,30 mL/min. Um programa em gradiente com aumento da fase orgânica de 5% a 95%, seguido de lavagem e reequilíbrio da coluna, foi utilizado para separação dos metabólitos. Os dados espectrométricos de massas foram adquiridos nos modos de ionização por eletrospray positivo e negativo, com faixa de varredura de m/z 50–1200; os parâmetros da fonte incluíram tensão de capilar de 3,5 kV, fluxo de gás de secagem de 10 L/min, temperatura do gás de secagem de 325°C, pressão do nebulizador de 35 psi e tensão do fragmentador de 120 V.
Os arquivos de dados brutos foram convertidos para o formato mzXML e processados usando o pacote XCMS no R para detecção de picos, alinhamento do tempo de retenção e integração da área dos picos. Amostras de controle de qualidade, preparadas pela combinação de alíquotas iguais de todos os extratos séricos, foram inseridas ao longo da sequência analítica para monitorar a estabilidade do instrumento. Características com ausência excessiva ou reprodutibilidade instável no controle de qualidade foram removidas antes da modelagem estatística. A identificação dos metabólitos foi realizada comparando a massa exata, o tempo de retenção e os padrões de fragmentação em MS/MS com os bancos de dados Human Metabolome Database (HMDB), METLIN e bibliotecas espectrais internas. Análises estatísticas multivariadas foram conduzidas usando o MetaboAnalyst 5.0. As características de metabólitos mantidas para relatórios posteriores foram priorizadas usando um critério combinado que incluiu contribuição discriminatória multivariada, direção da variação, e evidência estatística; os valores de P foram ajustados utilizando o método de Benjamini-Hochberg para levar em conta testes múltiplos. A tabela completa de relatório anotada, contendo 52 características de metabólitos, está disponível como Tabela Suplementar 1. A análise de enriquecimento de vias metabólicas foi realizada utilizando o banco de dados Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).
Análise estatística
Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o SPSS versão 26.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, EUA) e o software R (versão 4.2.1). Os dados contínuos foram expressos como média ± desvio padrão (DP) e avaliados quanto à normalidade utilizando o teste de Shapiro-Wilk antes dos testes inferenciais. Para dados com distribuição normal, foi utilizada a análise de variância de um fator (ANOVA) seguida pelo teste post hoc de Tukey para comparações entre múltiplos grupos; para dados com distribuição não normal, foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis com teste post hoc de Dunn. As correlações entre táxons microbianos intestinais e metabólitos séricos foram avaliadas utilizando o coeficiente de correlação de postos de Spearman e visualizadas como mapas de calor agrupados hierarquicamente. Os valores-P das correlações foram ajustados para múltiplos testes utilizando o método da taxa de falsas descobertas de Benjamini-Hochberg, e somente as correlações que foram consistentes em direção e estatisticamente significativas foram interpretadas. Um valor-P bicaudal < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo, salvo quando um limiar de valor-P ajustado foi especificado.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Efeitos do extrato de ZeLan nos fenótipos clínicos da SOP
A administração de DHEA induziu fenótipos endócrinos e metabólicos semelhantes ao PCOS em ratas, conforme evidenciado por elevações significativas no peso corporal, concentração sérica de testosterona, razão LH/FSH e níveis de insulina em jejum em comparação com o grupo Controle (todos P < 0,05). A avaliação da distribuição pelo teste de Shapiro-Wilk apoiou a análise paramétrica para os principais desfechos de peso c...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
O presente estudo fornece evidências de que o extrato de ZeLan melhora os fenótipos endócrinos e metabólicos relacionados à SOP em um modelo de rato induzido por DHEA e que esses efeitos estão associados a alterações favoráveis na composição da microbiota intestinal e nos perfis metabólicos séricos. A abordagem integrada de multi-ômica mostrou que o tratamento com ZeLan melhorou a hiperandrogenemia, a elevada relação LH/FSH e a resistência à insulina, além de restaurar parcialmente a diversidade alfa microbiana intestina...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Este estudo foi financiado pelo Projeto de Planejamento de Pesquisa Científica da Administração Provincial de Medicina Tradicional Chinesa de Hebei (Concessão nº 2021316).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Acrilonitrila | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A955-4 | Grado Optima LC-MS, 4 L; fase móvel e reconstrução da amostra |
| Coluna ACQUITY UPLC HSS T3 | Waters Corporation | 186003539 | 100 Å, 1,8 μm, 2,1 × 100 mm; separação UHPLC |
| Sistema de eletroforese em gel de agarose | Bio-Rad Laboratories | 1704486 | Sistema de eletroforese horizontal Mini-Sub Cell GT; avaliação da qualidade do DNA |
| Agilent 1290 Infinity II/6550 UHPLC-Q-TOF-MS | Agilent Technologies | G7120A/G7167B/G7116B/G6550B | Módulo UHPLC 1290 Infinity II acoplado ao MS Q-TOF 6550 iFunnel; plataforma de metabolômica não direcionada em soro |
| Algoritmo DADA2 | Bioconductor | Versão 1.24.0 | Geração de ASV e remoção de quimeras; versão inferida para corresponder ao fluxo de trabalho R 4.2.1/Bioconductor 3.15 |
| Deidroepiandrosterona (DHEA) | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | D4000 | Indução do modelo de SOP; 6 mg/100 g de peso corporal; CAS 53-43-0 |
| Água destilada | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | 10977015 | Água destilada UltraPure livre de DNase/RNase; veículo para gavagem oral nos grupos Controle e Modelo |
| Ácido fórmico | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A117-50 | Grado Optima LC-MS, 50 mL; aditivo 0,1% para fases móveis de LC-MS |
| Banco de Dados do Metaboloma Humano | University of Alberta / HMDB | HMDB 5.0 | Banco de dados de anotação de metabólitos |
| Plataforma Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | 20012850 | Sistema de sequenciamento utilizado pelo provedor de serviço de sequenciamento para sequenciamento de 16S rRNA em pareamento de 250 pb |
| Erva Lycopus lucidus Turcz. | Beijing Tongrentang Chinese Medicine Co., Ltd. | Lote ZL-20230315 | Matéria-prima botânica autenticada para extrato aquoso de ZeLan |
| Metanol | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A456-4 | Grado Optima LC-MS, 4 L; precipitação de proteínas para metabolômica de soro |
| Banco de dados METLIN | Scripps Research | METLIN Classic 2023 | Banco de dados de anotação de espectros de massa de metabólitos |
| Espectrofotômetro NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Espectrofotômetro microvolume NanoDrop One UV-Vis; avaliação da quantidade e pureza do DNA |
| QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit | Qiagen | 51604 | Extração de DNA de conteúdos cegais; kit de DNA fecal para 50 preparações |
| QIIME2 | Equipe de desenvolvimento QIIME2 | Versão 2022.2 | Processamento de sequências de 16S rRNA |
| Software R | R Foundation | Versão 4.2.1 | Análise estatística e processamento XCMS |
| Kits ELISA de soro para testosterona, LH, FSH e insulina | Cusabio Biotech | CSB-E05100r; CSB-E12654r; CSB-E06869r; CSB-E05070r | Kits ELISA de ratos para testosterona, LH, FSH e insulina para quantificação de hormônios e insulina em soro |
| Óleo de gergelim | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | S3547 | Veículo para injeção de DHEA |
| Pentobarbital de sódio | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | P3761 | Anestesia; 50 mg/kg intraperitoneal |
| Software SPSS | IBM Corporation | Versão 26.0 | Análise estatística |
| Primer universal de 16S rRNA 338F/806R | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Síntese personalizada: 338F/806R | Amplificação das regiões V3-V4; 338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG, 806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT |
| Pacote XCMS | Bioconductor / R | Versão 3.18.0 | Detecção de picos, alinhamento de tempo de retenção e integração |
| Extrato ZeLan | Extrato aquoso produzido internamente | Lote ZLE-20230402 | Tratamento por gavagem oral; flavonoides totais padronizados ≥2,5% |
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.